FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA DE TECNOLOGÍA MÉDICA

ACTUALIZACIÓN MÉTODOS MOLECULARES DE DIAGNÓSTICO VIRAL

2021

MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO

DE LICENCIADO EN TECNOLOGÍA MÉDICA

AUTOR: DANIEL FUENTEALBA REVECO

PROFESOR GUÍA: Dr. ORLANDO ALVA GÁLVEZ

TALCA-CHILE
2021
 CONSTANCIA

La Dirección del Sistema de Bibliotecas a través de su unidad de procesos técnicos certifica que el

autor del siguiente trabajo de titulación ha firmado su autorización para la reproducción en forma

total o parcial e ilimitada del mismo.

Talca, 2022

Vicerrectoría Académica | Dirección de Bibliotecas

1
 TABLA DE CONTENIDOS

RESUMEN 6
INTRODUCCIÓN 8
OBJETIVOS 10
Objetivos generales 10
Objetivos específicos 10
METODOLOGÍA DE BÚSQUEDA 11
MARCO TEÓRICO 12
1. INTRODUCCIÓN A LOS VIRUS 12
1.1 Historia del descubrimiento viral 12
1.2 Teorías de origen 13
1.3 Características 15
1.4 Clasificación 23
1.5 Rol en enfermedades 26
2. MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO DE PATÓGENOS 28
2.1 Cultivo celular 28
2.2 Histología 30
2.3 Serología 31
2.4 Moleculares 33
2.5 Proteómicas 34
3.DIAGNÓSTICO DE INFECCIÓN VIRAL 36

3.1 Generalidades 35

3.2 Métodos de diagnóstico indirectos 41

3.3 Métodos directos 42

3.4 Elección prueba diagnóstica 44

2
4. MÉTODOS MOLECULARES DE DIAGNÓSTICO VIRAL 46
4.1 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 46

4.2. Secuenciación masiva. 52

4.3. Citometría de flujo 60

CONCLUSIONES 67

BIBLIOGRAFÍA 69

3
 INDICE DE FIGURAS

Figura 1: Componentes estructurales básicos de los virus. 16

Figura 2: Estructura morfológica virus icosaédricos. 17
Figura 3: Estructura morfológica virus helicoidales. 18
Figura 4: Estructura morfológica virus complejo o mixto. 19
Figura 5: Replicación viral por diferentes mecanismos. 22
Figura 6: Esquema de las principales familias de virus. 26
Figura 7: Representación de lugar anatómico en donde se realiza la muestra 38
para el diagnóstico viral.
Figura 8: Etapas básicas de PCR. 47
Figura 9: Representación funcionamiento PCR transcriptasa reversa. 50
Figura 10. Tecnología de secuenciación de DNA de primera generación. 55
Figura 11. Tecnología de secuenciación de DNA de segunda generación. 57
PCR en emulsión (a), PCR puente (b).
Figura 12. Representación del sistema óptico de un citómetro de flujo 62
tradicional

4
 INDICE DE TABLAS

Tabla 1: Ventajas y desventajas generales del cultivo celular 29

Tabla 2. Tinción usada en distintas técnicas histológicas según grupo de 31
agente infeccioso
Tabla 3. Principales agentes virales, su transporte y sobrevida 38
Tabla 4. Procedimiento de bioseguridad a realizar según tipo de muestra 39
Tabla 5. Procedimiento de bioseguridad a realizar según el manejo de la 40
muestra
Tabla 6. Parámetros evaluados en la evaluación de un método de diagnóstico 44
y su definición
Tabla 7: Etapas de la secuenciación en general con su definición 55
correspondiente
Tabla 8: Sistemas que se encuentran en un citómetro de flujo tradicional con 61
su respectiva descripción
Tabla 9: Descripción de los distintos gráficos que se pueden encontrar como 63
resultado en la técnica de citometría de flujo
Tabla 10: Ventajas y desventajas de los métodos de diagnóstico molecular 65
descritos en la revisión

5
 RESUMEN

Los virus son agentes microscópicos con actividad parasitaria, es decir no pueden
vivir sin un hospedero, donde se han encontrado más de 2000 especies hasta la actualidad,
aumentando constantemente. Estos se componen principalmente de material genético
envuelto en proteínas que forman la cápside, donde además algunos pueden estar compuestos
por estructuras más complejas. Su rol en enfermedades tanto en humanos como en otras
especies y en distintas áreas de la ciencia ha permitido una constante evolución de los
métodos de diagnóstico. La detección y cuantificación específica de material genético en una
muestra biológica ha mostrado un significativo impacto en todas las áreas de la salud, entre
ellas el diagnóstico de enfermedades infecciosas.

Actualmente existen diversas técnicas que permiten detectar agentes virales

clasificándose como métodos indirectos donde se encuentran técnicas inmunológicas por
detección de anticuerpos como el caso de los test rápidos para la detección del SARS-CoV-
2 y métodos directos como la inmunofluorescencia directa, microscopia electrónica,
espectrometría de masas, técnicas inmunológicas por detección de antígenos y técnicas de
biología molecular tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), con todas sus
variantes como la RT-PCR, q-PCR, PCR in situ, otras, donde la RT-PCR en tiempo real ha
sido clave en el diagnóstico viral del SARS-CoV-2. Estas técnicas se caracterizan por tener
un alto grado de sensibilidad frente a distintos virus responsables de múltiples patologías en
el ser humano y otros seres vivos, sin embargo, presenta desventajas entre ella su elevado
costo y el requerimiento de personal capacitado para su funcionamiento. Durante los años se
han mejorado estas técnicas, siendo más económicas, más rápidas, y más fiables en términos
de sensibilidad y especifidad.

A nivel mundial los virus provocan millones de muertes de personas en el mundo

producto de enfermedades como la hepatitis o el VIH. Hoy en día se vive una pandemia
producto del virus SARS-CoV-2 en el cual es de suma importancia su diagnóstico temprano
y oportuno, por ello, los métodos moleculares juegan un rol importante en el diagnóstico

6
clínico de infecciones virales ya que supera en términos de sensibilidad y especifidad a los
métodos clásicos de diagnóstico.

Palabras claves: Virus, biología molecular, diagnóstico viral, diagnóstico molecular.

7
 INTRODUCCIÓN

Los virus han convivido con los humanos durante toda su existencia, su rol en el
ecosistema se fundamenta en su función regulatoria de la vida principalmente por su acción
parasitaria, además de su capacidad de ejecutar la transferencia horizontal de genes entre
bacterias. Debido a sus ciclos replicativos, estos pueden provocar distintas patologías y
enfermedades e incluso en algunos casos provoca la muerte del individuo infectado, siendo
este de origen animal, vegetal o bacteriano.

Hoy en día se han investigado y reconocido miles de tipos de virus existentes en

nuestro planeta, donde la gran minoría afectan al ser humano, pero que sin embargo, pueden
ser agentes causales desde infecciones leves, como los resfriados comunes producto
frecuentemente de agentes virales provenientes del género Rhinovirus, hasta grandes
complicaciones, como la fiebre hemorrágica producida por el virus del ébola o la pandemia
actualmente conocida producto del virus SARS-CoV-2 que produce la enfermedad COVID-
19. Gracias a los avances científicos se han estudiado de mejor forma a estos agentes
parasitarios con el objetivo de no sólo combatir distintas infecciones producidas de forma
natural por algunos virus como el VIH, virus la influenza H1N1 o los distintos virus que
pueden provocar hepatitis, donde cabe destacar que generan un gran impacto en la salud
pública y privada, sino que también, los virus han ido utilizados como tratamiento para
distintas patologías incluidas algunos tipos de cáncer o infecciones bacterianas, a través de
distintos métodos clínicos que los incluyen, entre ellos la fagoterapia.

El diagnóstico preciso de infecciones virales mejora la capacidad del médico tratante

para tomar decisiones sobre el tratamiento apropiado de los pacientes, también evaluar la
progresión de la enfermedad y prevenir el uso indebido de antibióticos. Además, permite la
implementación del control de infecciones y el seguimiento del éxito de los tratamientos
antivirales que pueden afectar el pronóstico de los pacientes. Los datos epidemiológicos
recopilados a través de diagnósticos precisos juegan un papel importante en la salud pública
mediante la identificación y el control de los brotes, la implementación de pruebas de

8
diagnóstico, programas de vacunación y tratamiento, sino también para reconocer patógenos
comunes y emergentes.

Las técnicas moleculares han revolucionado el diagnóstico viral durante el último

tiempo y mejoró tanto la sensibilidad como la especificidad de las pruebas y la velocidad con
la que se puede hacer un diagnóstico preciso. Entre las técnicas de biología molecular se
encuentra la reacción en cadena de la polimerasa y todas sus variantes que hoy en día es
fundamental en el diagnóstico viral del SARS-Cov-2 (variante RT-PCR específicamente),
secuenciación masiva utilizada principalmente en epidemiología para identificar cepas de
virus, citometría de flujo que identifica partículas víricas mediante sus características física-
químicas, entre otras técnicas.

La búsqueda de nuevas herramientas de detección de agentes virales es indispensable

en el conocimiento de la patogenia de múltiples enfermedades que gatillan en el ser humano
y otros seres vivos, además, permite el paso a nuevas investigaciones de uso viral en distintas
áreas de la ciencia como en biomedicina, botánica, agricultura e incluso en nanotecnología.
Por ello el presente trabajo tiene como objetivo realizar una revisión bibliográfica acerca de
los métodos de biología molecular actualmente utilizados para la detección de agentes
virales, debido al rol que tienen en distintas patologías infecciosas de humanos y otros seres
vivos, junto con su potencial en nuevos tratamientos clínicos y/o en distintas áreas científicas.

9
 OBJETIVOS

1.Objetivo General:

1.1 Describir los distintos métodos moleculares de diagnóstico viral

actualmente utilizados en laboratorios clínicos y de investigación.

2.Objetivos Específicos:

2.1 Comparar los distintos métodos de biología molecular utilizados para el

diagnóstico de virus.

2.2 Informar avances de los métodos moleculares de diagnóstico viral

descritos en la literatura.

10
 METODOLOGIA DE BÚSQUEDA Y ORGANIZACIÓN DE LA INFORMACIÓN

La búsqueda de información se realizó con el metabuscador ‘‘Google académico’’,

‘‘NCBI’’, para la información general donde se introdujo palabras claves como detección
viral, biología molecular, historia del virus, y se discriminó según fecha de publicación
siendo esta mayor al año 2000.

Para la búsqueda de información de técnicas actualizadas como PCR, secuenciación

masiva y citometría de flujo se utilizó la plataforma ‘‘PubMed’’ y ‘‘NCBI’’, donde se
introdujo palabras claves como PCR detección viral, infecciones virales, diagnóstico viral,
citometría de flujo en diagnóstico viral, secuenciación masiva en diagnóstico viral, entre otras
donde se discriminó según fecha de publicación siendo esta mayor al año 2010.

Se utilizaron manuales de procedimientos nacionales del MINSAL y de la OMS para la

búsqueda de información relacionada tanto a la detección como transporte de las muestras y
además se utilizó para la verificación de información de otros papers.

No hubo distinción ni restricciones de idioma, aunque gran parte de la evidencia hasta

el momento aportada y utilizada proviene de artículos científicos y o revisiones en inglés.

11
 MARCO TEÓRICO

1.INTRODUCCIÓN A LOS VIRUS

1.1 Historia del descubrimiento viral.

Hace millones de años que existen unos agentes microscópicos actualmente llamados
virus, estos son a grandes rasgos una partícula de código genético, DNA o RNA, encapsulada
en una vesícula de proteínas (65) que han pasado desapercibido en la humanidad hasta hace
aproximadamente unos doscientos años. De acuerdo a la historia de su descubrimiento en el
siglo XIX, se menciona a Luis Pasteur, un bacteriólogo francés, que propone su teoría
germinal de las enfermedades infecciosas, estas pueden ser causadas y transmitidas por un
germen (65). Luego en el año 1884 Charles Chamberland inventó un filtro en que el tamaño
de sus poros era menor al del tamaño de una bacteria promedio (aproximadamente 1-10um)
(46), otorgándole una herramienta al biólogo francés Dimitri Ivanovski que usó un filtro con
estas característica informando que las muestras de hoja molida de la planta de tabaco que
estaba investigando seguía siendo infectada después de filtrarlas (65), demostrando que los
agentes microscópicos que infectaban el mosaico del tabaco, tenían menor tamaño que las
bacterias.

Unos años después el microbiólogo Martinus Beijerinck de origen neerlandés repitió

los experimentos de Ivanovski observando que el agente infeccioso sólo se multiplicaba al
interior de células vivas en división, llamando a este agente contagium vivum fluidum lo que
significa que era un organismo vivo y reproductor que difería de otros organismos (93).

Con el paso del tiempo y del avance científico se logró un mejor entendimiento de
estos entes biológicos, permitiendo así, hace menos de 100 años, observar por primera vez

12
un virus mediante la microscopía electrónica en el que junto con otros estudios se pudo
determinar su estructura morfológica compuesta principalmente por proteínas y material
genético.

Hoy en día se han reconocido más de 2000 especies de virus que afectan a animales,
vegetales y bacterias, en donde frecuentemente van apareciendo cepas nuevas siendo de suma
importancia los métodos moleculares para su identificación.

1.2 Teorías de origen

Actualmente no se conoce con exactitud el origen de estos componentes parasitarios,

sin embargo, gracias a la investigación científica se han establecido posibles teorías al
respecto, donde se encuentran principalmente tres:

1.2.1 Teoría de la degeneración o regresión celular:

Al considerar la actividad infecciosa que tienen los virus, distintos investigadores han
postulado que estos no eran más que células pequeñas que parasitaban a células más grandes,
siendo por este mismo mecanismo el hecho de que hayan perdido material genético que les
permitía vivir fuera de otra célula y autosustentarse (98), por lo tanto a medida que pasaba el
tiempo y evolucionaban, llegaron a un punto en que estos agentes ultramicroscópicos no
necesitaban esta información genética (como por ejemplo el DNA responsable de codificar
proteínas de la membrana plasmática) y por ende, por algún mecanismo lo fueron eliminando
de su genoma.

En la actualidad se conocen bacterias del género Rickettsia y Chlamydia que son

bacterias intracelulares obligadas, que evolucionaron de ancestros de vida libre (98), por lo
tanto, sólo puede vivir dentro de una célula hospedadora debido a que ha perdido ciertos
genes responsables de esta función. Por otro lado, existe un grupo particular de virus
llamados virus de DNA grande nucleoplasmático (NCLDV por sus siglas en inglés), que
además de su gran tamaño, poseen una mayor complejidad en su estructura, y dependen en
menor grado de su hospedero, a diferencia de otros tipos de virus, por lo que algunos

13
virólogos han planteado que estos tipos de virus son descendientes de antepasados más
complejos (98). Sin embargo, también hay argumentos en contra, uno de ellos es que, aunque
a pesar de las que las cápsides tienen la misma conformación morfológica y genética que los
flagelos bacterianos, estos no se asemejan en absolutamente nada a las membranas celulares
(65).

1.2.2 Teoría del origen molecular:

También escrita en la literatura como hipótesis del nomadismo o del escape, postula
que los virus provienen de fragmentos de material genético móvil, principalmente de
plásmidos o elementos transponibles, conocidos generalmente como ‘’genes saltarines’’ y
que se encuentran en el 50% del genoma humano y un 80% en el genoma del maíz (73). Estas
secuencias de DNA mediante diferentes mecanismos salieron de la célula que lo contenía,
además de adquirir una capacidad autorreplicativa para seguir evolucionando de forma
independiente (65). Permitiendo así, explicar el origen de todos los virus. Los virus DNA a
partir de elementos transponibles o plásmidos, por otro lado, los virus RNA que se sugiere
que viene de RNA mensajero autorreplicativo y por último los retrovirus provenientes de
retrotransposones (65).

