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Fijador de Nitrgeno

Azospirillum sp.
El Salvador
Asociacin Azucarera
de El Salvador






Fijador de Nitrgeno
Azospirillum sp




Esta edicin y publicacin se hace gracias al apoyo del proyecto BID FOMIN
administrado por la Cmara Agropecuaria y Agroindustrial de El Salvador
(CAMAGRO) y la Asociacin Azucarera de El Salvador.


Autora de los Contenidos:
Esta publicacin utiliza extractos del documento El Gnero Azospirillum de Jess
Caballero-Mellado.

Gustavo Saura Laria, Ramona Fernndez Hernndez: Elaboracin de Contenido.
Juan Carlos Hidalgo: Elaboracin de conclusiones y recomendaciones.

Edicin Formato
FIAGRO, Fundacin para la Innovacin Tecnolgica Agropecuaria
Samuel Salazar Genovez
Mayuly Ferrufino
Juan Carlos Hidalgo

Publicacin
FIAGRO


San Salvador, diciembre de 2003


Fundacin para la Innovacin Tecnolgica Agropecuaria
Alameda Dr. Manuel Enrique Araujo
Edificio Century Plaza, Nivel 4
San Salvador, El Salvador

Tel: 267-0069
Fax: 267-0069
info@fiagro.org.sv

www.fiagro.org.sv

Fijador de Nitrgeno
Azospirillum sp.






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Fundacin para la Innovacin Tecnolgica Agropecuaria










ndice




Resumen...1

Antecedentes...2

Caractersticas...3
Biologa del organismo3
Mecanismos de estimulacin del Crecimiento de las Plantas3
Distribucin4
Interaccin con la Planta4
Experimentos de Inoculacin5

Aislamiento...6

Aplicacin...7
Mtodos de Propagacin y/o crecimiento de la bacteria7
Aplicacin en Forma Slida7
Aplicacin en forma seca8
Aplicacin en forma Granulada8

Experiencia cubana con Azospirillum...9
Factibilidad de la Aplicacin en Caa de Azcar9
Cultivos de papa, camote y tomate10
Factibilidad de la Aplicacin en Arroz10

Proceso tecnolgico...11

Capacidad Instalada y produccin Mundial...12
Aspectos Econmicos12

Conclusiones...13

Recomendaciones14

Anexos15

Fijador de Nitrgeno
Azospirillum sp.






1
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Resumen
Azospirillum sp. es el nombre cientfico con el que se designa a un
grupo de bacterias que tienen la capacidad de promover el crecimiento
de los cultivos y cuyas propiedades se han estudiado intensamente en
los ltimos 20 aos. Aunque no se sabe a ciencia cierta como funciona
el mecanismo responsable del rpido desarrollo de las plantas, s se ha
comprobado que los cultivos en los que se aplica Azospirillum crecen
mejor y de forma ms rpida.

Los anlisis hechos en los ltimos aos, indican que el Azospirillum
tiene la habilidad de tomar el nitrgeno atmosfrico y transformarlo en
un nutriente aprovechable por las races de la planta. A esto se suma el hecho de que la bacteria
causa un ensanchamiento y elongacin de las races, lo que aumenta significativamente la
superficie de absorcin de los nutrientes que se encuentran en el suelo.

Este tipo de tecnologa microbiolgica es interesante para la agricultura salvadorea, ya que su
aplicacin implicara una reduccin en los costos de fertilizantes qumicos y un beneficio directo
para el medio ambiente.

A esto se agrega el hecho de que El Salvador cuenta con las principales materias primas para la
produccin industrial del Azospirillum y con productores interesados en hacer uso de esta
tecnologa para la obtencin de cultivos libres de qumicos.



























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Azospirillum sp.






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Antecedentes
La Spirillum lipoferum, ahora llamada Azospirillum,
fue descrita por primera vez en 1925 por Martinus
Willem Beijerinck, luego de lo cual la bacteria
permaneci en el olvido por varias dcadas. Las
observaciones de Juan Jos Pea-Cabriales y
Johanna Dbereiner, en 1973, inician la poca
moderna de este microorganismo. Actualmente, se
reconocen seis especies en el gnero Azospirillum
1
.
Las dos primeras en ser descritas fueron A.
lipoferum y A. brasilense, siendo estas las ms
ampliamente estudiadas. Posteriormente, fueron
descritas las especies A. amazonense, A.
halopraeferans, A. irakense y A. largimobile.

Pocos aos despus del redescubrimiento del Azospirillum y hasta 1993, este gnero fue el ms
estudiado entre las bacterias asociadas a plantas. Esto se debi a la capacidad del Azospirillum
para estimular el crecimiento de las plantas y aumentar el rendimiento de los cereales, lo cual
promovi numerosos estudios sobre la ecologa, fisiologa y gentica de esta bacteria. En la
actualidad, los beneficios de su uso se han documentado ampliamente en Cuba, donde se han
obtenido buenos resultados con Azotobacter en caa de azcar, (Prez y Roldos, 1994) en arroz
(Socorro y Quesada, 1994) y con Azospirillum en caa de azcar (Roldos, Casas y Delgado, 1994)
en maz (Mascar y Carcao, 1994) y en tomate (Medina, 1994). Su uso comercial comienza a
extenderse en diferentes pases, entre ellos, Mxico.

