Prof. Rafael González P.

Departamento de Ciencias Fisiológicas

Período 1-2014
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 MECANISMOS DE ACCIÓN ENZIMÁTICA
Para que una reacción química tenga lugar, las moléculas de los
reactantes deben chocar con una energía y una orientación
adecuadas.

 Factores Termodinámicos: Para que una transformación

química de un compuesto (S) en un compuesto (P) pueda
transcurrir espontáneamente es necesario que el cambio en la
energía libre de Gibbs del sistema sea negativa.

 Factores Cinéticos: La transformación del (S) en (P) se

produce a través de un estado de transición en el que se están
rompiendo determinados enlaces y formándose otros nuevos.

 Enzima: Aumenta la probabilidad de choque con el sustrato,

orientación óptima de los mismos para que la reacción se
produzca.
2
MECANISMOS DE ACCIÓN ENZIMÁTICA

Una vez E-S, grupos funcionales

CATÁLISIS ENZIMÁTICA catalíticos situados adecuadamente
colaboran en la rotura o formación de
Suele implicar la existencia de enlaces mediante una variedad de
interacciones covalentes mecanismos:
transitorias S-E, o transferencia de
grupos desde/hacia la Enzima. 1.- CATÁLISIS ÁCIDO-BASE
TRANSFERENCIA DE PROTONES (H+)
Finalidad de adoptar una ruta de INCREMENTOS DE VELOCIDAD
FORMACIÓN DE INTERMEDIARIO CARGADO
reacción nueva y de menor
INESTABLE
energía.
2.- CATÁLISIS COVALENTE
ENLACE COVALENTE TRANSITORIO ENTRE E-S
REACCIONAR CON MÁS FACILIDAD PARA
FORMAR LOS PRODUCTOS

3.- CATÁLISIS POR IONES METÁLICOS

INTERACCIONES IÓNICAS ENTRE UN METAL
FIJADO A LA ENZIMA Y EL SUSTRATO
3
 IMPORTANCIA BIOMÉDICA DEL
ESTUDIO DE LAS ENZIMAS
Se sintetizan en el interior de las células y la mayoría
realiza allí sus funciones.

Refleja el daño de algún tejido. Diagnostico, seguimiento y

pronostico del paciente.

Numerosos fármacos importantes en terapéutica actúan

por reducción de las velocidades de reacciones metabólicas
al competir con el sustrato natural por una enzima clave.

Todos los factores que afectan la velocidad de las

reacciones catalizadas por enzimas -concentración de
enzima y de sustrato, temperatura, pH y Presencia de
inhibidores- tienen interés en clínica. 4
 NIVELES ENZIMÁTICOS COMO
ÍNDICES DE ENFERMEDAD

Enzima Daño ocasionado

α-amilasa Daño pancreático
Obstrucción biliar,
Fosfatasa Alcalina
Cáncer de huesos
Fosfatasa Ácida Cáncer de Próstata

Creatin-fosfoquinasa (CK-MB),
IAM
Lactato Deshidrogenasa (LDH-H4),

Transaminasa Glutámica Oxaloacética

IAM
(AST-TGO)
Transaminasa Glutámica Pirúvica (ALT-
Hepatopatías
TGP)
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 CINÉTICA ENZIMÁTICA
 Es una rama de la Cinética Química.
 Estudio cuantitativo de la catálisis enzimática.

 Velocidad de las reacciones.

CAMBIO [R] o [P] / t

 Mecanismo catalítico.
 Afinidad de las enzimas por sus sustratos.
 Inhibición.

*Mejor comprensión de las rutas metabólicas.

*Diseño de tratamientos más adecuados.
*La farmacología aprovecha el conocimiento de los factores que
modifican las reacciones enzimáticas. 6
 CLASIFICACIÓN DE LAS REACCIONES

En una reacción de PRIMER ORDEN la velocidad de

formación de los productos es directamente proporcional a
la concentración del sustrato.

Una reacción de SEGUNDO ORDEN es aquella en la que

la velocidad de formación del producto depende: de la
concentración de dos sustratos o del cuadrado de la
concentración de un único sustrato.

