Módulo 1.

Muestreo y examen microscópico de los alimentos

Cuando se elaboran alimentos o cuando se tiene que controlar su calidad y/o

seguridad, los análisis microbiológicos proporcionan información muy valiosa,
respecto a: la calidad de las materias primas, las condiciones sanitarias en que se
procesó el alimento, y sobre la efectividad del proceso, específicamente de los
métodos de conservación.

Como químicos sabemos que antes de proceder a un análisis es indispensable:

• tener claro el objetivo de un análisis,
• identificar los analitos adecuados y las técnicas para determinarlos, y
• planear correctamente el tipo y la forma de muestreo y de manejo de
las muestras.

Parte A.
PLANES DE MUESTREO Y CRITERIO MICROBIOLÓGICO

ICMSF es la Comisión Internacional para la Especificación Microbiológica de los

Alimentos (en inglés, International Comssion on Microbiological Specification for
Food) y forma parte de la Organización Mundial para la Salud (OMS). Está
constituida por representantes de la mayoría de los países en el mundo. ICMSF
surgió por la necesidad de regular el comercio internacional de alimentos
estableciendo límites microbiológicos, métodos de análisis y de muestreo.

Existen diversos métodos de muestreo, pero el de ICMSF está siendo adoptado

rápidamente por la industria de alimentos relacionada con el comercio internacional.

La calidad de los alimentos

Según Adams y Moss (2000), la calidad de los alimentos depende de 3 factores:

• Seguridad. Un alimento no debe contener ciertos niveles de microorganismos
patógenos o de sus toxinas que causen enfermedades cuando éste se consuma.
• Aceptabilidad. Un alimento no debe contener niveles de microorganismos tales
que lo conviertan en organolépticamente inaceptable en poco tiempo.
• Consistencia. La calidad de los alimentos debe ser consistente, es decir, no
mostrar variaciones de lote a lote, tanto desde el punto de vista de seguridad
como de aceptabilidad.

Para determinar la calidad de un alimento se debe tomar una muestra y suponer que
la calidad de esa muestra refleja la del lote del que fue tomado. La validez de esta
extrapolación dependerá de la representatividad de las muestras y de la exactitud y
precisión del análisis. De ahí la importancia de establecer un plan de muestreo
adecuado.

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Es necesario entonces contar con un criterio microbiológico para determinar si un
alimento es de buena o de mala calidad, evaluando la seguridad del alimento, el
seguimiento de buenas prácticas de manufactura, la vida de anaquel y la utilidad o
adecuabilidad de un alimento o ingrediente para cierto propósito (Smoot y Pierson,
1997).

Según la Comisión Internacional para la Especificación Microbiológica de Alimentos

(ICMSF, 2002), deben incluirse los siguientes factores en un criterio
microbiológico:
• Una descripción del alimento al que aplica el criterio, ya que al diferir en origen,
composición y procesamiento, cada alimento representa diferentes problemas de
descomposición y de seguridad.
• Una descripción de los microorganismos o toxinas capaces de causar problemas.
• Detalles de los métodos analíticos para detectar o cuantificar esos
microorganismos o toxinas.
• El número y tamaño de muestra que debe ser tomado de un lote de alimento.
• Los límites microbiológicos apropiados, de acuerdo con el alimento y el
microorganismo a analizar.

PLANES DE MUESTREO (ICMSF, 2002)

Un plan de muestreo debe incluir un procedimiento de muestreo y un criterio de

decisión.

Una muestra es un grupo de unidades que se sustraen para estimar el carácter de

una población.

La unidad de muestra es cada uno de los elementos que constituyen la muestra.

Un plan de muestreo está descrito por 2 valores: n, que es el número de unidades a

analizar y c, que es el número máximo de unidades defectuosas aceptables.

Mediante el uso de una curva de operación característica (para un par

determinado de valores n y c) se puede determinar qué tan discriminante es un plan
de muestreo. En esta curva se grafica la probabilidad de aceptación de un lote
contra la calidad real del lote (porcentaje de unidades defectuosas). Un plan de
muestreo es más estricto mientras mayor sea el número de unidades analizadas (n)
y menor el número máximo de unidades defectuosas a aceptar (c).

El riesgo del productor describe la probabilidad de que un lote aceptable sea

falsamente rechazado (1 - Pa); mientras que el riesgo del consumidor describe la
probabilidad de que un lote malo sea aceptado falsamente (Pa).

