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Facultad Regional Resistencia

Universidad Tecnológica Nacional Biotecnología-Año de Revisión 2020

Unidad 9: Microbiología de los alimentos


9.1. Toxiinfecciones alimentarias y otros peligros transmitidos por los alimentos
9.1.1. Incidencias de las toxiinfecciones alimentarias
9.1.2. Bacterias responsables
9.1.3. Micotoxicosis
9.1.4. Virus
9.1.5. Otras toxiinfecciones
9.2. Métodos de examen microbiológico
9.2.1. La razón del examen microbiológico
9.2.2. El muestreo
9.2.2.1. Plan de muestreo
9.2.2.2. Muestra representativa
9.2.2.3. Técnicas de muestreo
9.2.2.4. Tratamiento de la muestra
9.2.2.5. Métodos de análisis
9.2.3. Ensayos microbiológicos
9.2.4. Métodos tradicionales
9.2.4.1. Recuento de microorganismos viables aerobios mesófilos
9.2.4.2. Recuento de mohos y levaduras
9.2.4.3. Recuento de bacterias entéricas indicadoras: Escherichia coli, coliformes y
Enterobacteriaceae
9.2.4.4. Streptococos del grupo D de Lancefield
9.2.4.5. Clostridium sulfitorreductores
9.2.5. Técnicas de detección rápidas
9.2.5.1. Bioluminiscencia o prueba de ATP
9.2.5.2. Técnicas microscópicas
9.2.5.3. Citometría de flujo
9.2.5.4. Métodos inmunológicos
9.2.5.5. PCR en tiempo real
9.2.5.6. Biosensores
9.3. Diseño y construcción de la fábrica (Código alimentario Argentino Cap II)
9.4. HACCP y calidad del producto (Código alimentario Argentino Cap II)
9.5. Limpieza y desinfección (Material de lectura complementario)
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9.1. Toxiinfecciones alimentarias y otros peligros transmitidos por los alimentos


Las enfermedades transmitidas por los alimentos constituyen un problema de salud pública mundial.
La Organización Mundial de la Salud (OMS) define estos procesos como enfermedades que, de
acuerdo con los conocimientos actuales, pueden ser atribuidas a un alimento específico, a una sustancia
que se ha incorporado, a su contaminación a través de los recipientes o bien durante su preparación
o distribución. De acuerdo con esta definición, se incluyen las enfermedades de origen microbiano
y las causadas por tóxicos de cualquier naturaleza (Duricha, 2002). Asimismo, existen otro tipo de
toxiinfecciones no relacionadas con microorganismos que solo serán mencionadas y no profundizadas en
esta unidad.
Los distintos tipos de intoxicaciones alimentarias pueden agruparse convenientemente, basándose en sus
agentes etiológicos, en producidas por (Forsythe y Hayes, 2007):
1- Bacterias
2- Hongos
3- Virus
4- Animales
5- Vegetales
6- Productos químicos

9.1.1. Incidencias de las toxiinfecciones alimentarias


Son muchos los países que publican estadísticas sobre intoxicaciones alimentarias. Estados Unidos lo hace
a través del CDC (Centro para el control y prevención de enfermedades), que es un organismo dependiente
del estado. Europa lo hace a través de la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) y en
Argentina a través de la ANMAT (Administración Nacional de Medicamentos, Alimentos y Tecnología
Médica), por citar algunos ejemplos. A nivel mundial la OMS redacta informes sobre las diferentes
enfermedades transmitidas por los alimentos (ETAS), el último y más actualizado hasta el momento es el
del año 2015, que corresponde a las estadísticas recolectadas a nivel mundial durante el año 2010 y se
reportan en la Tabla 9.1. Sin embargo, es un hecho reconocido que solamente una parte muy pequeña del
número total de casos, tal vez sólo un 1%, figura en las estadísticas anuales. Ello se debe a que no se
declaran. Hasta hace muy poco sólo algunos países publicaban las cifras anuales y se acepta generalmente
que estas enfermedades y en especial la salmonelosis han aumentado a nivel mundial. Según la OMS en un
infograma publicado en su página y consultado recientemente, 77 millones de personas al año enferman
por ETAs en la Región de las Américas y más de 9000 mueren. De ellas 31 millones son niños menores de
5 años, de los que mueren más de 2000. Las enfermedades diarreicas representan el 95% de las ETA en la
región y los principales agentes etiológicos son: Salmonella no tifoidea. E. coli, Campylobacter y
Norovirus.
En la Tabla 9.2 se muestra la estadística de Estados Unidos, para el año 2013, aunque está desactualizada
es importante notar que a diferencia de la tabla 9.1 reporta otros tipos de microorganismos aún más
frecuentes en alimentos, en donde la salmonelosis representa un poco más del 30% de los casos reportados
y más del 60% de las hospitalizaciones. En la tabla 9.2 se observa valores muy inferiores a los de la OMS
y se debe a que son casos reportados ante los CDC y han requerido seguimiento de esos casos. Asimismo,
es importante notar el concepto de brote, que se puede considerar como la confirmación de casos que afecta
a dos o más personas, si son de la misma casa particular, se denomina brote doméstico y si no hay conexión
entre los casos se denomina brote general (Forsythe y Hayes, 2007).
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Tabla 9.1. Incidencia de las enfermedades transmitidas por agentes etiológicos, con un
intervalo de confianza del 95%, año 2010. OMS (Havelaar et al., 2015)
Tipo de enfermedad/Agente etiológico
Cantidad de
personas Muertes % Mortalidad
afectadas
Total 600.652.361 418.608 0,07
Agentes de enfermedad diarreica 548.595.679 230.111 0,04
Virus: Norovirus 124.803.946 34.929 0,03
Bacterias 349.405.380 187.285 0,05
Campylobacter spp. 95.613.970 21.374 0,02
E. coli enteropatogénica 23.797.284 37.077 0,16
E. coli enterotoxigénica 86.502.735 26.170 0,03
E. coli productora de toxina shiga 1.176.854 128 0,01
S. enterica no tifoidea 78.707.591 59.153 0,08
Shigella spp. 51.014.050 15.156 0,03
Vibrio cholerae 763.451 24.649 3,23
Protozoos 67.182.645 5.558 0,01
Cryptosporidium spp. 8.584.805 3.759 0,04
Entamoeba histolytica 28.023.571 1.470 0,01
Giardia spp. 28.236.123 0 0,00
Agentes invasivos de enfermedades 35.770.163 117.223 0,33
infecciosas
Virus: Hepatitis A 13.709.836 27.731 0,20
Bacterias 10.342.042 85.269 0,82
Brucella spp. 393.239 1.957 0,50
Listeria monocytogenes 14.169 3.175 22,41
Mycobacterium bovis 121.268 10.545 8,70
Salmonella Paratyphi A 1.741.120 12.069 0,69
Salmonella Typhi 7.570.087 52.472 0,69
Protozoos: Toxoplasma gondii 10.280.089 684 0,01
Gusanos infecciosos 12.928.944 45.226 0,35
Céstodos 430.864 36.500 8,47
Nematodos 12.285.286 1.012 0,01
Trematodos 218.569 7.533 3,45
Químicos y toxinas 217.632 19.712 9,06
Aflatoxina 21.757 19.455 8,94
Cianuro proveniente de mandioca 1.066 227 21,29
Dioxinas 193.447 0 0,00
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Tabla 9.2. Brotes notificados de ETAs, enfermedades asociadas a brotes y hospitalizaciones, por
etiología (confirmada o sospechada) - Sistema de vigilancia de brotes de enfermedades transmitidas
por alimentos, Estados Unidos, 2013.
Número de
Número de brotes Número de Infectados hospitalizaciones
*
Agente etiológico CC CS* Total % CC CS Total % CC CS Total %
Bacterias
Salmonella 149 8 157 26 3553 40 3593 32 623 5 628 62
E. coli, productora de 29 2 31 5 409 23 432 4 137 7 144 14
toxina Shigaperfringens
Clostridium 12 15 27 4 361 240 601 5 2 1 3 0
Campylobacter 20 7 27 4 266 21 287 3 17 5 22 2
Vibrio parahaemolyticus 9 4 13 2 57 23 80 1 4 1 5 0
Staphylococcus aureus 6 4 10 2 221 42 263 2 25 2 27 3
enterotoxin
Listeria monocytogenes 6 0 6 1 34 0 34 0 30 0 30 3
Bacillus cereus 2 3 5 1 9 16 25 0 0 1 1 0
Shigella 3 1 4 1 27 4 31 0 4 0 4 0
Vibrio cholerae 1 1 2 0 3 2 5 0 3 1 4 0
Staphylococcus spp 1 1 2 0 33 5 38 0 0 0 0 0
Clostridium botulinum 0 1 1 0 0 4 4 0 0 4 4 0
E. coli, Enteroagregativa 1 0 1 0 34 0 34 0 0 0 0 0
Otras 0 1 1 0 0 3 3 0 0 0 0 0
Subtotal 239 48 287 47 5007 423 5430 49 845 27 872 86
Químicos y toxinas
Toxina escombroide / 22 3 25 4 58 10 68 1 0 1 1 0
histamina
Ciguatoxina 7 9 16 3 25 27 52 0 2 4 6 1
Veneno amnésico de 1 0 1 0 2 0 2 0 2 0 2 0
mariscos 1
Toxina de pez globo 1 0 0 2 0 2 0 2 0 2 0
Veneno paralítico de 1 0 1 0 2 0 2 0 0 0 0 0
mariscos 3
Otros 1 2 0 2 60 62 1 0 3 3 0
Subtotal 33 14 47 8 91 97 188 2 6 8 14 1
Parásitos
Cryptosporidium 3 0 3 0 29 0 29 0 4 0 4 0
Trichinella 2 0 2 0 12 0 12 0 3 0 3 0
Cyclospora 2 0 2 0 199 0 199 2 10 0 10 1
Subtotal 7 0 7 1 240 0 240 2 17 0 17 2
Virus
Norovirus 154 103 257 42 3758 1241 4999 45 24 9 33 3
Hepatitis A 4 0 4 1 172 0 172 2 73 0 73 7
Sapovirus 1 0 1 0 33 0 33 0 0 0 0 0
Rotavirus 1 0 1 0 58 0 58 1 0 0 0 0
Otros 0 1 1 0 0 16 16 0 0 0 0 0
Subtotal 0 0 0
Total 448 370 818 100 9487 3873 13360 100 974 88 1062 100
*
CC: caso confirmado, CS: caso sospechoso. Fuente: Centers for Disease Control and Prevention, 2015.
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9.1.2. Bacterias responsables