1.2.3 Teoría de la coevolución viral:

Llamada también teoría virocétrica o hipótesis del virus primero, esta teoría indica
en palabras simples que los virus aparecieron antes que las células, por lo tanto, estos
pudieron haber sido las primeras entidades replicantes, empezando por estructuras proteicas
complejas además de ácidos nucleicos (73). Actualmente se conoce estructuras de
RNA con actividad catalítica llamadas ribozimas, que permiten catalizar reacciones químicas
(73), y que probablemente estas hayan existido antes de la primera célula, siendo así los virus
los vestigios del origen de la vida basada en RNA, desde antes del surgimiento de la vida
celular (65).

A pesar de la evidencia presente en estas teorías, ninguna de estas se considera

fielmente aceptada, e incluso ninguna de ellas es factible para considerar a estos agentes
como seres vivos, para ello deben cumplir ciertas características como: crecer, reproducirse,
mantener una homeostasis interna respecto al ambiente, responder a estímulos y llevar a cabo

14
diversos procesos metabólicos (73). Los virus son entidades ultramicroscópicas capaces de
reproducirse y evolucionar pero que sin embargo como se nombró anteriormente carecen de
metabolismo propio ya que necesitan de una célula hospedadora, incluso estos no poseen
citoplasma ni ribosomas siendo incapaz de realizar el proceso de traducción. Producto de
estas limitaciones en estricto rigor no se les consideraría como agentes vivos, aunque que
algunos investigadores los han considerado en el límite de la vida (65).

1.3 Características de los virus

1.3.1 Características estructurales

Los virus a grandes rasgos están compuestos por una cápside (algunos autores
también lo llaman cápsida) de proteínas que envuelve al material genético, este puede ser
DNA o RNA que a su vez puede ser monocatenario o bicatenario (49). Ya que no todos los
virus mantienen su capacidad infecciosa durante todo su ciclo biológico se les ha denominado
virión, a los que se encuentran en su ciclo infeccioso (61). Su estructura consiste en
una cubierta de proteína externa y un núcleo interno de ácido nucleico (27) , incluso los virus
más simples contienen RNA o DNA que al usar la maquinaria celular parasitada solo pueden
codificar de uno a dos pares de proteínas, mientras que el más complejo puede codificar entre
100 y 200 proteínas (49).

La función principal de los virus es transportar su material genético o ácido nucleico

de una célula hospedadora a otra (65), por lo tanto, respecto a su tamaño este debe ser menor
al de la célula que parasita, variando de 20 nm hasta los 250-400 nm de longitud (93), sin
embargo, hay algunos en donde su tamaño puede llegar a los 1000nm, como es el caso del
Megavirus chilensis que fue encontrado en la costa de Chile (25).

La cápside es una cubierta proteica compuesta de múltiples copias de una proteína o

unas pocas proteínas diferentes, cada una de las cuales está codificada por un sólo gen viral
(49), por lo tanto los virus pueden codificar la información para hacer esta cápside

15
relativamente grande con un material genético bastante reducido (49), además , existen
proteínas que contribuyen al empaquetamiento del ácido nucleico, en donde el conjunto de
estos elementos forma la estructura conocida como nucleocápside (65) . Los virus se pueden
encontrar desnudos (figura 1 A) o en algunos casos están cubierta por una membrana externa
o envoltura (figura 1 B), que consiste principalmente en una bicapa de fosfolípidos similares
a los de la membrana plasmática de una célula huésped infectada, pero también contiene uno
o dos tipos de glucoproteínas codificadas por sí mismo (49).

Figura 1: Componentes estructurales básicos de los virus. Virus con nucleocápside

desnuda (A), virus con nucleocápside envuelta (B), 1= genoma viral; 2= cápside;
3=capsómeros; 4= envoltura; 5= espículas; 6=fibras. Tomado y adaptado de Negroni, M., &
col. (2018).

Hoy en día se conocen tres formas principales de organización de las múltiples

subunidades de las proteínas de la cápside del genoma viral, donde se encuentra:

1.3.1.1 Virus Icosaédricos:

Esta simetría se encuentra conformada por un poliedro de 20 caras triangulares (65),

cada una de las cuales es un triángulo equilátero, constituido con tres subunidades
de proteínas de cápside idénticas (figura 2 C) , lo que hace un total de 60 subunidades por

16
cápside, por lo tanto todas las subunidades de las proteínas están equivalentes entre sí (49),
donde además puede o no presentar envoltura (figura 2 D)

Figura 2: Estructura morfológica virus icosaédricos. Simetría icosaédrica desnuda (C),

simetría icosaédrica envuelta (D). Tomado y adaptado de Negroni, M., y col (2018).

1.3.1.2 Virus Helicoidales:

En esta simetría las proteínas que originan los capsómeros se organizan en forma de
espiral o hélice y se distribuyen alrededor del ácido nucleico (65), en el que las proteínas de
carga positiva entran en contacto directo con el ácido nucleico cargado negativamente (65)
(figura 3).

17
Figura 3: Estructura morfológica virus helicoidales. Simetría helicoidal desnuda (A),
1=capsómeros, 2=RNA. Simetría Helicoidal envuelta (B), 1=espículas; 2= nucleocápside,
3=envoltura. Tomado y adaptado de Negroni, M., y col. (2018).

1.3.1.3 Virus mixtos:

Existen virus que tienen una simetría binaria, es decir una mezcla de la simetría
icosaédrica, con la helicoidal como por ejemplo los colifagos T, que incluso algunos poseen
estructuras adicionales como colas proteicas (65) (figura 4 B).

18
Figura 4: Estructura morfológica virus complejo o mixto. (Poxvirus con forma de
ladrillo) Simetría compleja (A),1 = ácido nucleico; 2=cuerpos laterales. Simetría binaria (B),
a=DNA; b= cabeza; c=cuello; d=vaina; e=fibras; f= el conjunto que conforma la cola.
Tomado y adaptado de Negroni, M., y col (2018) .

En la cápside se encuentran proteínas de superficie que forman la cápside externa

como tal, que funcionan como antirreceptores de reconocimiento celular, también se
encuentran las proteínas de la cápside internas, estructurales y no estructurales, asociadas al
ácido nucleico, junto con enzimas como la proteasa y proteínas no metabólicas internas y
superficiales asociadas al tropismo (65).

1.3.2 Características Genómicas:

En el genoma viral se encuentra toda la información genética de esta partícula

submicroscópica y es responsable de toda la capacidad infecciosa del virus, este ácido
nucleico se encuentra rodeado por una cubierta proteica llamada cápside y se caracterizan
por poseer solo un tipo de material genético (65) que puede ser RNA o DNA, además de
monocatenario o bicatenario es decir de una o dos hebras de material genético, en el que
puede presentar una polaridad + (positiva) o – (negativa) (61).

1.3.2.1 Virus DNA

Los virus DNA bicatenarios pueden replicar y transcribir su genoma (las dos hebras)
en el núcleo utilizando la maquinaria celular para producir RNAm necesario para la síntesis
de proteínas (65), mientras que los virus que poseen cadenas de DNA simple requieren de la
síntesis de una cadena complementaria de DNA, en donde luego de obtenerla, la replicación
continúa en el núcleo celular como si este agente infeccioso hubiera tenido ambas hebras
(61).

19
1.3.2.2 Virus RNA

Esta cadena de RNA puede tener polaridad positiva (+) o negativa (-), los RNA +,
sirven como RNA mensajero y posee los genes necesarios para la traducción (11). Por otro
lado, se encuentran los virus RNA –, es decir la secuencia inversa o anti-mensajero (5), estos
inicialmente deben ser transcrito en RNA mensajero y así traducir proteínas (61).

1.3.3 Ciclos replicativos.

La replicación de los virus consta de un proceso en el cual esta partícula infecciosa

penetra la célula huésped y mediante su maquinaria enzimática sintetizando nuevos agentes
virales. La replicación viral se divide en seis etapas que son 1) adsorción o fijación, 2)
penetración o entrada, 3) decapsidación o desnudamiento, 4) síntesis de proteínas y
replicación del genoma, 5) maduración o ensamblaje y por último 6) liberación o egreso (61).

El ciclo replicativo del virus comienza con la adhesión o adsorción de proteínas de la

cápside vírica con receptores específicos de superficie celular del huésped, aunque también
se describe que pueden unirse a flagelos o pilis bacterianos (65) (figura 5-1). Luego sigue el
siguiente paso que es el de penetración o entrada a la célula, este se puede realizar en forma
directa, en el cual solo pasa el material genético viral quedando toda la estructura proteica
adherida a la célula huésped, también se puede realizar por endocitosis producto de
invaginaciones de la membrana plasmática (figura 5-2), o por fusión de la envoltura viral con
la membrana de la célula parasitada (98) (figura 5-2’). Posteriormente viene la etapa de
decapsidación o desnudamiento en el cual enzimas celulares degradan la cápside viral,
mediante el cual los virus DNA ingresan su material genético al núcleo a diferencia de los
virus RNA que el material genético queda circulando en el citoplasma (61) (figura 5-4). En
la cuarta etapa se encuentra la síntesis de proteínas y replicación, en donde participan
distintos mecanismos dependiendo del material genético del virus. Como se nombró
anteriormente los virus DNA necesitan la RNA polimerasa para sintetizar el RNAm y así
producir proteínas víricas tempranas (no estructurales) o tardías (estructurales), los virus
RNA + actúan como RNAm produciendo la síntesis de proteínas, mientras que el RNA –
deben primero sintetizar RNAm, por lo que a este material genético no se le considera como
infeccioso por sí mismo (61) (figura 5-6,7,8). Además, existe un grupo especial llamados

20
retrovirus que a pesar de ser RNA+ poseen una enzima llamada retrotranscriptasa que usando
hebras de RNA puede sintetizar DNA sirviendo de molde para formar RNAm y así sintetizar
proteínas virales (61). En la penúltima etapa de maduración o ensamblaje involucra un
proceso termodinámico en el que la partícula viral se forma y adquiere estabilidad por la
articulación de cada uno de estos componentes víricos (65), en este punto es donde se forman
las nucleocápside por modificaciones postraduccionales, en el cual se pueden formar de
estructuras vacías (pro-cápsides) que se rellenan posteriormente con el genoma del virus. El
ensamblaje en los virus DNA ocurre en el núcleo, mientras que los virus RNA ocurre en el
citoplasma (61). Con respecto a su envoltura, esta es adquirida por un proceso de gemación,
en donde los virus RNA la adquieren de la membrana plasmática, mientras que los virus
DNA lo hacen de la membrana del núcleo celular, luego son transportados por el aparato de
Golgi, estos atraviesan la membrana del citoplasma por el sistema de endomembranas y
finalmente se fusionan con la membrana citoplasmática (61). En la fase de maduración, los
virus se convierten en viriones, es decir adquieren su capacidad infectiva. Por último, en la
etapa de liberación las partículas víricas sintetizadas se liberan por lisis celular (figura 5.9),
debido a la disminución de la síntesis de macromoléculas celulares o por algún efecto tóxico
causado por los virus, aunque algunos casos la célula puede sobrellevar este daño y sobrevive
(65). Los virus envueltos con la membrana citoplasmática pueden ser liberados
instantáneamente con el proceso de adquisición de la envoltura (figura 5-9’) mientras que los
envueltos con la membrana del aparato de Golgi o retículo endoplásmico la liberación
inducirá lisis celular (65)

21
Figura 5: Replicación viral por diferentes mecanismos. 1= partícula viral y
reconocimiento; 2=adsorción; 2’ fusión= 3 y 3’= penetración; 4= denudación; 5=
transcripción; 6= síntesis de proteínas tempranas; 7= replicación del genoma; 8 y 8’= con la
síntesis de proteínas tardías se produce el ensamblaje; 9= salida por lisis; 9’= salida por
brotación. Tomado y adaptado de Negroni, M., y col (2018).

En la literatura el ciclo replicativo de los virus se divide según su duración, en donde

se encuentran dos secciones, el ciclo lítico y el ciclo lisogénico: En el ciclo lítico el material
genético viral se transcribe inmediatamente a RNAm para producir partículas víricas
completas e infecciosas, mientras que en el ciclo lisogénico los virus circularizan en
moléculas bicatenarias viajando al núcleo integrándose al genoma celular, la célula continúa
haciendo sus funciones metabólicas normales hasta un cambio en el ambiente que produzca
una activación del ciclo lítico (65).

22
1.3.4 Hospederos

Actualmente se conocen múltiples hospederos para estos agentes parasitarios, entre

ellos se encuentran virus que infectan a bacterias, comúnmente llamados bacteriófagos,
también virus que infectan a células vegetales o células animales llamados virus vegetales y
virus animales respectivamente, incluso existen virus que infectan a otros virus conocidos
actualmente como virófagos (42). La capacidad infecciosa y el rango que este tiene dentro
de las células, depende de las proteínas que tiene en su cápside que le permiten la adherencia
a la célula hospedadora. Algunos virus pueden infectar a plantas, como también a insectos
que se alimentan de ella, por ejemplo, el virus amarillo de la papa que puede realizar su ciclo
replicativo en los saltahojas (insectos que se alimentan de las hojas de la planta de papa)
como también de la planta de papa misma (61). Existen virus con un amplio rango de huésped
como es el caso del virus de la estomatitis vesicular, que infecta a células de múltiples
mamíferos e insectos. Sin embargo, la mayoría de los virus animales no cruzan el nivel
taxonómico phylum, y algunos infectan células de especies estrechamente relacionadas (49).

1.4 Clasificación

Existe múltiples parámetros que permiten la clasificación de estos agentes

submicroscópicos, entre ellos: el tipo de ácido nucleico que posee, la simetría de su cápside,
el tamaño del virus, si presenta o no presenta envoltura, el tipo de replicación viral, las células
que es capaz de infectar, entre otros. El Comité Internacional de Taxonomía de Virus (ICTV
por sus siglas en inglés) es un comité de la División de Virología de la Unión Internacional
de Sociedades Microbiológicas en el cual sus actividades se rigen por los Estatutos acordados
con la División de Virología. Los objetivos de este comité están basados en acuerdos
internacionales aprobados por la comunidad de virólogos y virólogas, que permiten clasificar
y nombrar a los diferentes tipos de virus existentes conocidos hasta el momento además de
incorporar los descubrimientos nuevos (36).

A nivel universal se utilizan los siguientes niveles taxonómicos: Orden, Familia,

Subfamilia, Género y Especie, en el cual su clasificación primaria es esta última (1). La
nomenclatura que se utiliza, incluye el sufijo -viridae para las familias y -virus para los
géneros. La clasificación que se realiza en el ICTV considera a una especie un grupo

23
monofilético en el cual sus propiedades pueden ser distinguidas de otras especies por
múltiples criterios, este grupo es monofilético si es que todos sus integrantes han venido de
una población ancestral común (65). El sistema de clasificación presenta características
comunes a las divisiones de otros organismos celulares, manteniéndose el taxón en donde
normalmente los nombres de las especies virales se relacionan con la enfermedad causada.
Por otro lado, existe otro tipo de clasificación viral que se basa en el tipo de material genético
presente en el virus, el tipo de cadena y además su sentido. Esta clasificación consta de 7
grupos denominados con números romanos. Así lo grupos I y II serán de virus DNA, los
grupos III, IV y V corresponderán a virus RNA y los grupos VI y VII albergan a todos
aquellos virus que realizan transcripción inversa (65).Las clasificaciones anteriores son las
universalmente aceptadas pero no son las únicas, existen clasificaciones que se basan en la
similitud del ensamblaje y la estructura del virión, otras por las células a la que infecta como
la clasificación de Holmes o también clasificaciones por características físicas y químicas de
los virus como el sistema LHT de clasificación de virus o la clasificación de Casjens y Kingsn
(65).

