Asociaciones de microbiomas posepizoóticos en comunidades de anfibios neotropicales

Introducción

La propagación de patógenos invasivos relacionada con el aumento La conectividad es uno de los

principales impulsores de la pérdida de biodiversidad en todo el mundo. y el consiguiente desgaste
de las funciones del ecosistema (Crowl et al.,2008; Thakur et al., 2019). El proceso de invasión
ecológica tiene cuatro etapas distintas: transporte, introducción, establecimiento y propagación
(Blackburn et al., 2011), que preceden a la naturalización potencial del invasor. Para progresar a
través de estas etapas, un patógeno invasor debe navegar con éxito una variedad de bióticos y
filtros abióticos que dependen de la escala (Cohen et al., 2016). En escalas espaciales más grandes,
las comunidades nativas más diversas tienen un mayor capacidad intrínseca para el apoyo de
especies invasoras a través de mayor disponibilidad de recursos (Ma et al., 2016). Sin embargo, a
fin de escalas espaciales, la invasión se rige por una mayor competencia y interacciones con
especies microbianas nativas, que pueden disminuir la probabilidad de que un patógeno se
establezca con éxito (Ma et al., 2016).

La propagación y el establecimiento de un patógeno durante una primera La fase de brote

epizoótico no garantiza la naturalización. dentro de un sistema anfitrión (Anderson y May, 1986) y,
siguiendo una epizoótica, la persistencia a largo plazo de un patógeno se rige por una combinación
de factores bióticos y abióticos (Hawley & Altizer, 2011). Por lo tanto, comprender estos factores
es un paso crítico para Informar las estrategias de mitigación de enfermedades y evaluar el riesgo.
de invasión a comunidades ingenuas (Beukema et al., 2018; Canessa et al., 2020). Con este fin, los
Andes neotropicales presentan un ideal sistema para estudiar los factores bióticos y abióticos
asociados con multihost patógenos de la vida silvestre debido a la ocurrencia de megadiversos
comunidades de acogida (Cadena et al., 2012) que están integradas en grandes gradientes de
elevación. El patógeno fúngico Batrachochytrium dendrobatidis es clave impulsor de la pérdida de
biodiversidad de anfibios en todos los continentes con anfibios, excepto Asia, la supuesta región
de origen de la especies (O’Hanlon et al., 2018). Difundir globalmente a través de los anfibios
comercio (Fisher & Garner, 2007), B. dendrobatidis ha sido reportado como un factor en el declive
de más de 500 especies de anfibios en todo el mundo y la extinción de más de 90 (Scheele et al.,
2019; pero ver Lambert et al., 2020; Scheele et al., 2020). Introducido a neotrópicos en la década
de 1970 (Cheng et al., 2011), el patógeno es ahora ampliamente establecido en América del Sur y
Central. Tiempo Las comunidades neotropicales se han visto afectadas de manera
desproporcionada por disminuciones impulsadas por la quitridiomicosis, no todas las especies de
anfibios han igualmente afectado por esta enfermedad. Heterogeneidad observada en la
susceptibilidad a enfermedades se ha atribuido a una variedad de Factores abióticos que incluyen
la variación intrínseca de la resiliencia. de hospedadores de B. dendrobatidis que es l entrado por
mecanismos inmunitarios (Cohen et al., 2017; Woodhams et al., 2006, 2014). Esta web local de
interacciones comprende el nicho realizado de B. dendrobatidis y finalmente determina si el
patógeno prospera o muere (Hawley y Altizer, 2011).

Las defensas inmunitarias innatas de la piel del huésped son la defensa de primera línea. contra la
infección por B. dendrobatidis y se componen principalmente de compuestos antimicrobianos en
secreciones de glándulas granulares (Conlon et al., 2009). Sin embargo, tambin es de importancia
un extenso "Fenotipo inmune" que se debe al microbioma de la piel de los anfibios; esto ha sido
demostrado como un factor importante en resistir la infección por B. dendrobatidis (Rollins-Smith
et al., 2011). La El microbioma cutáneo de los anfibios está compuesto por una mezcla comensal
ensamblaje microbiano, incluidos taxones de bacterias y los dominios arqueales junto con
eucariotas microbianos, que principalmente residen dentro del reino de los hongos. Este complejo
microbioma de la piel consiste en una amplia gama filogenética de microorganismos, algunos de
los cuales probablemente han evolucionado para sobrevivir en la piel de los anfibios mientras que
otros son taxones más transitorios obtenidos del medio ambiente (Muletz et al., 2012). En
particular, la estructura del anfibio microbioma de la piel y su resistencia inferida a la infección por
B. dendrobatidis Se ha demostrado que se correlaciona con el medio ambiente en un paisaje
(Bates et al., 2018; Kueneman et al., 2019) y microhábitat escala (García-Recinos et al., 2019;
Harrison et al., 2019).