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Un lote rechazado deberá regresarse al productor, ser reprocesado, destruido o
prohibido para el consumo humano.

Para asegurar que la condición de la muestra tomada sea lo más similar a la del lote
del que se sustrajo, ésta deberá ser representativa. Para lograr lo anterior se
sugiere realizar un muestreo al azar o un muestreo estratificado, en el caso que
se esperen diferencias en la calidad del lote.

Se consideran los siguientes principios fundamentales:

• n se refiere al número de unidades que se sustraen de manera separada e
independiente.
• La sustracción de un número grande de unidades pequeñas provee mayor
protección que la del mismo peso total de muestra en menos unidades.
• La muestra real consiste de aquéllas unidades que se examinan.
• Lo relevante no es la sustracción de una fracción del lote, sino el tamaño de la
muestra tomada al azar y los criterios de aceptación y de rechazo.
• Cuando no es posible tomar una muestra al azar de todo un cargamento, sino sólo
de una sección accesible, se le llama a esta sección el marco y los resultados y
conclusiones aplicarán solamente a éste.
• Al aumentar el riesgo debe aumentar el número y el tamaño de las unidades, para
minimizar la probabilidad de aceptar un lote que debería ser rechazado.
• A menor uniformidad, será necesario sustraer un mayor número de muestras.
• Los análisis microbiológicos son laboriosos y lentos y los alimentos son
perecederos. Por estas razones existen presiones políticas o administrativas para
reducir el muestreo. Esto traerá como consecuencia el aumento en la probabilidad
de error.
• El tamaño de la muestra es crítico en situaciones de análisis de presencia o
ausencia.

MÉTODOS DE MUESTREO

Existen diferentes tipos de datos:

En el caso de los de atributos, las decisiones se basan en la presencia o ausencia
de algún microorganismo o en el resultado positivo o negativo de una prueba. En los
de medida la variable es continua, como una concentración o un número. Los de
medida pueden ser convertidos en los del tipo atributo estableciendo un valor límite.

Planes de 2 clases (Figura 1).

Son aquéllos en los que la muestra se divide en dos clases, después de analizar las
unidades:
⇒ Las unidades con las que se obtengan valores entre 0 y m se consideran
aceptables.
⇒ Las unidades con las que se obtengan valores mayores de m se consideran
defectuosas.

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Se pudo haber realizado una prueba para determinar la presencia o ausencia de un
microorganismo o una para determinar una cuenta microbiana o la concentración de
una toxina. m es un valor crítico arriba del cual la unidad analizada se considera
defectuosa.

Planes de 3 clases (Figura 2).

Son aquéllos en los que la muestra se divide en tres clases, después de analizar las
unidades:
⇒ Las unidades con las que se obtengan valores entre 0 y m se consideran
aceptables.
⇒ Las unidades con las que se obtengan valores entre m y M se consideran
marginalmente aceptables.
⇒ Las unidades con las que se obtengan valores mayores de M se consideran
defectuosas.

En ambos casos la probabilidad de aceptación dependerá de los valores n y c

seleccionados.

Las ventajas del uso de los planes de tres clases son:

• De acuerdo con la experiencia práctica, aún observando buenas prácticas de

manufactura, algunas unidades pueden resultar en el rango marginalmente
aceptable, sin causar problemas, y se pueden aceptar.
• Se afectan menos por cambios en la distribución de microorganismos dentro de un
lote, debidos a causas desconocidas.
• Permiten advertir aumentos en los riesgos, si existe una tendencia de aumento en
el número de unidades marginalmente aceptables.

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 PLAN DE MUESTREO DE DOS CLASES

n = número de unidades a analizar

c = número máximo de unidades defectuosas que se pueden aceptar

m = Cantidad que distingue aceptables de defectuosas

Aceptables Defectuosas

Figura 1 Planes de muestreo de dos clases.

PLANES DE 3 CLASES

Resultados cuantitativos
Concentraciones

m M

Aceptables Marginalmente Defectuosas

aceptables

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Figura 2 Planes de muestreo de 3 clases.

En la Figura 3 se presenta un diagrama de flujo sugerido por el ICMSF (2002) para la

selección del tipo de plan de muestreo.

Medición del microorganismo por:

Pruebas de presencia o ausencia Pruebas de

concentración
↓ ↓
Plan de dos clases Plan de tres clases
↓ ↓
Es posible aceptar la presencia de Seleccionar n y c
este microorganismo en el alimento?
↓ ↓
NO SI
c=0 c≥0
↓ ↓
Seleccionar Seleccionar
n nyc

Figura 3 Selección del tipo de plan de muestreo.

