PARCIAL 2.

BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR - POSGRADO

Susana Muñoz Gil e Isabella Muñoz Tróchez

sumunozg@unal.edu.co; imunozt@unal.edu.co

Diciembre, 2021

1. Con respecto a la regulación génica en procariotes, específicamente el operón lactosa

cómo se comporta a nivel de expresión génica el siguiente genotipo merodiploide (condición
diploide para el operón):

A) En presencia de alta concentración de Lactosa y Glucosa

Inicialmente el procariote prefiere el consumo de glucosa, sin embargo, la lactosa que se

encuentra en el medio va a permitir que el inductor lactosa se una al represor, lo que va a
generar su remoción en el operón, teniendo como consecuencia que se reclute la RNA
polimerasa y se da una expresión basal de la transcripción del gen de las enzimas Lac, lo
que va a permitir que esas enzimas degraden la lactosa que es un disacárido en
monosacáridos como galactosa y glucosa, y sirva así de fuente de alimento también. El
organismo procariote va a tener buena fuente de glucosa.

B) En ausencia de Glucosa, pero presencia de Lactosa

La cAMP va estar alta, el activador va a reclutar la RNA polimerasa, la expresión del operón
va a ser muy alta, va atener una transcripción de nivel activado, la lactosa va a desactivar el
represor y se va a poder dar una expresión abundante de lac.

Responda para cada ejercicio:

a) No hay expresión
b) Hay expresión baja para un operón
c) Hay expresión baja para los dos operones
d) Hay expresión alta para un operón
e) Hay expresión alta para los dos operones

Operón A / Operón B Respuesta en Respuesta en

presencia de ausencia de
Lactosa y Glucosa Glucosa pero en
presencia de
Lactosa

1 OC I+ Z+ / O+ I- Z+ c e

2 O+ I+ Z+ b d

3 O+ I- Z+ b d
 4 O+ IS Z+ a a

5 OC I- Z+ b d

6 O+ I- Z+ / O+ I+ Z+ c e

7 O+ I- Z+ / O+ I- Z+ c e

8 O+ I- Z+ / O+ IS Z+ b d

9 OC I- Z+ / OC IS Z+ c e

10 OC I+ Z+ / O+ I- Z+ c e

Respuesta:

1. En el operón A va a haber alta expresión debido a la mutación en OC y esto implica que la

proteína sintetizada por el gen regulador I+, no puede ser reconocida por la región
operadora debido a alteraciones estructurales en sus bases nitrogenadas. Posteriormente,
al no haber un represor en la región, la RNA polimerasa tiene la capacidad de unirse al
operador e iniciar la transcripción de los genes estructurales que conforman el operón. El
gen regulador I+, al igual que el gen OC se comportan de carácter dominantes, e indican que
sí va a haber expresión o transcripción. Por otro lado, el I+ dice que la proteína se puede
unir al operador pero en presencia del inductor Lactosa, que va a remover, lo que permitirá
la expresión, entonces en ambos casos se da la expresión. Para el operon B, el O+ indica
que la proteína represora se puede unir y en presencia de Lactosa permite la expresión del
operón, la I- no permite que se una la proteína al operador, por lo que si va a haber
expresión. Ahora, la expresión va a ser baja debido a que en presencia de Glucosa la
bacteria no requiere de una activación fuerte por parte de la Lactosa ya que tiene el
suministro en la Glucosa pero igual la Lactosa genera la unión a la proteína al operador
generando una expresión del operón, en menor cantidad pero la genera.
2. En este caso solo se encuentra el operón A, el O+ indica que la proteína represora se
puede unir al operador y en presencia de Lactosa, esta la va a inactivar, permitiendo la
llegada de la RNA polimerasa para continuar con la expresión del operón y darse la
transcripción. En el caso de la presencia de la Glucosa va a generar que se dé una baja
expresión pero en su ausencia será alta la activación de la transcripción.
3. El O+ permitirá la unión del represor y para el I- donde no permite la unión de la proteína
al operador también se va a permitir la expresión del operón.
4. El O+ permite la expresión, sin embargo, el gen IS no permite la expresión debido a que la
proteína represora es incapaz de reconocer al inductor Lactosa.
5. El OC permite la expresión del operón, al no dejar que la proteína represora se una al
operador. El gen I- tiene el mismo efecto, por lo que sí hay expresión en ambos casos.
6. Para este caso, si hay expresión en ambos operones, debido a que en el operón A, no
hay proteína represora que inhiba la expresión y en el operón B, la región operadora tiene
la capacidad de reconocer la proteína represora que será sintetizada por el gen I-
7. El operón A, contiene una mutación constitutiva I- la cual altera la estructura de la
proteína reguladora, impidiendo la unión a la región operadora, y así dando paso a la RNA
polimerasa. El operón B es regulado de manera normal.
8. El operón A, presenta una mutación I- y como se mencionó anteriormente, permitirá la
transcripción.
9. El OC presenta alteración en su estructura y no permite la unión al represor, por lo que se
da la transcripción. El operón B, presenta Is, que afecta la unión de la proteína represora al
promotor, y no se dará la transcripción ya que no se puede reconocer el inductor.
10. El OC no permite la unión del represor por lo tanto se da la trascripción , y el operón B
presenta I- lo cual impide la unión de la proteína represora al operador, dando paso a la
RNA polimerasa que permite la transcripción

