UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA

MOLINA

CURSO : Fitomejoramiento General

TITULO DEL INFORME : Marcadores Moleculares
DOCENTE : Dr. Félix Camarena Mayta
ALUMNO : Laura Mirella, Morote Larico

CICLO : 2017-II
GRUPO : B*

La Molina – 2017.
1. Introducción
La magnitud y estructura de la diversidad genética de una población determina su
capacidad para adaptarse al ambiente mediante la selección natural. Esto se debe a
que cuando la diversidad genética es escasa se reducen las combinaciones posibles
de genes capaces de conferir adaptación biológica y, por consiguiente, capacidad de
adaptación ante las variaciones de las condiciones ambientales, lo cual reduce la
probabilidad de que surjan nuevos individuos valiosos en la población. De este modo,
una población que crece en la naturaleza (o que se maneja en un área protegida) debe
contar con una diversidad genética adecuada para asegurar su existencia frente a los
constantes cambios en los componentes bió- ticos y abióticos de su ecosistema.
Los fitomejoradores buscan y recombinan la variabilidad genética en las poblaciones
de sus cruzamientios y realizan un seguimiento de las características o rasgos
deseados que permiten que los cultivos subsistan en determinados ambientes, o bien
resistan ante ciertas plagas o patógenos. Por lo tanto, los fitomejoradores necesitan
acceso a una diversidad genética adecuada para lograr resultados satisfactorios en los
programas de mejoramiento.

2. Marcadores moleculares
Los marcadores moleculares han sido definidos como cualquier diferencia notípica
controlada genéticamente. Se puede considerar que cualquier molécula, orgánica o
inorgánica, que sea característica de un organismo o proceso sea un marcador. Los
marcadores idóneos son los de ADN, siendo válido cualquier fragmento que se
encuentre muy cerca del gen o de la secuencia de interés y que lógicamente no afecte
al carácter en estudio (SIDTA 1999). Para Valadez y Kahl (2000) un marcador se
refiere a cualquier molécula de proteína, ARN o ADN de tamaño o peso molecular
conocido que sirve para monitorear o calibrar la separación de las mismas utilizando
electroforesis o cromatografía, y un marcador genético como cualquier gen cuya
expresión permite un efecto fenotípico que puede ser detectado fácilmente (por
ejemplo, un gen que ocasiona resistencia para algún antibiótico). Los marcadores del
ADN se basan fundamentalmente en el análisis de las diferencias en pequeñas
secuencias del ADN entre individuos. Las técnicas empleadas para ello son muy
 diversas y dan el nombre a los distintos tipos de marcadores, los cuales pueden ser de
carácter dominante o codominante (Karp y Edwards 1998). Algunos ejemplos de
ellos son: Polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP),
Amplificación aleatoria del ADN polimórfico (RAPD), Polimorfismo en la longitud
de los fragmentos amplificados (AFLP), Microsatélites o Secuencias simples
repetidas (SSR), Amplificación aleatoria del polimorfismo de microsatélites
(RAMPO) etc. (Rallo et al. 2002).

3. Tipos de marcadores genéticos

A los marcadores utilizados en el análisis genético se los puede dividir en tres tipos:

3.1. Marcadores morfológicos:

Los marcadores morfológicos fueron los primeros utilizados y tienen que ver
con el orígen de la genética. Mendel utilizó entre otros, el carácter rugoso o
liso de las semillas para analizar la segregación de los cruzamientos de
arvejas. En 1952, Rick desarrolló uno de los mapas genéticos más completos
en tomate utilizando caracteres morfológicos. En el mejoramiento genético
estos marcadores son de uso limitado, principalmente porque su expresión
puede estar influenciada por el ambiente, por factores genéticos (por ejemplo,
epistasis o genes modificadores), lo que altera el fenotipo de la planta e
interfiere en el mejoramiento.