Curvas de operación

Una curva de operación (Figura 4) es la que se obtiene al graficar la probabilidad de

aceptación, con valores entre 0 y 1 y el porcentaje real de unidades defectuosas del
lote (considerando que se hubieran analizado cada una de las unidades del lote). Se
presenta en la Figura 4 la curva de operación para el plan de muestreo n = 5 c = 0;
o sea que para considerar que la calidad del lote es buena analizarse 5 unidades del
lote y no se acepta ninguna unidad defectuosa. Entonces cuando el lote no contiene
ninguna unidad defectuosa la probabilidad de aceptación es de 95% y cuando
contiene 45% de unidades defectuosas, con el plan establecido, la probabilidad de
rechazo sería de 95%.

El efecto de n y c en la rigurosidad del plan de muestreo

En la Figura 5 se presentan las curvas de operación para diversos valores de n y c.

Se presentan 4 figuras con curvas para diferentes valores de n (5, 10,15 y 20) y en
cada figura se presentan curvas de operación para diferentes valores de c. Como se
puede observar, la Pa disminuye cuando n aumenta y cuando el valor c disminuye.

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Es posible entonces, modificando los valores de n y c, diseñar planes de muestreo
tan estrictos como se requiera.

Figura 4 Curva de operación característica para el plan de muestreo n=5, c=0.

(ICMSF, 2002).

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Figura 5 Efecto de los valores n y c en la rigurosidad del plan de muestreo (ICMSF,
2002).

SELECCIÓN DEL PLAN DE MUESTREO

Para seleccionar un plan de muestreo adecuado es necesario considerar:

1. La seriedad del tipo de riesgo según el microorganismo a analizar.

2. Las condiciones a las que se expondrá el lote del alimento.

Tipo de riesgo.

El plan de muestreo deberá ser más estricto mientras mayor sea el riesgo que
implique el tipo de microorganismo a analizar. Los factores a considerar en el tipo de
riesgo son:

• Médicos y epidemiológicos, que incluyen la severidad clínica de la enfermedad

producida, su frecuencia, duración, la infectividad del microorganismo, la
posibilidad de ocurrencia del estado portador y la extensión potencial.
• Etiológicos, como la asociación inherente con riesgos severos, como ocurre en el
caso de Salmonella typhi, Vibrio cholerae, Shigella dysenteriae, Entamoeba
histolytica, Taenia solium y Taenia saginata, que sobreviven y se multiplican en el
hombre, dañan su salud, amenazan su vida y presentan dosis infectivas
pequeñas, o como Clostridium botulinum, que produce una toxina fatal.

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• Factores clínicos. Se deberán tomar en cuenta las altas tasas de mortalidad
ocasionadas por enfermedades como la disentería y el botulismo, las secuelas
severas de la acción de Streptococcus beta-hemolítico, la convalescencia larga de
enfermedades como la fiebre tifoidea, la paratifoidea, la brucelosis y la
vulnerabilidad de niños, ancianos y enfermos.
• Factores epidemiológicos. La propensidad de ciertos tipos de microorganismos
patógenos de encontrarse distribuidos ampliamente en el reino animal, las
costumbres locales, los estándares de higiene, la asociación entre ciertos tipos de
patógenos con ciertos alimentos, las costumbres dietéticas y de la preparación de
los alimentos.

Se clasifica entonces a los microorganismos o grupos de microorganismos de

acuerdo al tipo de riesgo que representan en:

Sin riesgo a la salud. Se incluye aquí a los grupos microbianos responsables de la

descomposición de alimentos, que disminuyen su aceptabilidad, su vida de anaquel,
pero que como grupo de microorganismos no se considera que causen daño a la
salud.

Riesgo indirecto. Se considera a los microorganismos indicadores, como los

microorganismos mesófilos aerobios, los coliformes totales y fecales, los enterococos
y Staphylococcus aureus, que indican (de manera indirecta) la posible presencia de
microorganismos patógenos.

Riesgo moderado de extensión moderada. Son microorganismos ubicuos en la

naturaleza y la enfermedad que producen está relacionada con números grandes del
patógeno.

Riesgo moderado de extensión amplia. Incluye microorganismos que presentan

riesgos epidemiológicos severos. Son diseminados por alimentos específicos, pero
pueden introducirse al alimento por contaminación ambiental o cruzada. La
enfermedad resulta de inóculos relativamente pequeños.