Los experimentos de inoculacin en campo con Azospirillum han demostrado que estas bacterias
son capaces de promover el rendimiento de las cosechas en diferentes suelos y regiones
climticas. Varias cepas de Azospirillum brasiliense y Azospirillum lipoferum se han utilizado para
inocular cultivos de diferentes especies de plantas. Los datos indican que del 60 al 70 % de los
experimentos son exitosos y se obtienen incrementos de rendimiento estadsticamente
significativos en el orden del 5 a 30 %.

Se reporta una gran cantidad de microorganismos cuya aplicacin al suelo es beneficiosa, como
fijadora de nitrgeno (Rhizobium, Azospirllum, Franlda), promotora del crecimiento de las
plantas (Pseudomonas, Azospirillum Azotobaaer), para el incremento de la asimilacin de fsforo
en el suelo por las plantas (Badllus Polymyxa, Pseudomonas fluorescens). Sin embargo,
solamente los formulados de rhizobium para la fertilizacin (fijacin de nitrgeno) en legumi-
nosas como la soya han alcanzado un amplio desarrollo en cuanto a niveles de produccin,
comercializacin y aplicacin.






1
El Azospirillum pertenece a la subclase alfa de las proteobacterias. Las caractersticas tiles en su
identificacin rutinaria son la forma vibroide, el pleomorfismo y su movilidad en espiral. Las clulas
contienen cantidades elevadas de poli--hidroxibutirato (PHB). Diversas pruebas bioqumicas y fisiolgicas
son utilizadas rutinariamente para el reconocimiento de las especies de Azospirillum. La diferenciacin de
especies del gnero Azospirillum se logra evaluando la capacidad de usar diversos aminocidos y su efecto
sobre la fijacin de nitrgeno (N), recomendndose el uso de la histidina para la caracterizacin y
aislamiento selectivo de la especie A. lipoferum.

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Caractersticas
Se considera que uno de los principales mecanismos de
accin del Azospirillum radica en su capacidad de
producir sustancias promotoras durante la colonizacin
de las races. Esto estimula la longitud, la densidad de
las races laterales y el incremento del rea superficial
de las races. Estos y otros cambios fisiolgicos
favorecen la mayor absorcin de agua y nutrientes
minerales que ayudan al rpido crecimiento de las
plantas.

Tambin, se plantea como factor decisivo la fijacin no
simbitica de nitrgeno por parte de esta bacteria.
Para lograr estos efectos positivos, el microorganismo debe infestar las races. Esto se consigue
cuando se garantiza un elevado nmero de bacterias por gramo del formulado a aplicar y una
alta viabilidad del microorganismo en el suelo que le permita sobrevivir an en condiciones
adversas y colonizar las races.

Biologa del organismo
Forma de reproduccin: Divisin celular
Patogenicidad, toxicidad y alergenicidad y clasificacin en grupos de riesgos: No procede.
Mecanismos que utiliza el organismo para sobrevivir, multiplicarse, difundirse y competir en
el medio ambiente. Azospirillum produce y acumula grnulos de poli-beta-hidroxibutirato
los cuales son empleados por la propia clula como fuentes de carbono y energa durante
perodos de inanicin e incluso son capaces de formar quistes en condiciones muy
desfavorables.
Predadores y competidores:El crecimiento de este microorganismo en la rizosfera viene
determinado fundamentalmente por la disponibilidad de sustratos que esten presentes en el
medio rizosfrico y que sean necesarios para su desarrollo. Tambin diversas sustancias de
origen vegetal y microbiano que esten presentes en la rizosfera pueden afectar el desarrollo
de estas bacterias mediante efectos estimuladores e inhibidores. Se considera que los
aminocidos derivados de las plantas pueden estimular o reprimir la actividad de la enzima
nitrogenasa en ciertas cepas de Azospirillum . De igual forma las condiciones ambientales (
clima, tipo de suelo, temperatura y humedad del mismo) influyen en los procesos
interactivos que determinan la estructura de la comunidad microbiana as como tambin en
la asociacin Azospirillum-planta , la fijacin del nitrgeno y su contribucina la nutricin
vegetal.
Resistencia a la desinfeccin en el caso de los microorganismo:Practicamente nula.
Capacidad de transferencia de material gentico a otros organismos. Especificar los
parentales que existan en el medio ambiente y posibilidad de cruzamiento:No se han
realizado estudios.
Capacidad de mutacin y adaptabilidad a condiciones medio ambientales: Adecuada
adaptabilidad al medio ambiente.
Ciclo productivo: 24 horas

Mecanismos de estimulacin del crecimiento de las plantas
La capacidad de Azospirillum para estimular el crecimiento de las plantas se ha demostrado en
decenas de experimentos, tanto de campo como de invernadero. En numerosos estudios de
inoculacin con Azospirillum, adems del mejor crecimiento de las plantas, fueron observados
incrementos en el contenido de nitrgeno total de las plantas inoculadas. No obstante, en la
mayora de estos estudios, no se observaron diferencias significativas en el porcentaje de
nitrgeno o en el contenido de protena entre plantas inoculadas y no inoculadas. Esto
contribuy a desechar la idea de que la fijacin biolgica de nitrgeno era el mecanismo

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responsable de los efectos benficos observados. Debido a que los efectos de la inoculacin con
Azospirillum sobre el crecimiento de la raz y la parte area de las plantas son similares a los que
se presentan cuando las plantas son tratadas con fitohormonas, se sugiri que estas sustancias
podran ser responsables del mejor crecimiento de las plantas, as como de los incrementos
observados en el contenido de minerales y en el rendimiento de los cultivos.

