TECNOLOGIAS

RELACIONADAS CON
LA DETECCION DEL
DNA
¿cómo podemos obtener muchas copias del mismo gen?

A través de secuencias de ADN, que van a generar una proteína que ayuda a formar, por
ejemplo, pigmentos de una flor purpura.

A través de la secuencia de ADN crear muchas copias.

PCR (polimerasa chain reaction= reacción en cadena

de la polimerasa)
Asimila lo que hace la DNA polimerasa en el proceso de replicación. Simula una replicación
in vitro.

Amplificación enzimática de un fragmento de DNA específico. Permite generar millones de

copias idénticas de un fragmento de DNA específico.

Para el PCR solo se ocupa DNA polimerasa (enzima que sintetiza DNA)

Elementos que se requieren para la síntesis del DNA

por medio de la técnica de PCR
Partiendo por un DNA molde, la enzima DNA polimerasa incorporará nucleótidos
complementarios a partir de una zona específica delimitada por los primers.

La DNA polimerasa creara una copia, pero nosotros de manera artificial incorporaremos
parte del material que son:

 Los nucleótidos (ACTG)

  Primers
 Taq polimerasa
 Cofactores para la enzima que funcione de manera optima (miz buffer) es agua y
cationes

PCR: separar las hebras de DNA

La separación ocurre aplicando distintas temperaturas, lo que dara paso a la
denaturación.

Las hebras se romperán, quedando hebras simples.

Entonces se agrega en un tubo con nucleótidos, primers, mix de buffer, DNA simple.
Entonces este se agrega al termociclador, el cual permite hacer ciclos de temperaturas, las
cuales son:

1. Denaturación: 94°  abre las hebras

2. Priming: 60°
3. Extension: 72
 Al aumentar la temperatura se rompen los puentes de hidrogeno que mantienen
ambas hebras unidas y logramos obtener DNA de simple hebra
 Además, al separarse las hebras permite que se exponga las bases para que sean
leidas por las enzimas

PCR paso a paso

1. Al hacer la denaturación y estar expuestos a altas temperaturas lo único que se

separará será la cadena dejando dos hebras simples, sin embargo, la DNA
polimerasa no le ocurrirá nada a esas temperaturas debido a que esta proviene de
un organismo que vive a altas temperaturas (extremofilo), entonces, la actividad
de la enzima no se vera alterada.
2. La etapa del alineamiento de los primers que es donde se hace la especificidad del
fragmento a replicar. Aquí se aplican 2 primers,
 uno que permitirá la sintetización de hebra completaria
 el otro sintetizara la hebra reversa
3. En la extensión la taq va a reconocer al primer y se llevara a la temperatura de 72°
(optima a la cual la enzima trabaja) y se dejara por un periodo de tiempo que
empezara a rellenar con los nucleótidos agregados inicialmente.
En todo este proceso antes mencionado es solamente 1 ciclo. Por lo que, el termociclador
es capaz de hacer mas ciclos, en un promedio de 30 ciclos.

Como se visualiza
A través de geles de agarosa en electroforesis.

Geles de agarosa: son geles hechos de polímeros que al gelificar generan poros de un
tamaño determinado

Para poder visualizar y saber donde ver la muestra esta el buffer de carga, el cual tendrá
glicerol (para darle peso a la muestra para que vaya al fondo) y colorantes para saber
donde estará la muestra.

También se le agrega el bromuro de etilio que es un intercambiante del material

genético que al ser expuesto a luz UV emite fluorescencia (es tóxico y cancerígeno)

Luego la solución se agrega a los posillos del gel, lo que hara que al encenderlo, se genera
un campo electico tal que las cargas se moverán en la matriz dependiendo de su afinidad
con la carga.

Las moléculas mas grandes se quedan atrás y las mas pequeñas se mueven con facilidad
al lado positivo.

Luego el gel se ve en el transiluminador.

 Problema de metodología
Se tiene un grafico con cantidad de ADN x numero de ciclos por PCR.

Al inicio es muy baja la cantidad de ADN hasta que se genera un crecimiento exponencial
(ciclo 24-26) y después se llega a una fase plateau que es donde se toma la muestra y se
ve en la electroforesis.

La desventaja:

 Si se tiene dos muestras con distintas cantidades iniciales no se sabe cual tiene mas
o menos
 Si solo se quiere saber si esta presente o ausente el gen (26-28)

Fundamentos del PCR

PCR es una técnica de amplificación enzimática in vitro.