Algunas reacciones químicas son independientes de la

concentración de cualquier reactivo; son las llamadas
reacciones de ORDEN CERO. V=K
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 MICHAELIS-MENTEN:
BASES EXPERIMENTALES

Los estudios sistemáticos del efecto de

la concentración inicial del sustrato
sobre la actividad enzimática
comenzaron a realizarse a finales del
siglo XIX.

Para explicar la relación observada entre

la velocidad inicial (v0) y la concentración inicial
de sustrato ([S]0) propusieron que las
reacciones catalizadas enzimáticamente
ocurren en dos etapas. Rápido

En la primera etapa se forma el complejo

enzima-sustrato y en la segunda, el
complejo enzima-sustrato da lugar a la
formación del producto, liberando la Lenta
enzima libre. Limita Veloc Global 8
 MICHAELIS-MENTEN:
BASES EXPERIMENTALES
La concentración total de enzima, [ET], (que es constante a lo largo
de la reacción) es:
[ET] = [E] + [ES]
 Este modelo cinético adopta la hipótesis del estado estacionario, según
la cual la [E-S] es pequeña y constante a lo largo de la reacción.

Ésta es la Ecuación de Michaelis-Menten, la ecuación de velocidad de una

reacción catalizada enzimáticamente con un sustrato.

Es una definición de la relación cuantitativa entre la velocidad inicial Vo, la

velocidad máxima Vmáx y la concentración inicial de sustrato [S].

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 KM = CONSTANTE DE MICHAELIS-MENTEN

La representación gráfica de la
ecuación de Michaelis-Menten
(v0 frente a [S]0) es una
hipérbola .

La Vmax corresponde al valor

máximo al que tiende la curva
experimental. Se alcanza
cuando todos los centros
catalíticos de la enzima se
encuentran ocupados por el
sustrato.

La KM corresponde a la
concentración de sustrato a la
cual la velocidad de la
reacción es la mitad de la Vmax.
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 KM = CONSTANTE DE MICHAELIS-MENTEN

Es una medida de la
afinidad de la enzima
por el sustrato.

 A mayor KM menor
afinidad de la enzima
por el sustrato y
viceversa.

 Relaciona todas
las constantes de
Velocidad de una
reacción catalizada
por enzimas.
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LA [S] AFECTA LA VELOCIDAD DE REACCIÓN
CATALIZADA POR ENZIMAS

A concentraciones muy
elevadas de sustrato se
produce un efecto de
saturación y casi toda la
enzima se encuentra en
forma de complejo enzima-
sustrato.

En este momento se habrá

alcanzado la mayor
velocidad posible para la
reacción (Vmáx)
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 LINEWEAVER-BURK
GRÁFICA DE LA DOBLE RECÍPROCA
Se toman los inversos de la
ecuación M-M.
Reordenamos:

 No todas las enzimas cumplen

las condiciones (Enzimas
alostéricas)
ECUACIÓN DE UNA LÍNEA RECTA
y=m.x+b  Difícilmente aplicable a
Donde: reacciones con dos sustratos.
y = 1/Vo
m = Km/Vmáx  No se puede determinar con
x = 1/[S] exactitud Vmax ni Km (Hipérbola
rectangular, nunca llega a Vmax).
b = 1/Vmáx 13
 INTERPRETACIÓN DE Vmáx Y Km.
GRÁFICA DE LOS DOBLES RECÍPROCOS

 Calcular parámetros cinéticos

con exactitud.

 Estudiar la inhibición
enzimática.

 Identificar el punto de corte con

el eje de ordenadas (Y) es el
equivalente a la inversa de Vmáx,
y el de abscisas (X) es el valor de
-1/Km.