Recientemente, ha sido revisada la funcin de las fitohormonas en las asociaciones planta-
microorganismo. Azospirillum tiene la capacidad de producir auxinas
2
, citocininas y giberelinas
en medios de cultivo. No obstante, el mecanismo analizado con mayor amplitud ha sido la
produccin de auxinas, que puede modificar el contenido de fitohormonas
3
de las plantas
conduciendo a la estimulacin del crecimiento de las mismas. En cultivos de Azospirillum, se han
encontrado otros elementos promotores del crecimiento y maduracin de las plantas.

Distribucin
El Azospirillum muestra una amplia distribucin geogrfica. An cuando son ms abundantes en
las regiones tropicales, tambin se les encuentra en las regiones templadas, fras y desrticas. El
pH del suelo juega un papel importante en la presencia de las especies del gnero Azospirillum.
Las especies de A. brasilense y A. lipoferum se encuentran en mayor abundancia en suelos con
valores de pH cercanos a la neutralidad. Tambin se hallan espordicamente en suelos con un
pH abajo de 5, pero cuando el pH es menor a 4.5 no se logra su aislamiento.

Un estudio en el que se evaluaron 23 tipos de suelos con caractersticas diferentes mostr que el
porcentaje de arcilla, contenido de materia orgnica, capacidad de retencin de agua y
contenido de nitrgeno afectan positivamente la sobrevivencia de A. brasilense, en tanto que el
tamao de las partculas de arena y especialmente la alta concentracin de carbonato de calcio
afectan negativamente la sobrevivencia de esta especie en ausencia de plantas. No obstante, la
sobrevivencia de A. brasilense en la rizosfera es independiente de la aridez del suelo.

Interaccin con la planta
Una vez que las clulas de Azospirillum se han adaptado a las condiciones del ambiente
rizosfrico y han logrado llegar a la superficie de las races se inicia el establecimiento de la
asociacin. Diferentes estudios han mostrado que A. brasilense tiene la capacidad de adherirse a
las races de plantas gramneas como el mijo (Pennsisetum purpureum) y Digitaria decumbens,
trigo, maz, as como a las races de plantas de otras familias que incluyen al algodn y tomate,
e incluso a superficies inertes como poliestireno y arena. La capacidad de Azospirillum para
adherirse a las races, al menos a las de mijo, es significativamente mayor que la mostrada por
otras bacterias de la comunidad rizosfrica como Rhizobium, Azotobacter, Klebsiella o
Pseudomonas, e incluso que E. coli.

La asociacin de Azospirillum con las races de las plantas se desarrolla en dos etapas
completamente independientes.

La primera consiste en una absorcin rpida, dbil y reversible, la cual es dependiente de las
protenas de la superficie bacteriana del tipo, de las adhesinas en conjunto con la
participacin del flagelo polar.


2
El nombre auxina significa en griego "crecer" y es dado a un grupo de compuestos que estimulan la
elongacin. La Auxina es miembro de un grupo de hormonas vegetales; son sustancias naturales que
regulan muchos aspectos del desarrollo vegetal.
3
Las fitohormonas son potenciadoras de la germinacin y estimuladoras del crecimiento.

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La segunda fase consiste en un anclaje lento pero firme e irreversible que alcanza su mximo
nivel 16 horas despus de la inoculacin, el cual parece ser dependiente de un polisacrido
extracelular de Azospirillum.

Los resultados de un estudio reciente sugieren la posibilidad de que una protena de la
membrana externa de Azospirillum participe en el proceso de adherencia a las races de las
plantas. En diversos casos, se ha reportado la aparicin de material fibrilar que contribuye al
anclaje de Azospirillum a las races de diversas plantas, describindose como esencial para el
anclaje a las partculas de arena.

La inoculacin de diversas plantas con Azospirillum ha mostrado que los principales sitios de
colonizacin son las reas de elongacin celular y las bases de los pelos radicales. Slo algunas
clulas de Azospirillum llegan a adherirse a la cofia o a los pelos radicales. Sin embargo, fue
observada la presencia de Azospirillum dentro del mucigel que se acumula en la cofia. En plantas
de trigo fue observado que la inoculacin de Azospirillum induce cambios en la morfologa de los
pelos radicales, siendo estos cambios significativamente mayores que los causados por
Rhizobium leguminosarum o Azotobacter chrococcum, los cuales son mnimos. Adems, fue
observado que la inoculacin con 105 a 106 clulas de Azospirillum causa tanto la elongacin
como el aumento de la superficie total de la raz, en tanto que la inoculacin de 108 a 109
clulas causa la inhibicin del desarrollo.

Aparentemente, el incremento del tamao del sistema radical se debe, al menos parcialmente, al
aumento de la divisin celular y al intenso crecimiento de la zona de elongacin de las races. Es
de inters sealar que los sitios que coloniza Azospirillum lipoferum son diferentes, dependiendo
de la variedad de la planta, al menos en el caso del arroz. La capacidad de Azospirillum para
colonizar las races de las plantas es variable dependiendo de la cepa. See ha demostrado, por
ejemplo, que algunas cepas de A. brasilense, incluyendo la tipo Sp7, se encuentran restringidas
al ambiente rizosfrico y son capaces de formar colonias solamente en la superficie de la raz de
plntulas de trigo, en tanto que otras cepas son encontradas frecuentemente en altas
densidades en los espacios intercelulares de la raz, as como en el interior de los pelos radicales.