Cómo se puede observar de las estadísticas tanto de la tabla 9.1 y 9.2 es la Salmonella y Campylobacter,
las bacterias más implicadas en las ETAs. A continuación, se describen algunas consideraciones especiales,
respecto de estas y las otras bacterias más implicadas.

Salmonella
Son bacilos cortos (1-2 μm), Gram-, no esporulados y generalmente móviles con flagelo perítricos. El
género Salmonella contiene unas 2000 cepas distintas. Muchas cepas se denominan de acuerdo con el lugar
en donde se aislaron por primera vez, por ej. S. newport, S. heidelberg o atendiendo a la enfermedad que
causaban, por ej. S. typhimurium, causante del tifus en ratones. El tifus es una enfermedad transmitida por
piojos y otros artrópodos que causan fiebre y de manchas rojas sobre los brazos, espalda y tórax.
Las Salmonellas son anaeróbicas facultativas, se caracterizan por fermentar la glucosa con formación de
ácido y gas y por su incapacidad para hidrolizar la lactosa. Su temperatura óptima de crecimiento está
próxima a los 38 °C, son relativamente fotosensibles y se destruyen a 60°C en unos 15-20 minutos, siendo
incapaces de crecer por debajo de los 7 u 8 °C (Forsythe y Hayes, 2007).
La salmonela es una bacteria que puede causar una enfermedad llamada salmonelosis en los seres humanos.
Se trata de una enfermedad zoonótica, lo que significa que puede transmitirse directa o indirectamente entre
animales y seres humanos (EFSA, 2020a). Las salmonelas provocan la enfermedad cuando mueren,
después de multiplicarse en el intestino de su hospedador y de sufrir la lisis que libera una potente
endotoxina. El período de incubación, transcurrido desde la ingestión del alimento contaminado y la
aparición de los síntomas) está comprendido entre las 12 y 36 h. Los principales síntomas son: náuseas,
dolores abdominales, somnolencia, diarrea y fiebre moderada; puede producir deshidratación. El
microorganismo puede invadir el torrente sanguíneo originando septicemia. La mortalidad es baja, menos
del 1%, es más sensible en adultos mayores y niños menores de 1 año. La dosis infectiva (DI)
probablemente es 0,5x106 bacterias para desarrollar los síntomas, pero es variable, ya que depende del
alimento que acompaña y su resistencia a la acidez estomacal. La enfermedad dura hasta 7 días, pero los
síntomas pueden persistir durante semanas o meses.
La salmonelosis es la segunda enfermedad zoonótica más común tras la campilobacteriosis en la Unión
Europea (UE), y la salmonela es una causa común de los brotes de enfermedades de origen alimentario. En
UE se registran cada año más de 91.000 casos de salmonelosis. La EFSA ha calculado que la carga
económica global de la salmonelosis humana podría ascender a 3000 millones de euros al año
(EFSA,2020a).
Las carnes vacunas y aves. Se reportaron estudios en los que se encontraron que el 35% de las carnes crudas
de pollo, 45% las de pato, 79% en pollos congelados. En carnes vacunas son del 1 al 10%. Asimismo, el
tiempo desde la faena y el consumo es un factor clave. Se han reportado brotes por consumo de
ovoproductos y lácteos. La manipulación segura de la carne cruda y de otros ingredientes crudos, la cocción
a fondo y una buena higiene en la cocina pueden prevenir o reducir el riesgo que representan estos alimentos
contaminados (EFSA,2020a).

Campylobacter
Campylobacter es una bacteria que puede causar una enfermedad llamada campilobacteriosis. Con más de
246.000 casos en seres humanos al año, se trata de la enfermedad transmitida por alimentos más frecuente
en la UE. Sin embargo, se cree que el número real de casos está más cerca de los nueve millones cada año.
La EFSA estima que el costo de la campilobacteriosis en los sistemas de salud pública y la pérdida de
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productividad en la UE se sitúan en torno a los 2 400 millones de euros al año. La campilobacteriosis es


una enfermedad zoonótica, es decir, una enfermedad o infección que puede transmitirse directamente o
indirectamente entre animales y seres humanos (EFSA, 2020b).
La campilobacteriosis es la enfermedad zoonótica más comúnmente notificada en la UE, según el más
reciente informe European Union One Health 2018 sobre zoonosis publicado por la EFSA y el Centro
Europeo para la Prevención y el Control de las Enfermedades (ECDC). En 2018, los Estados miembros
notificaron 246 571 casos. La mayor incidencia se detectó en la carne de pollo (37,5 %) y la carne de pavo
(28,2 %). La mayoría de los pacientes son niños pequeños y personas mayores. Su incidencia fue alta en
parvadas de engorde (27,3%) y en carne fresca de pollos de engorde (36,7%) en Europa (EFSA, 2020b).
Hay dos especies principales causante de la enfermedad, la mayoría se debe a C. jejuni (89-93%) y en
menor medida a C. coli. Son bacilos G- delgados (0,5-0,8 x 0,2-0,5 μm). Son microaerófilos con una
temperatura óptima de 42-43 °C y no crecen a 25°C. DI: 500 bacterias, puede causar fácilmente
contaminación cruzada entre carne cruda y procesada. Produce al menos 3 toxinas. La duración de la
enfermedad dura de 2 a 14 días (Forsythe y Hayes, 2007).
Los síntomas habituales son fiebre, diarrea y calambres abdominales. La carne de ave cruda está
contaminada frecuentemente con Campylobacter, ya que esta bacteria puede vivir en el intestino de las aves
sanas. También se encuentra en los ganados porcinos y bovinos. La fuente de infección más común es
comer carne de pollo poco cocinada, o alimentos listos para el consumo que han estado en contacto con
pollo crudo. En sus evaluaciones, la EFSA ha comprobado que los pollos y la carne de pollo pueden
representar directamente entre el 20 y el 30 % de los casos en seres humanos. Estudios indican que el 74%
de los pavos, 38 % de los pollos, 23% en carne vacuna y 17% en cerdos
La manipulación segura de la carne cruda y de otros ingredientes crudos, la cocción a fondo y una buena
higiene en la cocina pueden prevenir o reducir el riesgo que representan estos alimentos contaminados.

Staphylococcus aureus
Es un bacteria pequeña (0,5-1 μm), esférica, Gram +, inmóvil que forma agrupaciones irregulares. Son
anaerobios facultativos, pero crecen mejor en presencia de aire. Temperatura óptima 37°C, soporta hasta
8°C o menos. Presenta la característica de tolerar tasas bajas de actividad de agua (0.86 mínimo) y niveles
de sal relativamente altos. Todas las cepas son coagulasa positiva, es decir que poseen una enzima que
coagula el plasma sanguíneo, pero solo el 30% de ellas produce enterotoxinas asociadas a toxiinfecciones
alimentarias. Las enterotoxinas tienen la particularidad de ser muy termorresistentes. La mayoría de ellas
soporta ebullición hasta por 30 minutos. De acuerdo con las estadísticas, es responsable del 0,5-1% de los
casos de toxiinfecciones alimentarias del Reino Unido, no obstante, es muy posible que constituya la forma
más corriente, debido a que por su naturaleza y su patogenicidad relativamente leve, pocas personas
denuncian o declaran la enfermedad. Sorpresivamente en EEUU, es el responsable de aproximadamente el
50% de los casos declarados durante muchos años, aunque más recientemente esta cifra ha caído al 10%
aproximadamente (Forsythe y Hayes, 2007).
Después de ingerido el alimento contaminado, los síntomas aparecen rápidamente, entre 1-6 horas. El
síntomas más dominante y grave es el vómito con nauseas, seguido por cólicos y diarrea. Los síntomas
duran 1 a 2 días y la mortalidad es normalmente baja. Se necesitan muchas células para causar la infección,
pero se desconoce la DI. Se han sugerido 1x106 células/g, en menores puede ser muy baja.
La fuente principal probablemente sea el organismo humano, siendo el principal reservorio la nariz. Entre
el 30 y 40% de las personas sanas albergan el microorganismo en la nariz, manos y otras partes del cuerpo.
Muchas lesiones, como granos, cortes y escoriaciones infectadas son fuente abundante, como así también
el pelo. Los animales, como las vacas, pueden presentar mastitis y propagar la enfermedad a la leche, como
así también las aves y ovoproductos.
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Bacillus cereus
Es un bacilo grande (3-5 μm largo y 1 μm de ancho). G+ esporulado. Las esporas son elípticas y centrales,
son poco termorresistentes y se destruyen a 100°C en 5-30 min. Es anaerobio facultativo y crece entre 10
y 48°C (óptima en 35-45°C). Produce dos clases de toxinas que dan lugar a dos tipos de toxiinfecciones
diferentes, una es termolábil y se destruye el 30 min. A 56°C, da lugar a un síndrome diarreico; la otra
soporta tratamintos de 90° a 126°C, produce síndrome vomitivo. El período de incubación dura 8-16 h. Se
encuentra corrientemente en el suelo y en el agua y puede aislarse fácilmente de gran variedad de alimentos
vegetales. Están implicados en gran variedad de alimentos, en especial los aromatizados abundantemente
con especias, que en general estas especies contienen bacilos esporulados. La gran mayoría de los brotes se
han asociado a arroz frito en restaurantes chinos y tiendas de platos precocidos.