2. Suponga que usted tiene un péptido +H3N-RKPM-COO-, y usted sabe que las moléculas
de RNAt usadas en su síntesis tienen los siguientes anticodones:

(3')-GGU-(5') (3')-GCU-(5') (3')-UUU-(5') (3')-UAC-(5').

Diga cuál es la secuencia de nucleótidos de DNA para la cadena molde del gen (5 ́-3’) que
codifica para este péptido.

Respuesta:

5 ́- __G__ __G__ __T__ __G__ __C__ __T__ __T__ __T__ __T__ __T__ __A__ _C_ - 3 ́

Secuencia de nucleótidos de ADN para el péptido +H3N-RKPM-COO-

Anticodón (3´ GGU GCU UUU UAC 5´) (RNAt)

Codón (5´ CCA CGA AAA AUG 3´) (RNAm)
Cadena molde (3´ GGT GCT TTT TAC 5´) (ADN-)
Cadena codificante (5´ CCA CGA AAA ATG 3´) (ADN+)

PARA LOS SIGUIENTES EJERCICIOS – SÓLO CON LOS RESULTADOS DE LAS

FIGURAS

Plantee un objetivo, analice resultados, deduzca conclusiones y plantee la continuación del

trabajo.
3.

OBJETIVO

Evaluar la actividad del promotor BCRP bajo la presencia de estradiol y el inhibidor

estrogénico ICI para la identificación del efecto del estrógeno en la expresión de la proteína
BCRP.

ANÁLISIS DE RESULTADOS

A. Se evaluó la actividad del estradiol, también del inhibidor del estradiol por medio de
medición de la actividad beta galactosidasa, en relación con una medida de RLU, que indica
una cantidad de luminiscencia expresada.

Inicialmente se tiene un control, no hay presencia de estradiol (E2) ni del inhibidor del
receptor estrogénico (ICI), no se evidencia efecto de la proteína

En fold 6.2, hay presencia de E2 pero no de ICI y se comienza a ver un efecto del estradiol
en la expresión de la BCRP, el E2 alcanza su máxima expresión, lo que induce que el E2 si
genera un respuesta activadora para la codificación del gen BCRP.

Cuando hay presencia del inhibidor del receptor, disminuye el efecto del E2 en la expresión,
como muestra en las barras del fold en 4.6 y 2.2. Incluso en el fold de 1uM se ve aún más
la disminución de la expresión del estradiol llegando a niveles muy parecidos de cuando no
había presencia de estradiol.

A medida que se aumenta la concentración del inhibidor, la expresión comienza a disminuir,

indicando que el inhibidor efectivamente ayuda a bloquear la expresión.

Se puede observar que a medida que disminuye el fold, se inactiva la expresión

Se inhibe la unión a ese receptor por lo que se disminuye la expresión de BCRP

B. Se evaluó la actividad de expresión del estradiol con respecto al control que es el

solvente de etanol, con el fin de verificar que el efecto efectivamente sea producido por el
estradiol y no por una contribución del solvente.
En esta gráfica se trata de un control, donde se evaluó el efecto del solvente y del estradiol.
Se comprobó que no hay efecto proveniente del solvente, por el contrario, es el E2 el que
muestra todo el efecto producido.