Experimentos de inoculacin
Con la inoculacin de Azospirillum, se observ frecuentemente un mayor desarrollo del sistema
radical el cual se traduce en mayor superficie de absorcin de nutrientes, as como en mayor
desarrollo de la parte area de las plantas. Tambin fueron observados incrementos en el
contenido de nitrgeno, fsforo, potasio y otros minerales en las plantas inoculadas.
Principalmente con A. brasilense y A. lipoferum se llevaron a cabo gran cantidad de
experimentos en muchos pases para evaluar su efecto sobre el rendimiento de los cultivos. Una
amplia revisin sobre los resultados de los experimentos desarrollados entre los aos 1974-1994
fue realizada por Okon y Labandera. Esta evaluacin revel que el xito de la inoculacin fue en
el rango del 60 al 70% de los experimentos realizados en suelos y regiones climticas diferentes,
con incrementos significativos, generalmente en el rango de 5 a 30%, en el rendimiento de los
cultivos. Sin embargo, cuando se evalu el efecto de la inoculacin en conjunto con la aplicacin
de niveles intermedios de fertilizacin con nitrgeno, fsforo y potasio, el xito de los
experimentos se incrementa hasta 90%. Frecuentemente, se observ que la inoculacin de los
cultivos con Azospirillum permite reducir en 40-50% el nivel de los fertilizantes sin que exista
disminucin en el rendimiento de la cosecha. Recientemente fueron observados incrementos en
la biomasa de pastizales naturales inoculados con A. brasilense aun bajo condiciones de
crecimiento subptimas.




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Aislamiento
El aislamiento de las bacterias Azospirillum es, por lo
general, bastante simple. El procedimiento puede
hacerse ya sea a partir de suelo rizosfrico
4
o de la
superficie de las races (rizoplano) de numerosas
plantas hospederas. Tambin se le aisla del interior
de las races o tallos de algunas plantas.

El medio de cultivo usado por excelencia para el
enriquecimiento del Azospirillum ha sido el NFb
5

semigelificado "libre" de nitrgeno y con malato
6

como fuente de carbono. No obstante, en este
medio de cultivo son aisladas predominantemente
cepas de las especies A. lipoferum y A. brasilense. El
medio NFb con algunas modificaciones en su
composicin y pH permiten el aislamiento predominante de otras especies de Azospirillum. Estos
medios son usados frecuentemente para evaluar la actividad reductora de acetileno
7
, como
indicativo de la fijacin de nitrgeno.

El cultivo puro se logra en diferentes medios de laboratorio. Se usa comnmente un medio
adicionado del colorante rojo Congo
8
, en el cual A. lipoferum y A. brasilense toman un color rojo
escarlata que permite la diferenciacin de otros gneros bacterianos.
Adems de los medios y mtodos descritos, tambin existen reportados algunos medios de
cultivo y mtodos para el crecimiento de Azospirillum en cultivo puro y en asociacin con
plantas, as como para su conservacin.
















4
Parte del suelo que se encuentra alrededor de las races de la planta a no ms de 15 o 20 cms de
profundidad.
5
Medio de cultivo sin nitrgeno. Se llama nfb por su significado en ingls: nitrogen fixation biological.
6
Llamado tambin cido Mlico. Es un compuesto orgnico que se encuentra en algunos frutos cidos.
7
Gas ligero que impide la fijacin de nitrgeno atmosfrico en las plantas y que en su estado puro es
incoloro e inodoro (C
2
H
2
).
8
El Rojo Congo es un colorante aninico o cido que tiene afinidad por la celulosa.

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Aplicacin
La forma ms simple de emplear la bacteria es, tal cual sale del fermentador, pero implica un
gran obstculo que es la remocin de grandes volmenes de lquido con peligro de
contaminacin en el transporte y almacenamiento. Por otro lado y lo ms importante, es que el
microorganismo llega al suelo desprovisto de proteccin, expuesto a los rigores del medio: calor,
humedad, microflora, entre otros lo que disminuye considerablemente sus posibilidades de
supervivencia. La aplicacin del inoculante en forma lquida puede ser, sin embargo, deseable
cuando no es posible tratar la semilla botnica y es necesario aplicar el biofertilizante
directamente al suelo.

Mtodos de propagacin y/o crecimiento de la bacteria
La mayora de las bacterias producidas en la industria agroalimentaria y en la farmacutica se
obtienen por fermentacin sumergida en biorreactores de diversas escalas con la aereacin-
agitacin adecuada a los requerimientos del microorganismo cultivado y con los accesorios y la
automatizacin necesaria que garanticen las condiciones de fermentacin (pH, temperatura,
etc.).

Debido a sus requerimientos nutricionales las bacterias del gnero Azospirillum pueden
producirse econmicamente por el mtodo de fermentacin en templas o discontinuo (batch).

Para la produccin por el mtodo de fermentacin batch que es el ms convencional, el primer
paso es la optimizacin del medio y condiciones de cultivo. Esto es tambin extensivo a la
fermentacin incrementada (fed-batch) y continua. Sorpresivamente, pocos estudios se han
dedicado a la fisiologa de Azospirillum propagado en fermentadores para la produccin de
biomasa.

Para la produccin de biomasa, el crecimiento no debe estar limitado por nitrgeno, lo que
implica una adicin de sales de nitrgeno al medio de cultivo. Tambin se requiere un control
estricto de la esterilidad puesto que el pH y la temperatura ptimos de Azospirillum permiten el
desarrollo de todo tipo de contaminantes potenciales. Los parmetros claves que deben
controlarse son:

La composicin del medio de cultivo
La temperatura
El suministro de oxgeno
El contenido intracelular de polibetahidroxibutirato (PBH) (material de reserva)
El estado fisiolgico de la bacteria al detener la fermentacin

El desarrollo de estrategias de fermentacin optimizadas conllevar a un mejoramiento de la
produccin de biomasa. El mtodo de fermentacin incrementado (fed-batch) en el que los
nutrientes se aaden en el medio durante el transcurso de la fermentacin pueden ayudar a
alcanzar el estado fisiolgico deseado en el medio, incrementndose tambin la productividad de
biomasa.