En consecuencia, la probabilidad de una persistencia exitosa a largo plazo de B. dendrobatidis

dentro de una comunidad de hospedadores anfibios será modificado por sus interacciones
antagónicas o mutualistas con los nativos especies microbianas (Gallien & Carboni, 2017). Los
resultados de las interacciones entre B. dendrobatidis y Los microbios residentes son complejos.
Por un lado, especies autóctonas que son filogenéticamente similares a las especies invasoras,
como no-Batrachochytrium c hytrid f ungi, puede potencialmente proporcionar un sentido
competencia con el invasor, lo que resulta en "resistencia biótica" (Ma et al., 2016). Por otro lado,
y siempre que no haya interacciones antagónicas significativas, estas especies nativas también
pueden ser un buen predictor del éxito de la invasión y, por lo tanto, de la persistencia (Park et al.,
2020). Estos argumentos contradictorios son conocido como "el acertijo de la naturalización de
Darwin" (Darwin, 1859).

Si bien varios estudios han demostrado que las bacterias de la piel de los anfibios ser un factor
importante en la mitigación de los impactos de B. dendrobatidis infección a escala individual y
poblacional (Bates et al., 2018; Ellison et al., 2019), el papel del micobioma (el hongo comunidad)
se ha ignorado en gran medida (Kearns et al., 2017), especialmente al considerar taxones que son
filogenéticamente similares a B. dendrobatidis. Interacciones bióticas antagonistas (resistencia
biótica) con el microbioma de la piel del huésped podría potencialmente excluir B. dendrobatidis
de algunas comunidades microbianas de acogida, mientras que oportunista los patógenos podrían
aprovechar los inmunodeprimidos Huéspedes infectados con B. dendrobatidis (Claytor et al., 2019;
Rollins-Smith et al., 2015) que provocan infecciones secundarias (Perpiñán et al., 2010) Por lo
tanto, se ha argumentado que habrá un conjunto de microbios taxones que están asociados
positivamente (taxones oportunistas) y negativamente asociado (taxones antagonistas) con la
presencia de B. dendrobatidis y, quizás, enfermedad.

Si bien la fecha exacta de la invasión de B. dendrobatidis en Ecuador se desconoce, la mayoría de

las disminuciones se produjeron durante el último 1980 (Merino-Viteri et al., 2005) como parte de
una serie de epizootias ondas a través del Neotrópico (Lips et al.2008) y antes de la
descubrimiento de B. dendrobatidis (Berger et al., 1998). Invasión de B. dendrobatidis en las
comunidades de anfibios ecuatorianos fue originalmente se cree que depende en gran medida de
las condiciones abióticas (Ron, 2005) y estudios anteriores han destacado el hecho de que el 89%
de las especies de anfibios en peligro crítico de extinción del país viven en lugares que se prevé
que sean "adecuados" para la proliferación de el patógeno (Menéndez-Guerrero & Graham, 2013).
Historia de vida del anfitrión está asociado con la probabilidad de quitridiomicosis (Bielby et al.,
2008), y los informes anecdóticos sugieren mayores impactos por quitridiomicosis en anfibios de
gran altitud que se reproducen en arroyos comunidades. Asociaciones entre el hábitat de
reproducción y el Se ha observado prevalencia de B. dendrobatidis en anfibios. en Australia (Kriger
& Hero, 2007), donde los anfibios asociaron con cuerpos de agua permanentes, particularmente
arroyos, mostró mayor predominio. En Ecuador, la evidencia de la magnitud de las disminuciones
en especies individuales ha sido difícil de cuantificar, y ha Ha habido pocos estudios sistemáticos
de B. dendrobatidis a escala de paisaje. (Bresciano et al., 2015). Sin embargo, las encuestas de
campo publicadas mostró que especies que alguna vez fueron comunes, como el zapato de Quito
sapo (Atelopus ignescens) experimentó la extirpación total en todo poblaciones conocidas (Ron et
al., 2003) mientras que los esfuerzos recientes revelaron que algunas especies han estado
persistiendo en poblaciones aisladas relictas, incluido el sapo tocón de Quito y otras especies de
Atelopus (Jervis et al., 2020; Tapia et al., 2017).

Aquí evaluamos las asociaciones patógeno-microbioma de B. dendrobatidis en esta megadiversa

comunidad de anfibios neotropicales a través de un diseño de muestreo a escala de paisaje a
través de un gradiente climático en Ecuador. Específicamente, (i) evaluamos la importancia
relativa de abiótico (elevación) y biótico (modo de reproducción del huésped y etapa de vida)
como factores para determinar la presencia de B. dendrobatidis; (ii) correlacionar composición del
microbioma del huésped a nivel de dominio con factores que predicen Presencia de B.
dendrobatidis; y (iii) determinar la presencia y diversidad de hongos quitridios no
Batrachochytrium en relación con factores asociado con la presencia de B. dendrobatidis.

2 | MÉTODOS

2.1 | Coleccion de muestra

El muestreo de campo se llevó a cabo en 17 sitios en todo Ecuador entre 28 de febrero y 28 de

abril de 2017. Realizamos recolección de muestras. dentro de un marco de tiempo limitado para
limitar el impacto de la estacionalidad sobre la enfermedad y los datos del microbioma. El
muestreo se realizó en un rango de elevación de 4.000 m (200-4.200 m s.n.m.) que abarca la gama
completa de hábitats habitados por anfibios ecuatorianos (Figura 1).

