VOL.XIII. . . No.

175 ENCUENTROS EN LA BIOLOGÍA 15

Métodos de secuenciación: tercera generación

por JOSÉ MIGUEL VALDERRAMA MARTÍN∗ , FRANCISCO ORTIGOSA∗ Y RAFAEL A. CAÑAS+
∗
Estudiante del Programa de Doctorado en Biología Celular y Molecular, 4ª Planta Edificio I+D,
Facultad de Ciencias, Universidad de Málaga, 29071.
+
Profesor Titular del Departamento de Biología Molecular y Bioquímica, 4ª Planta Edificio I+D,
Facultad de Ciencias, Universidad de Málaga, 29071.

jmvalderrama@uma.es, fortigosa@uma.es, rcanas@uma.es

Las primeras técnicas de secuenciación masiva de ácidos nucleicos (2.ª generación) han permitido
un extraordinario desarrollo de la Genómica y su «democratización». Sin embargo, presentan una serie
de flaquezas, principalmente su incapacidad para generar lecturas mayores de 1 kb y la necesidad de
amplificación previa de las muestras. En los últimos años se han desarrollado las denominadas como
técnicas de secuenciación de tercera generación, las cuales han venido a paliar algunos de los defectos de las
tecnologías precedentes. Por un lado, estas técnicas permiten obtener tamaños medios de lecturas de 30
kb, con máximos de 2,3 Mb. Por otro lado, no necesitan amplificación previa de las muestras de ácidos
nucleicos, por lo que no se pierden las marcas epigenéticas que puedan presentar. Además, estas técnicas
de tercera generación realizan la secuenciación directa del ARN, algo que no es posible con las técnicas
precedentes. Así mismo, abren un nuevo camino en la secuenciación de ácidos nucleicos, sentando un nuevo
precedente en el desarrollo de las Ciencias Genómicas hasta ahora desconocido.

The first techniques for massive sequencing of nucleic acids (2nd generation) have allowed an extraordi-
nary development of Genomics and its «democratization». However, they present a series of weaknesses,
mainly their inability to generate readings greater than 1 kb and the need for prior amplification of the
samples. In recent years, so-called third-generation sequencing techniques have appeared, alleviating some
of the shortcomings of previous technologies. On the one hand, they average read size reaches 30 kb, with
maximums of 2.3 Mb in a read On the other hand, they do not need prior amplification of the nucleic acid
samples, so the epigenetic marks that they may present are not lost. In addition, these third generation
sequencing techniques can also perform direct sequencing of RNA, which is not possible with the preceding
techniques. Thus, they point to a new path in nucleic acid sequencing, setting a new precedent in genomic
science development unknown until now.

Palabras clave: secuenciación, tercera generación, SMRT, PacBio, Oxford Nanopore, MinION. Enviado: 05/05/2020
Keywords: sequencing, third generation, SMRT, PacBio, Oxford Nanopore, MinION. Aceptado: 31/10/2020