Aplicacin en forma Slida
El soporte slido mayoritariamente empleado es la turba, aunque se ha ensayado e investigado la
aplicacin de otros como carbn mineral, suelo mineral, cachaza, arcillas, Bentonita, vermiculita,
soportes sintticos, lignito, Bagazo, compost de suelos, zeolita, cscaras de man, tuzas de maz,
aserrn, cscaras de arroz y cscara de caf entre otros. La turba se ha impuesto gracias a sus
favorables caractersticas tales como alta capacidad de absorcin y retencin de agua, contenido
natural de nutrientes, no formacin de grumos, facilidad de molida y la naturaleza biodegradable,
no txica ni contaminante de este material. La bsqueda de otros materiales como soportes est
dada por no contar con yacimientos de turba o no disponer de esta con la calidad requerida.

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Aplicacin en forma seca
Los formulados secos se preparan mediante la deshidratacin de las bacterias. Esto suprime su
actividad metablica, lo que mejora su resistencia al estrs externo y disminuye su sensibilidad
a la contaminacin. Estos inoculantes pueden ser preparados a partir de un liofilizado de
bacterias, por separacin de los microorganismos del medio de cultivo y posterior secado del
inoculante, encapsulamiento de las bacterias en alginato y posterior deshidratacin. Muchos de
estos formulados se presentan en forma de polvos humedecibles, que luego de ser suspendidos
en agua se pueden emplear en el tratamiento de semillas o ser asperjadas en el campo. Para su
preparacin se emplean adems otros ingredientes como dispersantes, adhesivos, protectores
celulares e inertes.

Aplicacin en forma Granulada
Se preparan tambin inoculantes granulados para su uso directo en el campo. Formulados
granulados de se preparan a partir de turba con tamao de partcula entre 40 y 60 mesh. Las
dosis de este tipo de inoculante, en dependencia del cultivo y tipo de suelo, pueden estar entre 5
y 60 kg ha
-1
.

El Instituto Cubano de Investigacin de Derivados de la Caa de Azcar (ICIDCA) ha
desarrollado una tecnologa que permite la obtencin de dos formas terminadas:

Polvo hmedo para impregnacin de semillas: Este producto se emplea para cultivos que se
siembran con semillas botnicas tales como arroz, maz, sorgo, etc. La semilla se recubre con
una capa de inoculante que debe contener entre 10
3
Y 10
7
ufc/semilla en dependencia del
tamao de la semilla. En este caso, la dosis de inoculante adecuada es de alrededor de 0.5 kg
ha
-1
.

Polvo humedecible para la aspersin al suelo: Se puede emplear para cualquier tipo de
cultivo, aunque preferiblemente para aquellos en los que no se puede emplear la
impregnacin, como es el caso de la caa de azcar y plantas de semillas muy pequeas, que
tienden a aglomerarse. La dosis depende del tipo de cultivo y puede fluctuar entre 10
7
Y 10
15

ufc/ha
-1
para aplicacin en surcos y entre 10
4
y 10
9
ufc/ha
-1
de suelo para semilleros.

















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Experiencia con Azospirillum
El Instituto Nacional de la Caa de Azcar de Cuba (INICA)
9
reporta ensayos de campo con
Azospirillum en caa de azcar. En estos experimentos, se emple el inculo lquido, sin
formular, con concentraciones de bacterias activas en el orden de 1.2-3.5 X 10
9
ufc ml
-1
. Se
encontr que, para caa de retoo, las dosis ms eficaces estn entre 75 y 100 l/ha
-1
. En
algunos casos, los rendimientos fueron similares a los obtenidos con las dosis de fertilizacin
mineral recomendadas.

No se han ensayado formulados slidos en caa de azcar por lo que se ha recomendado su
estudio, ya que esto posiblemente disminuya la dosis de inculo y mejore la efectividad del
biofertilizante.

Otras experiencias con Azospirillum se han realizado en el cultivo del tomate donde se
obtuvieron rendimientos similares a los que se alcanzan con aplicaciones de dosis completas de
fertilizantes minerales. En la biofertilizadn de Guinea (Panicum mximum) se observ un
incremento del rendimiento al inocular con Azospirillum.

Adicionalmente, el ICIDCA ha desarrollado una tecnologa de produccin del biofertilizante la
cual brinda la posibilidad de cuatro formas terminadas del mismo en dependencia de las
demandas del cultivo:

Inoculante lquido ( 60-90 das de vida a 10 C)
Formulacin lquida concentrada (90-180 das de vida til a 10C)
Formulacin slida para impregnacin de semilla (60-90 das de vida til a temperatura de 25
C )
Formulacin slida para preparacin asperjable (60-90 das de vida (mI a temperatura de
25C)

Caractersticas de los productos diseados por el ICIDCA:

Polvo hmedo para la impregnacin de semillas
Soporte: Turba o Cachaza
Viabilidad: > 10
9
ufc g
-1

Humedad: 60 2 %
Granulometra: < 140 mesh (0.07 mm)
Polvo humedecible para aspersin
Soporte: Turba o Cachaza
Viabilidad : > 10
9
ufc g
-1

Humedad: 60 2 %
Granulometra: < 200 mesh (0.074 mm)

Factibilidad de la Aplicacin en Caa de Azcar
El inoculante Azospirillum como licor del fermentador (sin formular) ha sido aplicado al cultivo de
la caa de azcar en experiencias realizadas por el INICA. Se reportan resultados satisfactorios
con el empleo de 75-100 l/ha
-1
de licor (10
9
ufc m
-1
) y sustitucin del 70 % o ms del fertilizante
qumico. Los rendimientos, en este caso, han sido similares a cuando se aplica la dosis completa
de Nitrgeno.