Los animales fueron localizados escuchando los machos que llaman y el encuentro visual.
encuestas alrededor de hábitats de reproducción adecuados. Premetamórfico a los animales se les
limpió las piezas bucales con un algodón MW100 hisopo con punta y los animales post-
metamórficos se limpiaron de acuerdo con a un protocolo estándar (Hyatt et al., 2007; Retallick et
al., 2006); cada espécimen se frotó con cinco pasadas por el centro de la parte inferior, en cada
flanco, el interior de las patas traseras y planta de los pies. Los hisopos se almacenaron por debajo
de 4 ° C hasta que el ADN extracción. Cada animal se colocó en una nueva bolsa de plástico y se
manipuló con un nuevo par de guantes de nitrilo para prevenir la infección cruzada de individuos
(Phillott et al., 2010). Las coordenadas y la elevación fueron tomado con un GPS Garmin etrex.
Caracterizar la comunidad microbiana de la cría acuática sitios, recolectamos muestras de
sedimentos pasando 1 L de agua a través un filtro de nitrocelulosa de 0,45 μm (Walker et al.,
2007). En caso de que el filtro bloqueado debido a grandes cantidades de sedimento, o la cría sitio
contenía menos de 1 L de agua, se registró el volumen filtrado. Los papeles de filtro se doblaron en
tubos Eppendorf de 2 ml, se secaron en una cabina de flujo laminar y almacenado a 4 ° C hasta su
análisis. Todo el equipamiento se esterilizó en una solución de clorhexidina al 5% entre los sitios.

2.2 | Extracción de ADN y B. dendrobatidis

diagnósticos

El ADN de todas las muestras se extrajo en un PrepMan Ultra (aplicado Biosistemas; Hyatt et al.,
2007). Para asignar el estado de la infección y para cuantificar la carga de morbilidad de cada
individuo, realizamos Batrachochytrium dendrobatidis-ITS (espaciador transcrito interno) qPCR
(reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa) según Boyle et al. (2004). Las extracciones se
diluyeron 1:10 antes de la amplificación de qPCR, se ejecutan por duplicado y se consideran
positivos si ambos pozos amplificado y estaban por encima de 0,1 equivalentes genómicos (GE;
donde 1 GE es la cantidad de material genético presente en una sola zoospora). Todas las
muestras se analizaron frente a estándares positivos de 0,1, 1, 10 y 100 GE de B. dendrobatidis
GPL (aislado IA042) y estándares de control negativo. Se repitieron las placas con una curva
estándar de R2 <0,95. Luego, todas las extracciones de ADN se utilizaron para amplificar y evaluar
tanto la bacteria (V4-16S rRNA) y comunidades de hongos (ITS-2).

2,3 | Procedimiento de laboratorio de micobioma

Identificar qué muestras de hongos contenían suficiente material genético. para la preparación de
la biblioteca, una PCR de cribado utilizando un cebador ITS3 / 4 Se realizó el fraguado y los
amplicones se visualizaron usando gel al 1,5%. electroforesis. Las muestras con una banda tenían
suficiente material genético. para someterse a la amplificación de ITS-2 y fueron seleccionados
para metagenómica preparación de la biblioteca. La preparación de la biblioteca ITS-2 se realizó
utilizando cebadores ITS-3F e ITS-4R de doble índice (Kozich et al., 2013) y Protocolos de PCR
(Bates et al., 2019). Las muestras se analizaron por duplicado, Los amplicones se visualizaron en un
gel de agarosa al 1,5% y las muestras producido una banda se agruparon para producir un
volumen final por muestra de 50 μl. El ADN del amplicón agrupado se purificó usando una perla
AMPure XP limpieza (Beckman Coulter). Se realizó una combinación equimolar de muestras. según
la intensidad de la banda del producto limpiado siguiendo visualización en un gel de agarosa al
1,5%. Las muestras luego se sometieron Secuenciación de extremo emparejado de 300 pb
utilizando química V3 en un Illumina Plataforma MiSeq (Illumina).

2,4 | Procedimiento de laboratorio de microbioma

La amplificación y secuenciación de bacterias se realizaron utilizando métodos descritos

previamente por Harrison et al. (2019). Brevemente, biblioteca La preparación se realizó con 515F
y 806R modificados. cebadores diseñados para amplificar la región V4 del gen ARNr 16S utilizando
un protocolo de indexación dual (Kozich et al., 2013). Limpieza de la biblioteca y la agrupación se
llevaron a cabo siguiendo el método descrito por Harrison y col. (2019), con una ejecución de
secuenciación final realizada en un Sistema MiSeq con un kit de química V2 de 500 ciclos
(Illumina).