Riesgo severo. Los microorganismos incluidos en este grupo presentan riesgos

severos a la salud.

En la Tabla 1 se presenta una clasificación de microorganismos y parásitos de

acuerdo con los criterios anteriores. Se debe mencionar que ésta no es una
clasificación rígida, ya que se debe tomar en cuenta que lo que para un adulto
normal representa un riesgo moderado, para un adulto, un bebé o un enfermo puede
ser un riesgo severo.

Efecto de las condiciones a las que se expondrá el alimento.

Dependiendo de la naturaleza del microorganismo y de la del alimento, existen

condiciones que pueden provocar:

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• Aumento del riesgo. Éste puede ocurrir por recontaminación después del
procesamiento, uso de tal manera que permita la multiplicación de
microorganismos, cuando la cocción no ocurre inmediatamente antes del
consumo.
• El riesgo no se modifica.
• Disminución del riesgo. Por ejemplo, cuando se sabe que se aplicará al alimento
un procesamiento térmico.
Combinando estos dos aspectos, el ICMSF propone que se consideren 15 casos,
así como un plan de muestreo para cada uno (Tabla 2).

Determinación de los valores m y M.

El valor m se define como el nivel de microorganismos aceptable y obtenible con

buenas prácticas de manufactura. Puede tener un valor de cero o de ausencia de
cierto microorganismo, o el nivel de detectabilidad de una prueba, o un valor
numérico.

El valor M es un nivel de contaminación riesgoso, provocado por malas prácticas

higiénicas.

Microorganismos de descomposición: serán los niveles de microorganismos que

producen una descomposición detectable (olor o sabor) o una vida de anaquel
inaceptablemente corta.

Indicadores de sanidad: niveles que indican una condición de sanidad inaceptable.

Microorganismos que presentan un riesgo a la salud: los niveles de

microorganismos (o concentración de toxinas) que producen enfermedades.

Tabla 1 Agrupación de microorganismos y de parásitos de acuerdo al tipo de

severidad del riesgo (Smoot y Pierson, 1997).

Tipo de riesgo Organismo

Riesgo severo Clostridium botulinum tipos A, B, E y F
Shigella dysenteriae
Salmonella typhi serotipos paratyphi A y
B
Escherichia coli enterohemorrágica
virus de la hepatitis A y E
Brucella abortus, Brucella suis
Vibrio cholerae 01
Vibrio vulnificus
Taenia solium

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Riesgo moderado de extensión Listeria monocytogenes
potencialmente amplia Salmonella spp.
Shigella spp.
otras cepas enterovirulentas de E. coli
Streptococcus pyogenes
Rotavirus
Virus del grupo Norwalk
Entamoeba histolytica
Diphyllobotrium latum
Ascaris lumbricoides
Criptosporidium parvum
Riesgo moderado de extensión limitada Bacillus cereus
Campylobacter jejuni
Clostridium perfringens
Staphylococcus aureus
Vibrio cholerae no 01
Vibrio parahaemolyticus
Yersinia enterocolitica
Giardia lamblia
Taenia saginata

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Tabla 2 Planes de muestreo sugeridos por el ICMSF (2002) para las diferentes
combinaciones de riesgo a la salud y condiciones de uso.

Condiciones en las que se espera que el alimento sea

manejado y consumido después del muestreo
Grado de riesgo Condiciones que Condiciones que Condiciones que
reducen el riesgo no modifican el incrementan el
riesgo riesgo
Sin riesgo directo, Vida de anaquel Sin cambio Vida de anaquel
vida de anaquel, aumenta disminuye
descomposición Caso 1 Caso 2 Caso 3
3 clases 3 clases 3 clases
n = 5, c = 3 n = 5, c = 2 n = 5, c = 1
Riesgo a la salud Riesgo disminuye Riesgo no cambia Riesgo aumenta
Bajo, indirecto Caso 4 Caso 5 Caso 6
(indicadores) 3 clases 3 clases 3 clases
n = 5, c = 3 n = 5, c = 2 n = 5, c = 1
Moderado, directo, Caso 7 Caso 8 Caso 9
extensión limitada 3 clases 3 clases 3 clases
n = 5, c = 2 n = 5, c = 1 n = 10, c = 1
Moderado, directo, Caso 10 Caso 11 Caso 12
extensión amplia 2 clases 2 clases 2 clases
n = 5, c = 0 n = 10, c = 0 n = 20, c = 0
Severo, directo Caso 13 Caso 14 Caso 15
2 clases 2 clases 2 clases
n = 15, c = 0 n = 30, c = 0 n = 60, c = 0

Referencias

Adams M.R., Moss, M.O. (2000). Food Microbiology. The Royal Society of Chemistry,
Gran Bretaña.