Las tecnologías de secuenciación de ácidos nuclei-
cos de 2.ª generación han revolucionado la Biología
durante los últimos 15 años. Su alto rendimiento
y fidelidad de las lecturas han permitido el impulso
definitivo de la Genómica tanto a nivel estructural (se-
cuenciación de genomas) como funcional (por ejemplo,
análisis transcriptómicos o epigenómicos) reduciendo
los gastos al punto de poder secuenciar el genoma
humano por menos de 1.000 [1] . De todos los métodos
de secuenciación de 2.ª generación es el de Illumina
el que se sitúa como referente o estándar actual en
cuanto a secuenciación masiva de ácidos nucleicos,
representando mejor que ninguna otra plataforma
las fortalezas y debilidades de estas tecnologías. Con
respecto a sus principales debilidades está el reducido
tamaño de las lecturas que producen (hasta 300 pb)
lo que aumenta la probabilidad de producir errores
de ensamblaje. Cuanto más pequeñas son las lecturas,
más fácil es encontrar porciones de secuencia comunes
a dos lecturas sin que estas pertenezcan a un mismo
fragmento genómico o transcrito. En el caso de trans-
criptomas se pueden producir numerosas secuencias
quiméricas (producto del ensamblaje de secuencias
procedentes de dos o más genes diferentes). En este
sentido los procesos de ayuste alternativo (alternative
splicing) son una gran fuente de perturbación de los
ensamblajes transcriptómicos provocando ensambla-
jes de secuencias que no se dan en la realidad. En
el caso de los ensamblajes de genomas, las secuen-
cias de pequeño tamaño, cuando se usa estrategias
de secuenciación no basadas en mapas genéticos o
físicos, pueden dar lugar a ensamblajes muy fragmen-
tados del genoma. Esto sucede principalmente en el
caso de genomas eucariotas de gran tamaño y con
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un alto porcentaje de secuencias repetitivas como
retrotransposones [2] . Por otro lado, las lecturas de
pequeño tamaño también pueden llevar a problemas
en la identificación de especies filogenéticamente cer-
canas en análisis metagenómicos de microorganismos.
Otra flaqueza de estos métodos es la necesidad de
amplificar la muestra de ácidos nucleicos previamente
a la secuenciación, por lo que siempre se secuencian
copias de las moléculas originales. Esto hace que se
pierdan las modificaciones químicas, marcas epige-
néticas, de los nucleósidos y, por tanto, generan la
necesidad de aproximaciones previas y complemen-
tarias a la secuenciación para poder determinar la
posición de estas modificaciones [3] .
Desde un punto de vista tecnológico, el impulso
creado por la aparición de las tecnologías de 2.ª gene-
ración ha propiciado el desarrollo de nuevos métodos
que han intentado solventar los dos principales pro-
blemas de estos métodos descritos anteriormente: el
tamaño de las lecturas y el uso directo de la muestra
de ácidos nucleicos sin amplificar. A estos nuevos
métodos se les ha denominado secuenciación de ter-
cera generación. Entre sus características generales
está la generación de lecturas de gran tamaño, una
secuenciación monitorizada a tiempo real y no nece-
sitan la amplificación previa de los ácidos nucleicos,
siendo capaces de detectar modificaciones químicas
de las bases nitrogenadas tanto de ADN como de
ARN. A pesar de estas ventajas, estas tecnologías de
secuenciación de 3.ª generación presentan dos gran-
des inconvenientes. El primero es que la cantidad de
lecturas (cobertura) que pueden generar sigue siendo
muy reducida en comparación con las que producen
las tecnologías de secuenciación de segunda genera-
ción como Illumina. El segundo y principal problema
de estas tecnologías es su menor fidelidad, siendo
las tasas de acierto de hasta un 99,8 % (Q27) para
PacBio [4] y hasta un 95 % (Q13) para Oxford Nano-
pore [5] , las cuales son menores en comparación con
las de tecnologías de segunda generación, cuyas tasas
de fidelidad son cercanas al 99.99 % (>Q35). Esto es
un condicionante muy importante para su desarrollo
y expansión comercial a campos de estudio diferentes
a la Genómica estructural, donde por el momento
presentan sus mejores resultados. Gracias a su capa-
cidad de generar lecturas largas pueden establecer
guías robustas para realizar ensamblajes de calidad
en especies con genomas grandes y repetitivos. Estos
borradores genómicos, que por los inconvenientes de
las técnicas previamente descritos no presentan una
elevada fidelidad, se pueden corregir mediante el uso
complementario de métodos de segunda generación,
esto es conocido como ensamblaje genómico híbri-
do [6] . Por lo tanto, actualmente las plataformas de
16
3.ª generación no pueden sustituir a las previas y re-
sulta esencial la coexistencia de diferentes tecnologías
de secuenciación para diferentes usos.
Secuenciación a tiempo real de una
sola molécula (SMRT, PacBio)
Esta técnica fue desarrollada durante la primera
década del siglo XXI por la empresa Pacific Bios-
ciences (PacBio) la cual lanzó al mercado su primer
secuenciador en 2011 [7] . El sistema de secuenciación
a tiempo real de una sola molécula (SMRT, siglas
en inglés) usa células de flujo que se basan en la
tecnología «guía de onda de modo cero» (ZMW), que
es un dispositivo que focaliza toda la luz hacia un
punto para su detección. Esto permite registrar la
señal lumínica emitida por un fluoróforo unido a un
único nucleótido. En el fondo de cada ZMW se inmo-
viliza una molécula de ADN polimerasa que realiza
la síntesis de la hebra complementaria de la molécula
de ADN que se quiere secuenciar (Figura 1A y B).
Esta ADN polimerasa está modificada para admitir
nucleótidos hexafosfato que presentan un fluoróforo
(específico para cada base nitrogenada) unido al úl-
timo grupo fosfato [8] . Al introducirse un nucleótido
durante la fase de síntesis se libera su fluoróforo emi-
tiendo fluorescencia durante un intervalo de tiempo
determinado (Figura 1C). La señal lumínica emitida
es detectada e interpretada como la incorporación de
un nucleótido específico dependiendo de la longitud
de onda de emisión del fluoróforo [9] . De este modo, el
proceso no requiere de ciclos de incorporación, sino
que se realiza en continuo (a tiempo real) y permite
la obtención de lecturas medias de unas 30 kb [10] .
Los tamaños de secuenciación son dependientes de
la vida media de las polimerasas ancladas al fon-
do de los micropocillos. Por otra parte, el sistema
SMRT da la posibilidad de secuenciar una muestra de
ácidos nucleicos sin necesidad de amplificarla como
ocurría en las tecnologías de 2.ª generación, en las
que los sistemas de detección necesitaban una «masa
crítica» de moléculas clonales que se secuenciasen al
mismo tiempo [3] . Una de las características de este
tipo de metodología es la capacidad de secuenciar
las dos hebras de un fragmento de ADN bicatenario
gracias a adaptadores monohebra que forman bucles
de horquilla (SMRTbell template) y unen ambas he-
bras del ADN molde. Uno de ellos une un cebador
para la ADN polimerasa que así puede comenzar
la síntesis/secuenciación y, tras sintetizar la hebra
complementaria a una de las hebras del ADN molde,
la polimerasa puede continuar sobre el otro adapta-
dor del SMRTbell template y finalmente realizar la
síntesis de la hebra complementaria de la segunda
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hebra del ADN molde [9] . Esto permite generar una
secuencia consenso que aumenta la fidelidad de la
secuenciación (Figura 1B). En el caso de tratarse de
una secuenciación de ARN, en el sistema SMRT la
ADN polimerasa es sustituida por una reversotrans-
criptasa, lo que permite obtener la secuencia del ARN
de la muestra pero sin tratarse de una secuenciación
directa de ARN debido a la reversotranscripción [11] .
Teóricamente, esto permite analizar los transcritos
completos (full length) de los ARN mensajeros y con
ello la detección y cuantificación de las variantes de
ayuste alternativo (alternative splicing).