2,5 | Procesamiento de secuencias de micobiomas

Los datos de la secuencia sin procesar se procesaron utilizando dada2 (Callahan, McMurdie, et al.,
2016) ejecutando una tubería recomendada por Pauvert et al. (2019) con modificaciones menores.
Secuencias de hongos con un llamado las bases se eliminaron antes de que se identificaran y
eliminaran los cebadores usando cutadapt (Martin, 2011) y las lecturas inversas fueron
descartado. ITS es una región de longitud variable y utiliza un paso de fusión conduce a un sesgo
para los hongos con regiones ITS cortas. El delantero lee se recortaron a 200 bases, se procesaron
utilizando el algoritmo de eliminación de ruido dada2 y se desreplicaron. Asignación taxonómica
de la secuencia de amplicones variantes (ASV) se realizó utilizando el hongo ITS-2 UNITE base de
datos versión 8 con modificaciones para incluir 26 B. dendrobatidis secuencias de UNITE versión 7
que no se incluyeron en el la mayor parte de la publicación rápida de datos en el momento de
escribir este artículo (Abarenkov et al., 2010). Los contaminantes sospechosos se eliminaron
utilizando el paquete R descontam (Davis et al., 2018) con el umbral establecido en 0.5. Lee que no
fueron asignados al reino fúngico fueron excluidos para eliminar la influencia de taxones no
objetivo

Después de la PCR de cribado ITS3 / 4, los amplicones de todos los secuenciados muestras (ver
Tabla S1: total, n = 181; hisopos de anfibios, n = 168; filtros de agua, n = 13), después del recorte
de datos y filtrado de calidad, produjo un total de 5.582.691 secuencias, con hisopos de anfibios
aportando el 96,34% del total de secuencias. Cada hisopo de anfibios (n = 160) produjo un
promedio de 31,636 secuencias (SD = 53,472.42, rango 0-313.580). Un total de 12 phyla, 39 clases,
129 órdenes, 301 familias y 642 géneros se detectaron en los hisopos de anfibios (Figura S1). Los
phyla más abundantes fueron Ascomycota (promedio 82% del total de secuencias) y
Basidiomycota (17%). Desde el 642 géneros detectados, 16 fueron dominantes con una
abundancia relativa media > 1% del total de secuencias: Debaryomyces (35%), Cladiosporum
(20%), Vishniacozyma (5%), Gibberella (4%), Rhodotorula (4%), Cephalotrichum (2%), Aspergillus
(2%), Plectosphaerella (2%), Didymella (2%), Cryptococcus (1%), Pyrenochaetopsis (2%),
Acremonium (2%), Fusarium (2%), Myrothecium (1%), Sarocladium (1%) y Penicillium (1%). Se
produjo un árbol filogenético de ASV utilizando el GTR modelo en fasttree versión 2.1.9. Análisis
posterior de ASV fúngicos se realizó utilizando el paquete R phyloseq (McMurdie & Holmes, 2013)
en la versión r 3.6.3 (R Core Team, 2020). Un árbol filogenético de Los ASV fúngicos se produjeron
utilizando el modelo GTR en la versión fasttree 2.1.9.

2,6 | Procesamiento de secuencias de microbiomas

Las secuencias sin procesar se procesaron utilizando dada2 (Callahan, McMurdie, et al., 2016)
utilizando la tubería predeterminada para secuencias bacterianas, adelante y las lecturas inversas
se recortaron a 240 y 160 pb respectivamente, mientras que otros parámetros de filtrado se
establecieron por defecto. Filtrado las lecturas se procesaron utilizando el algoritmo de
eliminación de ruido dada2, desreplicado y pasó por la eliminación de quimeras. Asignación
taxonómica de Las ASV se realizaron utilizando el ARNr 16S bacteriano SILVA (versión 132)
conjunto de entrenamiento (Yilmaz et al., 2013). Los contaminantes sospechosos fueron eliminado
usando el descontam del paquete r (Davis et al., 2018) con el umbral establecido en 0,5.
Amplicones de todas las muestras secuenciadas (ver Tabla S2: total, n = 367; hisopos de anfibios, n
= 347; filtros de agua, n = 20), después de los datos recorte y filtrado de calidad, produjo un total
de 14,570,591 secuencias, con hisopos de anfibios que contribuyen con el 97,46% del total
secuencias. Cada hisopo de anfibios (n = 347) produjo un promedio de 41.523 secuencias (SD =
28.975, rango 14.996-523.782). Un total de 35 filos, 65 clases, 145 órdenes, 236 familias y 574
géneros se detectaron en los hisopos de anfibios (Figura S1). Los phyla más abundantes fueron
Proteobacteria (promedio 74% de las secuencias totales), Bacteroidetes (11%), Firmicutes (8%) y
Actinobacteria (5%). De los 574 géneros detectados, 16 fueron dominantes con una media
abundancia relativa> 1% de las secuencias totales: Pseudomonas (32%), Acinetobacter (8%),
Stenotrophomonas (8%), Staphylococcus (7%), Klebsiella (6%), Verticia (4%), Chryseobacterium
(3%), Sanguibacter (2%), Sphingobacterium (2%), Citrobacter (1%), Raoultella (1%), Pantoea (1%),
Yersinia (1%), Glutamicibacter (1%), Empedobacter (1%) y Flavobacterium (1%). Se produjo un
árbol filogenético de ASV. utilizando el modelo GTR en fasttree versión 2 .1.9. D ownstream
analysis de ASV bacterianos se realizó utilizando el paquete r phyloseq (McMurdie y Holmes,
2013).

2,7 | Filogenia de Rhizophydiales

Las secuencias fueron subconjuntos en el orden Rhizophydiales usando el paquete R phyloseq

(McMurdie & Holmes, 2013) antes de seguir los métodos descrito para el flujo de trabajo de
bioconductores (Callahan et al., 2016). Brevemente, las secuencias se alinearon utilizando el
descifrador de paquetes r (Wright, 2016), antes de generar un árbol filogenético usando el
paquete r phangorn (Schliep, 2011). Instalamos un árbol de unión de vecinos que se optimizó
utilizando un modelo GTR para generar una probabilidad máxima árbol antes del arranque para
proporcionar estimaciones de confianza.