Doyle M.P., Beuchat L.R., Montville T.J. (2001). Food Microbiology. Fundamentals
and Frontiers. ASM Press, Washington, D.C.

ICMSF (2002) Microorganisms in Foods 7. Microbiological Testing in Food Safety

Kluwer Academic/Plenum Publishers. E.U.

12
Smoot L.M., Pierson M.D. (1997) Indicator microorganisms and microbiological
criteria. En: Doyle M.P., Beuchat L.R., Montville T.J. (Eds) Food Microbiology,
Fundamentals and Frontiers. ASM Press, Washington, D.C. 66-80.

Parte B.
EXAMEN MICROSCÓPICO DEL ALIMENTO

Cuando se tiene un alimento alterado por microorganismos ó en descomposición y

cuando se sospecha que un alimento está involucrado en una ETA, es importante
hacer un examen microscópico directo del alimento o de una de las primeras
diluciones; la microbiota que se encuentra en una tinción de Gram de dicha
preparación puede orientar al analista sobre el problema, aún cuando los
microorganismos pueden no estar viables. Por ejemplo la presencia de gran
cantidad de cocos Grampositivos puede implicar la presencia de toxina
estafilocóccica, aún si los cultivos resultan negativos, ya que el calentamiento puede
destruir a la bacteria pero no a la toxina.

Si se encuentran cantidades importantes de bacilos Grampositivos esporulados,

conviene considerar el manejo que ha tenido el alimento (refrigeración, tratamiento
térmico, condiciones aeróbicas o anaeróbicas) y relacionarlas con los posibles
contaminantes.

La presencia de bacilos Gramnegativos se debe relacionar con los síntomas y

periodos de incubación, para buscar alguno de los géneros posiblemente implicados:
Salmonella, Shigella, Escherichia, Yersinia, Vibrio, ó Campylobacter.

A continuación se describe el método para el examen microscópico de alimentos en

general:

Equipo
Material y muestras
Microscopio óptico
Alimento homogenizado o dilución 10-1.
Portaobjetos previamente marcados
Asa microbiológica
Reactivos
Colorantes de Gram
Metanol
Xilol (xileno ó dimetil-bencenos)
PRECAUCIÓN: Flamable, evitar exposición en embarazo

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Procedimiento

0. En esta práctica NO SE UTILIZA MECHERO por el xilol, que es muy volátil y

flamable. Aplique las muestras con pipeta Pasteur.
1. Hacer preparaciones fijas, secar al aire y fijar con metanol durante 1 a 2 minutos,
escurrir, enjuagar y secar al aire.
2. Desengrasar las muestras de alimentos (que lo requieran), sumergiendo en xilol
por 2 minutos; escurrir, lavar en metanol para eliminar el exceso de xilol, ya que
es insoluble en agua, escurrir y secar.
PRECAUCIÓN: El xileno es muy flamable y es tóxico. NO USAR MECHEROS
CUANDO SE USA XILOL. EVITAR LA INHALACIÓN. EMPLEAR LENTES DE
PROTECCIÓN. EVITAR LA EXPOSICIÓN EN EL EMBARAZO.
3. Teñir las preparaciones con el método de Gram
4. Examinar al microscopio, con 1000x y aceite de inmersión. Se deben examinar al
menos 10 campos de cada preparación, buscando los tipos predominantes de
microorganismos, en particular costridia, cocos Grampositivos y bacilos
Gramnegativos.

Para el examen microscópico de huevo congelado y en polvo, así como de leche

bronca, el método se aplica de manera cuantitativa, aplicando una cantidad
conocida de muestra en una superficie definida.

Referencias

CFSAN. 2006. Bacteriological Analytical Manual (online). USFDA. Disponible a

través de Internet en: http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-2.html

International Labour Organisation. (ILO). 2002. International Chemical Safety Cards

(ICSC). P-xylene. International Occupational Safety and Health Information Centre.
Disponible a través de Internet en:
http://www.ilo.org/public/english/protection/safework/cis/products/icsc/dtasht/_icsc00/i
csc0086.htm

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