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 INHIBICIÓN ENZIMÁTICA
Moléculas diferentes del sustrato pueden unirse al enzima
reduciendo total o parcialmente su actividad catalítica. Estas
moléculas reciben el nombre de inhibidores.
-Fármacos, Antibióticos, Conservantes, Venenos.
- Importantes para regular las rutas metabólicas
-Tratamiento Clínico

IRREVERSIBLE REVERSIBLE
 COMPETITIVA

 NO COMPETITIVA

 ACOMPETITIVA
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 INHIBICIÓN IRREVERSIBLE
EL INHIBIDOR SE UNE COVALENTEMENTE A LA ENZIMA
Disminución de la Concentración Enzima Activa y del
Complejo E-S

Altamente tóxicos

Tipos de Inhibidores Irreversibles:

Ligandos de Metales.
Metales Pesados.
Organofosforados.

Puesto que estos inhibidores no tienen semejanza

estructural con el sustrato, un incremento en la
concentración de éste, en general, es ineficaz para
suprimir esta inhibición. 16
 INHIBICIÓN REVERSIBLE
“COMPETITIVA”

SE REVIERTE AL AUMENTAR LA
CANTIDAD DE “S”. EL INHIBIDOR
COMPETITIVO ES DESPLAZADO
Y SE FORMA EL “P”. Km: aumenta
Vmáx: no se modifica
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 INHIBICIÓN REVERSIBLE
“NO COMPETITIVA”

El inhibidor reduce la velocidad máxima, Vmáx. Disminuye

pero Km (la afinidad de la enzima por el Km: Igual
sustrato) su valor sigue siendo el mismo.
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 INHIBICIÓN REVERSIBLE
“ACOMPETITIVA”

EL INHIBIDOR SE ENLAZA A
LA ENZIMA SÓLO SI Vmáx: DISMINUYE
PREVIAMENTE SE HA Km: DISMINUYE
UNIDO EL SUSTRATO
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 REGULACIÓN DE LAS VÍAS
METABÓLICAS
RETROINHIBICIÓN (REGULACIÓN FEED-BACK)

Primer paso de una ruta metabólica o punto de ramificación.

En muchos sistemas multienzimáticos el producto final de la secuencia de

reacciones puede actuar como un inhibidor específico de una enzima
situada al comienzo de la secuencia, lo cual determina que la velocidad de
la secuencia completa de reacciones resulte condicionada por la
concentración de producto final.

Tre α- cetobutirato Ile El producto final

Treonina de la ruta, inhibe
Desaminasa a la primera
enzima de la
misma. 20
 SISTEMAS ENZIMÁTICOS
REGULADORES

1.- SISTEMAS ALOSTÉRICOS

2.- SISTEMAS ISOZÍMICOS

3.- REGULACIÓN POR MODIFICACIÓN

COVALENTE

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 ENZIMAS ALOSTÉRICAS
POSEE SITIO ACTIVO Y SITIO ALOSTÉRICO

Enzima cuya actividad está regulada mediante un centro

alostérico, que es un sitio, distinto del centro activo de la
enzima, al que se une un regulador (llamado regulador
alostérico) de manera reversible y no covalente.

Presentan estructura cuaternaria

La actividad de la enzima se afecta por moléculas

efectores que se unen en otros lugares; sitios
alostéricos o regulables.

Catalizan pasos reguladores claves de las rutas

bioquímicas

La unión del sustrato es cooperativa

(Unión del 1er sustrato  facilita)

La curva de velocidad presenta una forma sigmoidea

(no cinética M-M) 22
 ENZIMAS ALOSTÉRICAS

PRESENTAN
2 ESTADOS CONFORMACIONALES.

Presenta un Estado Tenso (T)

(de baja afinidad al sustrato)

Un Estado Relajado
(de alta afinidad al sustrato).

SITIO ALOSTÉRICO
(para el efector o regulador + ó -)

SITIO CATALÍTICO
(para el sustrato).
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ENZIMAS ALOSTÉRICAS
HETEROTRÓPICAS:
(sustrato y efector son diferentes)

HOMOTRÓPICAS:
(sustrato y efector son iguales)

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 COOPERATIVIDAD (POSITIVA)

Consiste en que la fijación de una molécula de sustrato

favorece la fijación del siguiente, y así hasta ocuparse
toda la molécula

S S S S S S S
S S S
1 2 3

EN TÉRMINOS DE Km= ¿?

Existe también Cooperatividad negativa, cuando la

fijación de una molécula de substrato dificulta la
fijación del siguiente.