C. Se trató de identificar la localización de los elementos respuesta a las hormona

En 6.1 Fold se tiene el promotor completo, en la posición -1285/362 mostrando la expresión

más alta de estradiol. En este punto es donde hay el mayor efecto del E2 en la activación de
la expresión.

Se comienza a cortar el promotor, en un Fold de 6.6 el promotor está en una posición de

-243/362, indicando una menor respuesta a la hormona. Sin embargo, si el efecto mayor
estuviese totalmente en esa posición se esperaría que tuviera una mayor actividad o
expresión, casi igual al promotor en -1285.

En 1.4, posición -115/362, hay muy poca expresión, indicando que en ese punto no se
encuentra la región más influyente o la región principal de la expresión.

Y para el vector plásmido pGL3-Basic prácticamente no hay actividad, no hay expresión, no

hay efecto del estradiol.

D. En este punto se evaluó el Elemento Respuesta a Estrógeno (ERE), se midió la

actividad de expresión del estradiol para cada secuencia, de las cuales, algunas tenían
algún tipo de mutación. Se pretendía evaluar el efecto que tenían esas mutaciones, en esa
región del promotor.

En 5.7 se muestra la mayor actividad del estradiol con el elemento de la posición

-243/362, indicando que hay una respuesta fuerte del estradiol con esa secuencia.

En 3.8, al segmento del ERE se le hizo una mutación cambiando dos nucleótidos, lo que
resultó en una disminución de la expresión del estradiol en ese punto

En 2.8, la mutación del ERE fue el cambio de un nucleótido, disminuyendo un poco más la
expresión o la respuesta del estradiol a ese elemento en el punto -243 mutado

En 2.2, Se hicieron las dos mutaciones anteriores, tres cambios de nucleótidos, lo que
resultó en una disminución mayor. Esa mutación disminuyó notablemente el efecto del
estradiol, lo que se pensaría que no lleva a la expresión de BCRP.

En 0.6 se hizo una deleción completa del segmento de ERE dejando solo los nucleótidos, el
inicial y el final, mostrando la mayor disminución de la respuesta del estradiol a ese ERE.

CONCLUSIONES

➔ El inhibidor ICI en una concentración de 1 uM mostró los mejores resultados en

cuanto a su actividad de inhibición del estradiol.

➔ El solvente EtOH no tiene mayor efecto, el efecto en la expresión es netamente del

estradiol

➔ En la posición -1285 se encuentra la mayor respuesta al estradiol aunque en -243

todavía hay respuesta alta pero para la posición -115 ya no hay respuesta al
estradiol. Lo que indica que entre la posición -1285 y -243 se puede encontrar
localizado el elemento respuesta al estradiol específico. Y probablemente dar un
fuerte indicio de la región o del fragmento del promotor es donde se da la unión de
factores de transcripción para activar la expresión del gen.

➔ En el ERE original, sin mutación, con localización en -243/362 es donde hay mayor
respuesta de estradiol al elemento respuesta.
TRABAJOS FUTUROS

A pesar de que los resultados obtenidos al evaluar la región del promotor en -243/362
proporcionaron información valiosa y prometedora, se requiere un mayor estudio del
promotor completo, localizado en -1285/362, especialmente, sería de gran interés la región
comprendida entre -1285 y -243. Para así tener una información más concreta sobre el sitio
de la región promotora donde efectivamente se pueda disminuir o inactivar la promoción del
gen BCRP en casos de cáncer de mama. Y que sirva como pie para futuros estudios
relacionados con cáncer de mama.

4.

OBJETIVO

Evaluar la actividad regulada por dos inhibidores de la FAS (Fatty Acid Synthase) por medio
de análisis tipo Western blot, se busca inhibir la producción de las FAS ya actúan como
inductor en el oncogen Her2/neu (erbB-2) regulado por el factor de transcripción PEA3 que
contiene la capacidad de controlar la expresión, e implica supervivencia y proliferación de
las células del cáncer de mama.

Evaluar la actividad de la FAS (Fatty Acid Synthase) por medio de dos inhibidores y el
análisis de Western blot para identificar el efecto en la regulación del factor de transcripción
PEA3 y por consiguiente la expresión del oncogen Her2/neu implicado en el cáncer de
mama.