24
25
Figura 6: Esquema de las principales familias de virus. Los virus se agrupan por el tipo
de genoma y se dibujan en una escala aproximada incluyendo aquellas especies que infectan
a los seres humanos. Tomado y adaptado de Dennis, L., y col (2009).

1.5 Rol en enfermedades

La alteración producida por los virus en células normales infectadas, se conoce como
efecto citopático viral y que es responsable de muchas enfermedades que afectan no solo al
ser humano, sino que también a plantas u otros animales e insectos. Dentro de las infecciones
virales que puede manifestar el ser humano se encuentran:

Infecciones respiratorias que son una de las más frecuentes como el virus de la
influenza epidémica (A y B), virus de la influenza A aviar (H5N1), además el actualmente
virus conocido del SARS-CoV-2 que ha causado una pandemia a nivel mundial. Estos tipos
de virus tienen más probabilidades de causar síntomas graves en lactantes, adultos mayores
y pacientes con trastornos pulmonares o cardiopatías (45). También existe virus capaces de
provocar infecciones gastrointestinales como la gastroenteritis que afectan distintos tipos de
virus según el grupo etario, por ejemplo, los pertenecientes al género Rotavirus que afectan
principalmente a niños, los virus del género Norovirus que afectan a niños mayores y adultos,
mientras que los del género Astrovirus suelen afectar a niños pequeños y lactantes. Además
pueden provocar infecciones hepáticas como el virus de la hepatitis A,B,C,D y E en el que
cada uno causa un tipo específico de hepatitis, infecciones neurológicas como el caso de las
encefalitis virales producidas por virus del género Arbovirus a través de la picadura de un
antrópodo, infecciones cutáneas o mucosas como el virus del herpes simple en el que puede
comprometer la piel, boca, manos, ojos que puede llegar a ser grave, existe también el
papilomavirus humanos causante de verrugas genitales o en las palmas de manos y pies,
incluso alguno subgrupos pueden provocar cáncer de cuello uterino en mujeres (45). Por
último, en algunos casos hay virus que pueden causar enfermedades multisistémicas como
los enterovirus que incluyen Coxsackievirus y Echovirus de la misma manera que los
Citomegalovirus.

26
 Los virus como agentes infecciosos son causantes de muchas enfermedades tanto en
el ser humano como en plantas y animales incluso bacterias, en donde el grado de daño de la
patología depende del tipo de virus y su ciclo replicativo.

27
 2. MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO DE PATÓGENOS

Los métodos utilizados para reconocer distintos patógenos entre ellos los virus,
pueden clasificarse de dos formas, directos e indirectos (85). El primero se basa en demostrar
la presencia del virus o de alguno de sus constituyentes como su genoma viral o distintos
antígenos, mientras que el segundo se basa en la respuesta de anticuerpos específicos por
parte del huésped en el curso de la infección (85) .Así, se encuentran distintos métodos de
diagnóstico directos como el aislamiento en cultivos celulares, identificación del virus
mediante microscopía electrónica, PCR, hibridación, entre otras y métodos indirectos como
ELISA, inmunofluorescencia indirecta, entre otros (17).

2.1 Cultivo celular

El cultivo de tejidos se refiere al mantenimiento o crecimiento, in vitro, de células,

tejidos u órganos de origen animal o vegetal. El procedimiento consiste básicamente en
liberar las células del tejido original y llevarlas a un ambiente artificial que permite su
crecimiento, multiplicación y mantenimiento del metabolismo, de una manera controlada
(85).

La aplicación de los cultivos celulares en virología está fundamentada en el requisito de los

virus de penetrar y multiplicarse en las células, para producir alteraciones morfológicas y
metabólicas características. La capacidad de las células de permitir la multiplicación de virus,
y sufrir alteraciones, depende tanto del tejido y la especie de origen como de las condiciones
del cultivo y de las características propias del virus (85).

28
 El uso del cultivo celular es útil no sólo en virología, sino que, en distintas áreas de
investigación como inmunología, ingeniería de proteínas, investigación del cáncer entre otros
(85). Presentando, además, una serie de ventajas como también desventajas que hay tener en
consideración y que se describen en la siguiente tabla:

Tabla 1: Ventajas y desventajas generales del cultivo celular. Elaboración propia,

Fuentealba, D., (2021).

VENTAJAS DESVENTAJAS

Permiten un control preciso y fino del medio Costo de producción. Aunque ha ido en
ambiente. decadencia con las nuevas tecnologías
(especialmente por la biología molecular).

Caracterización y homogeneidad de la Inestabilidad como consecuencia de la

muestra. dotación cromosómica aneuploide.

Ocupan menos volúmenes de reactivos o El cultivo no siempre puede reemplazar el

fármacos en comparación con el ensayo in uso de animales de experimentación, sin
vivo. embargo, es una alternativa válida en
muchas ocasiones.

Actualmente se utiliza este método para el diagnóstico viral en infecciones de las vías
respiratorias donde su agente etiológico generalmente son los virus de la influenza, aunque
el método más sensible es la RT-PCR (17). Por otro lado, ya que la infección por
citomegalovirus es la infección intrauterina más frecuente y afecta a cerca del 1% de los
recién nacidos, la prueba prenatal más fiable para verificar la infección es su cultivo junto
con su detección en el líquido amniótico mediante alguna técnica molecular como PCR (17).
También la infección neonatal por el virus del herpes simple posee una elevada mortalidad y
una morbilidad significativa, donde pueden aparecer lesiones cutáneas, oculares o daño

29
cerebral grave. Su diagnóstico principalmente se realiza por el cultivo del virus y detección
con técnicas de biología molecular igualmente que los virus del género Citomegalovirus (14).

Sin embargo, en la rubéola que es una enfermedad muy contagiosa que se propaga a
través de las secreciones respiratorias y que su agente etiológico es un virus RNA de la
familia Togavirus, no se puede emplear el método de cultivo ya que este requiere mucho
tiempo en realizarse y no es eficaz en una patología que se agrava con mucha rapidez (32).

Los métodos modernos de cultivo celular aún se consideran en muchos laboratorios

lo más precisos y sensibles para el diagnóstico viral, sin embargo, las técnicas de biología
molecular avanzan rápidamente como técnica elegida para la identificación de virus.

2.2 Histología

En la actualidad la biología molecular logra identificar cepas de virus, bacterias y

parásitos que han sido de importancia clínica y medioambiental. Los estudios histológicos
con técnicas histológicas convencionales y especiales le brindan una información básica al
clínico acerca de la naturaleza del proceso infeccioso (95)

Algunos agentes infecciosos se pueden ver en cortes teñidos con hematoxilina-eosina

(por ejemplo, cuerpos de inclusión formados por Citomegalovirus y virus del herpes simple,
cúmulos bacterianos, que normalmente se tiñen de azul, Candida y Mucor entre los hongos,
la mayoría de los protozoos y todos los helmintos). Sin embargo, muchos agentes infecciosos
se ven mejor con tinciones especiales que identifican los microorganismos a partir de las
características particulares de su pared celular o su cápsula tinciones de Gram,
acidorresistentes, plata, mucicarmín y Giemsa o después del marcado con anticuerpos
específicos, donde los microorganismos se ven mejor en el borde de avance de la lesión que
en el centro de la misma, en particular si hay necrosis (95).

Existen diferentes técnicas histológicas para identificar distintos patógenos, donde

alguna de ellas se presentará en la siguiente tabla.

30
Tabla 2. Tinción usada en distintas técnicas histológicas según grupo de agente
infeccioso. Elaboración propia, Fuentealba, D., (2021).

TINCIÓN AGENTE INFECCIOSO

Brown Brenn Bacterias gran positivas y negativas

Verde metilo Bacterias gran negativas

Pironina Bacterias gran positivas

Glenn Bacterias gran negativas

PAS Hongos

Hematoxilina/ eosina Inclusiones virales

Warthin Starry Espiroquetas

La utilización de técnicas histológicas convencionales y especiales posibilita

determinar la presencia del agente causal de infección a nivel celular, lo que permite emitir
un diagnóstico de infección más discriminativo y de mayor calidad por el especialista (7).

2.3 Serología

El organismo dispone de un sistema de defensa inespecífico que le permite defenderse

de los patógenos externos en ausencia de un contacto previo con ellos (en ausencia de
reconocimiento), y de un sistema de defensa específico, más desarrollado y sofisticado, que
le permite defenderse con eficacia frente a los microorganismos y que exige para su
desarrollo de un reconocimiento previo del agente. Este segundo mecanismo de defensa
puede adquirirse por contacto con el agente o sus antígenos a través de una infección, por
inoculación voluntaria (vacunación) o por administración de anticuerpos preformados en otro
organismo (anticuerpos maternos transferidos a través de la placenta o por administración de
sueros hiperinmunes). Esta respuesta es específica y con capacidad de distinguir entre lo

31
propio y extraño; en las ocasiones en las que existe conflicto en este reconocimiento aparece
la enfermedad autoinmune. La respuesta es más o menos persistente y capaz, además, de
dejar recuerdo de este su primer contacto con el antígeno (memoria inmunológica) que le
permitirá reaccionar de forma más eficaz y violenta en las exposiciones posteriores al mismo
antígeno (15).

En el curso de una infección varían las poblaciones de anticuerpos frente al agente

infectante, en primer lugar, la clase predominante suele ser IgM, mientras que con el
transcurso del tiempo las IgM disminuyen hasta desaparecer o quedar a muy baja
concentración y, en cambio, aumentan las IgG. La búsqueda de anticuerpos clase IgM es de
utilidad para hacer diagnóstico de infección reciente en una sola muestra de suero extraída
en el período agudo de la enfermedad. Este método se emplea para el diagnóstico de
enfermedades como: Rubéola, infecciones por Citomegalovirus, Hepatitis a virus A, como
también actualmente se realizan test serológicos para la detección del SARS-Cov-2, sin
embargo, los métodos moleculares (RT-PCR en específico) siguen siendo el gold estándar
para su diagnóstico (37). La búsqueda de anticuerpos clase IgG en una sola muestra se utiliza
como técnica de tamizaje, por ejemplo, para el diagnóstico de la infección por el virus de la
inmunodeficiencia humana (VIH). Posteriormente los hallazgos positivos son confirmados
en la misma muestra de suero por otra metodología que preferentemente son métodos de
biología molecular (13).

La confirmación serológica de una infección aguda por cualquiera de estas técnicas

tradicionales está dada por un aumento de cuatro veces o mayor en el título de anticuerpos
cuando se emplean diluciones al doble seriadas. En los últimos años se han desarrollado
nuevos métodos para la detección de anticuerpos virales, y en muchos casos han demostrado
ser mejores que las pruebas tradicionales en términos de economía, sensibilidad,
especificidad y rapidez (95).

32
2.4 Moleculares

Las técnicas de amplificación de ácidos nucleicos, como la reacción en cadena de la

polimerasa (PCR) y la amplificación mediada por transcripción, se utilizan para el
diagnóstico de múltiples patologías, entre ellas la gonorrea, la infección por clamidias (57),
infecciones virales como la actual pandemia producto del virus SARS-CoV-2 que se
diagnostica mediante PCR (6). Los métodos moleculares son mucho más sensibles que el
estudio convencional de algunos patógenos como el cultivo celular o algunas técnicas
histológicas (17). Por ejemplo el estudio de la encefalitis por el virus del herpes simple
mediante PCR del líquido cefalorraquídeo tiene una sensibilidad aproximada del 80%,
mientras que la del cultivo vírico del líquido cefalorraquídeo es inferior al 10% (17), del
mismo modo, las pruebas de ácido nucleicos para Chlamydia genital detectan entre un 10 y
un 30% más de casos que el cultivo convencional de Chlamydia. En cuanto a otras
infecciones, como la gonorrea, la sensibilidad del estudio de los ácidos nucleicos es parecida
a la del cultivo (17). Además, hoy en día existen actualizaciones de estas técnicas como la
PCR cuantitativa que para el virus BK, el Citomegalovirus y el virus de Epstein-Barr permite
valorar la carga viral en los receptores de trasplantes, también estas pruebas cuantitativas que
miden los ácidos nucleicos víricos permiten orientar el tratamiento médico de los pacientes
infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana, el virus de la hepatitis B y el virus
de la hepatitis C (13).

Actualmente, se emplean de forma rutinaria paneles moleculares que permiten la

detección de 20 patógenos o más para el diagnóstico de las infecciones respiratorias
bacterianas y víricas y también de las infecciones bacterianas, víricas y parasitarias digestivas
(17). Esta secuenciación masiva, asociada o no a una amplificación inicial por PCR, se
emplea para la detección de patógenos nuevos o poco frecuentes y también para la
investigación epidemiológica (95). En el capítulo ‘‘Métodos Moleculares Para El
Diagnóstico Viral’’ se explican las técnicas con detalle.

33
2.5 Proteómicas

El proteoma es el conjunto de proteínas que un organismo o en este caso agente viral

que produce o modifica. Gracias a la proteómica ha permitido la identificación de cantidades
cada vez mayores de proteínas de distinto tipo y con distinta función (67). Esta generalmente
se refiere al análisis experimental a gran escala de proteínas y proteomas, pero que sin
embargo a menudo se uso específicamente para referirse a la purificación de proteínas y la
espectrometría de masas.

En proteómica, existen múltiples métodos para estudiar proteínas. Generalmente, las

proteínas pueden detectarse mediante el uso de anticuerpos (inmunoensayos) o
espectrometría de masas. Si se analiza una muestra biológica compleja, se debe usar un
anticuerpo muy específico en el análisis de transferencia de puntos cuantitativos (QDB) o se
debe usar una separación bioquímica antes del paso de detección, ya que hay demasiados
analitos en la muestra para realizar detección y cuantificación precisas (17).

34
 3. DIAGNÓSTICO DE INFECCIÓN VIRAL

3.1 Generalidades

Gran parte de las técnicas utilizadas en el diagnóstico clínico se basan en pruebas

serológicas que identifican anticuerpos específicos frente a diversas proteínas antigénicas.
Sin embargo, existen circunstancias en las cuales son necesarias pruebas que detecten
precozmente la infección viral (tratamientos específicos, medidas profilácticas, entre otras.).

En algunas infecciones virales es posible detectar la presencia de antígenos virales

previamente al desarrollo de la seroconversión, siendo esta prueba la única evidencia de la
exposición al virus cuando no existe aumento de los niveles de anticuerpos circulantes
(pacientes inmunodeprimidos) (17). Igualmente, la detección del genoma viral puede
favorecer la precocidad del diagnóstico viral y su confirmación. En la última década se han
desarrollado una serie de técnicas para el diagnóstico viral basadas en la detección de ácidos
nucleicos. De ellas la Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es la más utilizada. En el
momento actual, la tendencia en el diagnóstico virológico consiste en emplear nuevas y más
sensibles tecnologías de detección de antígenos y de investigación de ácidos nucleicos con
el propósito de lograr un diagnóstico viral más rápido (96).

El diagnóstico clínico orientará hacia la prueba apropiada a realizar, pero además de

aquel, se requiere información epidemiológica, identificación correcta del paciente, edad de
aquel y la fecha de obtención de la muestra. También resulta útil averiguar si el paciente ha
recibido vacunas virales o terapéutica antiviral en una fecha reciente.