Vibrio parahaemolyticus
El microorganismo es un bacilo corto (1,5- 2,5 μm x 0,5 μm), curvado, Gram-, móvil por un solo flagelo
polar, es anaerobio facultativo y algo halófilo 2-4% NaCl, tolerando hasta un 8% de NaCl. Crece entre 10
y 44°C, siendo óptimo su crecimiento a 37°C. Es muy termolábil y se destruye fácilmente a temperaturas
mayores a 50°C. Las cepas patógenas pueden lisar los glóbulos rojos. Los síntomas aparecen 10-18 h luego
de la ingestión del alimento contaminado, presentándose náuseas, vómitos, dolor abdominal y diarrea. La
tasa de mortalidad es muy baja, en general en ancianos y enfermos.
Se encuentra exclusivamente en ambientes marinos, se han aislado en moluscos bivalvos, crustáceos y
peces. En japón, en donde es común el consumo de pescado crudo es responsable del 60% de los casos de
toxiinfecciones.

Clostridium botulinum
Es el microorganismo causante del botulismo. Es un bacilo anaerobio obligado, móvil, Gram + y
esporulado, son bacilos grandes (4-8 μm x 0,9-1,2 μm). Se conocen 7 cepas que de denominan de la A a la
G, basándose en las toxinas que producen. Algunas de ellas producen botulismo en humanos y otras en
animales. Las exotoxinas producidas por este microorganismo son muy tóxicas para el hombre, la A que es
la más letal para el hombre, 1 g podría matar a 100 millones de personas. Las toxinas que se forman en el
alimento antes de su ingestión se absorben en el intestino delgado, se transportan por la corriente sanguínea
y finalmente se incorporar al tejido nervioso, son neurotoxinas. Sobre todo atacan a los nervios periféricos
de los músculos involuntarios del organismo. Las toxinas no son muy termorresistentes: los tipo A y B se
inactivan exponiéndolas a 80 °C durante 10 min, mientras que las E, por ejemplo, requieren 5 minutos a
60°C. La producción de toxina es inestable a un pH mayor a 7. En condiciones normales a un pH igual o
menor de 4,5 no hay crecimiento ni producción de toxina.
Los primeros síntomas se presentan a las 18-36 h, después de ingerir el alimento que contiene la toxina.
Los primeros síntomas son náuseas, vómitos y posiblemente diarrea, acompañados de fatiga, cefalea,
mareos. La muerte se produce por fallo respiratorio o cardíaco. La tasa de mortalidad es alta, en EEUU es
del 65%. El tratamiento incluye la administración de antitoxina específica, junto con técnicas de
mantenimiento vital.
Está muy difundido en el suelo (principalmente las patógenas para el hombre), se aísla fácilmente de las
aguas dulces y marinas, de sus sedimentos y del pescado.
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Listeria monocytogenes
La Listeria monocytogenes serotipo 4b es la principal cepa patógena, causante de listeriosis. Es un bacilo
anaerobio facultativo, móvil ( a 20-25°C), corto, Gram +, mide 0,5-2 μm de longitud x 0,4-0,5 μm de
diámetro. Temperatura óptima 35-37°C. Las cepas patógenas son hemolíticas. Es un patógeno leve, la
ingestión de un pequeño número de bacterias viables no produce manifestaciones clínicas en adultos sanos.
En ancianos, adultos con patologías previas y niños produce septicemia y meningitis. La mortalidad es
muy alta en niños (50%). El período de incubación es largo varía de 4 a 21 días.
Puede aislarse del suelo, agua, piensos y heces de muchos animales. La leche cruda es una fuente importante
y los quesos.

Clostridium perfringens
Es un bacilo grande (2-8 μm x 1μm), inmóvil, Gram + y esporulado, anaerobio obligado (aunque crece a
bajo niveles de oxígeno). Temp. Óptima 45°C, hay 5 tipos productores de toxina, sola la A es causante de
toxiinfecciones, mientras que la denominada C causa una enfermedad grave conocida como enteritis
necrótica. Las cepas termorresistentes A, cuyas esporas resisten la ebullición de 1 a 5 h, son las
responsables de la mayoría de los brotes. La mayoría de los síntomas aparecen luego de 6 a 22 h,
caracterizada por dolores abdominales graves y diarreas profusas: generalmente no hay nauseas, ni vómito
ni fiebre. Tasa de mortalidad baja, necesita ingerirse un número grande de células viables, más de un millón.
Crece en el suelo, agua, intestinos humanos y animal, se aisló en carnes crudas de mamíferos y aves.

Escherichia coli
Es un bacilo corto, móvil, Gram-, muy similar a Salmonella. Se diferencia porque puede hidrolizar la lactosa
y sacarosa con la producción de ácido y gas. Las cepas patógenas se dividen en 6 grupos:
E. coli enteroagregante (EAEC), causa diarrea persistente en los niños pequeños. Producen 3 tipos de
toxinas que estimulan la secreción intestinal. E. coli enteropatogénica (EPEC) causa graves diarreas en
niños pero se desconocen sus mecanismos patogénicos, se sabe que algunas producen toxinas. E. coli
enterotoxigénica (ETEC), producen diarrea en niños y adultos, producen una toxina termolábil que se
inactiva a 60°C en 30 minutos y una termoestable que resiste los 100 °C durante 15 minutos. E. coli
enteroinvasiva (EIEC) produce una toxina y frecuentemente induce enfermedades más graves como colitis
y heces sanguinolentas. E coli enterohemorrágica (EHEC). E coli O157:H7 (llamada así por sus antígenos
O- y H-), es la más conocida, su DI es de 10-100 bacterias y sus vehículos infectivos son la carne poco
cocida, productos lácteos, jugo de manzana, entre otros. Está también la E. coli Verotoxigénica (VTEC).
Los brotes se asocian, muchos de ellos a hamburguesas contaminadas.

9.1.3. Micotoxicosis

El término micotoxicosis hace referencia a un amplio grupo de intoxicaciones causadas por la inhalación,
el contacto directo o la ingestión de alimentos que han sido contaminados con micotoxinas, las cuales son
metabolitos tóxicos producidos por una gran variedad de hongos filamentosos, entre los que se destacan los
géneros Aspergillus, Fusarium, Claviceps, Penicillium y Stachybotrys.
Los primeros casos documentados de estas intoxicaciones datan de la Edad Media en Europa, en donde se
denominó a este cuadro clínico como “fuego del infierno”, debido a las alucinaciones, psicosis, delirios,
convulsiones, sensación de quemazón y necrosis distal, que producían como resultado de la ingestión de
alimentos preparados con cereales contaminados con alcaloides del cornezuelo o Claviceps puerpurea. La
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micotoxicología moderna nace en 1962 gracias al descubrimiento de las aflatoxinas, a raíz de una crisis
veterinaria que ocurrió cerca de Londres y en la que murieron alrededor de 100 000 pavos a causa de esta
micotoxina. Las micotoxinas son producidas principalmente por hongos filamentosos bajo unas
condiciones óptimas de temperatura que oscilan entre los 20-25 °C, requieren de un pH entre 4 y 8 y una
humedad relativa de 80 a 90 %. La exposición a las micotoxinas puede generar carcinogénesis,
teratogénesis, inmunosupresión y cuadros clínicos de neurotoxicidad, nefrotoxicidad, hepatotoxicidad,
mielotoxicidad, toxicidad pulmonar y endocrina; siendo los mecanismos más importantes para la aparición
de tales manifestaciones el estrés oxidativo y la genotoxicidad inducida por micotoxinas.