2,8 | Análisis estadístico

Los análisis estadísticos se realizaron dentro de r versión 3.6.3 (R Core

Equipo, 2020). Determinar los factores que impulsan la presencia-ausencia de B. dendrobatidis,

construimos una mezcla lineal generalizada modelo de efectos utilizando el paquete R lme4 (Bates
et al., 2014). La El estado de infección por B. dendrobatidis de cada anfibio se estableció como
variable de respuesta binaria, con modo de reproducción (factor de tres niveles), etapa de vida
(factor de dos niveles) y elevación ajustados como variables explicativas, y el sitio se estableció
como un factor aleatorio dentro de un error binomial estructura. Para reducir los problemas
asociados con la activación de los predictores diferentes escalas, las variables de clima y elevación
se centraron y estandarizado a SD = 1. La significancia de cada una de estas variables se calculó
utilizando un procedimiento de simplificación paso a paso con filtrado del valor p (Figura 2). Los
datos de ARNr 16S se enraizaron al tamaño mínimo de biblioteca de 14.996 lecturas; Los datos de
ITS-2 no se enrarecieron debido a la menor profundidad de lectura y diversidad de estas
secuencias (Pauvert et al., 2019). El análisis microbiano combinado se realizó mediante la
concatenación de estos datos. Generar mapas de calor y abundancia relativa. parcelas, los taxones
se agregaron al nivel taxonómico relevante, filtrado por contribución porcentual a las lecturas
totales (> 3,5%) y luego trazado como un mapa de calor utilizando los paquetes R gplots (Warnes
et al., 2015) y ggplot2 (Wickham, 2016) respectivamente. Agrupación jerárquica El uso de
distancias de Bray-Curtis se realizó en los ejes xey utilizando la función R “Hclust” (Müllner, 2013).
Diversidad alfa (Shannon) para las comunidades de hongos y bacterias se calculó utilizando la
función "estimar_riqueza" en el paquete r phyloseq (McMurdie Y Holmes, 2013). Diferencias en la
diversidad alfa entre la cría Los grupos de modos y etapas de la vida se determinaron mediante el
uso de un ANOVA con pruebas de Tukey post-hoc en base r (R Core Team, 2020). El análisis de
diversidad beta se realizó utilizando componentes principales ordenación de análisis (PCA) en
distancias de Aitchison de razón logarítmica centrada (clr) datos transformados (Gloor et al.,
2017). Usamos PERMANOVA para cuantificar las diferencias en la estructura de la comunidad
microbiana entre las muestras, usando la función "adonis" en el paquete R vegano (Oksanen et al.,
2013).

Para encontrar taxones microbianos con asociaciones positivas y negativas con B . dendrobatidis ,
utilizamos el paquete r cooccur (Griffith et al., 2016 ) de forma independiente tanto en la etapa de
la vida (huéspedes pre y posmetamórficos ) como en cada uno de los conjuntos de datos de ARNr
16S e ITS-2 con un conjunto de umbrales de co-ocurrencia a 0,1.

3 RESULTADOS

3.1 Muestreo de campo y predictores de la infección por B. dendrobatidis

Se recolectaron un total de 377 muestras de 43 especies de anfibios y su entorno inmediato. Estos

consistían en 22 filtros de sedimentos de agua, 250 hisopos de anfibios adultos y 105 hisopos de
renacuajos. Los desarrolladores directos (96 adultos) estuvieron presentes a 191–4,233 m, los
reproductores de estanques (69 renacuajos, 102 adultos) estuvieron presentes a 207–3,529 my los
reproductores de arroyos (36 renacuajos, 52 adultos) estuvieron presentes a 260–2,722 m. En la
Tabla S4 se proporciona un resumen de las categorías de modos de reproducción . Se muestrearon
menos criadores de arroyos debido a su rango de elevación restringido y baja tasa de encuentro.
En la Tabla S3 se presenta un resumen de las muestras de especies y sitios .

En total, 35 de los 377 animales (9,2%, Clopper - intervalo de confianza Pearson [IC] del 7% -13%)
en la muestra se encontró que eran Batrachochytrium dendrobatidis positiva a través de B .
dendrobatidis ‐ITS qPCR, con una intensidad de infección promedio de 17,1 GE ( DE = 36,0, rango
0,1-194 GE). Este “de baja prevalencia, de baja intensidad” patrón es característico de un sistema
de enfermedad enzoótica tras la invasión por B . dendrobatidis . La hipótesis de que los anfibios
corriente de cría en las altas elevaciones estarían asociadas a B . presencia de dendrobatidis . En el
modelo global, B . dendrobatidisEl estado se analizó con la elevación, la etapa de vida (adulto o
renacuajo) y el modo de reproducción (desarrollador directo, reproductor de arroyo o de
estanque) como predictores, y el sitio como factor aleatorio (Figura 2 ). La cría de corriente se
determinó que era el único factor significativo en la presencia de B . dendrobatidis (Figura 2 ).
3.2 Análisis de comunidades bacterianas y fúngicas