Las etapas de diagnóstico viral son principalmente cinco: Identificación de síntomas,

recolección de la muestra, transporte y/o almacenamiento, procesamiento de la muestra y
entrega de resultados que se detallan en los próximos subcapítulos (83).

35
3.1.1 Recolección, transporte y procesamiento de la muestra.

Las mejores muestras por lo general son las que se obtienen en un estadio temprano
de la enfermedad (dentro de las primeras 72hs), cuando el virus se excreta en concentraciones
relativamente elevadas y todavía no se ha unido con anticuerpos (22). Después de
transcurridos 7 días habitualmente no vale la pena realizar cultivos virales cuando se trata de
huéspedes inmunocompetentes. No obstante, en huéspedes inmunocomprometidos y en las
infecciones virales persistentes o crónicas, el virus puede estar presente durante períodos
prolongados (22). Además, el volumen de la muestra debe ser suficiente como para permitir
la realización de los ensayos apropiados y la conservación, por ejemplo: en caso de tener que
repetir el ensayo en pruebas adicionales, como PCR.

A continuación, se detallan algunas técnicas de recolección de muestras clínicas:

❖ Hisopados conjuntivales: Se debe frotar la conjuntiva palpebral con un hisopo estéril

humedecido con solución salina estéril. Luego se debe colocar el hisopo en 3-4ml de
medio de transporte, este posee proteínas como puede ser la albúmina de bovino o la
gelatina. Además, posee un agregado de antibióticos y antifúngicos logrando así prevenir
el sobredesarrollo de la flora bacteriana y fúngica residente del huésped (19).
❖ Hisopados de lesiones y vesículas cutáneas: Se debe recolectar la muestra dentro de los
3 días de la erupción de la vesícula. Primero, se lava suavemente la superficie de la
vesícula o la lesión con 70% de etanol, luego se aspira el fluido vesicular con una jeringa
de tuberculina y se coloca el fluido aspirado en 3-4ml de medio de transporte. Luego se
debe frotar las lesiones cutáneas o vesículas abiertas con un hisopo y colocarlo en 3-4ml
de medio de transporte. El hisopado de las vesículas puede ser colocado en el medio de
transporte que ya tiene el fluido vesicular (83).
❖ Aspirado nasofaríngeo: Se introduce una sonda nasogástrica por las fosas nasales hasta
la rinofaringe y se aspira el mucus en un tubo colector con características especiales. El
contenido de la sonda se lava con medio de transporte para virus, que se recoge en el tubo
colector (19).
❖ Hisopados nasales: Se introduce un hisopo de algodón, seco, suavemente en la nariz. Se
deja el hisopo en la nariz durante algunos segundos para que las secreciones sean

36
 absorbidas y así obtener la muestra. Luego se coloca el hisopo dentro de 3-4ml de medio
de transporte. Es la muestra de elección para virus respiratorios (19).
❖ Hisopados faríngeos: En esta técnica se frota las amígdalas y faringe con un hisopo de
algodón seco. Se coloca el hisopo en 3- 4ml de medio de transporte (19).
❖ Hisopados rectales: Se introduce un hisopo de algodón humedecido 2-3cm dentro del
canal anal realizando movimientos rotatorios. Posteriormente, se coloca el hisopo dentro
de 3- 4ml de medio de transporte. (83)
❖ Orina: Se debe recolectar un total de 10-15ml de orina recientemente emitida en un
recipiente estéril y enviarla directamente al laboratorio (19).
❖ Líquido cefalorraquídeo (LCR): Se debe recolectar al menos 0,1ml de LCR (2-3ml
preferentemente) y además se debe transportar directamente al laboratorio (19).
❖ Sangre con anticoagulante (para cultivo viral o inmunofluorescencia): Se debe recolectar
sangre entera en un tubo que contenga heparina, citrato o EDTA. Además, se debe enviar
la sangre directamente al laboratorio donde su rápida entrega (2- 6 horas) al laboratorio
es esencial (83)
❖ Suero (para pruebas serológicas): En este caso se debe recolectar la muestra de sangre en
un tubo estéril que no contenga anticoagulantes, luego se debe enviar la muestra al
laboratorio sin congelar. De acuerdo al origen de la muestra, esta requerirá diferentes
tratamientos previos a ser inoculada. Si lo que se quiere es inocular la muestra en cultivos
celulares lo que se recomienda es hacerlo inmediatamente después de obtenida. Además,
si el método de estudio a aplicar es una inmunofluorescencia, se deben confeccionar frotis
y se fijan al portaobjeto con acetona, para así poder conservarlos a -20º o -70º hasta su
tinción (83).

37
Figura 7: Representación de lugar anatómico en donde se realiza la muestra para el
diagnóstico viral. Elaboración propia, Fuentealba, D., (2021).

En la siguiente tabla se detalla el medio de transporte y condiciones de transporte de las

muestras en la pesquisa de distintos tipos de virus.

Tabla 3. Principales agentes virales, su transporte y sobrevida.

Virus Medio de transporte Tiempo días / % de

Temperatura °C recuperación

Adenovirus Bentonita 14/ambiente 100

B5 Bentonita 21/ambiente 100

CMV 2SP (Medio chlamyidia), 21/4 4

Sorbitol 70% 3/4 4
Medio de cultivo viral 3/4 1
SPG 3/4 10
Echovirus 11 Bentonita 21/ambiente 100

38
 HSV Leche descremada 30/4 25
Medio de Richards 12/2 10-50
SPG 3/4 30

Influenza Bentonita 14/ambiente 33

Parainfluenza Bentonita 14/ambiente 50

Rubeola Bentonita 14/ambiente 1

VZV 2 SP 3/20 4

CMV: Citomegalovirus, HSV: virus del herpes simple, VZV: virus varicela-zóster, 2SP: 2
sacarosa fosfato,SPG : sacarosa fosfato glutámico. Tomado de del Pilar Crespo, M. (2000).

3.1.3 Bioseguridad

La bioseguridad es el Conjunto de normas y actitudes que tienen como objetivo

proteger la salud del personal frente a los riesgos biológicos, químicos y físicos a los que está
expuesto en el desempeño de sus funciones, es por ello que es esencial cumplir las normas
de seguridad que son establecidas a nivel nacional (43). A continuación, se establecen a
grandes rasgos el uso de elementos de protección personal, junto con acciones que debe
realizar el laboratorista según el tipo de muestra (64):

Tabla 4. Procedimiento de bioseguridad a realizar según tipo de muestra. Elaboración

propia, Fuentealba, D., (2021).

TIPO DE MUESTRA PROCEDIMIENTOS Y USO DE

ELEMENTOS DE PROTECCIÓN
PERSONAL

39
 Sangre Higiene de manos, uso de guantes, uso de
sistema de extracción al vació, evitar
producción de aerosoles.

Secreción respiratoria Higiene de manos, uso de guantes,

mascarilla N95, protección ocular.

Orina Higiene de manos, guantes, evitar la

generación de aerosoles.

Manejo de tejidos Higiene de manos, uso de guantes, delantal,

pechera plástica, mascarilla N95, protección
ocular.

Tabla 5. Procedimiento de bioseguridad a realizar según el manejo de la muestra,

Elaboración propia Fuentealba, D., (2021).

DISTRIBUCIÓN DE LA MUESTRA PROCEDIMIENTOS Y USO DE

ELEMENTOS DE PROTECCIÓN
PERSONAL

Traslado De muestras de laboratorio Personal capacitado exclusivamente para

dentro del hospital transporte, no manipular muestras, estas
deben estar en envases plásticos cerrados
mínimo con tapa rosca, transporte en cajas
cerradas, de material liso, lavable,
resistente, con gradillas apropiadas al
envase.

Transporte de muestras de laboratorio Personal capacitado y exclusivamente para

fuera del hospital: transporte, no debe manipular las muestras,

40
 la muestra debe estar en contenedor sellado
y se debe descontaminar el envase.

Recepción de la muestra de laboratorio Se deben utilizar guantes, además se debe

realizar una higiene de manos al retirar los
guantes.

Manipulación y procesamiento de la Se deben utilizar guantes, una pechera

muestra de laboratorio plástica, una mascarilla N95 y protección
ocular en caso de aerosoles, y, además, se
debe higienizar las manos al retirar los
guantes

En caso de accidentes en el transporte de Se deben utilizar los guantes, absorber

muestras de laboratorio (derrame o fluidos con papel desechable luego se debe
quiebre): lavar con abundante agua junto con la
desinfección de la superficie con solución
clorada. Por último, se debe higienizar las
manos al retirar los guantes.

3.2 Métodos de diagnóstico indirectos

El diagnóstico indirecto implica la demostración de la huella que el agente infeccioso

ha dejado por su contacto con el sistema inmune. La muestra más frecuente en este caso es
la muestra de sangre para evaluar la presencia de anticuerpos específicos, por lo que
frecuentemente se lo denomina diagnóstico serológico y que se realiza mediante distintos
métodos inmunológicos que se presentan a continuación (24).

3.2.1 Métodos Inmunológicos (Detección de anticuerpos)

❖ Inmunofluorescencia indirecta: La Inmunofluorescencia indirecta, es un método rápido

y confiable para la determinación de anticuerpos antivirales en el suero del paciente. Se
basa en la unión de anticuerpos antivirales presentes en el suero del paciente a los

41
 antígenos virales expresados en la superficie y citoplasma de células infectadas, que han
sido fijadas a un portaobjeto de vidrio. Como control de especificidad se usan células no
infectadas. La presencia de anticuerpos se evidencia por la aparición de fluorescencia en
el citoplasma (que es vista a través de microscopía fluorescente) y superficie de las
células infectadas, mientras que las células control no tienen fluorescencia (44).
❖ Enzimoinmunoanálisis indirecto: Los enzimoinmunoanálisis indirectos se han aplicado
de forma amplia en los últimos años al diagnóstico de anticuerpos virales. Tiene las
ventajas de ser un método versátil, relativamente económico y sensible. La metodología
es la siguiente: Los antígenos virales se inmovilizan sobre una fase sólida (esferita,
policubetas para microtitulación u otros elementos de plástico) y se agregan los sueros en
estudio, se incuban, se lavan y se revela la reacción antígeno-anticuerpo por el agregado
de una inmunoglobulina antiespecie conjugada con una enzima, seguida por el substrato
apropiado para esta. Los resultados se pueden leer con un espectrofotómetro y en algunos
casos de forma visual (79).
❖ Western Blot; La técnica de Western Blot se basa en la separación electroforética de
proteínas virales que son posteriormente inmovilizadas en papel de nitrocelulosa con el
objeto de determinar la presencia de anticuerpos específicos contra cada una de esas
proteínas (51).

3.3 Métodos directos

El diagnóstico directo implica la demostración del agente infeccioso y/o componentes

antigénicos en los fluidos orgánicos. Incluye la elección de la muestra, su transporte,
conservación y procesamiento que permita la identificación del patógeno en específico en
este caso los virus. Existen diferentes métodos directos para el diagnóstico viral, donde los
mas importantes son: Cultivo celular para diagnóstico viral, estudios inmunológicos de
detección de antígenos, estudios de visualización como la microscopía electrónica, test de
aglutinación entre otros.

3.3.1 Cultivos celulares

El cultivo celular para el diagnóstico viral se basa en preparar diferentes líneas

celulares que son inoculadas con la muestra clínica sospechosa. El éxito del aislamiento del
virus depende de la óptima selección, recogida y transporte de la muestra clínica (86). Con
relación a su procedimiento, una vez que ingresa la muestra al laboratorio se agita

42
fuertemente y se descarta el tejido sobrante. Seguidamente se centrifuga al medio líquido de
forma que en el pellet contendrá hongos, bacterias, células entre otras cosas para luego ser
desechado. Por otro lado, en el sobrenadante contendrá los virus ya que estos presentan
menos densidad. Este último posteriormente se inocula en los diferentes medios de cultivo
celulares y a través del efecto citopático que se presente en el monocapa celular del cultivo
se detecta la presencia viral. (17).

Los distintos cultivos celulares varían en cuanto a su susceptibilidad a los diferentes

virus, ya que existe una relación específica huésped-virus, y es en función de los datos
clínicos y del tipo de muestra que se elige el cultivo para inocular el material (17).

3.3.2 Inmunológicos (Detección de antígenos)

En el caso de detección de antígenos, se utiliza un anticuerpo específico antiviral (por

lo general IgG) en el cual la fracción Fc se ha conjugado una molécula marcada, que puede
ser isotiocianato de fluoresceína (Inmunofluorecencia), un isótopo radioactivo 125I o 131I
(RIA), o una enzima: peroxidasa, fosfatasa alcalina, o biotina-avidina (EIA), para objetivar
la reacción (54).

3.3.3 De visualización (Microscopía electrónica)

Mediante el microscopio electrónico es posible observar la morfología de los viriones

presentes en muestras clínicas. La limitación del método además del costo del microscopio,
es que necesita de una alta concentración de viriones (aproximadamente 109 partículas
virales/ml, dependiendo del virus) presentes en la muestra, por ello es poco sensible. Esto
hace que sea una técnica poco utilizada, más aún con el desarrollo de técnicas alternativas de
utilidad similar (85). El microscopio electrónico nos permite, por ejemplo, obtener resultados
positivos rápidos de muestras de materias fecales de pacientes con diarrea, ya que tanto los
Rotavirus, como los Adenovirus, Coronavirus y Calicivirus pueden ser visualizados e
identificados como causantes de enfermedad. Por ejemplo, los Rotavirus poseen una forma
característica en doble rueda y un tamaño distintivo, 70nm de diámetro, y se los encuentra en
concentraciones de hasta 1011 partículas virales por gramo de heces. También en otras
muestras, como líquido vesicular, biopsia de tejidos, verrugas, orina o suero es posible
obtener resultados positivos, mediante coloración negativa. Si la concentración de virus en
la muestra clínica es baja, y por tanto no visible 7 directamente por microscopio electrónico,
se pueden utilizar técnicas que aumenten la visualización, por ejemplo, la
inmunoelectromicroscopía, que consiste en el agregado de anticuerpos específicos antivirales
y la formación de agregados de partículas que son más fácilmente visibles que las partículas
solas (85).

43
3.3.4 Enzimoinmunoanálisis (EIA)

Los enzimoinmunoanálisis para la detección de antígeno se basan habitualmente en

la captura del antígeno por anticuerpos específicos unidos a una fase sólida, en general el
pocillo de una microplaca o una pequeña esfera de plástico. El antígeno viral presente en la
muestra clínica se combina con el anticuerpo fijado a la fase sólida y el antígeno viral se
detecta mediante la adición de otro anticuerpo específico conjugado a una enzima. La enzima
conjugada suele ser peroxidasa o fosfatasa alcalina (79). El substrato para esas enzimas varía.
En la reacción con la peroxidasa el substrato es un peróxido capaz de oxidar un compuesto
químico incoloro que en su forma oxidada tiene un color característico. En el caso de la
fosfatasa la desfosforilización es la responsable directa de la aparición del color. Por esta
técnica se puede procesar gran número de muestras en forma rápida y automatizada, no
requiriendo de un observador experimentado para leer los resultados, ya que estos se leen por
medio de espectrofotómetros especialmente diseñados, siendo entonces una técnica más
objetiva (79).