Micotoxicosis inducida por hongos del género Aspergillus


Aspergillus es un género de hongos filamentosos, saprofitos, pertenecientes al phylum Ascomicota. Este
moho está formado por hifas hialinas (translucidas) y tienen reproducción sexual (con formación de
ascosporas en el interior de las ascas) y reproducción asexual (con formación de conidios). El hongo es un
contaminante habitual de alimentos almacenados (granos y cereales), cuyas condiciones óptimas para la
producción de micotoxinas son 25 °C y una humedad relativa del 95 %.
Las principales toxinas producidas por este género de mohos son las aflatoxinas y las ocratoxinas, descritas
a continuación:
Aflatoxinas: son micotoxinas cancerígenas, teratogénicas (producen defecto congénico), mutagénicas, que
tienen tropismo por órganos como hígado, cerebro y riñón. Estas toxinas son producidas bajo condiciones
óptimas de temperatura y humedad por A. flavus y A. parasiticus. Se han descrito 18 tipos de esta
micotoxina donde se destacan B1, B2, G1, G2, M1, M2. El metabolito tóxico más importante de este grupo
es la aflatoxina B.
Aflatoxina B1 (AFB1): es un contaminante habitual en climas tropicales y subtropicales de alimentos
almacenados (cacahuetes, pistachos, maíz y arroz); esta micotoxina se ha descrito como un potente
carcinógeno dietario y está implicado en la etiología del carcinoma hepatocelular. Además, se ha asociado
a inmunosupresión y a graves déficits nutricionales. El mecanismo toxicológico de AFB1 (cuadro 1) está
dado por su radical epóxido, el cual interactúa con proteínas de conjugación, generando toxicidad,
inhibición en la síntesis de proteínas e inmunosupresión, además, es capaz de producir genotoxicidad e
inducir procesos cancerígenos, debido a la mutación del gen P53, donde se produce la transversión de una
guanina a tiamina en el codón 249. La intoxicación con esta toxina se denomina aflatoxicosis, en la cual se
evidencian dos formas clínicas: aguda y crónica (cuadro 1). La forma aguda está asociada a nefrotoxicidad,
cardiotoxicidad y principalmente a hepatotoxicidad, generando un cuadro caracterizado por ictericia,
vómitos, dolor abdominal e insuficiencia hepática, provocando de esta manera la muerte. La forma crónica
está relacionada con desnutrición proteica, carcinogénesis e inmunosupresión. En humanos portadores del
virus de la hepatitis B, la exposición a esta micotoxina se ha relacionado a un incremento de 60 veces el
riesgo de carcinoma hepatocelular con respecto a la población general, dado que AFB1 es 30 veces más
potente en pacientes portadores de estos virus.
Hoy en día, algunos países desarrollados tienen una legislación clara en cuanto a las concentraciones de
AFB1 permitidas en sus alimentos, la cual no puede superar las 20 partes por billón (ppb). Adicionalmente,
algunos expertos coinciden en que es fundamental trabajar en estrategias preventivas para evitar la
exposición a estas toxinas, siendo la más importante la tecnificación del sector agrícola y evitar así la
contaminación de los cereales con hongos productores de micotoxinas.
Ocratoxinas: son un grupo de metabolitos secundarios tóxicos producidos principalmente por hongos de
los géneros Aspergillus y Penicillium, los cuales son contaminantes habituales de cereales, café, pan y
alimentos de origen animal. Se han descrito cinco tipos de ocratoxinas: A, B, C, α y β, siendo la más tóxica
la ocratoxina A.
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Ocratoxina A (OTA): es una micotoxina nefrotóxica, cancerígena y mutagénica, la cual es producida


esencialmente por las especies Aspergillus ochraceus y A. nigri. OTA es soluble en disolventes orgánicos
y ligeramente soluble en agua. Es absorbida en el tracto digestivo, especialmente en el intestino delgado y
de ahí es transportada a través de la sangre, principalmente a los riñones y en una menor concentración se
deposita en el hígado, en músculos y en grasa.
Se ha demostrado que ocratoxina A es nefrotóxica, hepatotóxica, teratogénica e inmunotóxica. El
mecanismo toxicológico de ocratoxina A está mediado por el estrés oxidativo, producción de especies
reactivas de oxígeno, que inducen a la inhibición en la síntesis de proteínas, interfieren con los sistemas
metabólicos, promueven la peroxidación de lípidos de membrana, perturban la homeostasis del calcio,
inhiben la respiración mitocondrial y provocan daño del ADN. Además, puede inducir a fallos en la
apoptosis y a alteraciones en el gen P53. Por lo tanto, esta micotoxina es causante de nefrotoxicidad,
teratogénesis y se comporta como un agente promotor del cáncer renal y hepático.

Micotoxicosis inducida por hongos del género Fusarium


El género Fusarium es un grupo de hongos filamentosos con más de 100 especies descritas, las cuales están
ampliamente distribuidas en el suelo y plantas de zonas tropicales y subtropicales. Este es uno de los grupos
de mohos que tiene mayor capacidad genética para sintetizar micotoxinas bajo condiciones óptimas de
temperatura que oscilan entre los 18 a 30 °C y una humedad relativa del 88 %. Las micotoxinas producidas
del género Fusarium son capaces de inducir efectos tóxicos agudos y crónicos que suelen relacionarse con
el tipo de micotoxina, el nivel de exposición, las especies animales que se exponen y la edad de estos.
Las principales micotoxinas producidas por este género son: tricotecenas, fumonisinas y zearalelona.
Tricotecenos: son producidas por hongos fitotóxicos del género Fusarium, esencialmente por las especies:
F. tricinctum, F. nivale, F. roseum, F. graminearum, F. solani, F. culmorum y F. poae. De estas
micotoxinas se han identificado más de 200 derivados que se dividen en dos grupos (A-B), siendo las
toxinas más importantes del grupo A la toxina T2, la toxina HT-2, diacetoxiscirpenol,
monoacetoxiscirpenol, triacetoxiscirpenol y escirpentriol, y las del grupo B son la vomitoxina o
deoxinivalenol, fugarenona X, nivalenol. Estas toxinas son contaminantes habituales de cereales y pueden
generar toxicidad tanto en animales como en seres humanos.
El mecanismo de toxicidad de estas micotoxinas (cuadro 1) está mediado por su interacción con la unidad
ribosomal 60s, lo cual genera la separación de la subunidad rRNA 28s, el bloqueo de los procesos de
elongación y la activación de proteínas inactivadoras de ribosomas (RIPs), provocando de esta manera
estrés ribotóxico y daños en el rRNA, lo que provoca la inhibición del proceso de traducción y de la síntesis
de proteínas, generando de esta manera toxicidad, inhibición de la síntesis de ADN y ARN, alteración en
la división celular, en la estructura de la membrana. Además, compromete la integridad y la función de la
mitocondria.
Fumonisinas: son un grupo de micotoxinas que contaminan el maíz y son producidas principalmente por
hongos del género Fusarium. Fueron aisladas y descritas por primera vez en Sudáfrica en 1988, y de acuerdo
con la Agencia Internacional de Investigación en Cáncer (IARC, por sus siglas en inglés), desde 1993 se
encuentran catalogadas en el grupo 2B como posibles carcinógenos humanos por detrás de AFB1 que se
encuentra en el grupo 1 de esta clasificación. Existen 15 tipos de fumonisinas agrupadas en cuatro categorías
(A, B, C, P); siendo las más conocidas FB1, FB2 y FB3, de las cuales FB1 es la más tóxica y representa
aproximadamente 70 % de la fumonisina total. Fumonisina B1: Es una micotoxina sintetizada durante el
metabolismo de cepas toxigénicas de Fusarium verticilloides y F. proliferatum. Las intoxicaciones con esta
toxina se han asociado al consumo crónico de maíz y de alimentos derivados de este cereal, que están
contaminados con pequeñas concentraciones de FB1. En humanos esta toxina se ha asociado a cáncer
esofágico y defectos en el cierre del tubo neural y en animales se ha relacionado a edema pulmonar,
hepatoxicidad, neurotoxicidad y nefrotoxicidad. El mecanismo de toxicidad de FB1 consiste en bloquear la
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síntesis de esfingolípidos, los cuales son elementos esenciales en la estructura de la membrana celular,
particularmente en las células nerviosas y tienen como función controlar los mecanismos de regulación de
la célula actuando como segundos mensajeros en los procesos de crecimiento, diferenciación y muerte
celular (cuadro 1).
Esta alteración en la biosíntesis de esfingolípidos ocurre como consecuencia de la inhibición de la enzima
ceramida sintasa, lo que genera la acumulación de compuestos como son esfingonina y esfingosina, los
cuales generan neurotoxicidad, nefrotoxicidad y hepatoxicidad. El consumo de alimentos preparados con
cereales contaminados con esta micotoxina se ha asociado a intoxicaciones agudas (cuadro 1), en las cuales
se presentan manifestaciones gastrointestinales como vómitos, diarrea, dolor abdominal y deshidratación.
La toxina se ha asociado a cáncer de esófago en el sur de África, donde se ha relacionado a un bajo status
económico, además de dietas ricas en maíz y cereales; alimentos en donde se han aislado altas
concentraciones de esta micotoxina. FB1 también se ha relacionado con malformaciones congénitas, dado
que al bloquear la biosíntesis de esfingolípidos se disminuye la absorción de folato en las gestantes y ésto
se ha relacionado con defectos en el cierre del tubo neural.