Para comparar las comunidades bacterianas (ARNr 16S) y fúngicas (ITS-2) tanto de las muestras
ambientales como de los hisopos de anfibios, dividimos las muestras por hábitat de reproducción
(hisopos ambientales y de piel) y etapa de vida (hisopos de piel). A pesar de la etapa de vida
siendo un predictor no significativa de B . dendrobatidis (Figura 2 ), analizamos los anfibios por
grupos definidos por etapa de vida y modo de reproducción, ya que se sabe que las comunidades
microbianas están fuertemente influenciadas por la etapa de vida del hospedador (Bates et al.,
2018 ). El agrupamiento jerárquico de Bray-Curtis agrupó las muestras ambientales y los hisopos
de anfibios por separado en los conjuntos de datos bacterianos (Figura 3b ) y fúngicos (Figura 3d ).

Después de los resultados del modelo mixtos (Figura 2 ), esperábamos que los anfibios corriente
de cría presentaría resistencia reducida biótico a B . dendrobatidis a través de una diversidad
reducida o diferencias en la estructura de su comunidad de microbioma. Investigamos estas
diferencias como dominios independientes y como ensamblaje microbiano mixto. La diversidad
alfa, medida por el índice de diversidad de Shannon, de la comunidad fúngica mostró diferencias
significativas entre ambientes, modos de reproducción y etapas de vida (Figura 3a). La comunidad
de hongos ambientales era significativamente más rica en arroyos que en estanques y
encontramos que los adultos que se reproducen en estanques tenían una diversidad alfa fúngica
significativamente mayor que los renacuajos que se reproducen en estanques y los adultos que se
reproducen en arroyos (Figura 3 ). Además, no encontramos diferencias significativas en la
diversidad de hongos entre los grupos de larvas de anfibios. Estos resultados muestran una
diversidad de hongos significativamente mayor en los arroyos en relación con los estanques, una
tendencia que no se corresponde con los patrones de diversidad de hongos en los micobiomas de
anfibios que están asociados con estos hábitats. En marcado contraste, los diferentes entornos,
etapas de vida y modos de reproducción no fueron buenos predictores de la diversidad alfa
bacteriana (Figura 3c), aunque todos los grupos de anfibios tenían una diversidad bacteriana
significativamente menor que su entorno.

3.3 Análisis combinado de comunidades bacterianas y fúngicas

Para examinar la estructura de la comunidad microbiana combinada (bacterias y hongos),

combinamos los datos de ARNr de ITS2 y 16S para cada muestra. La diversidad alfa, medida con el
índice de diversidad de Shannon, de la comunidad microbiana (Figura 4c ) mostró diferencias
significativas entre el entorno del arroyo y las dos etapas de la vida reproductora del arroyo.
Siguiendo la misma tendencia que los análisis de dominio individual (Figura S2 ), las agrupaciones
de anfibios con diferentes historias de vida (Figura 4a ) fueron un factor significativo en la
estructura de la comunidad (PERMANOVA F = 4.3, R 2 = .07, p = .001) , pero mucha más de la
varianza fue explicada por el sitio (PERMANOVA F = 3.5, R2 = .13, p = .001) y género huésped
(PERMANOVA F = 3.4, R 2 = .18, p = .001).
Análisis Co-ocurrencia encontró que 56 taxones en todos los hongos y las comunidades
bacterianas están asociados positivamente y negativamente con la presencia de B . dendrobatidis
(Tabla S5 ). Siguiendo los resultados del modelo mixto, esperábamos que los anfibios
reproductores de arroyos tuvieran una asociación reducida con taxones microbianos
potencialmente protectores. Debido a las diferencias entre los taxones microbianos de adultos y
renacuajos (Figura 3 ), el análisis de co-ocurrencia se realizó por separado en cada etapa de la vida.
Se encontraron renacuajos estanque para ser enriquecido para taxones potencialmente
protectora en comparación con renacuajos de flujo (Figura 5 ), lo que puede explicar la ausencia
de B . dendrobatidisdetectado dentro de este grupo. Los anfibios adultos tenían una abundancia
constantemente baja de taxones potencialmente protectores independientemente de la
asociación con el hábitat de reproducción.

Las secuencias de quitridio de ITS2 que recuperamos abarcan 96 ASV con representantes de ocho
familias diferentes (Figura 6 ). Además, encontramos clados de quitridios desconocidos, algunos
de los cuales estaban enriquecidos con anfibios. Estos taxones de quítridos se concentraron en
ambientes de reproducción de arroyos, con el 59% de estas 120 detecciones de quítridos en
anfibios que se reproducen en arroyos o en sus sitios de reproducción. Cabe destacar que ninguno
de estos taxones batrachochytrid mostró relaciones significativas con B . dendrobatidis .