Dado que la caa de azcar no se siembra con semilla botnica es imposible la impregnacin de
semillas y debe por tanto aplicarse el inoculante directamente al suelo como spray o granulado.


9
Ver otro resultados de experimentos en Anexos, p. 17.

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10
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El costo de la fertilizacin con NH
3
anhidro de una hectrea es de 23 USD (100 kg ha
-1
), luego
para obtener efecto econmico positivo, el costo del inoculante Azospirillum ms el del 30 % de
la dosis de NH
3
debe ser inferior a ese valor.

Cultivos de Papa, Camote y Tomate
Dosis del inoculante entre 40 y 80 L.ha -
1
compensan la reduccin del 25 % de la fertilizacin
nitrogenada, as como estimulan los rendimientos cuando es aplicado con la fertilizacin
completa.

Factibilidad de la Aplicacin en Arroz
El licor de Azospirillum
ha sido probado con
resultados satisfactorios
en la sustitucin de
parte del fertilizante
qumico. Los mejores
resultados se obtienen
con aplicacin de 13 l
ha
-1
del licor de
Azospirillum y 70 % de
la dosis de urea. El arroz
es ideal para el empleo
de polvo hmedo para la
impregnacin de
semillas. La dosis que se
reporta para cereales es
500 g para el
tratamiento de semillas
que corresponde a 1 ha de siembra.

Las dosis tan bajas de inoculante que se requieren en la impregnacin de semillas implica una
gran ventaja econmica para la fertilizacin de cultivos que admiten este mtodo de inoculacin
















Tabla 2. Costos de inversin y produccin de Inoculante de
Azospirillum (Estimados)
Costo de Inversin Costo de Produccin
Proceso Variante USD USD kg
-1
Turba Cachaza Turba Cachaza
Polvo hmedo.
Impregnacin
de semillas
I 69,523 84,514 0.36 0.34
Polvo hmedo
.Impregnacin
de semillas
II 57,890 69,855 0.27 0.25
Polvo humedecible.
Aspersin
del suelo
I 69,523 84,514 0.'12 0.40
Polvo humedecible
Aspersin al suelo
II 57,980 69,855 0.33 0.31
Licor del
fermentador
- 0.12

Fijador de Nitrgeno
Azospirillum sp.






11
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Proceso Tecnolgico
La experiencia indica que en un producto comercial es aconsejable proteger los microorganismos
en un medio que les permita sobrevivir largo tiempo antes de ser introducidos en el suelo y que,
una vez all, les asegure una supervivencia que les garantice una rpida penetracin y
reproduccin en las races para cumplir su cometido. Los productos se pueden obtener en dos
variantes tecnolgicas:

I. Polvo hmedo para impregnacin de semillas
II. Polvo humedecible para aspersin en suelo

La Variante I
10
se caracteriza por el preempaquetamiento del soporte y la inoculacin y
homogenizacin manual. Mientras que en la variante II estas dos ltimas operaciones se realizan
de manera mecnica.

Existen instalaciones para la produccin de inoculantes comerciales para la variante I. La
Variante II
11
requiere un alto grado de hermeticidad del equipamiento para evitar la
contaminacin y es interesante ya que no requiere de tanta fuerza de trabajo.









10
Detalle de la Operacin tecnolgica y Equipamiento para una Planta de 500 t segn la Variante I en
Anexos, p. 16.
11
Detalle de la Operacin tecnolgica y Equipamiento para una Planta de 500 t segn la Variante II en
Anexos, p. 17.
FERMENTADOR Servicios

Agua. Vapor. Electricidad
Nutrientes

Miel Final de Caa.
Hidrolizado de Levadura.
MgSO
4
. Na
2
HPO
4
. (NH
4
)
2
HPO
4


Caldo Fermentado
Rico en Bacterias

Fijador de Nitrgeno
Azospirillum sp.






12
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Capacidad Instalada y Produccin Mundial
El mercado mundial de inoculantes de Azospirillum, a pesar de que se reporta sobre algunos
comerciales como Azospirillum en soporte de vermiculita, que se vende in Italia y Azospirillum
lipoferum CTRL microgranulado, registrado en Francia con el nombre Azogreen, Graminosol de la
firma Argentina Nltrasoil S.A y algunos otros, se caracteriza por ser an incipiente, dependiendo
su desarrollo comercial significativo de tres factores principales interrelacionados entre s.

El progreso que se espera alcanzar en el conocimiento bsico de su asociacin con la planta.
Una tecnologa optimizada de formulacin y aplicaci6n
Una evolucin en la actitud de las industrias agroqufmicas y de semilla hacia los inoculantes
microbianos.

Recientemente, se han alcanzado avances significativos en cada uno de estos tres dominios y el
futuro cercano dir si existe un nicho de mercado rentable para los inoculantes de Azospirillum.