Micotoxinas diversas

Alcaloides del cornezuelo: probablemente la primera micotoxina descrita fue el ergotismo, enfermedad
originada por la ingestión de centeno y con menor frecuencia otros granos de cereles infestados por el hongo
Claviceps purpurea. El tejido fúngico crece formando una masa dura, el cornezuelo, que contiene diversos
alcaloides, derivados del ácido liségico, que después de purificados se emplean con fines medicinales. Uno
de estos derivados es la dietilamina del ácido lisérgico, una droga alucinógena. Aunque el cornezuelo tiene
valor medicinal, los alcaloides no purificados son tóxicos y producen dos tipos de ergotismo, el gangrenoso
y el convulsivo. El último es el más frecuente y se caracteriza por una variedad de síntomas como vómitos,
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diarrea, hablar desordenado, ataques convulsivos, alucinaciones y delirio que en los casos graves va
seguido de muerte. Actualmente los brotes son raros.

Toxinas de arroz amarillo: los miembros del género Penicillium producen varias toxinas en los alimentos,
especialmente en el arroz. Este cereal se enmohece rápidamente en las condiciones húmedas y cálidas que
predominan en Oriente y el arroz muy contaminado con mohos adquiere color amarillo. Se conocen tres
especies de Penicillium que originan micotoxinas en el arroz y son peligrosas para la salud: P. isladicum,
causas lesiones hepáticas, P. citrinum, causa lesiones renales y P. citreoviride, causa parálisis del sistema
nervioso central. Aunque no se han descripto brotes grandes y aunque las pruebas que relacionan a los
mohos con la enfermedad son un tanto circunstanciales, la gran cantidad de arroz consumida, junto con su
frecuente contaminación, sugieren que probablemente es la causa de la enfermedad humana.

9.1.4. Virus

Los virus no se multiplican en los alimentos que por lo tanto, sólo actúan como vehículos de transmisión
de aquellos; en muchos aspectos ocurre igual que en el caso de la fiebre tifoidea y la disentería bacilar; son
muchos y diversos los virus aislados de los alimentos, pero su papel no es suficientemente conocido.
Los virus, cuando se ingieren producen infecciones que se denominan “enterovirus”. Se multiplican en el
intestino de la persona infectada que puede eliminar por las heces grandes cantidades. La primera fuente de
infección de los brotes transmitidos por los alimentos, será el propio hombre. Hay tres virus que son
importantes agentes etiológicos de infecciones humanas, que se transmiten con los alimentos: norovirus,
virus de la hepatitis infecciosa y rotavirus.
Los virus no se replican en los alimentos; en vez de ello los alimentos actúan de vectores. Ello se debe a
una contaminación primaria del alimento con aguas polucionadas, tal como ocurre con los moluscos
bivalvos, hortalizas, frutas y ensaladas. Hay también una contaminación secundaria debida a los
manipuladores de los alimentos, por ejemplo, sándwiches y ensaladas. La dosis infeciva pueden ser tan baja
como 100 partículas víricas.

9.1.5. Otras toxiinfecciones

Ciertos animales de agua dulce y marina son tóxicas para el hombre incluso cuando se consumen en estado
de frescura (toxicidad natural). Además, muchos alimentos marinos se conviertes en tóxicos, bien después
de ingerir otras formas de vida marina, que son tóxicas por si mismas, o bien como resultado de la acción
microbiana una vez muertos (toxicidad secundaria). Finalmente, un amplio rango de alimentos, que van
desde la carne de cerdo y vacuno hasta los productos de la pesca, ya que pueden estar infectados por
parásitos peligrosos para el hombre que pueden transmitirse fácilmente por ingestión del alimento
(infecciones parasitarias).
Se conocen muchos vegetales que son intrínsecamente venenosos para el hombre, pero la mayoría no se
ingieren, por lo que no serían consideradas como causantes de toxiinfecciones.
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9.2. Métodos de examen microbiológico

9.2.1. La razón del examen microbiológico

Hay una serie de razones que justifican la necesidad de analizar los alimentos para determinar cualitativa o
cuantitativamente sus microorganismos. Los principales objetivos del análisis microbiológico son asegurar:
1- Que el alimento cumple ciertas normas estatutarias
2- Que se ajusta a normas internas establecidas por la compañía procesadora y a las externas exigidas
por el comprador
3- Que las materias primas que llegan a la fábrica para ser procesadas cumplen las normas exigidas y
las pactadas por el productor
4- Que se mantienen el control del proceso y la higiene de la línea de elaboración.
Los métodos del examen microbiológico utilizados para controlar la calidad del alimento son en si mismos
muy variados y dependientes, en gran parte, del alimento que va a ser analizado y pueden dividirse de la
siguiente manera:
1- Estimación del número total de microorganismos
2- Estimación del número de microorganismos indicadores
3- Examen o estimación del número de microorganismos alterantes de los alimentos y de otros grupos
especiales
4- Examen o estimación del número de microorganismos productores de toxiinfecciones alimentarias
y de los microorganismos patógenos transportados por los alimentos
5- Análisis de los productos metabólicos de los microorganismos

9.2.2. El muestreo

9.2.2.1. Plan de muestreo


Uno de los mayores problemas del análisis microbiológico de los alimentos es determinar el número de
muestras de un lote o de un día de trabajo que deben analizarse para asegurar que el producto o material
alimenticio cumple la norma exigida. Debe existir un compromiso entre la exactitud de los resultados y la
economía del análisis. Los esquemas de muestreo, actualmente en uso, implican el análisis de 5 o 10
muestras por lote, o de la raíz cuadrada del número de envases por lote; sin embargo, podría ser excesivo
y por lo tanto el criterio de el tipo de fuente microbiana debe considerarse, es decir se tomarán mas muestras
en los casos que se sabe que son microbiológicamente peligrosos. También debe tenerse en cuenta que el
número de análisis se ve afectado por la razón o causa que lo motiva; así, se necesitan menos pruebas para
la confirmación de un estándar o norma satisfactorio que cuando el fin perseguido es la eliminación de un
producto no satisfactorio.
Cualquier esquema de muestreo debe tener una base estadística y se sugiere un análisis más profundo para
cada caso en particular. A continuación, se detallan algunos factores a considerar para tener en cuenta al
momento de diseñar un sistema de muestreo.
Se han diseñado planes de muestreo de dos y de tres clases. El plan de dos clases consta de tres parámetros,
n, c y m, en donde:
n= número de unidades de muestras del lote que se va a analizar,
c= número máximo aceptable de unidades de muestra que pueden superar el valor m. El lote se rechaza si
se supera este valor,
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m= número máximo de bacterias relevantes por g. Los valores que superan este número son marginalmente
aceptables o inaceptables.
Por ejemplo, n=10 y c=0, significa que se analizan 10 unidades de muestra buscando un patógeno específico
(ej. Salmonella). Si una unidad contiene Salmonella el lote completo es inaceptable.
El parámetro adicional en un plan de tres clases es:
M= cantidad que se utiliza para separar lo marginalmente aceptable de lo inaceptable. Los valores iguales
o mayores que M en cualquier muestra son inaceptables. Por ejemplo, un plan de muestreo para coliformes
podría ser n=5, c=2, m 3, M=20. Esto significa que 2 unidades de 5 pueden contener entre 3 y 20
coliformes. Sin embargo, si 3 unidades contienen entre 3 y 20 coliformes o 1 sola muestra contiene más de
20 el lote es inaceptable. De aquí que el plan de muestreo de 3 clases incluya una tolerancia por la
distribución al azar de los microorganismos de los alimentos.
La severidad del plan de muestreo puede decidirse utilizando el concepto de la ICMSF (1986)
(International Commission of Microbiological Specifications for Foods) basado en el peligro potencial del
alimento y en las condiciones que debe reunir antes de su consumo.

9.2.2.2. Muestra representativa


La ICMSF define “muestra es representativa” como aquélla cuyo estado es tan parecido como sea posible
a la del lote (o partida) del cual se tomó. Por tanto, es necesario la subjetividad en la toma de muestra y
asegurarse de que se toman suficientes muestras. Como mejor se realiza esto es mediante el muestreo al
azar, utilizando tablas de números aleatorios. Sin embargo, debe tenerse en cuenta el posible aumento de
microorganismos en el equipo o proceso y por lo tanto en el alimento, durante la producción de una partida;
el producto suele contener muchos menos microorganismos al comienzo que al final del trabajo de fábrica,
lo que deberá tenerse presente en cualquier esquema de muestreo. En consecuencia, puede ser ventajoso
retirar los productos a intervalos de tiempo regulares.
Otras de las dificultades del muestreo derivan de la consistencia heterogénea del producto alimenticio ya
que si el alimento no es homogéneo se requiere un muestreo más frecuente. Asimismo, cuando los
microorganismos se limitan a zonas específicas del alimento el muestreo es en ocasiones deliberadamente
desequilibrado, por ejemplo, en alimentos como la carne, el pescado y la fruta la mayoría de sus
microorganismos se localizan en las superficies externas y son ésas, por lo tanto, las que constituyen las
principales regiones de muestreo.