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 MODELOS QUE TRATAN DE EXPLICAR LA
CINÉTICA DE LAS ENZIMAS ALOSTÉRICAS
1.- MODELO MWC: MONOD, WYMAN Y CHANGEUX - 1965
Modelo Concertado.
No se conciben formas híbridas del
tipo R-T.
Si no hay nada unido, las formas se
encuentran en equilibrio.

2.- MODELO KHF: KOSHLAND, NEMETHY Y FILMER- 1966

La unión de un efector causa un cambio

conformacional en una subunidad que, a
su vez, induce un cambio en su interacción
con las subunidades contiguas.
 ENZIMAS ALOSTÉRICAS
Ciertas sustancias tienden a estabilizar la forma R. Son
los llamados moduladores positivos.

Las moléculas que favorecen la forma R pero que actúan

sobre una región del enzima distinta del centro activo son
los activadores alostéricos

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 ENZIMAS ALOSTÉRICAS
Las sustancias que favorecen la forma T y disminuyen
la actividad enzimática son los moduladores
negativos.

Si estos moduladores actúan en lugares distintos del

centro activo del enzima se llaman inhibidores
alostéricos

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CINÉTICA DE LAS ENZIMAS
ALOSTÉRICAS

EFECTOR
ALOSTÉRICO
POSITIVO
Vo
SIN EFECTOR
EFECTOR
ALOSTÉRICO
NEGATIVO
Vo

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 ISOENZIMAS
Enzimas que tienen distinta estructura molecular aunque su función
biológica es similar se llaman isozimas o isoenzimas. Estas diferencias
de estructura se traducen en ligeros cambios en sus propiedades, de
forma que cada isozima se adapta perfectamente a la función que debe
realizar.

Tienen secuencias de aminoácidos similares, pero no idénticas. Todas

catalizan la misma reacción bioquímica y tienen:

Distintas propiedades cinéticas : diferentes Km y Vmáx

Diferentes propiedades reguladoras (diferentes efectores)
Diferentes preferencias por coenzimas
Diferente distribución celular

Compartimento celular donde actúa: Malato Deshidrogenasa.

Tipo de Tejido: Lactato Deshidrogenasa.

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 ISOENZIMAS

LDH= Tetrámero con dos posibles tipos de subunidades:

M (muscular) y H (cardiaco).

LDH1 (H4); LDH2 (H3M), que se encuentran sólo en el corazón y en los

glóbulos rojos

LDH5 (M4), que se encuentra en el hígado y músculo esquelético

LDH3 (M3H); LDH4 (M2H2), que se encuentran en otros órganos.

La isoenzima M4 tiene mayor afinidad por piruvato y la H4 por lactato.

Este tipo de regulación permite que diferentes patrones metabólicos

funcionen en distintos órganos. 31
 MODIFICACIÓN COVALENTE
Enzimas sufren un cambio en la actividad debido a la Modificación
Covalente de algunos restos aminoacídicos de la cadena polipeptídica.

Pasan de una forma menos activa a otra más activa uniéndose

covalentemente a un grupo químico de pequeño tamaño como el Pi o el
AMP. En las enzimas de las vías degradativas del metabolismo, la forma
fosforilada es más activa que la no fosforilada, mientras que en las vías
biosintéticas ocurre lo contrario.

Las principales modificaciones covalentes que conducen a una modificación de

la actividad enzimática (activa  inactiva) son:
* Fosforilación <==> Desfosforilación
* Acetilación <==> Desacetilación
* Adenilación <==> Desadenilación
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* Uridilación <==> Desurilación
MODIFICACIÓN COVALENTE
Fosforilación: Protein Quinasas

Desfosforilación: Protein Fosfatasas 33

 MODIFICACIÓN COVALENTE
Suele haber fenómenos de modificación
covalente de enzimas en la respuesta celular
a señales químicas:

 Neurotransmisores
 Hormonas
 Factores de crecimiento
 Estímulos morfogenéticos y de diferenciación
 Muerte celular programada (apoptosis)
 Estímulos antigénicos
 Luz y otros agentes físico-químicos

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