Las tecnologas de formulacin y aplicaci6n condicionan varios parmetros de primera
importancia para el aseguramiento de una exitosa vida comercial de estos productos. Sin
embargo, debe tenerse en cuenta que una cepa eficiente, una formulacin optimizada, un
proceso de produccin econmicamente viable y un sistema prctico de inoculacin en el campo
no son suficientes para lanzar el producto al mercado, ya que existen otros requerimientos que
deben satisfacerse antes de la comercializacin tales como:

la eficiencia y confiabilidad del producto debe demostrarse estadsticamente en pruebas de
campo a gran escala.

Los costos de registro y sus demoras deben considerarse, pues este proceso puede variar
considerablemente de un pas a otro. an dentro de una misma entidad econmica tal como
la Comunidad Econmica Europea (CEE) por ejemplo, Italia, Alemania y Francia tienen
procedimientos totalmente diferentes. las autoridades francesas exigen programas estrictos
de pruebas toxicolgicas y en campo. El ejemplo francs es bien visto pues muchos pases
estn en el proceso de implementaci6n de reglas de registro y est previsto que en los
prximos aos la caracterstica ms comn ser la reglamentaci6n estricta. Esto quiere decir
que los productos microbianos tendrn que demostrar ambas cualidades, su eficiencia y su
inocuidad.

Aspectos Econmicos
Los mayores valores de inversin para la cachaza se deben a que dada la menor densidad de
este material deben emplearse equipos de mayor volumen. Los costos de produccin de la
cachaza son ligeramente menores dado su costo como materia prima con relacin a la turba.

La efectividad del inoculante se determina al comparar el costo de su aplicacin en una hectrea
con el de un fertilizante qumico tradicional al que sustituye totalmente o en parte. La dosis de
inoculante depende del tipo de aplicacin y tipo de cultivo, por lo que generalmente debe
determinarse experimentalmente. La dosis est ligada estrechamente tambin al ttulo del
inoculante en el momento de la aplicacin.


Fijador de Nitrgeno
Azospirillum sp.






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Conclusiones

Por sus propiedades, el Azospirillum se presenta como una opcin interesante como
biofertilizante en una gran diversidad de cultivos al servir como medio de fijacin de nitrgeno
atmosfrico y El Salvador podra tomar ventaja de ello en las siguientes formas:

A nivel mundial, se cuenta con la tecnologa apropiada para producir industrialmente este
microorganismo y esta podra adaptarse a las condiciones del El Salvador, considerando la
disponibilidad de materias primas existentes en el pas.

Es interesante mencionar el potencial que posee este microorganismo para disminuir la
cantidad de fertilizantes utilizadas en los cultivos convencionales, adems de ser una fuente
de nitrgeno adaptable a los cultivos que quieren certificarse como libres de qumicos.

Los biofertilizantes son una opcin que adems es beneficiosa para el medio ambiente.

A esto se suma el hecho de que los productos orgnicos tienen un valor agregado que un
mercado cada vez ms grande est dispuesto a adquirir.



























Fijador de Nitrgeno
Azospirillum sp.






14
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Recomendaciones

Entre las alternativas ms interesantes para ser utilizado como biofertilizante se encuentra el
cultivo de caa y los cultivos orgnicos, sin embargo habr que realizar pruebas de campo para
asegurar la correcta utilizacin de este microorganismo. Esto se debe a que el comportamiento
del Azospirillum depende en gran medida del suelo en el que se inocule.

Habr que valorar tambin cules seran los efectos en el rendimiento de la caa y los costos de
una produccin industrial de Azospirillum. Con ello, se asegurara que la produccin es posible y
rentable.

Se hace necesaria adems una campaa de informacin en la cual se informe a los cultivadores
de la caa de qu es el Azospirillum, sus usos y beneficios, con el objetivo de que acepten el
producto. Esto, por supuesto, despus de realizar las pruebas de campo necesarias que
ratifiquen los beneficios otorgados al microorganismo.

Sin embargo, es necesario aclarar que la bacterizacin
12
ha presentado resultados
extremadamente variables lo que constituye el ms grande obstculo en el desarrollo de una
tecnologa efectiva y confiable. El principal problema es que el suelo es un medio altamente
heterogneo e impredecible para los microorganismos introducidos.

























12
Proceso mediante el cual las bacterias se introducen en el suelo e invaden la raz de la planta.

Fijador de Nitrgeno
Azospirillum sp.






15
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Anexos

Resultados de Experiencias en Caa de Azcar
El inoculante Azospirillum como licor del fermentador ha sido aplicado al cultivo de la caa de
azcar en experiencias realizadas por el INICA. Se reportan resultados satisfactorios con el
empleo de 75-100 L/ha de licor (10
9
UFC mL
-1
) y sustitucin del 70% o ms del fertilizante
qumico.

En la variedad de planta C 266-70, ( provincia Pinar del Ro ), los resultados indicaron un
efecto positivo cuando se aplica este biopreparado ( 100 L ha
-1
), los incrementos productivos con
esta dosis variaron entre 26.2 y 29.7 % con respecto al testigo sin nitrgeno, sustituyendo todo
el nitrgeno que se porta con fuente mineral.

En la variedad C 87-51 tercer y cuarto retoo, (provincia Matanzas), la planta respondi
positivamente ante la aplicacin de los 100L ha
-1
y se repiti la sustitucin de todo el nitrgeno
aplicado en forma general.

En la variedad Jaron 60-5, (provincia Villa Clara), los mejores resultados se obtuvieron
cuando se emplearon dosis entre 50-100 L ha
-1
que representa aproximadamente el 90% del
valor que se obtuvo cuando se aplic 100 Kg de nitrgeno en forma mineral.