9.2.2.3. Técnicas de muestreo


Los alimentos líquidos no presentan problemas, ya que pueden tomarse con pipetas una vez que han sido
bien mezclados. En los alimentos sólidos se utilizan diferentes técnicas. En alimentos cuyas unidades son
relativamente manejables, como aves y pescados, la pieza entera se lava con agitación en un medio de
muestreo líquido. Se suele incluir las vísceras que es la región más propensa a estar contaminada.
Asimismo, otras técnicas como el hisopado o métodos del agar de contacto suelen utilizarse, aunque los
recuentos son menores.
En el caso de carnes, pescados y aves suele utilizarse el muestreo destructivo, en donde a través de
diferentes utensilios se toma la muestra de carne a diferentes profundidades. En el caso de carnes picadas,
y alimentos particulados es más sencillo el muestreo porque se toman pesos conocidos de muestra.

9.2.2.4. Tratamiento de la muestra


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Cuando se toma un peso conocido de la muestra, se le adiciona un diluyente estéril adecuado como solución
de salmuera diluida (0,9%) o agua peptonada al 0,1 %, luego continua un mezclado mecánico o el pasaje
por un Stomacher. El volumen de diluyente a utilizar es generalmente nueve veces mayor que el tamaño de
la muestra.

9.2.2.5. Métodos de análisis


Los métodos convencionales de detección requieren que el microorganismo forme una colonia en un medio
de cultivo. Este método, aunque no es costoso, requiere tiempo para la preparación de los medios de cultivo
y luego para procesar los resultados y registrar los datos. Asimismo, requieren de un tiempo de varios días
de incubación para obtener datos confiables, ya que luego del tratamiento de obtención de la muestra el
microorganismo puede estar subletalmente lesionado, por eso deben incorporarse cultivos de recuperación
o de enriquecimiento antes de utilizar los medios selectivos. Los límites de detección vienen determinados
por el procedimiento seguido y por la correspondiente normativa legal.
Otros métodos más modernos, llamados de recuento rápido, involucran los inmunoensayos enzimáticos
(ELISA), la impedancia microbiológica, la separación inmunomagnética, la luminiscencia y las sondas
génicas ligadas a la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Estos procedimientos separan o concentran
las células bacterianas o sus fragmentos hasta niveles detectables en una fase que no requieren crecimiento

9.2.3. Ensayos microbiológicos


Los ensayos microbiológicos utilizados en alimentos son iguales a los ensayos de recuento de otros
microorganismos y por lo tanto fueron tratados anteriormente en la unidad 4. Se sugiere repasar ese
tema en esa unidad.

9.2.4. Métodos tradicionales

Organismos indicadores
El análisis rutinario de los alimentos para poner de manifiesto un amplio rango de bacterias patógenas es
impracticable en la mayoría de los laboratorios. Por ello se ha convertido en práctica corriente investigar
en los alimentos la existencia de bacterias que indican la posibilidad de la presencia de las productoras
de toxiinfecciones alimentarias o de otras patógenas. Por esto se les denomina “microorganismos
indicadores” y se catalogan frecuentemente como de gran importancia al establecer la seguridad y calidad
microbiológica de los alimentos. Las principales bacterias empleadas como indicadores son coliformes,
enterococos y enterobacterias. En ocasiones resultan una buena guía los recuentos viables totales a 37°C,
por ejemplo, mesófilos totales, aunque su relación con la seguridad alimentaria es débil.
Algunos microbiólogos de los alimentos han modificado en los últimos años este concepto de
microorganismos indicadores, de los que postulan dos grupos diferentes:
1- Microorganismos índices: cuya presencia en los alimentos sugiere la posibilidad de que haya
bacterias patógenas, es decir, están relacionados con la seguridad sanitaria. Su presencia en un
alimento indica la posible presencia simultánea de microorganismos patógenos ecológicamente
relacionados. Así, por ejemplo, E. coli ha venido utilizándose como índice de posible presencia de
patógenos de procedencia entérica (entre ellos, Salmonela) en el agua y los alimentos
2- Microorganismos indicadores: cuya presencia está más relacionada con el estado microbiológico
general del alimento, esto es, con su calidad higiénica. Ponen de manifiesto deficiencias en la
calidad microbiológica de un determinado alimento en términos más generales. Por ejemplo,
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presencia de bacterias del grupo coliformes en la leche pasteurizada, en número que exceda a un
valor de referencia experimentalmente establecido, puede advertir diversas deficiencias de este
producto:
a) un tratamiento térmico insuficiente,
b) una contaminación posterior al tratamiento,
c) un almacenamiento del producto final a una temperatura demasiado elevada.
Aunque la idea es la distinción de estos dos grupos existen entrecruzamientos entre ambos conceptos, ya
que por ejemplo las Enterobacteriaceae, deben considerarse primariamente como microorganismos
indicadores y sin embargo, como organismos índices en ciertos alimentos en los que cabría esperar
Enterobateriaceae patógenas (por ejemplo salmonelas). Así un microorganismo podría ser índice o
indicador dependiendo el tipo de alimento y proceso.
9.2.4.1.Recuento de microorganismos viables aerobios mesófilos
No son muy buenos microorganismos indicadores, pero su uso está justificado por los siguientes
motivos:
• Recuentos altos en alimentos estables a menudo indican materias primas contaminadas o
tratamientos no satisfactorios desde el punto de vista sanitario.
• En los productos perecederos pueden indicar también condiciones inadecuadas de
tiempo/temperatura durante su almacenamiento.
• La presencia de un número elevado de bacterias aerobias mesófilas que crecen bien a temperatura
corporal o próxima a ella, significa que pueden haberse dado condiciones favorables a la
multiplicación de los microorganismos patógenos de origen humano o animal.
• Todas las bacterias patógenas conocidas vehiculadas por los alimentos son mesófilas y en algunos
casos contribuyen con su presencia a los recuentos en placa encontrados.

El recuento de microorganismos viables aerobios mesófilos tiene un valor limitado en los siguientes casos:
• En determinados tipos de alimentos con una fermentación o maduración (embutidos fermentados,
col ácida, queso y otros derivados lácteos) es natural y deseable una gran multiplicación bacteriana.
Los microorganismos impropios no pueden diferenciarse de la microflora propia o normal.
• En los alimentos tratados por el calor, la población de microorganismos viables suele ser muy baja,
aunque un examen microscópico de estos productos puede a veces poner de manifiesto la presencia
de microorganismos muertos, cuyo número indica que la materia prima estaba muy contaminada.
• Los recuentos de bacterias mesófilas no explican la vida útil en un alimento conservado en
refrigeración, ya que muchos microorganismos mesófilos no crecen a temperaturas por debajo de
los 5ºC. Para esta finalidad es preferible el recuento de bacterias viables psicrotróficas con
temperaturas de incubación entre 0 y 5 ºC durante 10 días.

9.2.4.2. Recuento de mohos y levaduras

En alimentos no ácidos que conservan la humedad, las levaduras y los mohos crecen más lentamente que
las bacterias y por ello pocas veces determinan problemas en tales alimentos.
En los alimentos ácidos y en los de baja actividad de agua, crecen con mayor rapidez que las bacterias,
determinando por ello importantes pérdidas por alteración de frutas frescas y zumos, vegetales, quesos,
alimentos en salazón, cereales y encurtidos, así como en los alimentos congelados y en los deshidratados,
cuyo almacenamiento se realiza en condiciones no adecuadas.
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9.2.4.3. Recuento de bacterias entéricas indicadoras: Escherichia coli, coliformes y


