Rosa de Bengala

Se conoce con el término brucelosis al conjunto de enfermedades ocasionadas, tanto en el

hombre como en los animales (zoonosis), tiene una sinonimia variada como: Enfermedad
de Bruce, Fiebre Malta, Fiebre Ondulante y otros; el agente causal de la enfermedad
pertenece al género Brucella.

El género Brucella está formado por bacilos gramnegativos pequeños, inmóviles y aerobios,
de crecimiento lento, se reconocen tres especies clásicas responsables de la brucelosis
humana, con especificidad de especie animal, distribución geográfica y peculiaridades
patógenas.
1. Brucella melitensis afecta fundamentalmente a cabras y ovejas, pero puede afectar
a bóvidos y cerdos. Es considerada como la de mayor patogenicidad para el hombre
ya que como sabemos este es un huésped accidental no específico sobre todo la
especie melitensis biovariedad 1 y 2.
2. Brucella abortus es el microorganismo implicado con mayor frecuencia en la
brucelosis bovina.
3. Brucella suis afecta primariamente al ganado porcino.

La brucelosis humana presenta manifestaciones clínicas muy polimorfas, siendo muchas de

ellas asintomáticas.
La brucelosis aguda típica se manifiesta como una enfermedad febril de inicio agudo, con
sudoración profusa, desproporcionada a la fiebre existente y de predominio nocturno, con
algias de localización articular (sin artritis), musculares o neurológicas. La fiebre,
sudoración y las algias constituyen la tríada clásica de la brucelosis aguda.
En el curso de la evolución pueden presentarse síntomas focales (orquiepididimitis,
sacroileítis y espondilitis, e incluso bursitis y tenosinovitis). Otras focalizaciones pueden ser
la aparición de granulomatosis hepática y la neumopatía brucelar. La afectación del
sistema nervioso central y la endocarditis son las complicaciones más graves de la
enfermedad.
En algunos pacientes, las consecuencias de la enfermedad se prolongan durante años,
dando lugar a la "brucelosis crónica", de difícil delimitación, con artralgias, impotencia
funcional musculoesquelética, parestesias y alteraciones neurovegetativas

Para el diagnóstico, se pueden emplear métodos indirectos y directos:

 Cultivo: El aislamiento de Brucella spp. constituye el método diagnóstico

definitivo. Suele obtenerse por hemocultivo o cultivo de médula ósea y, más
raramente, por cultivo de líquido cefalorraquídeo, líquido articular, exudado purulento,
etc.
Examen microscópico.
Brucella spp presenta unas características tintoriales especiales: aunque no es una
bacteria ácido-alcohol resistente, no sufre decoloración con ácidos débiles. Así
mismo, también la tinción de Gram es peculiar: si el tiempo de exposición al alcohol-
acetona es muy breve, presenta una decoloración irregular, pudiendo observarse en
la misma muestra la coexistencia de pequeños cocobacilos gramnegativos y
grampositivos.
Subcultivo y aspecto colonial.
El subcultivo del medio difásico o del frasco procedente del aparato automático, en
medio con agar-sangre o agar-chocolate, muestra el crecimiento, al cabo de 48
horas, de pequeñas colonias brillantes, de diferente tamaño y de color miel claro. Si
no se observan cuidadosamente las placas, en casos con crecimiento de escaso
número de colonias, se puede falsear erróneamente algún diagnóstico.
Tras la tinción de Gram de estas colonias para observar su aspecto característico, se
realizará la reacción de la oxidasa (positiva) y aglutinación con suero específico
frente a Brucella, suficiente para identificar el aislamiento.
 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR): Dada la
extrema sensibilidad que muestra la detección de DNA bacteriano mediante PCR en
las distintas muestras estudiadas, es muy probable que en los próximos años se
aplique la PCR a muestras de enfermos con sospecha de brucelosis, permitiendo el
 diagnóstico de la enfermedad con criterios de certeza en aquéllos casos en los que
no se da una respuesta precisa.

También llamados métodos serológicos, permiten detectar la presencia de anticuerpos