. DISCUSIÓN

Más de 30 años después de la disminución epizootias causadas por la quitridiomicosis en

poblaciones de anfibios neotropicales nos encontramos con que la presencia de B . dendrobatidis ,
así como nuevos quítridos nativos no descritos, están fuertemente asociados con las comunidades
de anfibios que se reproducen en arroyos. Nuestros datos muestran que los rasgos del ciclo de
vida de los anfibios modifican los microbiomas bacterianos y fúngicos del hospedador y la
susceptibilidad a la infección por Batrachochytrium dendrobatidis . Hemos observado una
marcada variación entre las etapas de la vida de acogida y los modos de cría en la frecuencia y la
dirección de putativo interacciones entre microbioma y B . dendrobatidis, lo que indica que se
producen interacciones funcionalmente relevantes. A pesar de que hemos detectado una alta
diversidad de quitridios nativos, que no parece ser una fuerte competencia con B . dendrobatidis ,
como lo demuestra la falta de asociación negativa con el patógeno. Críticamente, estos datos
empíricos expanden la distribución de patógenos por debajo del límite inferior de elevación de
1,000 m predicho por el modelado de envoltura de variables abióticas solamente (Ron, 2005).
Nuestro trabajo destaca la importancia de comprender las interacciones abióticas y bióticas al
intentar cuantificar la heterogeneidad entre las especies hospedadoras en cuanto a la
susceptibilidad a un patógeno letal posterior a la invasión. Nuestro trabajo también pone de
relieve la compleja serie de factores que se han combinado para gobernar la transición de este
patógeno a través de escalas endemismo local y del paisaje, y que en última instancia definen el
“nicho realizado” de B . dendrobatidis en esta región del neotrópico.
Detectamos B . dendrobatidis de 200 a 3500 m de altura, lo que extiende la distribución en altura
del patógeno más allá de las disminuciones observadas impulsadas por la quitridiomicosis a gran
altura. Al confirmar la presencia de B . dendrobatidis dentro de la cuenca del Amazonas
ecuatoriano, nuestros datos concuerdan con otros estudios contemporáneos en la región
(McCracken et al., 2009 ; Russell et al., 2019 ). La prevalencia y la intensidad de la infección media
(9,2%, 17,1 GE) de B . dendrobatidis que nos informe es mayor que el observado en el área de
distribución natural de B . dendrobatidis GPL (Swei et al., 2011; Tapley et al., 2020 ), pero es
comparable o inferior al de otros B . dendrobatidis en los neotrópicos que probablemente hayan
pasado al endemismo (Bresciano et al., 2015 ; Flechas et al., 2017 ; Jervis et al., 2020 ; Kilburn et
al., 2010 ; Puschendorf et al., 2006 ). La asociación observada de elevación con la disminución de
anfibios históricos es probablemente debido a diferencias en la progresión de la enfermedad como
la presencia de B . dendrobatidis no necesariamente causa quitridiomicosis en poblaciones de
anfibios silvestres (Lips, 2016). Aquí, encontramos que la etapa de vida y la elevación no parecen
ser predictores significativos de la presencia de B . dendrobatidis . Esto sugiere que las
observaciones de descensos más pronunciados en los sitios de gran altitud se deben a diferencias
en la progresión de la enfermedad individual más que a la distribución de patógenos per se.

Ambas etapas de la vida de los anfibios corriente de cría eran más propensos a ser infectados con
B . dendrobatidis , un hallazgo que concuerda con que estos taxones tienen un mayor riesgo de
quitridiomicosis durante las epizootias (Kriger y Hero, 2007 ). Sin embargo, encontramos que las
estructuras de los microbiomas asociados con los reproductores de arroyos diferían entre las
etapas de vida larvaria y adulta. Los anfibios adultos que se reproducen en arroyos mostraron una
diversidad alfa de hongos significativamente menor (Figura 3a ) y una menor abundancia relativa
de hongos (Figura 4d ) que los adultos que se reproducen en estanques. Especulamos que los
anfibios estanque de cría adultos presentan una mayor diversidad variado comunidad, hongos a
B . dendrobatidislo que podría obstaculizar la persistencia a largo plazo del patógeno en el
huésped a través de una competencia intensificada. Esta competencia reduciría la carga de
infección de un individuo a través de la resistencia biótica (Ma et al., 2016 ) y, por lo tanto,
reduciría la transmisión, lo que tendrá consecuencias a nivel poblacional (Woodhams et al., 2011 ).

Encontramos 56 taxones microbianos que están asociados positivamente o negativamente con la

presencia de B . dendrobatidis y muestran que los renacuajos de arroyo albergan una menor
proporción de taxones microbianos potencialmente protectores que los renacuajos que se
reproducen en estanques. Existe evidencia de que existen compensaciones en la inmunidad innata
del huésped y el microbioma protector (Metcalf y Koskella, 2019 ). Dado que los renacuajos tienen
una competencia inmunológica menor que los adultos (Grogan et al., 2018), es posible que
dependan más de un microbioma protector, una hipótesis que puede explicar la falta de variación
observada en la proporción de taxones protectores entre los grupos de anfibios adultos. A pesar
de estas asociaciones son correlativas, nuestros resultados son consistentes con el argumento de
que existen interacciones antagónicas entre B . dendrobatidis y taxones en el microbioma de la
piel de los anfibios. En apoyo de este argumento, encontramos asociaciones negativas con
Trichosporon asahii (El ‐ Tarabily, 2004 ) y Raoultella sp. (Fiolka et al., 2012 ) que son conocidos
para producir compuestos que inhiben el crecimiento de los competidores de hongos, y,
potencialmente, B .dendrobatidis . Taxones microbianos asociados positivamente con B .
dendrobatidis puede representar infecciones secundarias de hosts que están
inmunocomprometidos por B . dendrobatidis (Rollins ‐ Smith et al., 2015 ) o interacciones
mutualistas entre la microbiota del huésped (Partida ‐ Martinez & Hertweck, 2005 ). Aunque estos
resultados son interesantes, se requiere más trabajo experimental para diseccionar la
direccionalidad de estas asociaciones y proporcionar una base mecanicista para estas
interacciones microbiota-patógeno.