3.2. Marcadores bioquímicos:

Las proteínas de reserva de la semilla y las isoenzimas son los marcadores
bioquímicos más utilizados. Las proteínas de reserva, por tener distinto peso
molecular y carga, se pueden separar por electroforesis en geles de
poliacrilamida y teñirlas con un colorante para proteínas. Las bandas que se
obtienen son producto de la expresión de genes y se las analiza como
marcadores genéticos. Las isoenzimas consisten en moléculas de proteína
diferencialmente cargadas, que también se pueden separar usando métodos de
electroforesis. Estas enzimas catalizan reacciones bioquímicas específicas;
 por lo tanto, al separarlas en geles de almidón y poliacrilamida, agregarles el
sustrato y los cofactores apropiados, se produce una reacción bioquímica que
reduce una sustancia coloreable, la que se deposita como una banda en el gel.
Estas bandas se pueden analizar como marcadores genéticos y se heredan en
forma codominante. Los marcadores bioquímicos han sido reemplazados en
gran medida por otro tipo de marcadores genéticos; sus principales
desventajas son: 1) que detectan niveles menores de variación y 2) que al ser
productos de la expresión génica se ven afectados por modificaciones
postranscripcionales o postransduccionales. Sin embargo, las proteínas de
reserva se siguen utilizando en la identificación de variedades, y las
isoenzimas en la estimación de parámetros de fecundación y de selección.

3.3. Marcadores moleculares:

Dentro del tercer grupo de marcadores se encuentran aquellos que detectan
polimorfismo a nivel del ADN. Diversas son las técnicas que se utilizan para
obtener estos marcadores moleculares.

3.3.1. RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism):

Los primeros marcadores desarrollados fueron los RFLP. Detectan
polimorfismo en el lugar de corte de enzimas de restricción y generan
fragmentos de ADN de diferente longitud, los cuales se separan por
electroforesis y se inmobilizan en membranas de nylon o nitrocelulosa. La
detección de los fragmentos cortados se realiza a través de una sonda
(segmento de ADN de 500 a 3000 pares de bases) de ADN genómico o
cADN, marcada radioactivamente (también pueden ser marcadas con
reactivos quimioluminiscentes). La sonda marcada se hibrida por
complementariedad de bases con el segmento inmobilizado en la
membrana y al colocar sobre ella una placa radiográfica se revelan bandas.
Estas bandas se pueden analizar como marcadores genéticos
codominantes. El uso de radioactividad y la complejidad de la técnica son
algunas de las complicaciones de los RFLP.
3.3.2. Marcadores basados en la técnica de PCR:
La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) revolucionó el campo de
la biología molecular y a partir de ella se desarrollaron una serie de
técnicas.
 RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)
La técnica RAPD consiste en la amplificación de segmentos de ADN
a través del uso de un cebador o iniciador (fragmentos cortos de ADN
monohebra de 10 a 20 bases), de secuencia aleatoria o arbitraria. Los
cebadores se hibridan en aquellos sitios donde encuentran secuencias
complementarias en el ADN usado como molde. Cuando el cebador
hibrida a las hebras complementarias en forma opuesta y lo
suficientemente cerca, da lugar a productos de amplificación. Los
productos de amplificación se separan por electroforesis en geles de
agarosa y se visualizan al colorearlos con bromuro de etidio en un
trasiluminador de luz UV. El polimorfismo entre los individuos resulta
de las diferencias en las secuencias de hibidización de los iniciadores
o primers y se comportan como marcadores genéticos del tipo
dominante. Esta técnica es apropiada para realizarla en laboratorios de
baja complejidad, ya que no se necesita conocer previamente la
secuencia de los primers (son de secuencia arbitraria), no se usa
radioactividad y con bajos costos se puede analizar un alto número de
loci. Uno de los inconvenientes de RAPD es la baja repetibilidad de
los resultados. Este problema se puede solucionar clonando y
secuenciando las bandas RAPD, para luego sintetizar primers
específicos para cada marcador RAPD; a estos marcadores que son
más repetibles se les llama SCAR (Sequence Characterize Amplified
Regions).
 Microsatélites
El ADN genómico de eucariotas y en especial el de las plantas, tiene
una serie de secuencias repetidas que pueden llegar a representar el
80% del genoma. Los microsatélites (también llamados secuencias
simples repetidas) son secuencias de di o trinucleótidos repetidas un
cierto número de veces. En plantas, Akkaya et al. y Morgante y
Olivieri encontraron que los microsatélites son altamente
polimórficos, y que las repeticiones de (AT)n son las más numerosas.
Los microsatélites se amplifican a través de PCR, utilizando primers
específicos que se hibridan en regiones conservadas que flanquean la
región del ADN que contiene las secuencias repetidas. Los productos
de amplificación, en este caso regiones de ADN con, por ejemplo, dos
o tres repeticiones de (AT)n, se separan en geles de poliacrilamida y
se colorean con plata. El polimorfismo está dado por el número de
repeticiones y son marcadores del tipo codominante. Por su alto grado
de polimorfismo pueden ser utilizados para diferenciar genotipos con
alto grado de parentesco (clones). La dificultad de esta técnica radica
en que es necesario invertir en el desarrollo de las secuencia de los
cebadores específicos para el microsatélite, y esto no lo pueden
realizar laboratorios de baja complejidad. Sin embargo, una vez
conocida las secuencias su utilización en el análisis genético no es
compleja.
 CAPs (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence)
La técnica consiste en sintetizar primers específicos para un locus de
interés del genoma de plantas. Estos cebadores se utilizan en
reacciones de PCR para amplificar segmentos de ADN de muestras de
diversos individuos. Los productos de amplificación se cortan con
enzimas de restricción y se analiza el perfil de bandas que se obtiene,
luego de separarlas por electroforesis y teñirlas con bromuro de etilio.
Esta técnica tiene algunas de las ventajas de los RFLP pero no las
complicaciones del análisis a través de Southern blots (ensayos de
Southern). Sin embargo, es necesario conocer las secuencias de ADN
del fragmento que se quiere amplificar y esto dificulta su amplia
utilización.

 AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)

AFLP consiste en amplificar en forma selectiva fragmentos de ADN
cortados con enzimas de restricción. El ADN de las plantas a analizar
se corta con dos enzimas de restricción, usualmente Mse I y EcoR I,
luego se le ligan adaptadores con una, dos o tres bases de más, que
permite que se amplifiquen en forma selectiva sólo aquellos
fragmentos que tienen estas bases suplementadas a los primers. La
separación de estos fragmentos por electroforesis en geles de
poliacrilamida genera entre 50 y 100 fragmentos. La ventaja de este
método radica en que se puede analizar un gran número de locus en
un solo gel; el principal inconveniente de estos marcadores que se
comportan como dominantes, es el uso de radioactividad o la
dificultad en la manipulación de los geles tan delgados, al teñirlos con
plata. La elección correcta de la técnica a utilizar en el análisis
genético es un aspecto muy importante, ya que en el mejoramiento
vegetal se trabaja con muestras muy grandes, lo que supone altos
costos y una cantidad considerable de trabajo.
Bibliografía:

- ALBANY, N.; VILCHEZ, J.; NAVA, A.; GONZÁLEZ, M.; CASTRO DE RINCON,
C. 1998. El análisis de conglomerado para complementar el estudio de patrones
electroforéticos en Psidium spp. Revista Facultad de Agronomía - LUZ (Venezuela)
15:142-152.
- BECERRA, V.; PAREDES, M. 2000. Uso de marcadores bioquímicos y moleculares
en estudios de diversidad genética. Agricultura Técnica 60(3):270-281.
- HEMANTH, K.N.V.; NARAYANASWAMY, P.; THEERTHA, P.D.; MUKUNDA,
G.K.; SONDUR, S.N. 2001. Estimation of genetic diversity of commercial mango
(Mangifera indica L.) cultivars using RAPD markers. The Journal of Horticultural
Science and Biotechnology 76(5):529-533.
- KARP, A.; KRESOVICH, S.; BHAT, K.; AYAD, W.; HODGKIN, T. 1997.
Molecular tools in plant genetic resources conservation: a guide to the technologies.
International Plant Genetic Resources Institute (IPGRI). Roma Italia. 47p.
- SÁNCHEZ, I. 2002. Búsqueda y aislamiento de marcadores moleculares en Pleurotus
ostreatus (en línea). Navarra, España. Consultado 1 ago. 2002. Disponible en
www.unavarra.es/genmic/publicaciones/tfc/isabel- %20sanchez.htm