3.3.5 Test de Aglutinación

El test de aglutinación es un método simple, de un solo paso, que a veces se usa para
la detección de antígenos virales en muestras clínicas. Los ensayos de aglutinación, dependen
de la fijación inicial de anticuerpos antivirales específicos sobre eritrocitos o partículas de
látex. Luego este reactivo se incuba con la muestra clínica en la cual se investiga el antígeno
y las partículas se aglutinan si el antígeno adecuado se encuentra presente. Estas pruebas en
general se complementan o se confirman por medio de otros ensayos debido al elevado
porcentaje de reacciones inespecíficas. El test de aglutinación ha sido usado para detectar
antígeno de Rotavirus en heces (el más importante) mostrando una buena sensibilidad cuando
se lo compara con el EIA para Rotavirus. Además, es una técnica rápida y barata. También
se la ha usado para detectar antígenos de Adenovirus.

3.4 Elección de prueba diagnóstica.

En la valoración de los diferentes procedimientos de diagnóstico descriptos, se

pueden considerar tres parámetros de importancia fundamental que se define cada uno de
ellos de la siguiente manera:

Tabla 6. Parámetros evaluados en la evaluación de un método de diagnóstico y

su definición. Elaboración propia, Fuentealba, D., (2021)

PARÁMETRO DEFINICIÓN

44
 Sensibilidad Proporción de personas con la infección que
reaccionan positivamente en la prueba
diagnóstica realizada. Por ejemplo: Una
prueba diagnóstica será más sensible,
cuando detecte un mayor número de
personas infectadas o enfermas.

Especifidad Es la proporción de personas sin la infección

o enfermedad que reaccionan como
negativos. Por ejemplo: Una prueba es más
específica cuando tiene menos reacciones
positivas entre las muestras de personas que
no tienen la enfermedad.

Valor Predictivo Es la probabilidad de tener la enfermedad

dado el resultado del test.

Valor Predictivo Positivo Es la probabilidad de tener la enfermedad si

el resultado del test es positivo.

Valor Predictivo Negativo Es la probabilidad de no tener la enfermedad

si el resultado del test es negativo

Los valores predictivos de los test lo determinan la sensibilidad, la especificidad y la

prevalencia de la enfermedad en la población a la que se le aplique el test. Un test de alto
valor predictivo negativo será aquel que tenga una alta especificidad y no necesariamente
una alta sensibilidad. Por el contrario, un test de alto valor predictivo positivo tendrá que
tener una gran especificidad ya que debe acertar la positividad de las muestras realmente
positivas. Por ello un test ideal sería aquel que detectara el 100% de las personas con la
enfermedad y excluyera el 100% de las personas sin la enfermedad, no dando nunca
resultados falsos positivos o falsos negativos. Desafortunadamente, esto no ocurre con las
técnicas disponibles actualmente (96). En la elección del método diagnóstico además de la
sensibilidad y especificidad se debe considerar aspectos operativos en las técnicas a ser
usadas, como ser: costos, complejidad técnica del ensayo, volumen necesario y preparación
de la muestra, tiempo que requiere el proceso, disponibilidad comercial del kit de calidad
reconocida. Además, se debe considerar el nivel de complejidad del laboratorio y la
disponibilidad tecnológica y de recursos que requiere cada técnica (96).

45
 4. MÉTODOS MOLECULARES DE DIAGNÓSTICO VIRAL

4.1 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en inglés polymerase

chain reaction), es un método de biología molecular desarrollado por Kary Mullis en la
década de 1980 (59). Esta técnica se basa en los procesos naturales que usa la célula para
replicar una nueva cadena de DNA complementaria a la hebra molde y así obtener un gran
número de copias de un DNA particular, para ello se emplean ciclos de altas y bajas
temperaturas alternadas con el propósito de separar las hebras del material genético recién
formado tras cada fase de replicación para luego mediante una reacción enzimática poder
amplificarlas.

4.1.1 Fundamentos de la técnica

Este método de diagnóstico presenta generalmente 6 etapas que son: inicio,

desnaturalización, alineamiento o unión al cebador, extensión o elongación de la cadena,
elongación final y conservación, donde en algunos casos se señalan los básicos
correspondientes a desnaturalización, alineamiento y por último extensión (39) (Figura 6).

46
Figura 8: Etapas básicas de PCR. Banda azul: hebras de DNA. Banda roja: Cebadores.
Flechas: dirección polimerización. Tomado y adaptado de Khanacademy. (2020).

La etapa inicial de la PCR consiste en elevar la temperatura de la reacción con el

objetivo de separar las cadenas de DNA por desnaturalización, obteniendo dos plantillas
monocatenarias para poder amplificarlas. En algunos casos la desnaturalización se hace por
adición de sales u otros agentes químicos (15).

El siguiente paso corresponde al alineamiento o unión al cebador, estos son

oligonucleótidos cortos (aproximadamente entre 18 y 30 nucleótidos) complementarios a
sección del DNA que se quiere en este caso amplificar (secuencia diana), ubicándose uno al
comienzo de la cadena monocatenaria y otro al final (13). La unión del cebador a la hebra
molde requiere de la disminución de temperatura en la reacción, entre 40 – 68°C durante 20-
40 segundos (33).

47
 En la etapa de extensión o elongación de la cadena, se eleva nuevamente la
temperatura permitiendo así la extensión de la Taq polimerasa, esta añade los
deoxinucleósidos trifosfatos (dNTP) en dirección 5’ a 3’ sintetizando nuevas hebras de DNA.
Se usa la Taq polimerasa ya que esta proteína tiene la capacidad de soportar temperaturas
altas que pueden llegar a los 80 °C sin desnaturalizarse.

Por último, en algunos casos se eleva la temperatura de 70 a 74°C durante un periodo

de 5 -15 minutos para asegurarse que no queden hebras de DNA sin ser amplificado, además
se incluye un paso llamado conservación durante aproximadamente 10 minutos con el
objetivo de sobrellevar la reacción a corto plazo (70).

Una vez terminada la amplificación se puede utilizar un método llamado

electroforesis para verificar la cantidad y tamaño de los fragmentos de DNA producidos.

4.1.2 Ventajas comparativas

La principal ventaja de la PCR es que permite generar millones de copias de material

genético a partir de una o muy pocas copias de DNA, presenta también una alta especificad
por lo que puede diferenciar especies de microorganismos muy cercanos evolutivamente y
por último puede detectar infecciones virales de forma precoz (20), además se ha evidenciado
una alta sensibilidad y especificad de la PCR en infecciones perinatal de VIH en comparación
con el cultivo viral y el antígeno p24 (19), y también se ha identificado un mayor número de
muestras positivas en muestras bovinas por PCR en comparación con ensayos como ELISA
y AGID para la detección del virus de leucosis (37).

4.1.3 Limitaciones

Una de las limitaciones de la reacción de PCR es el requerimiento de personal

altamente especializado ya que uno de los principales problemas radica en la contaminación
inherente de la muestra que pueden conducir a resultados erróneos, además posee ciertos
problemas de reproducibilidad por lo que dificulta su estandarización para ser llevado a cabo
por personal no capacitado (37). Otro punto importante es el tiempo de resultado

48
relativamente largo 2 a 5 horas, demorándose hasta 72 horas en ser entregados al paciente en
los servicios sanitarios chilenos para detectar el SARS-COV-2, a diferencia de por ejemplo
los test rápidos, con un tiempo de espera de aproximadamente 30 minutos (78). Además, esta
técnica es relativamente costosa sin considerar la instrumentación necesaria. (37)

Por último, con respecto a la técnica, solo durante la fase exponencial de la reacción
de PCR es posible extrapolar hacia atrás para determinar la cantidad inicial de la secuencia
diana contenida en la muestra. la reacción de PCR finalmente deja de amplificar la secuencia
diana a una velocidad exponencial y se produce un "efecto meseta" debido a los inhibidores
de la reacción de la polimerasa que se encuentran en la muestra, la limitación del reactivo, la
acumulación de moléculas de pirofosfato y el autoanillado del producto acumulado, haciendo
que la cuantificación del punto final de los productos de PCR no sea confiable. Este es el
atributo de la PCR que hace que la PCR cuantitativa (q-PCR) en tiempo real sea tan necesaria
(59).

4.1.4 Variantes

4.1.4.1 PCR en tiempo real

La PCR en tiempo real es una variante de la PCR normal en el que además de la

amplificación del material genético es posible cuantificarlo. Para ello es necesario emplear
fluoróforos que pueden ser de dos tipos: de afinidad al DNA o sondas específicas para
fragmentos de DNA, es decir sólo emiten fluorescencia cuando se ha amplificado el material
genético. Finalmente, se realiza la amplificación (síntesis) del ADN o ADNc en un
termociclador acoplado a un sistema óptico, que monitorea la señal de los fluoróforos usados
para detectar el producto amplificado. Debido a que la fluorescencia de éstos aumenta
conforme el producto se amplifica, se combinan los procesos de amplificación y detección
en una sola etapa (3).

4.1.4.2 PCR transcriptasa reversa

La técnica PCR con transcriptasa reversa permite la amplificación de material

genético a partir de RNA formando DNA complementario (DNAc) usando una enzima
llamada transcriptasa reversa. Puede utilizarse como método de detección de genes, estudiar
el material genético de virus RNA como los retrovirus entre ellos el VIH o el virus de la

49
gripe. Actualmente se usa la técnica RT-PCR en tiempo real para diagnosticar la infección
por el virus SARS-COV-2 (virus RNA), siendo el más usado en Chile desde el inicio del
diagnóstico del virus en la población (1).

Figura 9: Representación funcionamiento PCR transcriptasa reversa. Elaboración

propia, Fuentealba, D., (2021).

4.1.4.3 PCR in situ

Con la explosión en la identificación de virus "nuevos" en prácticamente cualquier

especie animal examinada, el dilema se convierte en vincular la presencia de un virus
responsable de una patología en el individuo afectado. Como se señaló anteriormente, esto
se puede hacer utilizando inmunofluorescencia o inmunohistoquímica. Un problema con
estas técnicas, particularmente con un agente recién descubierto, es que no se tienen los
anticuerpos necesarios para su diagnóstico. La alternativa a los sistemas de detección de
anticuerpos es el uso de sondas de ácido nucleico (FISH—hibridación in situ fluorescente).
Estas corresponden a regiones conservadas del genoma se sintetiza con una etiqueta
fluorescente en el extremo 50 (6-carboxifluoresceína como ejemplo). Desde la evaluación
histopatológica de muestras de tejido, pueden seleccionarse cortes que muestren una lesión

50
característica asociada con la enfermedad clínica. La aplicación de la sonda específica del
virus a la sección de tejido permite determinar si el agente es específicamente asociado con
las lesiones en conjunto a la inespecífica señal de PCR positiva de un extracto de tejido (33).

Esta variación de PCR como dice su nombre, se realiza en secciones histológicas o

células que pueden ser visualizadas en el sitio de amplificación puede ser mediante dos
mecanismos:

❖ PCR-hibridación in situ (PISH): Consiste en realizar una PCR sobre el corte de tejido o
la extensión citológica y después detectar el DNA amplificado mediante hibridación in
situ con sondas complementarias marcadas colorimétricamente (avidina-biotina-
peroxidasa).
❖ PCR in situ (en sentido estricto): Consiste en realizar una PCR sobre el corte de tejido o
la extensión citológica utilizando nucleótidos (dNTPs) o cebadores marcados
colorimétricamente o con fluorescencia. (23)

4.1.4.4 PCR múltiple

Esta variante de PCR lleva su nombre ya que puede amplificar simultáneamente más
de una hebra de DNA, combinándose múltiples parejas de cebadores, con la precaución de
estar lo suficientemente lejos unas de otras para que las amplificaciones no interfieran entre
sí. (23)

Los ensayos de PCR multiplex se utilizan ahora con frecuencia para detectar la
presencia de una variedad de virus implicados en síndromes específicos como infecciones
respiratorias, por ejemplo: Influenza virus (INF) A y B, virus de la parainfluenza (PIV) tipos
1, 2, 3 y 4, virus respiratorio sincitial humano, metaneumovirus humano (hMPV), rinovirus
humanos (RV), coronavirus humanos y coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo
(SARS-CoV), humano enterovirus (EV) y adenovirus. Entre sus desventajas, incluyen costos
de puesta en marcha más altos, costos de reactivos más altos y capacitación extensa y
específica para laboratorios especializados y equipo especializado para su funcionamiento.

51
4.1.4.5 PCR anidada

Se realizan dos PCR consecutivas de 25 a 30 ciclos cada una. En la primera se utilizan

un par de cebadores llamados externos; en la segunda se usan cebadores complementarios a
secuencias de ADN contenidas en los fragmentos que se amplificaron en la primera PCR
(llamados cebadores internos) que flanquean una región central que es la que queremos
amplificar. El fundamento de esta técnica es que los productos de la primera amplificación
son un molde ideal para la segunda amplificación, mucho mejor que el ADN genómico
original. Dada su enorme sensibilidad, uno de los peligros de esta técnica es la
contaminación, por lo que su utilización es difícil en laboratorios de rutina. (23)

4.2.1 Secuenciación masiva.

En 1975, Sanger y Coulson publicaron el primer método enzimático para secuenciar

el DNA a través de la incorporación de dideoxinucleótidos terminales, y poco después
lograron secuenciar el genoma del bacteriófago Phi-X174, que fue el primer ácido nucleico
totalmente secuenciado en la historia de la humanidad (31). En los últimos años se han
desarrollado nuevas plataformas de secuenciación denominadas de alto rendimiento o nueva
generación (NGS por sus siglas en inglés) que son capaces de generar de forma paralela y
masivamente millones de copias de material genético en un único proceso de secuenciación,
elevando significativamente su rendimiento a un menor coste y ofreciendo ventajas
significativas respecto a los sistemas convencionales de secuenciación (54).

4.2.1.1 Fundamentos de la técnica.

El gran avance que alteró para siempre el progreso de la tecnología de secuenciación

de DNA se produjo en 1977, con el desarrollo de la técnica de "terminación de cadena" o
didesoxi de Sanger. Esta técnica utiliza análogos químicos de los desoxirribonucleótidos
(dNTP) que son los monómeros de las cadenas de DNA. Los didesoxinucleótidos (ddNTP)
carecen del grupo hidroxilo 3 ′ que se requiere para la extensión de las cadenas de DNA y,

52
por lo tanto, no pueden formar un enlace con el fosfato 5 ′ del siguiente dNTP (36). La mezcla
de ddNTP radiomarcados en una reacción de extensión de DNA a una fracción de la
concentración de dNTP estándar da como resultado la producción de hebras de DNA de cada
longitud posible, ya que los didesoxinucleótidos se incorporan aleatoriamente a medida que
la hebra se extiende, deteniendo la progresión adicional. Al realizar cuatro reacciones
paralelas que contienen cada base de ddNTP individual y ejecutar los resultados en cuatro
carriles de un gel de poliacrilamida, se puede utilizar la autorradiografía para inferir cuál era
la secuencia de nucleótidos en la plantilla original, ya que habrá una banda radioactiva en el
carril correspondiente. en esa posición del gel (ver figura 8). Aunque se trabajaba con el
mismo principio que otras técnicas (el de producir todas las posibles secuencias de longitud
incremental y etiquetar el nucleótido final), la precisión, robustez y facilidad de uso llevaron
al método de terminación de cadena didesoxi, o simplemente, secuenciación de Sanger, a
convertirse en la tecnología más común utilizada (35).

53
54
Figura 10. Tecnología de secuenciación de DNA de primera generación. El ejemplo de
ADN que se va a secuenciar (a) se ilustra mediante secuenciación de Sanger (b) o Maxam-
Gilbert (c), los fragmentos generados a partir de cualquiera de las metodologías se pueden
visualizar mediante electroforesis en un gel de poliacrilamida de alta resolución (d). Tomado
de Heather y col (2016).