frente al antígeno específico de la Brucella, lo cual es detectable desde la segunda y
tercera semana después de la exposición; período en el cual aparecen los anticuerpos
aglutinantes frente al antígeno brucelar.
Aglutinación: En sus diferentes modalidades, es la prueba más utilizada debido a su
rapidez y sensibilidad. El aumento significativo del título de anticuerpos es la base
diagnóstica de la enfermedad.
 Seroglutinación en tubo o placa con pocillos: Enfrenta diluciones crecientes del
suero problema a una cantidad constante de B. abortus. Este antígeno reacciona
tanto con anticuerpos de esa especie como frente a los de B. melitensis y B. suis,
que son las tres especies responsables en la práctica de la totalidad de enfermos
con brucelosis.
 Prueba de Coombs: Es de gran interés para el diagnóstico de la brucelosis crónica.
Se utiliza para demostrar la presencia de anticuerpos aglutinantes y no aglutinantes,
fundamentalmente IgG. El suero de Coombs (inmunoglobulina humana) se
encargaría de facilitar la aglutinación de los anticuerpos no aglutinantes del suero
problema, fijados a la suspensión antigénica de B. abortus.
 Seroaglutinación tras tratamiento del suero con 2-mercaptoetanol: es una
modificación de la seroaglutinación en la que se usa solución salina al 0,85% con
0,1M de 2-mercaptoetanol. Este compuesto es capaz de destruir las moléculas de
IgM, perdiendo éstas su capacidad aglutinante, sin interferir con las de IgG que son
las que se cuantifican. En general, la práctica de la seroaglutinación y la prueba de
Coombs conjuntamente, permiten el diagnóstico de la mayoría de los casos. La
negatividad de ambas pruebas, salvo en los primeros días de la enfermedad excluye
la brucelosis.
 Enzimoinmunoanálisis: Podemos detectar la presencia de los anticuerpos específicos
que seleccionemos (IgG, IgM o IgA), con unos valores excelentes de sensibilidad y
especificidad. Aunque permiten conocer con una mayor precisión el perfil de las
inmunoglobulinas en el curso de la enfermedad, tampoco ofrecen la posibilidad de
establecer un criterio para discernir entre curación y evolución a cronicidad.
  Inmunofluorescencia indirecta y fijación de complemento: Presentan una mayor
complejidad técnica, por lo que no suelen utilizarse.

 Rosa de Bengala:
Principios de la prueba:
El Rosa de Bengala es una técnica de aglutinación en porta para la detección cualitativa y
semicuantitativa de anticuerpos anti-Brucela en suero humano. La suspensión bacteriana y
coloreada, es aglutinada por anticuerpos IgG o IgM presentes en el suero del paciente.
Utiliza como suspensión bacteriana, Brucella abortus, a la que se añade el colorante Rosa
de Bengala en un medio ácido tamponado. Tras la mezcla a partes iguales del antígeno
Rosa de Bengala y del suero, en caso de brucelosis aparecerán aglutinados coloreados. El
límite de sensibilidad es de 25 UI/ml.
Proporciona una aproximación diagnóstica en pocos minutos con una sensibilidad y
especificidad muy altas. Presenta elevado grado de correlación con la seroaglutinación y,
por su simplicidad, es muy útil como prueba de despistaje inicial o screening. Sus falsos
negativos se limitan a enfermos con procesos de pocos días de evolución y a algunos
casos de enfermedad de curso muy prolongado.
Reactivos:
 Brucella Rose Bengale: Antígeno Rosa de Bengala preparado a partir de un cultivo de
Brucella abortus, inactivado por calor y fenol (5%) concentrado, y resuspendido en
un medio tamponado coloreado con rosa de Bengala. Conservación entre 2 a -8° C
en la oscuridad.
 Control + (Tapón rojo) Suero animal, con un contenido de anticuerpos anti-Brucella ≥
50 UI/mL. Conservante.
 Control – (Tapón azul) Suero animal. Conservante
Material adicional
 Agitador mecánico rotatorio de velocidad regulable a 80-100 r.p.m.
 Agitador vórtex.
 Pipetas de 50 μL.
Muestra
Suero fresco. Estable 7 días a 2-8ºC o 3 meses a -20ºC.
Las muestras con restos de fibrina deben ser centrifugadas antes de la prueba. No utilizar
muestras altamente hemolizadas o lipémicas.
Procedimiento:

1. Atemperar los reactivos y las muestras a temperatura ambiente. La sensibilidad del

ensayo disminuye a temperaturas bajas.

2. Depositar 50 μL de la muestra a ensayar y una gota de cada uno de los controles

Positivo y Negativo, sobre círculos distintos de un porta.

3. Mezclar el reactivo de Rosa de Bengala vigorosamente o con el Agitador vórtex antes de

usar. Depositar una gota (50 μL) junto a cada una de las gotas anteriores.

4. Mezclar las gotas con un palillo, procurando extender la mezcla por toda la superficie
interior del círculo. Emplear palillos distintos para Cada muestra.

5. Situar el porta sobre un agitador rotatorio a 80 – 100 r.p.m. durante 4 Minutos. El

exceso de tiempo de agitación puede originar la aparición De falsos positivos.

1. Realizar diluciones dobles de la muestra en solución salina 9 g/L.

2. Proceder para cada dilución, como en la prueba cualitativa.

Lectura e interpretación
Examinar macroscópicamente la presencia o ausencia de aglutinación Inmediatamente
después de retirar el porta del agitador. La presencia de Aglutinación indica una
concentración de anticuerpos anti-Brucela igual o Superior a 25 UI/mL.
En el método semicuantitativo, se define el título como la dilución mayor Que da resultado
positivo.

Cálculos
La concentración aproximada de anticuerpos anti-Brucella en la muestra Del paciente se
obtiene de la siguiente manera:
25 x Título de anti-Brucella = UI/mL
Valores de referencia
Hasta 25 IU/mL. Es recomendable que cada laboratorio establezca sus Propios valores de
referencia
Características del método
1. Sensibilidad analítica: 25 (±5) UI/mL, en las condiciones descritas en el ensayo.
2. Efecto prozona: No se observa efecto prozona hasta valores de1000 UI/mL.
3. Sensibilidad diagnóstica: 100%
4. Especificidad diagnóstica: 98%