Permite amplificar un fragmento específico de ADN situado entre dos regiones de

secuencia conocida, y

consta de tres pasos:

1. Desnaturalización del ADN (a 95ºC): las dos hebras se separan a esta temperatura.
2. Hibridación de dos iniciadores (a 50ºC-65ºC): en este rango de temperaturas los
iniciadores o cebadores se unen a la hebra de ADN complementaria. Estos
cebadores son específicos y determinan que fragmento de ADN se va a amplificar.
3. Extensión o elongación de la PCR (72º C): la Taq polimerasa se une al cebador y
empieza a replicar la cadena que se desea amplificar.

Estos tres pasos o fases conforman un ciclo que se repite unas entre 30 y 40 veces. Puesto
que cada cadena que se sintetiza en el ciclo anterior sirve de molde para el siguiente, en
cada ciclo se duplica el número de copias de ADN. Así, la cantidad de ADN obtenido crece
de forma exponencial, y pueden conseguirse al final del proceso millones de copias de un
único fragmento de ADN.

Componentes del PCR

ADN molde: El primer paso antes de iniciar una PCR es extraer el ADN que se quiere
amplificar, normalmente a partir de muestras de sangre o de parafina. El protocolo de
extracción y de PCR cambia en función del origen de la muestra, ya que el ADN puede
haberse visto afectado por los diferentes mecanismos de preparación de muestras. La
calidad del ADN influirá en las aplicaciones que le podremos dar, es importante tener una
buena calidad. Mediante técnicas de PCR se puede llegar a detectar una única molécula en
una mezcla compleja de ADN. La sensibilidad de la PCR varía dependiendo de la cantidad
de ADN molde (tamaño medio de los fragmentos y pureza). Además, determinadas
sustancias que pueden estar presentes en el ADN extraído pueden disminuir la eficacia de
la PCR. La cantidad óptima de ADN molde de partida para la reacción de PCR es de 10-200
ng.

Primers, iniciadores o Cebadores: Los primers son críticos para la PCR ya que
proporcionan la especificidad de la reacción. Así, en función del diseño de estos cebadores
se amplificará una región u otra dentro del ADN utilizado como molde. Son secuencias
de cadena simple de entre 20 y 40 nucleótidos, complementarios a los extremos de cada
lado de la secuencia que queremos amplificar. La longitud y secuencia de los cebadores
son características esenciales para la reacción de PCR, ya que determinan la eficiencia de
la misma. Cuando se diseñan los cebadores (existen programas informáticos específicos
para ello), hay que considerar bien la temperatura a la que debe realizarse la hibridación y
evitar los motivos repetidos que puedan hibridar de forma incorrecta con el ADN.
También debe evitarse la presencia de secuencias invertidas que puedan dar lugar a la
formación de estructuras secundarias en el cebador, o las secuencias complementarias
entre los dos cebadores que darían lugar a dímeros entre ellos

Enzima Taq polimerasa: Es una enzima termoestable capaz de incorporar

progresivamente nucleótidos desde el extremo 3’ de un cebador. La Taq polimerasa fue
inicialmente aislada de la bacteria Thermus aquaticus y es capaz de amplificar el ADN a
altas temperaturas (y por tanto no se desnaturaliza cuando en el ciclo se superan los 75ºC
y 95ºC). Actualmente, se usan polimerasas sintéticas con actividad “hot-start”, cuya
activación se inicia a elevadas temperaturas. Esto impide la síntesis a partir de dímeros de
cebadores, que se pueden formar a bajas temperaturas.

Tampones o buffer: cada ADN polimerasa requiere de su tampón específico para realizar
su actividad enzimática en condiciones óptimas de pH, etc.
MgCl2: la concentración de MgCl2 influye en la productividad y especificidad de la PCR.
Una concentración baja de estos iones produce un bajo rendimiento, pero alta
especificidad. Sin embargo, una concentración elevada da un alto rendimiento, pero
produce la formación de productos inespecíficos. Hay otros reactivos como el DMSO o la
betaína, que hacen que se amplifiquen mejor las zonas ricas en GC.

Nucleótidos: componentes básicos del ADN, constituyen las unidades que la Taq
polimerasa va a utilizar para formar la nueva cadena de ADN. La concentración estándar
de los nucleótidos en la reacción es de 200 microM. Los cuatro deben estar a la misma
concentración para evitar errores en la polimerización.