4.2.1.2 Secuenciación de primera generación

La secuenciación de primera generación se basó en la utilización de métodos y

técnicas bioquímicas capaces de cortar cadenas de RNA en sitios específicos y ya
reconocidos (35), el procedimiento general de las técnicas de secuenciación incluye 5 etapas,
que son:

Tabla 7: Etapas de la secuenciación en general con su definición correspondiente.

Elaboración propia Fuentealba, D., (2021)

ETAPA DEFINICIÓN
Fragmentación del DNA Generación de pequeños fragmentos de
distinto tamaño, luego se unen a sus
extremos moléculas llamadas adaptadores
(La unión del adaptador más el fragmento
de DNA se conoce como librería)
Enriquecimiento (opcional) Consiste en seleccionar exclusivamente las
áreas de interés antes de la secuenciación.
Ligación Unión del material amplificado a una
superficie sólida donde se llevará a cabo la
reacción de secuenciación.
Secuenciación Uso de métodos y técnicas bioquímicas con
el propósito de determinar el orden del
material genético, tanto la secuenciación y
detección de las bases ocurren al mismo

55
 tiempo en todas las moléculas de ADN
(secuenciación masiva y paralela)
Creación de archivos Creación de una base de datos con la
información de la secuenciación y
alineamiento de las lecturas contra un
genoma de referencia.

Los dispositivos de secuenciación de primera generación producen lecturas de

aproximadamente 1 Kilobase (Kb) de longitud (considerando que el Homo-sapiens consta de
unos 3200 millones de pares de bases (102), por lo tanto, para analizar fragmentos más largos,
los investigadores utilizaban ‘‘fragmentos de escopeta’’ en el que el material genético
superpuesto se clonaba y se secuenciaba por separado (35).

4.2.1.3 Secuenciación de segunda generación:

Con el desarrollo de esfuerzos de secuenciación didesoxi a gran escala, apareció otra

técnica que preparó el escenario para la primera ola en la próxima generación de
secuenciadores de DNA. Este método difería de los métodos existentes en que no infirió la
identidad de nucleótidos mediante el uso de dNTP u oligonucleótidos marcados con radio o
fluorescencia antes de visualizar con electroforesis. En su lugar, los investigadores utilizaron
un método luminiscente descubierto recientemente para medir la síntesis de pirofosfato: este
consistía en un proceso de dos enzimas en el que se usa ATP sulfurilasa para convertir el
pirofosfato en ATP, que luego se usa como sustrato para la luciferasa, produciendo así luz
proporcional a la cantidad. de pirofosfato (35).

Las máquinas de secuenciación de segunda generación fueron un cambio de

paradigma en el sentido que permitieron la paralelización masiva de reacciones de
secuenciación, aumentando la cantidad de DNA que se puede secuenciar (35).

56
 Figura 11. Tecnología de secuenciación de DNA de segunda generación. PCR en
emulsión (a), PCR puente (b). Tomado y adaptado de Pareek, C y col (2011) (36)

Estas plataformas de segunda generación pueden generar entre quinientos millones

de bases de secuencia sin procesar y miles de millones de bases en una sola ejecución. En la
PCR en emulsión (Ver figura 9, A), la mezcla de reacción consiste en una emulsión aceite-
agua creada para encapsular complejos entre el DNA y nanoesferas, dentro de gotículas de
agua. Tras la emulsión, se lleva a cabo la amplificación, de tal manera que cada nanoesfera
queda recubierta por varios miles de copias de la misma secuencia molde formando una
polonia. En la PCR puente (B), la secuenciación tiene lugar sobre una placa de vidrio, sobre
la que están dispuestos adaptadores complementarios a los adaptadores anclados en las
secuencias desnaturalizadas a secuenciar. Así, cada fragmento de DNA monocatenario se
unirá por uno de sus extremos a uno de los oligonucleótidos complementarios presentes en
la placa. Tras la acción de la polimerasa, que utiliza estos adaptadores como cebador, se
sintetiza la cadena complementaria, quedando inmovilizada. Seguidamente, tendrá un nuevo

57
ciclo de desnaturalización, provocando que las hebras desnaturalizadas formen puentes
gracias a la unión de su extremo libre con otro de los adaptadores inmovilizados en la placa.
Este proceso se repite varias veces, hasta formar lo que se conoce como clusters, una
agrupación de secuencias idénticas inmovilizadas sobre una superficie sólida. (68).

4.2.1.4 Secuenciación de tercera generación.

En las plataformas HT-NGS de segunda generación discutidas anteriormente, el

principio se basaba en la amplificación por PCR en emulsión de fragmentos de DNA, para
hacer que la señal de luz sea lo suficientemente fuerte para la detección de bases confiable
por las cámaras CCD (Dispositivo de carga acoplada). Aunque la amplificación por PCR ha
revolucionado el análisis de ADN, en algunos casos puede introducir errores de secuencia de
bases o favorecer ciertas secuencias sobre otras, cambiando así la frecuencia relativa y la
abundancia de varios fragmentos de ADN que existían antes de la amplificación. Para superar
esto, se podría lograr la miniaturización final en la nanoescala y el uso mínimo de
bioquímicos si la secuencia pudiera determinarse directamente a partir de una sola molécula
de DNA, sin la necesidad de amplificación por PCR y su potencial de distorsión de los niveles
de abundancia. Esta secuenciación de una sola molécula de DNA ahora se denomina "tercera
generación de tecnología HT-NGS”. El concepto de secuenciación por síntesis sin una etapa
de amplificación previa, es decir, secuenciación de una sola molécula (35).

4.2.1.5 Utilidad en investigación y diagnóstico viral.

El hito de la secuenciación del genoma humano fue logrado por dos grupos de
científicos utilizando estrategias diferentes de secuenciación (68), con ello se han podido
detectar distintos tipos de variaciones genómicas y mutaciones en distintos tipos de
organismos e incluso en virus (35).

La actual pandemia surgió durante la era de la epidemiología genómica impulsada

por los continuos avances en la secuenciación de próxima generación. Desde su reciente
aparición, la epidemiología genómica permitió la identificación precisa de nuevas cepas o
especies de agentes patógenos y la reconstrucción de su variabilidad genética en tiempo real,
lo que se hizo evidente en los brotes de influenza H1N1, MERS y SARS. Sin embargo, la

58
escala global y descontrolada de esta pandemia ha generado una situación que obligó a
utilizar de forma masiva herramientas de la epidemiología genómica como la rápida
identificación del SARS-CoV-2 y el registro de nuevas cepas y su vigilancia activa en todo
el mundo. Antes de la pandemia de COVID-19 la disponibilidad de datos genómicos de
agentes patógenos circulantes en varios países de Latinoamérica era escasa o nula (16). Con
la llegada del SARS-CoV-2 dicha situación cambió significativamente, aunque la cantidad
de información disponible sigue siendo escasa y, en países como Colombia, Brasil, Argentina
y Chile, la información genómica del SARS-CoV-2 provino principalmente de grupos de
investigación en epidemiología genómica más que como producto de una política o programa
de vigilancia en salud pública (6). Por lo tanto, esta pandemia ha puesto de manifiesto la
importancia de la secuenciación genómica en dos aspectos clave en enfermedades
infecciosas, la identificación rápida del patógeno que causa la infección, y su caracterización,
seguimiento y evolución que faciliten el control de la infección. El estado de desarrollo de la
secuenciación y de su metodología de análisis en las unidades de genómica y bioinformática
de los centros de investigación y sanitarios ha facilitado enormemente su aplicación durante
esta pandemia, aunque es necesario llegar a protocolos estandarizados y armonizados que
permitan la comparación de datos de una forma fidedigna (102).

4.2.1.6 Ventajas comparativas.

La secuenciación masiva como se ha dicho anteriormente, permite detectar distintos

tipos de mutaciones en un tiempo relativamente corto dependiendo de la cantidad de pares
de bases que se quiera secuenciar y día a día se están realizando mejoras continuas con el
propósito de que sea más eficiente. Su uso radica principalmente en la epidemiología de las
enfermedades infecciosas y se complementa con las otras técnicas de diagnóstico como la
PCR.

La secuenciación masiva ha transformado la microbiología, sobre todo desde que se han

reducido los costes y los tiempos de análisis, gracias al desarrollo de la bioinformática, que
va generando nuevos programas de análisis. La masiva generación de datos requerirá cada
vez más inversiones en grandes centros de supercomputación, y el desarrollo de programas
de código abierto será cada vez más profuso, aunque, paralelamente, se comercializarán
paquetes de uso bioinformático que requerirán mínimos conocimientos técnicos (9).

59
4.3.1 Citometría de flujo

A grandes rasgos, la citometría de flujo es una tecnología que proporciona un análisis

multiparamétrico rápido de células individuales en solución, estos utilizan láseres como
fuentes de luz para producir señales de luz tanto dispersas como fluorescentes que son leídas
por detectores como fotodiodos o tubos fotomultiplicadores. Estas señales se convierten en
señales electrónicas que son analizadas por una computadora y escritas en un archivo de
datos de formato estandarizado (55).

Esta tecnología es una herramienta poderosa que tiene aplicaciones en inmunología,

biología molecular, bacteriología, virología, biología del cáncer y monitoreo de
enfermedades infecciosas que ha visto avances dramáticos en los últimos 30 años,
permitiendo detalles sin precedentes en los estudios del sistema inmunológico y otras áreas
de la biología celular (55). También, es un instrumento sofisticado que mide múltiples
características físicas de una sola celda, como el tamaño y la granularidad, simultáneamente
mientras la celda fluye en suspensión a través de un dispositivo de medición. Su
funcionamiento depende de las características de dispersión de la luz de las células bajo
investigación, que pueden derivarse de colorantes o anticuerpos monoclonales dirigidos a
moléculas extracelulares ubicadas en la superficie o moléculas intracelulares dentro de la
célula (2).

4.3.1.1 Fundamento de la técnica.

Un citómetro de flujo tradicional consta de tres sistemas los que se encuentran:

sistema fluídico o sistema de fluidos, sistema óptico y sistema electrónico (55) que se
describen a continuación:

60
Tabla 8: Sistemas que se encuentran en un citómetro de flujo tradicional con su
respectiva descripción. Elaboración propia, Fuentealba, D., (2021)

SISTEMA FUNCIONAMIENTO
De fluidos Fluido envolvente (generalmente una
solución salina tamponada) que se presuriza
para administrar y enfocar la muestra al
punto de intercepción o interrogación del
láser donde se analiza la muestra.
Óptico Ópticas de excitación (láseres) y ópticas de
recogida (tubos fotomultiplicadores o PMT
y fotodiodos) que generan las señales de luz
visible y fluorescente que se utilizan para
analizar la muestra.
Electrónico Convierte las señales de los detectores en
señales digitales que pueden ser leídas por
una computadora.

En el sistema de fluidos su función principal es alinear y transportar células dentro de

una cámara de flujo hacia el haz de luz, por lo tanto, es necesario que la muestra se encuentre
suspendida en un fluido, en el cual se aplica una propiedad hidrodinámica que consiste en la
inyección de la muestra en el centro de una corriente de fluido envolvente, el cual puede ser
agua o un buffer de fosfatos (87). Lo anterior se logra porque la presión de la muestra es
mayor que la presión del líquido envolvente por lo que gracias a este sistema, las células
pueden ser alineadas en “fila india”, y de esta manera se asegura que el haz de luz incida
sobre una célula a la vez (70) (Ver figura 10).

El sistema óptico está compuesto por láseres y filtros, que se encargan de iluminar a
las células y dirigir las señales resultantes hacia los detectores apropiados. Las células, al ser
incididas por el láser, tendrán la capacidad de dispersar la luz de acuerdo con su tamaño y su
granularidad. En caso de que la luz se disperse frontalmente, se obtendrá un parámetro
denominado FSC (forward scatter), que indica el tamaño de la célula (aunque también se

61
puede realizar en partículas virales) (Figura 11). Por tal motivo, aquellas células marcadas
con fluorocromos serán excitadas por el láser y la luz será dirigida hacia un detector, el cual
recibirá la longitud de onda emitida por la excitación del fluorocromo. Gracias a este sistema,
se puede conocer el tamaño y la granularidad de la célula, así como las proteínas que se
expresan (marcadores), permitiendo así la identificación de diferentes tipos celulares. A
medida que el citómetro posea más detectores, mayor será su capacidad para identificar
poblaciones celulares (55).

Figura 12. Representación del sistema óptico de un citómetro de flujo

tradicional. Tomado y adaptado de McKinnon y col. (2018).

Como se mencionó anteriormente, el marcaje celular con anticuerpos monoclonales

acoplados a fluorocromos, representa un paso crucial para la identificación de subtipos
celulares mediante el uso de la técnica de citometría de flujo. Los anticuerpos monoclonales
permiten detectar y “etiquetar” poblaciones específicas de células (2). Esta tecnología
consiste en la creación de un anticuerpo que sea capaz de unirse a una estructura específica
(antígeno), mismo que se expresa en el tipo celular que se requiere identificar.
Adicionalmente, este anticuerpo debe contener una unión covalente a un fluorocromo, que

62
emitirá luz fluorescente cuando sea excitado por el láser (2) de este modo, la célula se “tiñe”
y facilitará la identificación de las células que se unieron al anticuerpo o marcador (71).

Por último, los resultados obtenidos pueden ser representados mediante diferentes
estilos, desde una gráfica de puntos hasta una figura tridimensional; la clave se centra en
seleccionar los gráficos que reflejen los resultados con precisión y sin generar confusiones
(71).

Los distintos gráficos que podemos encontrar en resultados de citometría de flujo se

muestran a continuación

Tabla 9: Descripción de los distintos gráficos que se pueden encontrar como resultado
en la técnica de citometría de flujo. Elaboración propia, Fuentealba, D., (2021)

Gráfico de puntos Este gráfico muestra la relación entre dos

marcadores diferentes y muestra a cada
punto como un evento (se define como
evento a cualquier partícula que haya sido
excitada por el láser).
Gráfico de densidad Estos gráficos, además de representar a las
poblaciones con base en la expresión de dos
marcadores, muestran la frecuencia relativa
(densidad) de las poblaciones mediante
colores cercanos al naranja (gráfico
pseudocolor), o mediante líneas.
Histograma Los histogramas muestran la intensidad de
expresión de un marcador versus el número
de eventos. El desplazamiento de la curva
hacia la derecha indica mayor expresión del
marcador, mientras que la altura del pico
indica la frecuencia de las células
capturadas.

63
 Gráficos 3D Este tipo de gráficos permite comparar a las
poblaciones con respecto a la expresión de
tres marcadores diferentes y la frecuencia
relativa.

4.3.1.2 Utilidad en investigación y diagnóstico viral.

Por tratarse de una técnica de identificación y cuantificación específica de células, la

citometría de flujo facilita el diagnóstico o seguimiento de patologías como leucemias,
linfoma, inmunodeficiencia primaria, monitoreo del estado hematológico de pacientes con
infección de VIH, así como la detección de células cancerosas o tumorales (55).

Actualmente, la citometría de flujo es una poderosa herramienta para el diagnóstico,

clasificación y determinación del pronóstico de diversas enfermedades, no obstante, es
imprescindible vincular la investigación biomédica con la investigación clínica, y de esta
manera, fortalecer la caracterización de nuevas poblaciones celulares que se encuentren
implicadas en el desarrollo de estas patologías (2).

En el mundo globalizado de hoy la citometría de flujo ha mostrado a lo largo y ancho

del planeta ser de gran utilidad para la detección o identificación de microorganismos desde
bacterias hasta diferentes familias de virus incluyendo Baculoviridae, Herpesviridae,
Myoviridae, Picordnaviridae, Retroviridae, Rotavirus, entre otros (87).