ANÁLISIS DE RESULTADOS:

A) Primera gráfica:

En este caso se tienen las células de cáncer de mama tratadas con cerulenin y se
sometieron a un análisis de Western Blot, permitiendo el estudio de la
sobreexpresión de la oncoproteína Her2.

Se evaluó la Ciclina como control o como marcador para visualizar niveles de

multiplicación celular, la cual se mostró en una concentración continua en las 24
horas de aplicación.

En segunda instancia se muestra la respuesta del factor de transcripción PEA3,

mostrando como mayor concentración en 7.5 µM y 10 µM en las últimas horas. Con
lo que se podría inducir que el factor PEA3 está regulando la expresión de Her2/neu
a partir de una concentración de 7.5 µM en ese tiempo.

El PEA3 muestra un buen comportamiento con el Cerulenin.

Segunda gráfica:
 Aquí se muestran las células tratadas con Cerulenin donde se evaluaba mediante
una RT-PCR, el efecto de los transcriptos Her2 y la GADPH, este último se tomó
como un gen de referencia.

La mayor concentración de Her2/neu se muestra al inicio donde no hay mayor

Cerulenin, se muestran las mayores concentraciones en igual medida entre 0 µM y
2.5 µM, y a partir de 5 µM disminuye notablemente hasta llegar a 10 µM donde hay
ausencia total de la expresión . Indicando que la Her2/neu se expresa mayormente
en dichas concentraciones, sin una mayor presencia de Cerulenin, lo cual, podría
sugerir que la presencia de Cerulenin regula de cierto modo la expresión de
Her2/neu, produciendo su disminución. La GADPH permite verificar que las
condiciones de expresión son normales y que el efecto que muestra la Her2/neu es
el correcto y respectivo para ella.

En resumen, el Cerulenin es un inhibidor de las FAS(Fatty Acid Synthase), que

induce a la sobreexpresión del oncogen Her2/neu (erbB-2), por medio de la técnica
RT-PCR se puede observar que coincide con los resultados, ya que al adicionar
concentraciones de 0 a 5 (µM) del primer inhibidor, se obtiene un alto resultado de
expresión de los fragmentos transcritos pertenecientes al oncogen. Sin embargo, al
adicionar una concentración de 10 (µM), la expresión del gen disminuye
significativamente.

Con este resultado se podría alcanzar a verificar la posición de algunos autores que
aseguran que la Cerulenin puede inducir apoptosis en células cancerígenas.

Según los resultados de ambas técnicas se podría concluir que el PEA3 junto con el
Cerulenin, tienen un efecto regulador en la transcripción del oncogen Her2/neu.

B) En este punto se deseaba evaluar el efecto de los inhibidores de la FAS en la

expresión del Her2/neu mediante un Western Blot, empleando los RNA de
interferencia siRNA y el inhibidor Orlistat.

Primera gráfica:

Para la FAS se observó cómo la presencia del siRNA FAS infiere la disminución de
la expresión a medida que se aumentaba la concentración, inicialmente en una
concentración de 50 nM no hay una disminución considerable sin embargo, al llegar
a una concentración de 200 nM se evidenció una mayor disminución. Estos
resultados fueron comparados con el control de siRNA. De este resultado se puede
concluir que el siRNA FAS si provee un efecto inhibidor en la expresión de Her2/neu,
mediante la inhibición de la FAS. Adicionalmente, esto permite reforzar la idea de
que la FAS está fuertemente relacionada con el Her1/neu y que puede servir como
un agente terapéutico para el cáncer de mama.

Se evaluó el efecto inhibidor sobre la proteína p185, involucrada en proceso de

expresión del oncogen Her2/neu, lo cual obtuvo como resultado, una pequeña
disminución de la expresión de la p185 muy pareja en las tres concentraciones que
se varió el siRNA FAS.
 La beta actina fue empleada como control de la expresión, indicando condiciones
normales.

Estos resultados permiten concluir que el siRNA FAS efectivamente tiene un efecto
inhibidor de la expresión de Her2/neu, un poco más notorio para la FAS que para la
p185. Induciendo que la FAS puede presentar mayor relación con el Her2/neu y en
general con toda la actividad involucrada en el desarrollo del cáncer y su rol en la
supervivencia de células tumorales. De lo que se podría sugerir en trabajos futuros
un mayor acercamiento de este, para una posible diana terapéutica en estudios de
cáncer de mama.