Termociclador: es un equipo que marca las temperaturas en los tiempos indicados, de

forma que permite realizar automáticamente las distintas fases que conforman la reacción
de PCR

Tipos de PCR
1. Pcr anidado
2. Pcr multiple
3. PCR invertido
4. RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA)
5. qPCR (Real time-PCR o quantitative PCR) 6.- RT-PCR (Reverse transcription-PCR)

PCR anidado
Se utiliza cuando no se quiere trabajar con todo el material genético porque a veces es
tanto que colapsa la reacción o tanto material genético provoca que el primers alineen de
manera inespecífica en otra región del material genético.

Entonces son 2 PCR distintos en donde:

1. Se amplifica el fragmento mas grande que se quiere como molde

2. Se amplifica el que se anda buscando
La PCR anidad es una modificación de la PCR diseñada para aumentar la sensibilidad de la
reacción del ensayo

Esta modificación consta de dos grupos de cebadores dirigidos contra la misma diana.

El primer grupo de primers de desarrolla de la manera usual, mientras que el segundo

grupo son primers situados internamente o anidados con respecto al primer grupo

PCR INVERTIDO
Se ocupa en retrovirus, o virus de VIH. Para saber donde se insertó el virus.

El cual funciona en base a que se conoce una secuencia y se desconoce el resto. Entonces,
se ocupan enzimas de digestión que lo que hacen es cortar el material genético en
secuencias especificas.
Ejemplo: se agrega la enzima A y en el que desconoce se corta en algún sitio. Ahora se
pueden unir las 2 A con la enzima ligasa. Entonces luego se corta con B. ahora le
fragmento desconocido se deja entre las B. entonces se pueden agregar primers con
secuencias de B y se pueden amplificar los fragmentos

PCR RAPD
Se ocupaba para los test de paternidad.

Entonces se utilizan sets de primers, uno A, B y C. lo que se buscara por ejemplo, un gen
quiere ver si es igual en todos o no.

 Si se quiere ver entre A y B se mezclan y se forman el fragmenteo 4

 Si se mezclan primers A con C se da el fragmento C

Entonces en el cuadro (b) se observa todas las combinaciones. En donde marcaran todas
las secuencias nuevas, entonces si se espera un tamaño en especifico y es ams grande se
sabe que se agrego una nueva secuencia
 Qpcr (REAL TIME-pcr O quantitative PCR)
Tiene la capacidad de ir indicando la cantidad de material genético presente en la
muestra. Cuantifica minuto a minuto

La PCR a tiempo real simplifica la técnica de PCR puesto que no es necesario realizar una
electroforesis posterior, ya que es en el propio termociclador donde se detecta a tiempo
real la cantidad de amplificado.

Esta técnica permite, a diferencia del PCR convencional, permite seguir la cinética de cada
reacción en tiempo real, por lo que permite una cuantificación sensible y específica del
blanco que se desea analizar, al utilizar la fase exponencial de la curva de amplificación a
diferencia de la PCR convencional que se observa el resultado final de la amplificación
(Fase plateau)

Qpcr: DETECCION
Se detecta a través de fluorescencia, es un equipo de termociclador que no solamente
hace los ciclos de temperatura, sino que también cuantifica la cantidad de fluorescencia o
intensidad de sluorescencia. Esto lo hace por cada ciclo.

Sondas específicas para fragmentos del ADN, es decir, que sólo emiten fluorescencia
cuando se ha amplificado un fragmento del ADN de interés.

Se pueden dividir en tres tipos:

a) sondas de hibridación (A)

b) sondas de hidrólisis (B)

c) sondas de horquilla (C)

Todas se basan en la transferencia de energía entre dos fluoróforos (principio FRET): un
donador (reportero) y un aceptor (apagador o quencher), los cuales emiten fluorescencia
a diferente longitud de onda. Cuando el reportero y el apagador se encuentran próximos,
el apagador absorbe toda la fluorescencia del reportero. Cuando este par de moléculas se
separa, la fluorescencia del reportero no puede ser absorbida por el apagador y en
consecuencia puede ser detectada por el fotodetector.

Qpcr: sondas de hibridación

Se utilizan moléculas que cuando interactúan con el material genético emiten una
intensidad de luz que es detectada por la cámara fotográfica. Emite luz a una frecuencia
determinada. Mientras mas juntos estén D y A, mejor será la detección
En este caso se utilizan dos sondas específicas, que hibridan con la secuencia del ADN de
interés.

Una de ellas está marcada con un donador (en la figura como D) y la otra con un aceptor
(en la figura como A).