En la variedad Jaron 60-5, C 120-78 (Cienfuegos), los mejores resultados se obtuvieron
cuando se aplicaron las dosis de 75 L ha
-1
aplicados en retoo, capaz de sustituir 80 Kg de
nitrgeno mineral por hectrea.

En las variedades Ja 60-5 , C 266-70, C 120- 78, Bj 59-24 (Santi Spiritus), se aplican
dosis de 100 L/ ha y los rendimientos se incrementan entre 22- 50 % con relacin al testigo . Se
sustituye entre el 89 y 100 % de todo el fertilizante mineral aplicado

En la variedad Jaron 60-5 (Ciego de Avila), las dosis de 75 y 100 L ha
-1
incrementaron los
rendimientos a 20 y 38 % respectivamente con relacin al testigo absoluto.

En las variedades 266-70 , Jaron 60-5 , C 87-51, C 266-70 y C 120- 78 (Camagey), se
aplicaron dosis entre 50 y 150 L ha
-1
, resultando la mas adecuada 100 L ha
-1
para incrementar
los rendimientos hasta el nivel de la fertilizacin mineral ( 33 % como promedio).

En la variedad C 568-75, (Granma), las dosis de 100 L ha
-1
del inoculante produjo incrementos
productivos al mismo nivel que la fuente mineral.

En la variedad Jaron 60-5 (Holgun ), se obtuvieron los mejores resultados para la dosis de
120 L ha
-1
, produciendo un incremento en la produccin de los tallos.

En las variedades 687-51, C120-78, Jaron 60-5 (Santiago de Cuba), se obtuvieron
incrementos en los rendimientos agrcolas ( entre un 25 y 32 % con respecto al testigo)
empleando dosis de 100 L ha
-1
.









Fijador de Nitrgeno
Azospirillum sp.






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Fundacin para la Innovacin Tecnolgica Agropecuaria
Operaciones Tecnolgicas y Equipamiento para una Planta de 500 t a
-1
de Inoculante
Variante I

Secado: En instalacin de secado a la intemperie

Humedad de entrada
Turba: 65 %
Cachaza: 75 %

Humedad de salida
Turba: 17 %
Cachaza: 12 %

Si se emplea otro tipo de secado, la temperatura no puede sobrepasar los 70 C.

Molida y Clasificacin: Un sistema que permite moler los materiales (turba o cachaza) y
clasificarlos hasta los tamaos de partculas deseadas.

Capacidad: 40 kg h
-1
(turba 17 % o cachaza 12 %)

Granulometra
Entrada: < 20 mm
Salida < 140 mesh (O. 105mm)
< 200 mesh (0.0074 mm)

Empaquetamiento: Unidad envasadora en bolsas de polipropileno de 0.5 kg de turba o cachaza.
Capacidad: 3,334 bolsas de 0.5 kg d
-1


Esterilizacin: Mediante tratamiento con vapor a las bolsas que contienen los soportes.

Capacidad: Para esterilizar 3,334 bolsas de 0.5 kg de turba o cachaza en un da

Equipamiento: Autoclave provisto con sistema para introducir y sacar las bolsas.

Temperatura: 121 C (1 kg cm
-2
de presin de vapor)

Tiempo de esterilizacin: 90 min.

Sistema de inoculacin de bolsas: Para inocular el licor del fermentador a razn de 260 ml por
bolsa y 3,334 bolsas en el da.














Fijador de Nitrgeno
Azospirillum sp.






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Variante II
Secado: Idem Variante I

Molida Y dasificacin : Idem variante I

Esterilizacin, enfriamiento e inoculacin: Estas tres operaciones se realizan en un aparato
provisto de un mecanismo revolvedor y de extraccin del material.

Capacidad : <40 kg h
-1
de turba o cachaza
Material en contacto con el licor: Acero inoxidable.
Enchaquetamiento para vapor o agua de enfriamiento
Temperatura de entrada del material soporte: 28 C
Temperatura de salida del material soporte: 30 C
Temperatura vapor saturado: 121C (presin = 1 kg cm
-2
)
Se mantiene el material durante 90 min. a esta temperatura.
Temperatura de enfriamiento, entrada: 28 C
Temperatura agua enfriamiento, salida: 40 C

Esterilizacin de bolsos: Las bolsas vacas se esterilizan mediante tratamiento con vapor en
autoclave.

Capacidad: 3,334 bolsas para 0.5 kg (3,334 por da)

Material de la bolsa: Polipropileno

Temperatura: 121 C (1 kg Cm-2 de presin de vapor)

Tiempo de esterilizacin: 90 min.

Envases: Sistema para envasar en bolsas de 0.5 g (3,334 por da) o en bolsas de 20 kg (83
bolsas d
-1
)

La instalacin en las variantes
tecnolgicas puede producir polvo
hmedo para impregnacin de semillas o
polvo humedecible para impregnacin en
suelo. Las cantidades de uno u otro
producto que se elaboren anualmente
dependen del mercado y de los resulta-
dos de las pruebas demostrativas en
campo que se realizan para diferentes cultivos.

La capacidad total de produccin en 300 das es de 500 t (1 milln de bolsas de 0.5 kg 25 mil
bolsas de 20 kg).









Base de clculo: 1 L de caldo fermentado con un
titulo de 10
10
ufc ml
-1

Medio de cultivo g t'
Miel final de caa 12
MgSO
4
7 H
2
0 0.2
Hidrolizado de levadura (7% N
2
) 1
(NH4)
2
HPO
4
2
NaHPO
4
6