Segunda gráfica:

Para la p185 es notable la disminución de su expresión a medida que se aumenta la

concentración del inhibidor de FAS, Orlistat. En una concentración de 0 µM de
Orlistat, la p185 está en su máxima expresión pero a medida que se aumenta la
concentración del inhibidor, la expresión de la p185 va disminuyendo hasta llegar a
20 µM en donde la banda se ve bastante clara, indicando que hay menor expresión
de la p185 en esa concentración. Como resultado se verifica que el inhibidor de FAS,
Orlistat, a una concentración de 20 µM tiene un buen efecto inhibidor de la proteína
de expresión p185 y por ende de la expresión de la Her2/neu.

Para el factor PEA3 se evidencia que sin presencia de Orlistat no pasa nada pero a
medida que se aumenta la concentración del inhibidor, la expresión de PEA3
aumenta, indicando que tiene mayor regulación sobre el Her2/neu. Lo cual, es el
resultado esperado.

Para este caso aplica lo mismo para la beta actina.

El segundo inhibidor será el siRNA FAS, que según los resultados por medio de
Western blot, infiere una correlación positiva entre el control y el inhibidor, mostrando
una disminución mayor en la expresión de las FAS (Fatty Acid Synthase) a una
concentración de 200 (nM). También se observa una menor expresión de la p185
relacionada con el gen Her2. Además, el Orlistat a una concentración de 20 (µM)
induce en una inhibición del gen y una alta presencia del factor PEA3 que regula su
expresión.

C) Evaluación de la actividad del promotor del gen Her2/neu con el uso del gen
reportero LUC y ambos inhibidores de FAS.

Primera gráfica:

Si no hay silenciador (siRNA FAS) ni el inhibidor Orlistat, la actividad del promotor

para la Her2/neu va a estar en su mayor expresión ya que no hay nada que lo
detenga a tener mayor actividad de promotor y que se de su expresión.
 El silenciamiento por el RNA de interferencia de la FAS tiene un efecto notable en la
expresión de Her2/neu pues disminuye en un 50%, a la mitad, la actividad del
promotor para la Her2.

El inhibidor de Orlistat también mostró buen resultado al disminuir la actividad hasta

en un 60% de la actividad o expresión de la Her2/neu.

Ambos inhibidores obtuvieron buenos resultados disminuyendo la expresión de

Her2/neu, confirmando los resultados de las gráficas anteriores. Esto permite
proponer para trabajos futuros estudios más profundos sobre el papel de PEA3, su
actividad y su efecto en la regulación de la sobreexpresión del oncogen Her2/neu.

Cabe resaltar que la cantidad empleada de siRNA (0.02 µM) comparada con la de
Orlistat (10 µM) es bastante menor y sus resultados siendo igual o cercanamente
buenos al Orlistat.

Gráfica derecha:

Se hace una mutación en la secuencia contenida en el promotor que contiene el sitio

de unión para PEA3.

Evaluando el promotor del Her2/neu mutado, el efecto cambia notablemente, ya que

solo con la mutación, la actividad del promotor o de la expresión, llega a 30 mientras
que sin la mutación era 100, lo cual indica que esa región en el promotor es esencial
para la unión de los factores de transcripción en el momento de la expresión o de la
transcripción como tal de la Her2/neu, en este caso sería la unión para PEA3.

El uso tanto del siRNA como del Orlistat no mostraron un cambio mayor con
respecto al efecto de la mutación, ya que en los tres casos se alcanza un 30. De
igual forma, el siRNA y el Orlistat actúan mejor para el promotor mutado que en
condiciones normales.

Se observó también, en la gráfica del nivel de expresión del gen reportero un alto
nivel de actividad del gen Her2 a nivel del control, sin embargo, en el primer gen, el
Orlistat inhibe mayormente la expresión del oncogen a menor comparación de el
siRNA FAS, aunque esta diferencia no es muy significativa respecto al control. En el
gen modificado con los nucleótidos se pueden despreciar las diferencias entre la
modificación y los inhibidores, ya que la mutación implica una disminución
significativa en la expresión del gen Her2.