La señal del fluoróforo aceptor solo es detectada en caso de que se encuentre unido al
donador. Por lo que conforme se da la amplificación del ADN, la cantidad de
oligonucleótidos unidos será mayor por lo que se incrementará la intensidad de la
fluorescencia.

Este sistema sigue la señal del fluoróforo aceptor de forma opuesta a la sondas de
hidrólisis, que siguen la señal del reportero o donador

Qpcr: dondas de horquillas

Tienen un extremo fluoroforo que emiten fluorescencia y en el otro extremo un apagador.
Esto absorbe la energía de la molecula fluorescente cuando están a una distancia cercana
la una a la otra. Entonces se sabe que al estar unidos se apaga la fluorescencia

En estas sondas, un oligonucleótido marcado en su extremo 5’ con un reportero y el 3’ con

un apagador, se encuentran formando una horquilla, estructura que los mantiene
cercanos para poder llevar a cabo la transferencia de energía y mantener al reportero
apagado. Al unirse a la secuencia de interés, la horquilla se extiende, aumentando la
distancia entre el apagador y el reportero, permitiendo detectar la fluorescencia de este
último. Estas sondas de horquilla son altamente específicas

Qpcr: uso SYBR green

Cuando esta unido al material genetico brilla mil veces mas que cuando no esta unido.
Es un fluoroforo que cuando esta el DNA de doble hebra no se asocia y cuando esta libre
emite, pero es baja. Pero cuando se hace la doble hebra por el taq se asocia a la doble
hebra aumenta su nivel de fluorescencia. Mientras mas moléculas doble hebra tenga,
mayor será la intensidad. Esta se ocupa hoy en dia

Existen además de la sondo otro formato de detección que es el uso de moléculas

fluorescentes. Puesto que la señal fluorescente es proporcional a la cantidad de producto
la utilización de fluoróforos específicos para DNA doble hebra o bicatenario es una
alternativa al uso de sondas.

SYBR-Green I es un fluoróforo específico que se une solamente a DNA doble hebra. Este
fluoróforo se une con gran afinidad al surco menor del DNA bicatenario, aumentando su
fluorescencia unas 1000 veces. La detección con SYBR-Green I es tan sensible que llega a
identificar la producción de una única molécula. Este formato de detección necesita una
puesta a punto previa para que la PCR no amplifique productos inespecíficos que luego el
fluoróforo detectaría, introduciendo errores en el posterior análisis de los resultados

Qpcr: detección
En el punto Ct se ve que inicia le crecimiento exponencial
El equipo mide continuamente el incremento en fluorescencia manteniendo un registro
que grafica generando una cinética o curva de amplificaión, lo que permite saber que la
reacción mantiene una relación lineal hasta un determinado número de ciclos

Si se mantiene una relación lineal es posible hacer una extrapolación y determinar el

número de moléculas iniciales.

El PCR clásico mide la cantidad de producto solo al término de todos los ciclos y presume
que la reacción es lineal.

La curva de amplificación está constituida por al menos tres fases distintas:

1) Fase de latencia (lag), donde la acumulación de producto no se puede detectar

2) Fase exponencial.

3) Fase de saturación.

Ventajas de PCR en tiempo real

 En la PCR convencional se observa el resultado final de la amplificación (Fase
plateau). En la PCR a tiempo real se analizan los datos de la fase de crecimiento
exponencial, que es mucho más informativa.
 El incremento de la fluorescencia es directamente proporcional al número de
amplicones generados, por tanto, se puede cuantificar.
 La precisión, la resolución y la sensibilidad son mayores con la PCR a tiempo real.
 La PCR convencional solo discrimina por el tamaño del amplificado, en cambio la
PCR a tiempo real discrimina por tamaño y secuencia.
  No se requiere ningún proceso post-PCR por lo que se ahorra tiempo. Además, se
minimizan los problemas de contaminación por amplicones y se reduce la
variabilidad en el resultado.
 El rango dinámico, es decir la sensibilidad de la técnica para diferenciar entre
diferentes cantidades, es mucho mayor empleando PCR a tiempo real, hasta 6
órdenes de magnitud.
 Si se emplean sondas en la detección de la fluorescencia, se evita la detección de
los artefactos de la reacción, como los dímeros de cebadores, que dan falsos
positivos

RTPCR
Es un PCR que se ocupa para material genético de RNA, hace es tomarlo previamente ya
través de la transcriptasa reversa toma el RNA, lo pasa a DNA y después es ocupado como
molde para hacer el PCR.