Varios estudios han descrito las características biológicas e inmunológicas de las

epidemias de coronavirus anteriores (SARS, MERS) y la mayoría de los investigadores han
utilizado la citometría de flujo para describir los cambios en los linfocitos T y B, así como el
papel de las células inflamatorias en la inmunopatogénesis de la enfermedad. Actualmente,
se dispone de información muy limitada sobre el estado inmunológico innato del huésped de
los pacientes infectados con SARS ‐ CoV ‐ 2 y con respecto a la descripción del aumento de
neutrófilos totales, reducción de linfocitos totales y aumento de los niveles séricos de IL ‐ 6
y de proteína C reactiva. lo que sugiere una fuerte respuesta inflamatoria en estos pacientes
(16).

64
4.3.1.3 Ventajas comparativas.

Las ventajas que proporciona la citometría de flujo frente a otros métodos que
emplean fluorocromos es que se puede utilizar para medir muchos parámetros, y obtener
medidas cualitativas y cuantitativas de cada célula, siendo una técnica con alta sensibilidad,
especificidad y objetividad. Además, puede utilizarse de forma muy sencilla para diferenciar
poblaciones celulares y determinar diferencias en tamaño y/o complejidad en nuestras células
favoritas por tratamientos o condiciones determinadas. Y también nos sirve para medir, en
general, cualquier elemento que podamos marcar en la célula, desde marcajes muy simples,
como transfecciones con GFP, hasta dobles marcajes con anticuerpos secundarios, entre otros
parámetros (87).

4.3.1.4 Avances y descubrimientos

La disponibilidad de métodos de alta capacidad de procesamiento, el incremento

continuo de las capacidades de los sistemas de computación, los nuevos desarrollos en los
softwares para análisis y la creatividad de los investigadores han acelerado los
descubrimientos en la genómica, proteómica y los campos relacionados en el mundo. El
conocimiento obtenido en estas áreas augura un futuro promisorio para entender el impacto
directo que los microorganismos tienen no sólo en la vida humana, sino que también en
distintas áreas como aplicaciones industriales, veterinaria, agricultura, entre otros (2).

A continuación, se presenta una tabla resumen con los distintos métodos moleculares
descritos.

Tabla 10: Ventajas y desventajas de los métodos de diagnóstico molecular descritos en

la revisión. Elaboración propia, Fuentealba, D., (2021)

TÉCNICA DE BIOLOGÍA VENTAJAS DESVENTAJAS

MOLECULAR
PCR simple y múltiple -Mayor rapidez que los -Técnicamente puede ser un
métodos basados en reto optimizar las
cultivos. condiciones de PCR
-Alta especificidad y
sensibilidad

65
 -PCR múltiple: Detecta -Se requiere
varios patógenos al enriquecimiento para
mismo tiempo. detección
-Automatizados -Se necesita procesamiento
-Resultados precisos y post- PCR de los productos
exactos a partir de la (electroforesis)
detección genética -Costosa
específica -Requiere personal
-Diferenciación de varios calificado para su
serotipos de funcionamiento.
microorganismos.

PCR en tiempo real -Es más específica y -Dificultad en ensayos

sensible que los métodos múltiples
de cultivo -Labilidad del ARNm
-No se encuentra -Posibilidad de
influenciada por la contaminación cruzada.
amplificación no -Requiere personal
específica, esta puede calificado para su
además ser monitoreada manipulación
en tiempo real.
Secuenciación Masiva -Alta precisión y -Costosa.
sensibilidad. -Requiere personal
-Más rápido que los calificado para su
métodos basados en funcionamiento.
cultivo -Su uso radica más en la
epidemiología como tal más
que en el diagnóstico
Citometría de flujo -Alta sensibilidad y -Costosa.
especifidad. -Requiere personal
-Más rápido que los calificado para su
métodos basados en manipulación.
cultivo.

66
 CONCLUSIONES

Hoy en día, la tendencia en el diagnóstico viral consiste en emplear nuevas y más

sensibles tecnologías de detección de antígenos y de investigación de ácidos nucleicos con
el propósito de lograr un diagnóstico viral más rápido y efectivo. Las técnicas de biología
molecular presentan varias ventajas, entre ellas su rapidez, costo/beneficio y el hecho de que
el resultado no es fácilmente alterado por la calidad de la muestra y momento de recolección
de ésta en relación al inicio de los síntomas.

La velocidad de implementación de técnicas de biología molecular en laboratorios

de virología no ha sido muy rápida, considerando los costos directos e indirectos que se
requieren. Hasta ahora, la inmunofluorescencia es indirecta han sido la técnica de detección
más utilizada, por ser barata, rápida y fácil de implementar. Sin embargo, los costos de las
técnicas de biología molecular han tenido una reducción consistente, dada la capacidad de
análisis simultáneo de múltiples virus, lo que reduce volúmenes de reactivos utilizados y
aumentan el grado de automatización de la técnica.

La patogenia y la epidemiología ayudan a tomar decisiones con respecto a la prueba

correcta para elegir un diagnóstico apropiado. Los avances en la especificidad y sensibilidad
y la capacidad para realizar pruebas para una variedad de virus a través de múltiples
plataformas hacen un diagnóstico preciso e identificación rápida de virus circulantes para
obtener datos clínicos relevantes. Posibilitar nuevas técnicas para la identificación de virus
emergentes y reemergentes. La calidad de las muestras, la historia clínica y la presentación
del paciente y la estrecha colaboración entre el médico, el patólogo y el laboratorio siguen
siendo fundamentales para datos de diagnóstico para una mejor gestión del paciente.

Las pruebas moleculares han mejorado enormemente la capacidad del laboratorio

para diagnosticar infecciones virales. El aumento de la sensibilidad significa que los
pacientes infectados serán diagnosticados con mayor precisión y más a menudo,
especialmente en momentos durante el curso de su infección cuando están diseminando
niveles bajos de virus que ser pasado por alto por pruebas no moleculares. El beneficio de un
diagnóstico más preciso es cuádruple: primero, beneficia al paciente en términos de recibir

67
los medicamentos antivirales apropiados; en segundo lugar, ayuda a controlar las infecciones
médicos en la provisión de medidas apropiadas de control de infecciones, como la contención
de gotas cuando sea necesario para minimizar el riesgo de diseminación nosocomial; tercero,
puede detener la búsqueda de un diagnóstico incluso si no hay un agente antiviral beneficioso
para el virus que se encontró; y cuarto, proporciona más información precisa a las autoridades
de salud pública sobre qué virus están circulando en la comunidad para que puedan ajustar
la política de salud pública en consecuencia.

68
 BIBLIOGRAFIA

1. ¿Por qué en Chile utilizamos el RT-PCR si existen 6 técnicas para el diagnóstico de

COVID? (2020). https://www.uchile.cl/noticias/164468/tecnicas-para-la-deteccion-
covid-por-que-en-chile-usamos-rt-pcr.

2. Adan, A., et al. (2017). "Flow cytometry: basic principles and applications." Critical
Reviews in Biotechnology 37(2): 163-176.
3. Aguilera, P., Ruiz Tachiquín, M., Rocha Munive, M. G., Pineda Olvera, B., Chánez
Cárdenas, M. E., & Chain, P. (2015). Herramientas moleculares aplicadas en
ecología. PCR en tiempo real. Herramientas Moleculares Aplicadas En Ecología,
13(3), 175–202. http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones2/libros/710/pcrtiempo.pdf

4. Almanza Holguín, L. N. and J. P. Duque Varela (2020). Estandarización de una

metodología para la cuantificación de títulos virales por citometría de flujo: virus
dengue y zika, Universidad El Bosque.
5. Alonso, R., Aguilera, A., Córdoba, J., & Fuertes, A. (2015). Diagnóstico
microbiológico de las hepatitis virales. Enfermedades Infecciosas y Microbiología
Clínica, 33(9), e53-e62. https://doi.org/10.1016/j.eimc.2014.08.002
6. Álvarez Díaz DA, Laiton-Donato K, Franco-Muñoz C, Mercado-Reyes M.
Secuenciación del SARS-CoV-2: la iniciativa tecnológica para fortalecer los sistemas
de alerta temprana ante emergencias de salud pública en Latinoamérica y el Caribe.
biomedica [Internet]. 30 de octubre de 2020;40(Supl. 2):188-97. Disponible en:
https://revistabiomedica.org/index.php/biomedica/article/view/5841.
7. Álvarez R. Guía de estudios: técnicas histológicas (2001). Facultad de Ciencias
Veterinarias Departamento de Ciencias Biológicas. (N.o 1–15). UNCPBA.
8. Budnik, I., Ferrés, M., & Pardo, T. (2016). Aporte de la biología molecular en el
diagnóstico de infecciones respiratorias agudas. Revista Chilena de Enfermedades
Respiratorias, 32, 224–232.

69
9. Cadena-Zamudio, Jorge & Martínez-Peña, Marcos & Guzman, Luis & Arteaga-
garibay, Ramón. (2016). Aplicación de secuenciación masiva para el estudio y
exploración de diversidad microbiana y su aprovechamiento biotecnológico. 9. 13.
Carballal, G., et al. (2014). Virus respiratorios emergentes y el nuevo impacto de los
rinovirus por medio del diagnóstico molecular, Corpus.
10. Castaño, M. E., & Zapata, J. C. (2000). Cultivos celulares. Fondo Editorial
Biogénesis, 49-64.
11. Caygill, R. L., et al. (2010). "A review on viral biosensors to detect human
pathogens." Anal Chim Acta 681(1-2): 8-15.
12. Chang, K. S. (1994). Polymerase chain reaction. Cancer Bulletin, 46(3), 280–283.
https://doi.org/10.1007/978-3-662-44185-5_1252
13. Conde-Ferráez, L., Ceh-Guerrero, A. L., Canché-Pech, J. R., Ayora-Talavera, G., &
del Refugio González-Losa, M. (2019). Infección por citomegalovirus humano en
neonatos de un hospital público de Mérida, Yucatán. Gaceta medica de México,
155(4), 336-342.

14. Contreras, Ana M., & Reta, Cynthia B, & Torres, Oscar, & Celis, Alfredo, &
Domínguez, Jacqueline (2011). Sangre segura en ausencia de infecciones virales por
VHB, VHC y VIH en período de ventana serológica de donadores. Salud Pública de
México, 53 (1), S13-S18. ISSN: 0036-3634. Disponible en:
https://www.redalyc.org/articulo.oa?id=10619778003
15. Cossarizza A, De Biasi S, Guaraldi G, Girardis M, Mussini C; Modena Covid-19
Working Group (MoCo19). SARS-CoV-2, the Virus that Causes COVID-19:
Cytometry and the New Challenge for Global Health. Cytometry A. 2020
Apr;97(4):340-343. doi: 10.1002/cyto.a.24002. Epub 2020 Mar 18. PMID:
32187834; PMCID: PMC7162395.

16. De Buitrago J. M. (2010). Técnicas virológicas y virología clínica. Técnicas y

Métodos de Laboratorio Clínico, 501–510. https://doi.org/10.1016/B978-84-458-
2029-2.50036-7

70
17. De Grazia, S., et al. (2019). "Performance evaluation of gastrointestinal viral ELIte
panel multiplex RT-PCR assay for the diagnosis of rotavirus, adenovirus and
astrovirus infection." J Virol Methods 268: 48-52.
18. Dougnac, A. Manual de toma, manejo y envío de muestras al laboratorio clínico
(2013, octubre). Ministerio de Salud del Salvador.
19. Debiasi RL, Tyler KL. Molecular methods for diagnosis of viral encephalitis. Clin
Microbiol Rev. 2004 Oct;17(4):903-25, table of contents. doi:
10.1128/CMR.17.4.903-925.2004. PMID: 15489354; PMCID: PMC523566.
20. Debiasi, R. L., & Tyler, K. L. (2004). Molecular methods for diagnosis of viral
encephalitis. Clinical microbiology reviews, 17(4), 903–925.
https://doi.org/10.1128/CMR.17.4.903-925.2004
21. Del Pilar Crespo, M. (2000). El diagnóstico viral por el laboratorio. Colombia
Médica, 31(3), 135-150.
22. Del Carmen C, Variantes de PCR. (2011). Dermatología Peruana, 9(1), 15–29.
23. Edward H, MT Ph D, Pérez-Campos Mayoral L Ph D, Sánchez Navarro LM, et
al. ¿Debería considerarse la RT-PCR un estándar de oro en el diagnóstico de COVID-
19? Revista de Virología Médica. Enero de 2021; 93 (1): 137-138. DOI: 10.1002 /
jmv.26228. PMID: 32592498; PMCID: PMC7361438.
24. Ed, Y. (2013). Giant viruses open Pandora’s box. Nature. Antiviral Res 79(1): 1-5.
25. Eiros, J. M., Ortiz de Lejarazu, R., Tenorio, A., Casas, I., Pozo, F., Ruiz, G., & Pérez-
Breña, P. (2009). Diagnóstico microbiológico de las infecciones virales respiratorias
[Microbiological diagnosis of viral respiratory infections]. Enfermedades infecciosas
y microbiologia clinica, 27(3), 168–177. https://doi.org/10.1016/j.eimc.2008.03.004
26. Fernández, M. A. M., González, E. O., Caspistegui, J. N., Gutiérrez, M. D. G.,
Sampelayo, T. H., & Fernández-Cruz, E. (1996). Estudio comparativo de tecnicas
para el diagnóstico del virus de la inmunodeficiencia humana en niños menores de 15
meses por: cultivo viral, reacción en cadena de la polimerasa y antígeno p24. Canales
Españoles de Pediatría, 44(6), 540–544.
https://www.aeped.es/sites/default/files/anales/44-6-4.pdf

27. Filippone, M. P., et al. (2010). Molecular diagnosis of systemic sugarcane diseases in
Argentina. methodology adjustment and applications." 87(2).