Enterobacteriaceae
La bacteria E.coli tiene como hábitat natural el tracto intestinal de hombre y animales, es indicador de
contaminación fecal. E. coli es el indicador clásico de la posible presencia de patógenos entéricos en el
agua, en los moluscos, en los productos lácteos y en otros alimentos crudos.
En el análisis de agua E. coli es el indicador clásico de la posible presencia de patógenos entéricos, cuanto
mayor es su número mayor es la contaminación; esto es así porque los microorganismos no se multiplican
en el agua y su número disminuye lentamente, a no ser que aparezca una contaminación. En alimentos la
presencia y concentración de E. coli es de menor significado y su presencia, incluso en mayor número, no
implica necesariamente una contaminación fecal intensa reciente. Su número está influenciado por muchos
factores como crecimiento actual en el alimento, equipo deficientemente limpiado o contaminación a partir
de las personas. Por lo tanto, todo lo que puede concluirse con muchos alimentos es que la contaminación
fecal, directa o indirecta, tuvo lugar en alguna fase de su obtención y que la seguridad sanitaria del alimento
es cuestionable.
Una práctica común es utilizar las pruebas para coliformes, que incluyen E. coli, en los ensayos de
“screening” o preliminares. Si de estas pruebas iniciales se deduce la posibilidad de contaminación fecal,
los coliformes y otras Enterobacteriaceae se someten a posteriores estudios para determinar si entre ellos
está presente E. coli.
El término habitual “coliformes” comprende E. coli y diversas especies pertenecientes a otros géneros de
la familia Enterobacteriaceae fermentadores de la lactosa con producción de gas a 31-37ºC. Pueden ser o
no fecales.
Los “coliformes fecales” incluyen un grupo de microorganismos seleccionados por incubación de los
inóculos procedentes de un caldo de enriquecimiento de coliformes a temperaturas superiores a las normales
(44-45ºC), dependiendo del método. Tales cultivos de enriquecimiento contienen por lo general un alto
porcentaje de E. coli y son, por ello, muy indicativos de una probable contaminación de origen fecal del
alimento.
Hay laboratorios que prefieren determinar la familia entera de las Enterobacteriaceae (es decir, todos los
tipos lactosa+ y lactosa -) por las siguientes razones:
• El recuento de coliformes puede incluir toda una serie de bacterias diferentes, según la muestra, el
medio, la temperatura de incubación y los criterios utilizados para la lectura. Esta variabilidad puede
ser la causa de discrepancias entre los datos obtenidos en laboratorios diferentes.
• En ocasiones predominan las estirpes de E. coli no fermentadoras u otras que no producen gas
aunque metabolicen la lactosa
• Una prueba sólo para las bacterias lactosa positivas puede llevar a resultados falsamente seguros en
los casos en los que predominan las lactosa negativa (ej Salmonella).
• Salmonella puede ser en los alimentos, más resistente frente a las influencias desfavorables que E.
coli y otros coliformes. De nuevo, la ausencia de estos últimos microorganismos puede llevar a
conclusiones de seguridad falsas.
Función como organismo índice: E. coli es el único microorganismo índice válido en el análisis de los
alimentos vegetales frescos. En los alimentos frescos o naturales de origen animal, la mayor parte de las
Enterobacteriaceae proceden de contaminaciones de origen fecal y su presencia en gran número puede
indicar una manipulación no higiénica y/o un almacenamiento inadecuado.
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Función como organismos indicadores: en los alimentos que han recibido un tratamiento para garantizar
su sanidad, la presencia de niveles considerables de Enterobacteriaceae o de coliformes indica:
1) Tratamiento inadecuado y/o contaminación posterior al tratamiento, más frecuentemente a partir de
materias primas, equipos sucios o manejo no higiénico.
2) Multiplicación microbiana que pudiera haber permitido el crecimiento de toda la serie de
microorganismos patógenos y toxigénicos.

9.2.4.4. Streptococos del grupo D de Lancefield


El sistema de Lancefield es un sistema de clasificación serológica de los estreptococos β hemolíticos usado
internacionalmente hoy día y desarrollado por la microbióloga estadounidense Rebecca Craighill
Lancefield. Está basado en la naturaleza antigénica de los hidratos de carbono de su pared celular.
El grupo D incluye,
-Enterococos (Strep. faecalis y Strep. faecium)
-Estreptococos menos resistentes al calor, tales como Strep. bovis y Strep. equinus
Al grupo completo se le designa con cierta imprecisión con el nombre de “estreptococos fecales”.
Se encuentran también tan ampliamente distribuidos en el medio ambiente que su significado como
indicadores de contaminación fecal está seriamente restringido.
El grupo D se considera que son resistentes
•a la desecación
•a las temperaturas elevadas y bajas
•a los detergentes y desinfectantes
Tienen un papel significativo como indicadores
• de prácticas de limpieza y desinfección deficientes en las industrias alimentarias
• por resistencia a la congelación son los indicadores preferidos de prácticas de sanitización
deficientes en las industrias de congelación de alimentos
• por resistencia al calor, pueden sobrevivir a los tratamientos térmicos que permitirían también la
supervivencia de virus en algunos alimentos pasteurizados o deshidratados

Sin embargo, su presencia guarda escasa relación con el peligro de la existencia simultánea de
microorganismos patógenos, por lo que no se los considera como microorganismos índice.

9.2.4.5.Clostridium sulfitorreductores
Este grupo se caracteriza por ser sulfitoreductores, esporulados y anaeróbicos, pueden proceder del
intestino humano o animal. Se trata de formas esporuladas, es decir, de formas de resistencia que no es
indicativo de contaminación reciente. No tienen interés para indicar contaminación fecal, pero si indican
deficiencias higiénicas por contaminación telúrica (tierra, cursos de agua). Su importancia radica en
que dentro de este grupo se encuentra el patógeno Clostridium perfringens. Para este microorganismo
se emplean técnicas de recuento en placas junto con medios selectivos. Corrientemente C botulinum no
se somete a recuento en los alimentos y las pruebas que con él se emplean implican generalmente la
detección de toxinas botulínicas en el alimento y el aislamiento seguido de la detección de sus toxinas.
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9.2.5. Técnicas de detección rápidas (Fuente: Montañez Izquierdo (2013))

En general, los métodos rápidos son métodos independientes del cultivo y representan una alternativa para
superar la dificultad de cultivar comunidades microbianas complejas (Teufel y Redl, 2006). A continuación,
se describen los más importantes.
9.2.5.1. Bioluminiscencia o prueba de ATP
El adenosin trifosfato (ATP, Adenosine Triphosphate) está presente en todas las células vivas y su cantidad
por célula es bastante constante (Ishida et al., 2002). La prueba de ATP se basa en la bioluminiscencia, que
es la propiedad que tienen algunos organismos de producir luz, específicamente en la reacción que produce
de forma natural la luciérnaga de América del Norte, Photinus pyralis. En este caso, la enzima luciferasa
utiliza la energía química contenida en la molécula de ATP para catalizar la reacción oxidativa de la
luciferina, que genera un producto inestable que se descompone y produce luz (Aycicek et al., 2006). La
emisión de luz se mide utilizando un luminómetro y se expresa en unidades relativas de luz (URL), así la
lectura es proporcional al contenido de ATP (Aycicek et al., 2006).

Es una técnica rápida, simple, que facilita su uso como prueba de campo (Vilar et al., 2008). Sin embargo,
los resultados positivos pueden indicar la presencia de ATP proveniente tanto de microorganismos así como
de materia que contiene ATP, por ejemplo, residuos de alimentos (Poulis et al., 1993; Vilar et al., 2008).
Por tanto, el resultado se refiere al estado de “higiene” de una superficie (Lelieveld et al., 2003). Además,
la técnica no es muy sensible y por consiguiente no es adecuada para medir la higiene de equipos donde se
necesita esterilidad absoluta (Mostert et al., 2005).

9.2.5.2. Técnicas microscópicas


Existen varias técnicas microscópicas: microscopía de epifluorescencia, microscopía electrónica de barrido
y transmisión, espectrofotómetro infrarroja transformada de Fourier, láser confocal de barrido y técnicas
de microscopía de fuerza atómica (Mostert et al., 2005).
La microscopía de epifluorescencia directa (DEM, Direct Epifluorescence Microscopic) se ha convertido
en la técnica de microscopía ideal para examinar especímenes biológicos, fijados o vivos, porque permite
la detección selectiva y específica de moléculas en concentraciones pequeñas (Yuste, 2005). Donde los
objetos de interés fluorescen en un fondo negro por medio de sondas fluorescentes, que permiten marcar
virtualmente cualquier aspecto de los sistemas biológicos (Lichtman y Conchello, 2005).
La fluorescencia es la propiedad que exhiben algunas moléculas, denominadas fluoróforos, que absorben
energía a una longitud de onda menor y específica que provoca alteraciones en el estado electrónico,
vibracional y rotacional, y después de cierto periodo de tiempo, emiten una porción de esta energía a una
longitud de onda mayor y específica (Herman, 1998; Lichtman y Conchello, 2005; Petty, 2007).
Los microscopios de fluorescencia deben cumplir cuatro funciones: (1) proporcionar una luz de excitación
con longitudes de onda adecuadas al espécimen; (2) separar la luz de excitación de la luz de fluorescencia
emitida; (3) colectar la mayor cantidad posible de fluorescencia emitida por los fluoróforos; y (4) permitir
la observación de los detalles finos de la muestra (Herman, 1998). En el microscopio de epifluorescencia
el objetivo no sólo tiene como función enfocar y amplificar la muestra, sino que sirve como un condensador
que ilumina la muestra.
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La ventaja de esta técnica es que nos brinda la posibilidad de observar a los microorganismos en
interacción con el sustrato y la forma en que se encuentran distribuidos y/o agrupados, por tanto puede ser
útil para una evaluación rápida de la higiene de una superficie (Holah et al., 1989). Sin embargo, presenta
como desventaja el bajo límite de detección que posee, y por tanto resulta muy tedioso detectar menos de
103 células cm-2 en una muestra (Joux y Lebaron, 2000).

9.2.5.3. Citometría de flujo


Es un proceso que realiza medidas de las características físicas o químicas de una sola célula u otras
partículas biológicas, o no biológicas, de aproximadamente el mismo tamaño, mientras estas pasan en una
corriente de flujo (Shapiro, 2005). Con esta técnica las células son forzadas a moverse rápidamente en una
sola fila a través de una fuente de luz con alto poder, midiendo la viabilidad de un número de organismos
estadísticamente significativo (5 000 - 25 000 células por muestra) (Mostert et al., 2005).
La citometría de flujo usada con sondas fluorescentes permite medir propiedades funcionales y
estructurales de células individuales en una población. Las células son marcadas con fluorocromos
específicos o con conjugados fluorescentes que se unen con alta especificidad a un constituyente celular
particular, es posible medir una amplia variedad de constituyentes celulares como proteínas, carbohidratos,
ADN, ácido ribonucleico (ARN) y enzimas (Ivnitski et al., 1999). Las ventajas de la citometría de flujo son
la exactitud, velocidad, sensibilidad y reproducibilidad (Mostert et al., 2005).