CONCLUSIONES

➔ Se logró evaluar el efecto de los inhibidores de FAS en la expresión de Her2/neu, al

igual que del factor de transcripción PEA3 y de la proteína p185 involucrada en el
proceso de expresión de Her2/neu. Este proceso fue acompañado de controles que
verificaron el funcionamiento normal de la expresión bajo esas condiciones.
➔ En general, los resultados obtenidos fueron positivos en cuanto a la regulación de la
expresión de Her2/neu bajo los efectos de los inhibidores empleados.
 ➔ Se obtuvo que la actividad del factor de transcripción PEA3 era más alta en
concentraciones de 7.5 µM y 10 µM de Cerulenin, al final de las 24 horas de
tratamiento.
➔ El Cerulenin a una concentración de 10 (µM) presenta control altamente significativo
sobre la expresión del oncogen Her2/neu (erbB-2) ya que tiene la capacidad de
inhibir las FAS (Fatty Acid Synthase) que actúan como inductores en la
sobreexpresión del gen Her2 asociado al cáncer de mama.
➔ Tales resultados llaman a posibles caminos donde se habla de la capacidad del
Cerulenin para inducir apoptosis en células cancerígenas y más sobre la regulación
del PEA3 teniendo efectos directos sobre la expresión de Her2/neu.
➔ Inhibición por parte del siRNA FAS y el Orlistat de la activación del promotor o de la
expresión de Her2/neu, incluso mejores resultados con la secuencia del sitio de
unión de la PEA3, mutación que a su vez mostró buenos resultados en la
disminución de expresión de Her2/neu.
➔ El resultado del siRNA FAS a 200 (nM) muestra un efecto en el control de la
expresión de las FAS (Fatty Acid Synthase) por consiguiente reduce la la actividad
de inducción en el gen Her2/neu (erbB-2).
➔ El Orlistat presenta también actividad de inhibición del gen, generando una alta
expresión en el resultado del factor de PEA3 que regula la transcripción del oncogén
y en este caso actuaría como represor silenciando el reclutamiento de la RNA
polimerasa. Este resultado es mayor a comparación con el siRNA FAS.

TRABAJOS FUTUROS

Los resultados de la investigación son favorables respecto los inhibidores del gen Her2,
relacionado con el cáncer de mama, tanto la actividad expresada por el inhibidor siRNA
FAS, actuando sobre la inhibición de las FAS, puede dar paso a conocer qué consecuencias
puede traer reducir la producción de FAS en el organismo. Además, el Orlistat inhibe la
transcripción del gen por medio de la producción de factores como PEA3, con este estudio
pueden encontrarse además relaciones entre la secuencia que reconoce el factor y su sitio
activo, para así especificar más a fondo la interacción entre el factor PEA3 y la expresión
del gen por medio de cambios o alteraciones en su secuencia de nucleótidos.

Debido a los resultados obtenidos sobre el factor de transcripción PEA3, se recomienda

profundizar su acción, participación en la regulación de la sobreexpresión del oncogen
Her2/neu, sus vías de acción, activación, relación con otros inhibidores y actores de la
expresión de Her2/neu y de otros posibles targets, entre otras aplicaciones, con el fin de un
posible tratamiento, donde se pueda aplicar una terapia más específica que permita un
mejor estudio de genes involucrados no solo en el cáncer de mama sino de muchos otros.

Adicionalmente, se podría pensar en extender este estudio a muchas otras proteínas

involucradas en la expresión del Her2/neu, no solo la p185.

Se podrían considerar otras mutaciones posibles para el promotor del oncogen Her2/neu.

Finalmente, se podría plantear un uso más profundo de la Cerulenin para evaluar a más
profundidad su capacidad de inducir apoptosis en células cancerígenas.
5.

OBJETIVOS

Evaluar la relación entre coactivador transcripcional AIB1 con los receptores esteroideos
mediante el uso de técnicas electroforéticas y de precipitación para la determinación de la
efectividad de la unión de proteínas coactivadoras con receptores nucleares en células de
cáncer de mama

Evaluar la interacción entre receptores nucleares y el coactivador CBP (CRE Binding

Protein) con el fin de encontrar la mayor actividad del coactivador para así clasificar el
mayor y menor efecto del CPB que induce a los receptores de las células cancerosas.

ANÁLISIS DE RESULTADOS

A. En las primeras columnas, 1 y 2, no se alcanza a percibir actividad, no hay reacción

de unión a la proteína.