71
28. Forbes, B. A., et al. (2007). Diagnostic microbiology, Mosby St Louis.
29. Gadsby, N. J., et al. (2010). "Comparison of the Luminex Respiratory Virus Panel
fast assay with in-house real-time PCR for respiratory viral infection diagnosis."
48(6): 2213-2216.
30. Goldsmith, C. S., & Miller, S. E. (2009). Modern uses of electron microscopy for
detection of viruses. Clinical microbiology reviews, 22(4), 552–563.
https://doi.org/10.1128/CMR.00027-09
31. González Muñoz, G., Laferte Serrano, J., Guzmán Tirado, M. G., Rosario
Domínguez, D., & Rodríguez Váldez, C. (1992). Evaluación de un sistema
ultramicroELISA para el diagnóstico de la rubéola. Rev. cuba. med. trop, 220-3.
32. Green, M. R., & Sambrook, J. (2018). The Basic Polymerase Chain Reaction
(PCR). Cold Spring Harbor protocols, 2018(5), 10.1101/pdb.prot095117.
https://doi.org/10.1101/pdb.prot095117
33. Gunson, R., et al. (2005). "Real-time RT-PCR detection of 12 respiratory viral
infections in four triplex reactions." 33(4): 341.
34. Heather, JM y Chain, B. (2016). La secuencia de secuenciadores: La historia de la
secuenciación del ADN. Genómica, 107 (1), 1-
8. https://doi.org/10.1016/j.ygeno.2015.11.003
35. ICTV. (2020). The ICTV report on Virus Classification and Taxon Nomenclature.
36. Instituto Catalán de Nanociencia y Nanotecnología. (2020). Técnicas y sistemas de
diagnóstico para COVID-19: clasificación, características, ventajas y limitaciones
diagnóstico de COVID-19 SARS-CoV-2. NanoB2A - ICN2, 1–10.
http://www.ciencia.gob.es/stfls/MICINN/Ministerio/FICHEROS/TecnicasDiagnosti
coCOVID19-ICN2.pdf
37. Instituto Catalán de Nanociencia y Nanotecnología. (2017). Técnicas y sistemas de
diagnóstico para COVID-19: clasificación, características, ventajas y limitaciones
Diagnóstico de COVID-19 SARS-CoV-2.
38. Khanacademy. (2020). Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
https://www.khanacademy.org/science/ap-biology/gene-expression-and-
regulation/biotechnology/a/polymerase-chain-reaction-pcr

72
39. Kreuze, Jan & Perez, Ana & Untiveros, Milton & Quispe-Huamanquispe, Dora &
Fuentes, Segundo & Barker, Ian & Simon, Reinhard. (2009). Complete viral genome
sequence and discovery of novel viruses by deep sequencing of small RNAs: A
generic method for diagnosis, discovery and sequencing of viruses. Virology. 388. 1-
7. 10.1016/j.virol.2009.03.024.
40. Kuypers, J., Wright, N., Ferrenberg, J., Huang, M. L., Cent, A., Corey, L., & Morrow,
R. (2006). Comparison of real-time PCR assays with fluorescent-antibody assays for
diagnosis of respiratory virus infections in children. Journal of clinical
microbiology, 44(7), 2382–2388. https://doi.org/10.1128/JCM.00216-06
41. La Scola, B., Desnues, C., Pagnier, I. et al. The virophage as a unique parasite of the
giant mimivirus. Nature 455, 100–104 (2008). https://doi.org/10.1038/nature07218

42. Lara-Villegas, H. H., Ayala-Núñez, N. V., & Rodríguez-Padilla, C. (2008).

Bioseguridad en el laboratorio: medidas importantes para el trabajo seguro.
Bioquimia, 33(2), 59-70.
43. Larrañaga Larrañaga, C., Avendaño Carvajal, L. F., Gaggero Brillouet, A., Suárez
González, M., Montaldo, G., Palomino, M. A., & Díaz, A. (1990). Diagnóstico de
infección por adenovirus y virus respiratorio sincicial en lactantes: comparación entre
aislamiento e inmunofluorescencia indirecta. Rev. chil. infectol, 167-71.
44. Laura, K. (2018). Tipos de enfermedades virales. Manual MSD.
45. Levin, P. A., & Angert, E. R. (2015). Small but mighty: Cell size and bacteria. Cold
Spring Harbor Perspectives in Biology, 7(7), 1–11.
https://doi.org/10.1101/cshperspect.a019216

46. L., Vabret, A., Buchy, P., Freymuth, F., & Deubel, V. (2009). Simultaneous detection
of respiratory viruses in children with acute respiratory infection using two different
multiplex reverse transcription-PCR assays. Journal of virological methods, 162(1-
2), 40–45. https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2009.07.004
47. Li, X., Geng, M., Peng, Y., Meng, L., & Lu, S. (2020). Molecular immune
pathogenesis and diagnosis of COVID-19. Journal of pharmaceutical analysis, 10(2),
102–108. https://doi.org/10.1016/j.jpha.2020.03.001

73
48. Lorca J., & Merchant, H. (2010). Biología Celular y Molecular (1.a ed.). Perason
Educación.
49. Loeffelholz, M. J., & Tang, Y. W. (2020). Laboratory diagnosis of emerging human
coronavirus infections - the state of the art. Emerging microbes & infections, 9(1),
747–756. https://doi.org/10.1080/22221751.2020.1745095
50. Mahmood, T., & Yang, P. C. (2012). Western blot: technique, theory, and trouble
shooting. North American journal of medical sciences, 4(9), 429–434.
https://doi.org/10.4103/1947-2714.100998
51. Mahony J. B. (2008). Detection of respiratory viruses by molecular methods. Clinical
microbiology reviews, 21(4), 716–747. https://doi.org/10.1128/CMR.00037-07
52. Mora, M. V., Botelho, L., Vieira, D. S., Pinho, J. R., Carrilho, F. J., Honda, E. R., &
Salcedo, J. M. (2010). Characterization of hepatitis B virus (HBV) genotypes in
patients from Rondônia, Brazil. Virology journal, 7, 315.
https://doi.org/10.1186/1743-422X-7-315
53. María Santamaría González, J. M. L. R. (2018). "Aplicaciones clínicas de las técnicas
actuales de biología molecular." 8.
54. McKinnon, K. M. (2018). Flow cytometry: An overview. Current Protocols in
Immunology, 120, 5.1.1– 5.1.11. doi: 10.1002/cpim.40
55. Molijn, A., Kleter, B., Quint, W., & van Doorn, L. J. (2005). Molecular diagnosis of
human papillomavirus (HPV) infections. Journal of clinical virology : the official
publication of the Pan American Society for Clinical Virology, 32 Suppl 1, S43–S51.
https://doi.org/10.1016/j.jcv.2004.12.004
56. M, Torres MAE, Villalba MJDA. Diagnóstico de infección por Chlamydia
trachomatis mediante PCR en pacientes que acuden a la Clínica de Especialidades de
la Mujer de la Secretaría de la Defensa Nacional. Ginecol Obstet Mex.
2009;77(01):13-18.
57. Mushahwar I. K. (2008). Hepatitis E virus: molecular virology, clinical features,
diagnosis, transmission, epidemiology, and prevention. Journal of medical
virology, 80(4), 646–658. https://doi.org/10.1002/jmv.21116
58. NCBI. (2017). Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). 09/11.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/probe/docs/techpcr/

74
59. NCBI. (2015). Reacción en cadena de la polimerasa generalidades (PCR).
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/probe/docs/techpcrqsede/
60. Negroni, M., & Inés González, M. (2018). Virus: Generalidades. Microbiología
Estomatológica Parte I, 69–80. https://www.berri.es/pdf/MICROBIOLOGIA
ESTOMATOLOGICA‚ Fundamentos y guía práctica/9789500695572

61. Neske, F., Blessing, K., Tollmann, F., Schubert, J., Rethwilm, A., Kreth, H. W., &
Weissbrich, B. (2007). Real-time PCR for diagnosis of human bocavirus infections
and phylogenetic analysis. Journal of clinical microbiology, 45(7), 2116–2122.
https://doi.org/10.1128/JCM.00027-07
62. Obando-Pacheco, P., Justicia-Grande, A. J., Rivero-Calle, I., Rodríguez-Tenreiro, C.,
Sly, P., Ramilo, O., Mejías, A., Baraldi, E., Papadopoulos, N. G., Nair, H., Nunes, M.
C., Kragten-Tabatabaie, L., Heikkinen, T., Greenough, A., Stein, R. T., Manzoni, P.,
Bont, L., & Martinón-Torres, F. (2018). Respiratory Syncytial Virus Seasonality: A
Global Overview. The Journal of infectious diseases, 217(9), 1356–1364.
https://doi.org/10.1093/infdis/jiy056
63. Organización Mundial de la Salud. (2006). Manual de Bioseguridad en el
Laboratorio. World Health Organization.
64. Padilla, C., Lobos, O., & Brevis, P. (2006). Biología Fundamental (Editorial
Universidad de Talca, Chile).

65. Pozo, F., Ruiz, G., & Pérez-Breña, P. (2009). Diagnóstico microbiológico de las
infecciones virales respiratorias [Microbiological diagnosis of viral respiratory
infections]. Enfermedades infecciosas y microbiologia clinica, 27(3), 168–177.
https://doi.org/10.1016/j.eimc.2008.03.004
66. Pando, V. (2010). El proteoma, análisis fundamental para el entendimiento de un
sistema biológico. Revista de Divulgación Científico-Tecnológica del Gobierno del
Estado de Morelos, 21–32.
67. Pareek, C. S., Smoczynski, R., & Tretyn, A. (2011). Sequencing technologies and
genome sequencing. Journal of applied genetics, 52(4), 413–435.
https://doi.org/10.1007/s13353-011-0057-x

75
68. Pawlotsky J. M. (2002). Molecular diagnosis of viral
hepatitis. Gastroenterology, 122(6), 1554–1568.
https://doi.org/10.1053/gast.2002.33428
69. Pérez, A. M. (2011). Reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain
Reaction, PCR). Repositorio Institucional de La Universitat Politècnica de València,
10. https://riunet.upv.es/bitstream/handle/10251/10700/Reacción en cadena de la
polimerasa.pdf

70. Pérez-Lara JC, Santiago-Cruz W, Romero-Ramírez H, et al. Fundamentos de

Citometría de flujo: Su aplicación diagnóstica en la investigación biomédica y clínica.
Rev Med UV. 2018;18(2):41-52.
71. Plotnikova, M. A., et al. (2020). "Antibody microarray immunoassay for screening
and differential diagnosis of upper respiratory tract viral pathogens." J Immunol
Methods 478: 112712.
72. Pray, L. (2008) Transposons: The jumping genes. Nature Education 1(1):204

73. Pretorius, M. and M. Venter (2017). Diagnosis of Viral Infections. Viral Infections in
Children, Volume I: 151-182.
74. Purcell R. (1997). The hepatitis C virus: overview. Hepatology (Baltimore,
Md.), 26(3 Suppl 1), 11S–14S. https://doi.org/10.1002/hep.510260702
75. Quan, P. L., et al. (2008). "Rapid sequence-based diagnosis of viral infection."
Antiviral Res 79(1): 1-5.
76. Ramírez T, M. (2020). "Rol del laboratorio clínico ante la epidemia del COVID-19:
revisión de los métodos diagnósticos disponibles y sus limitaciones." Revista médica
de Costa Rica 86(629).
77. Red salud. (2020). EXÁMENES COVID-19. https://www.redsalud.cl/nuestra-
red/campanas/examenes-covid-19-disponibles

78. Reinhardt, G., Carrasco, L., Tadich, N., & Riedemann, S. (2001). Comparación entre
dos técnicas de diagnóstico para diarrea viral bovina (Dvb) en 50 predios de la X
Región, Chile: seroneutralización y enzimoinmunoensayo indirecto (Elisa-I).
Archivos de medicina veterinaria, 33(2), 173-183.

76
79. Reyes O, Jesús, Comach P, Guillermo, Franco, Leticia, & Camacho G, Daría. (2016).
ESTANDARIZACIÓN DE TÉCNICAS PARA EL DIAGNÓSTICO MOLECULAR
DE FLAVIVIRUS Y ALFAVIRUS. Comunidad y Salud, 14(1), 27-32. Recuperado
en 26 de julio de 2021, de
http://ve.scielo.org/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S169032932016000100005&
lng=es&tlng=es.
80. Riedemann, JP;Illesca, M;Droghetti, J. (2013). Comparative study of nested PCR,
ELISA and AGID tests in the detection of bovine leukaemia virus infection in serum,
blood and milk samples. In Rev. méd. Chile (Vol. 129, pp. 647–652).
https://doi.org/http://dx.doi.org/10.4067/S0718-221X2015005000053
81. Riedemann, JP;Illesca, M;Droghetti, J. (2013). Estudio comparativo de detección del
virus papiloma humano (VPH) en muestras citológicas y biopsias de cuello uterino.
In Rev. méd. Chile (Vol. 129, pp. 647–652).
https://doi.org/http://dx.doi.org/10.4067/S0718-221X2015005000053

82. Sandín, M. (2010). Métodos de estudio y diagnóstico viral. Edición de un artículo

científico. http://higiene.edu.uy/cefa/Libro2002/Cap%208.pdf
83. Segretín, M. E. (2003). Los cultivos celulares y sus aplicaciones I (cultivos de células
animales). Argen Bio.
84. Segretín, M. E. (2006). Los cultivos celulares y sus aplicaciones II (cultivos de células
vegetales). Consejo argentino para la información y el desarrollo de la
biotecnología, 2, 5-8.
85. Saguado, José. (2007). Aplicaciones de la citometría de flujo en microbiología,
veterinaria y agricultura. Revista MVZ Córdoba, ISSN 1909-0544, Nº. 2, 2007, pags.
1077-1095. 12. 10.21897/rmvz.430.
86. Singhal, N., Kumar, M., Kanaujia, P. K., & Virdi, J. S. (2015). MALDI-TOF mass
spectrometry: an emerging technology for microbial identification and
diagnosis. Frontiers in microbiology, 6, 791.
https://doi.org/10.3389/fmicb.2015.00791Skidmore, S. J. C. i. d. r. (2002).
"Overview of hepatitis E virus." 4(2): 118-120.
87. Valasek, M. A., & Repa, J. J. (2005). The power of real-time PCR. Advances in
physiology education, 29(3), 151–159. https://doi.org/10.1152/advan.00019.200

77
88. Van Borm, S., Belák, S., Freimanis, G., Fusaro, A., Granberg, F., Höper, D., King,
D. P., Monne, I., Orton, R., & Rosseel, T. (2015). Next-generation sequencing in
veterinary medicine: how can the massive amount of information arising from high-
throughput technologies improve diagnosis, control, and management of infectious
diseases?. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.), 1247, 415–436.
https://doi.org/10.1007/978-1-4939-2004-4_30
89. Vargas, C. (2005). Desarrollo de métodos de diagnóstico molecular de enfermedades
virales, bacterianas y fúngicas en hortalizas, San Luis Potosí, Mexico: Instituto
Potosino de Investigación Cientifica.
90. Wagner, R., & Krug, R. (2020). Virus. In ncbl (Encyclopæd).
91. Walker, D. (1996). Medical Microbiology (Baron. S).
92. Walwyn Salas, Verónica, Iglesias Duquesne, C. Magaly, Almarales, María Rosa,
Acosta Tieles, Néstor, Mera Fernández, Ana, & Cabrejas Acuña, María Ofelia.
(2004). Utilidad de técnicas histológicas para el diagnóstico de infección en piezas
anatómicas. Revista Cubana de Medicina Militar, 33(2) Recuperado en 26 de julio
de 2021, de http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0138-
65572004000200006&lng=es&tlng=es.

93. Watzinger, F., Ebner, K., & Lion, T. (2006). Detection and monitoring of virus
infections by real-time PCR. Molecular aspects of medicine, 27(2-3), 254-298.
94. Watzinger, F., Suda, M., Preuner, S., Baumgartinger, R., Ebner, K., Baskova, L.,
Niesters, H. G., Lawitschka, A., & Lion, T. (2004). Real-time quantitative PCR
assays for detection and monitoring of pathogenic human viruses in
immunosuppressed pediatric patients. Journal of clinical microbiology, 42(11),
5189–5198. https://doi.org/10.1128/JCM.42.11.5189-5198.2004
95. Wessner, D. R. (2010) The Origins of Viruses. Nature Education 3(9):37

96. Yadav, A. R., et al. (2020). "An overview on Ebola virus disease." 12(4): 267-270.
97. Youlton, Sardi, Antonella. (2020). El impacto del Proyecto Genoma Humano y la
discriminación genética: aspectos éticos, sociales y jurídicos. Revista de Bioética y
Derecho, (48), 209-226. Epub 11 de mayo de 2020. Recuperado en 26 de julio de

78
 2021, de http://scielo.isciii.es/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1886-
58872020000100015&lng=es&tlng=es.
98. Your genome. (2016). What is PCR (polymerase chain reaction)?
http://www.yourgenome.org/facts/what-is-pcr-polymerase-chain-reaction

99. Zaballo, A. (2011). Secuenciación de genomas de SARS-CoV-2: herramienta clave

en esta pandemia. Sem@foro, 70(1), 54–89.
100. Zhu, H., et al. (2020). "Recent advances in lab-on-a-chip technologies for viral
diagnosis." Biosens Bioelectron 153: 112041.

79