A través de nuestro conjunto de datos de hongos ITS2, encontramos una fuerte señal de que los
entornos de arroyos y los anfibios que se reproducen en arroyos tenían el mayor número de
supuestos quítridos nativos en su microbioma en comparación con los entornos de estanques y
anfibios que se reproducen en estanques o anfibios en desarrollo directo (Figura 6 ). La ausencia
de quítrido lo que tiene positivo significativo o asociaciones negativas con B . dendrobatidis
implica que puede que no exista una competencia significativa entre el patógeno y los taxones de
quítridos nativos en las escalas que investigamos. Mientras que el enigma de la naturalización de
Darwin presenta argumentos contrastantes sobre el impacto de la similitud filogenética de las
comunidades nativas en relación con el establecimiento exitoso de especies invasoras (Darwin,
1859), la evidencia sugiere que la similitud filogenética de las especies nativas puede ser un buen
predictor del éxito de una especie invasora (Tan et al., 2015 ), siempre que haya poca interacción
antagónica entre ellas. Este argumento sugiere que la asociación entre el B . dendrobatidis y
anfibios corriente de cría pueden ser en parte debido a corrientes y anfibios corriente de cría son
hábitats adecuados para quitridios y la falta de competencia entre B . dendrobatidis y estos
quítridos nativos pueden explicar la proliferación del patógeno en estos ambientes. Esto puede
representar un ejemplo de la "hipótesis de liberación del enemigo" (Colautti et al., 2004), que
predice que una especie invasora tendrá éxito en nuevos entornos que carecen de competencia
en comparación con el rango nativo del invasor. Por lo tanto, en nuestro estudio, el
enriquecimiento de quitridios en los reproductores de arroyos parece ser un proxy confiable para
el establecimiento de B no nativos . dendrobatidis y es quizás un predictor del impacto del
ecosistema, si predice la susceptibilidad de los anfibios nativos a la quitridiomicosis. Esto está en
contraste con los patrones observados en Asia, donde la probable coevolución de anfibios y B .
dendrobatidis dentro de su área de distribución nativa significa que no se observa quitridiomicosis
(Swei et al., 2011 ). Se requerirían más estudios dentro del rango nativo de B. dendrobatidis para
evaluar el nivel de la competencia entre B . dendrobatidis y otros quitridios asiáticos, y estos
estudios pueden dar una idea de explicar B . El éxito de dendrobatidis una vez introducido en
sistemas ingenuos. Por el contrario, se podría razonar que los taxones de quitridio que no son de
Batrachochytrium ecuatorianos que describimos pueden plantear un problema de bioseguridad si
son patógenos para las comunidades anfibias ingenuas fuera de su área de distribución nativa.

Se debe tener precaución al invocar patrones contemporáneos de comunidades microbianas para

describir observaciones históricas de la disminución de anfibios, como las observadas en las tierras
altas ecuatorianas. Se puede argumentar que el huésped y su microbioma, el “hologenoma”
combinado, pueden considerarse como una sola unidad bajo selección (Wilson, 1997 ). En este
caso, los datos presentados en este estudio solo serán representativos de la comunidad
microbiana posepizoótica actual. Esto puede diferir de la comunidad de anfibios con
predisposición a la enfermedad debido a una subrepresentación de huéspedes susceptibles y una
microbiota desadaptativa después de su extirpación (Roughgarden et al., 2018 ).

En general, nuestro estudio presenta evidencia de que el nicho ecológico de B después de la

epizootia se dio cuenta . dendrobatidis está conformada más por los factores bióticos de la
ecología y el microbioma del hospedador que por factores abióticos a escala del paisaje. En
particular, se muestra que los anfibios corriente de cría están asociados con B . dendrobatidis , así
como otras especies de quitridios no registradas previamente, y que estas albergan un ensamblaje
microbiano menos diverso que incluye una menor abundancia de taxones que se prevé que
inhiban la proliferación. Aunque se requiere la disección funcional de estas asociaciones, que la
persistencia de enzoótica B . dendrobatidisa través de las escalas de paisajes neotropicales parece
moldeado por factores bióticos que da esperanza de que los enfoques de la ecología microbiana,
como los que detallamos aquí, brindarán una nueva perspectiva de las consecuencias a más largo
plazo de las invasiones microbianas. En términos más generales, hemos demostrado que la
ecología de la reproducción del hospedador da forma fuertemente a las asociaciones entre
patógenos y microbiomas a escala de paisaje en comunidades megadiversas, un rasgo que puede
influir en la resiliencia frente a enfermedades infecciosas emergentes.