A partir de la tercera columna, se comienzan a ver resultados. En la columna 4 se

logra evidenciar una mayor interacción con el complejo ER:ERE, bajo la presencia
de rER y los extractos nucleares de las células cancerígenas MCF-7.

En la columna 5 vemos como se expresa más en el supershift en presencia de Anti

ER mAb1.

Finalmente la última columna también presentó resultados, con las bandas un poco
más claras pero con una ligera mayor expresión de unión en supershift y ER:ERE.

Segunda gráfica: Se precipitaron proteínas de unión AIB1, p300 y la CBP,

al complejo ERE, bajo un proceso de purificación, que implica de ciertos lavados de
la muestra.

Aquí evidenciamos, que la unión tanto para CBP como p300 fue la menor, casi
imposible de ser distinguida. Sin embargo, para la AIB1 y el ER pasó lo contrario,
mostraron buena unión.

B. La interacción del coactivador CBP (CRE Binding Protein) y el receptor nuclear T3R
como se esperaría, no muestra actividad B-galactosidasa en el control donde no son
adicionados. Sin embargo, la actividad B-galactosidasa aumenta significativamente y
es el mayor resultado cuando el coactivador CBP y el receptor T3R se encuentran
en complejo con la ayuda del ligando.

La actividad de expresión B-galactosidasa disminuye en relación con el segundo

receptor nuclear RXR, sin embargo la expresión puede considerarse alta.
Confirmando la relación y función entre el CPB y el receptor. En el siguiente receptor
(RAR), también existe expresión de la B-galactosidasa, afirmando la activación del
receptor por medio del coactivador CBP. Por último, el receptor nuclear ER muestra
 la menor interacción con el CBP, sin embargo la expresión de B-galactosidasa es a
su vez altamente considerable.

C. Los últimos gráficos corresponden la actividad o expresión del gen y es

despreciable, cuando se opta por la regulación por medio de un promotor de timidina
kinasa (TK), sin embargo, cuando se regula bajo un promotor mínimo con un
elemento de respuesta RARE (Elemento de Respuesta al Ácido Retinoico), puede
inferirse que la regulación es directamente proporcional a la concentración de CBP.
Además, en la gráfica alterna, se puede observar un porcentaje del 80% aprox. de
células azules expresadas relacionadas con el promotor RARE(p36 LacZ) en
presencia de Ácido Retinóico.También se observa, que la concentración de anti-CPB
es inversamente proporcional al número de células azules considerando que el
efecto de CPB es efectivo. En el promotor RARE(SV40/LacZ) muestra un porcentaje
mayor de células azules aproximadamente del 20% cuando no hay presencia de
Ácido Retinóico y las concentraciones de células azules son incluso más altas con
este promotor.

CONCLUSIONES

➔ A partir de la adición de extracción nuclear de las células cancerígenas MCF-7 se

logra evidenciar una respuesta, donde la columna 4 mostró mejor interacción para el
ER:ERE y la columna 5 para el supershift.
➔ Los resultados de precipitación mostraron que la AIB1 y ER tuvieron la mejor unión,
mientras que la CBP y el p300 fue muy leve casi nula.
➔ Los receptores nucleares (T3R, RXR, RAR, ER) presentan relación y alta expresión
en la asociación con el coactivador CBP (CRE Binding Protein).
➔ La mayor actividad de expresión entre el coactivador CBP (CRE Binding Protein) y
los receptores nucleares estará dada por el receptor T3R.
➔ La menor actividad de expresión se dio con el receptor nuclear ER, sin embargo el
resultado de B-galactosidasa es altamente considerable.

TRABAJOS FUTUROS

Los resultados de la investigación son favorables, sin embargo se pueden evaluar los
receptores nucleares en otros promotores para verificar una mayor efectividad del
tratamiento, aunque el segundo promotor mutado haya mostrado un alto porcentaje de
células azules, también podría existir la posibilidad de mutar en otra secuencia específica y
reducir la expresión de la actividad de células cancerosas asociadas al cáncer de mama y
ovario. Además, al conocer la proporción de receptores nucleares que afecta el CBP, se
podría inhibir el sitio activo de cada uno según corresponda. Se puede también evaluar
inhibidores en los receptores nucleares que fueron mayormente relacionados con en CBP
para ver cómo esta relación induce a los demás receptores nucleares que tuvieron menor
expresión.