9.2.5.4. Métodos inmunológicos


El Ensayo por Inmunoabsorción Ligado a Enzima (ELISA, Enzyme-linked immunosorbent assay) es la
fuente de inspiración para muchas aplicaciones de biosensores. El tipo más común es ELISA tipo sándwich
(Lazcka et al., 2007). En este sistema el anticuerpo primario es inmovilizado sobre un soporte sólido, la
muestra con el antígeno es adicionada a este soporte. Posterior a un paso de incubación, el material no unido
se enjuaga y se agrega el anticuerpo secundario conjugado con una enzima para formar un “sándwich” del
antígeno entre las dos moléculas de anticuerpos (de Boer y Beumer, 1999; Gracias y McKillip, 2004). La
cantidad de señal emitida se relaciona con la cantidad de antígeno diana en la muestra. Si la enzima está
presente, el sustrato apropiado será modificado, dando lugar a un producto que puede ser detectado por
colorimetría o técnicas fluorométricas (de Boer y Beumer, 1999). Los métodos ELISA tienen un límite de
detección típico de 104 UFC ml-1, por consiguiente la detección directa de los microorganismos no es
posible y necesita de un enriquecimiento previo con un mínimo de 16 - 24 h de incubación (de Boer y
Beumer, 1999; Gracias y McKillip, 2004).
Las técnicas de anticuerpos son fácilmente automatizadas y rentables. Un ejemplo es el sistema de Ensayo
de Inmuno Diagnóstico Vitek (VIDAS, Vitek Immuno Diagnostic Assay System) basado en el ensayo
fluorescente ligado a enzimas automatizado (ELFA, automated Enzyme-Linked Fluorescent Assay)
(Lazcka et al., 2007). Otro ejemplo es la técnica de separación inmunomagnética (IMS, Inmunomagnetic
Separation), que utiliza perlas de hierro recubiertas de anticuerpos, así el microorganismo en suspensión se
une a las perlas inmunomagnéticas, a continuación, el material es expuesto a un campo magnético que
básicamente extrae las bacterias de la suspensión, concentrando la cantidad de microorganismos de
la muestra para su posterior detección o cuantificación (de Boer y Beumer, 1999; Nugen y Baeumner,
2008). La IMS puede ser combinada con casi cualquier método de detección como el cultivo o la reacción
en cadena de la polimerasa (PCR, Polymerase Chain Reaction) (Gracias y McKillip, 2004; Nugen y
Baeumner, 2008).
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9.2.5.5. PCR en tiempo real


Los formatos de las sondas de detección adaptados a los instrumentos de tiempo real, ha sido gracias a la
construcción de sondas de oligonucleótidos con doble marcado, basadas en el principio de Transferencia
de Energía de Resonancia fluorescente (FRET, Fluorescent Resonance Energy Transfer), es decir, que
emiten una señal de fluorescencia sólo cuando están separadas (Giulietti et al., 2001). Estas sondas incluyen
los sistemas TaqMan y otros más sofisticados como Molecular Beacons, scropions y sondas de hibridación
que no necesitan hidrólisis por la actividad nucleasa de la Taq (Giulietti et al., 2001; Reischl et al., 2002).
Por otro lado, el uso de colorantes de ADN bicatenario como SYBR Green, también resulta muy útil en la
detección de productos de PCR, sin la necesidad de usar una sonda cara y selectiva (Giulietti et al., 2001).

Figura 9.1. Principio del sistema TaqMan. 1) Desnaturalización; 2) Hibridación; 3) Amplificación y emisión de fluorescencia;
4) Dos cadenas nuevas de ADN. Sonda TaqMan: emisor de fluorescencia (F, reporter) y extintor de fluorescencia (Q,
quencher).
El sistema de PCR TaqMan utiliza una sonda no amplificable por su extremo 3' para asegurar que no
actúe como cebador (Arya et al., 2005). La sonda contiene un emisor de fluorescencia (F, reporter)
en su extremo 5' y un extintor de fluorescencia (Q, quencher) en su extremo 3' (Reischl et al., 2002). Si la
secuencia diana está presente, después de la desnaturalización de la doble hebra de ADN, la sonda TaqMan
y los cebadores se hibridan a una de las hebras simples de ADN (Wilhelm y Pingoud, 2003; Arya et al.,
2005). En esta fase con la sonda aún intacta, la fluorescencia de emisión es absorbida por el quencher,
principio FRET (Heid et al., 1996). Posteriormente, ocurre la extensión de los cebadores hibridados por
medio de la Taq polimerasa (Saiki et al., 1988). La Taq polimerasa hidroliza la sonda y separa el reporter
del quencher, dando como resultado un aumento de la fluorescencia (Giulietti et al., 2001) (Figura 5).
El aumento de la fluorescencia de emisión durante la reacción de PCR es detectada en tiempo real por el
termociclador y con los datos de fluorescencia obtenidos el programa construye el gráfico de amplificación
(Figura 6) (Arya et al., 2005). La curva de amplificación consta de tres fases distintas: 1) una fase inicial
lag en donde la acumulación de producto no puede ser medida, 2) una fase exponencial y 3) una fase
estacionaria (Wilhelm y Pingoud, 2003). El punto en donde ocurre el primer incremento significativo de
fluorescencia que excede el ruido de fondo, se define como ciclo umbral (Ct, threshold cycle) (Heid et al.,
1996). El valor de Ct sirve para determinar la presencia del ADN diana así como para estimar con gran
precisión su cantidad inicial (Wilhelm y Pingoud, 2003). A mayor presencia de ADN diana al inicio de la
reacción, menor número de ciclos serán necesarios para alcanzar el Ct (Arya et al., 2005). Además, la PCR
en tiempo real (RTi-PCR, Real-Time PCR) incluye un control interno de amplificación (IAC, Internal
Amplification Control) que permite detectar la presencia de inhibición durante la amplificación previendo
resultados falsos negativos. El IAC es amplificado al mismo tiempo que el gen diana pero es detectado por
un segundo fluoróforo. Si el IAC y ADN diana tienen valores de Ct igual a cero, indica que un inhibidor
estuvo presente y el ensayo de PCR necesita ser repetido (Uyttendaele et al., 2003).
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La RTi-PCR permite la obtención de resultados en pocas horas, manteniendo un alto nivel de sensibilidad
y especificidad (Lazcka et al., 2007; Nugen y Baeumner, 2008). No obstante, una desventaja principal es
que puede producir inhibición de la enzima polimerasa por contaminantes de la muestra, y se pueden
obtener falsos positivos como resultado de la detección de ácidos nucleicos libres o microorganismos no
viables. Para superar este inconveniente se incorpora un paso de enriquecimiento para reducir los
contaminantes. La PCR se puede acoplar con otros métodos, por ejemplo PCR unido a biosensor o IMS
(Nugen y Baeumner, 2008; Nayak et al., 2009).

9.2.5.6.Biosensores
El uso de biosensores nos proporciona una herramienta portátil, rápida, sensible y con inmediata
interpretación de los resultados “sobre el terreno”. Además, de la posibilidad de detectar la presencia y
cantidad de microorganismos en cualquier ambiente (Ivnitski et al., 1999; Nayak et al., 2009).
Un biosensor básico incluye un sustrato (silicio, vidrio o polímeros) recubierto por una capa conductora
(polisilicio, dióxido de silicio, nitrito de silicio, metal y óxidos metálicos) (Nayak et al., 2009).
Generalmente, para la detección bacteriana, incluye un componente de reconocimiento biológico
como enzimas, ácidos nucleicos o anticuerpos que están íntimamente asociados o integrados a un
transductor fisicoquímico o microsistema de transducción, que puede ser óptico, electroquímico,
termoquímico, piezoeléctrico, magnético o micromecánico (Ivnitski et al., 1999; Lazcka et al., 2007).
Cuando se usan enzimas, tienden a funcionar como marcadores en lugar de elementos reales de
reconocimiento bacteriano. Pueden ser usadas para marcar anticuerpos o sondas de ADN, de la misma
manera como en la prueba de ELISA. Sin embargo, el uso de anticuerpos está más difundido que el uso de
sondas de ADN. Los anticuerpos pueden ser policlonales, monoclonales o recombinantes, dependiendo de
sus propiedades selectivas y la forma en que son sintetizados (Lazcka et al., 2007). Para la detección de
patógenos de origen alimentario, se han desarrollado diversos biosensores con un rango y límite de
detección alrededor de 1,0 x 103 células ml-1 para E. coli, E. coli O157:H7, Salmonella, S. Typhimurium,
Legionella pneumophila, C. jejuni y Listeria. Sin embargo, también se ha logrado conseguir una
sensibilidad de 30 UFC de E. coli ml-1 de agua. El tiempo de detección de los biosensores es variable, por
ejemplo desde 15 minutos para la detección Listeria, o menos de una hora en la detección de E. coli (Nugen
y Baeumner, 2008; Nayak et al., 2009).

Referencias:
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