Figura 1. Representación esquemática de la tecnología de secuenciación SMRT de PacBio. A) ZMW contenido en una celda
SMRT, en cuya parte inferior se encuentra una polimerasa inmovilizada. La unión del adaptador a la proteína anclada permite
la síntesis de la hebra complementaria del ADN. La incorporación de un nucleótido marcado produce una liberación de
fluorescencia que es detectada como la incorporación de un nucleótido específico atendiendo a la longitud de onda emitida.
B) Proceso de síntesis de la hebra complementaria de ADN. Los adaptadores (lila) se encuentran ligados a los extremos de
una doble cadena de ADN (azul y rojo) formando una estructura circular. La ADN polimerasa es la enzima encargada de
llevar a cabo la síntesis de ADN. Posteriormente se obtienen un conjunto de fragmentos sintetizados (lecturas) que dan lugar
a la obtención de una secuencia consenso. C) Cada nucleótido se encuentra marcado con un fluoróforo diferente. Cuando la
ADN polimerasa incorpora un nucleótido marcado, se produce un pulso de fluorescencia que es detectado específicamente
permitiendo la decodificación de la secuencia de ADN. El panel B fue diseñado con Biorender.

Una de las ventajas adicionales de la secuencia-
ción SMRT es que se pueden determinar directamente
modificaciones químicas de las bases nitrogenadas de
los nucleótidos. En las técnicas de 2.ª generación se
secuencian copias de la molécula de ADN o ARN
original, lo que elimina las modificaciones químicas
(marca epigenética) de los nucleótidos [3] . Por lo tanto,
requieren procedimientos previos a la secuenciación
para marcar los nucleótidos que presentan una deter-
minada modificación química (por ejemplo, secuencia-
ción por bisulfito para determinación de metilaciones
en las citosinas [12] ). Sin embargo, en el caso de las
tecnologías de 3.ª generación es posible detectar la
presencia de cualquier nucleótido modificado (casi
cualquier modificación) en la secuencia sin necesidad
de marcajes previos. La detección de los nucleóti-
dos modificados se produce debido a que existe un
retraso por parte de la ADN polimerasa en la intro-
ducción de los nucleótidos cuando se encuentra un
nucleótido modificado [13] (Figura 2). Además, esta
capacidad también permite la detección de marcas
epitranscriptómicas en el ARN utilizando el mismo
principio [11] .
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Figura 2. Detección de la modificación química del ADN N6 -metiladenosina (m6 A). Comparación esquemática del proceso
de síntesis de ADN por la polimerasa en ausencia (A) y presencia (B) de m6 A. Cuando la ADN polimerasa encuentra en
la secuencia molde una modificación química, se produce un retardo en el tiempo de incorporación del nucleótido lo que se
traduce en una diferencia temporal en la detección del pulso de fluorescencia, indicando la presencia de m6 A.

una membrana a cuyos lados hay establecido un dife-

rencial de voltaje [15,16] . De esta manera, es posible
Tecnología Oxford Nanopore determinar la secuencia de una hebra de ácidos nu-
(ONT) cleicos de manera directa, sea ADN o ARN, algo que
ni en el caso de la SMRT es posible puesto que realiza
De manera posterior a la aparición de la secuen-
una reversotranscripción al secuenciar ARN. En el
ciación SMRT de PacBio surge como alternativa Ox-
lado de entrada de las moléculas se establece una
ford Nanopore Technology (ONT). Esta empresa ha
carga negativa y al otro extremo una carga positiva
desarrollado su tecnología durante las dos primeras
para facilitar el movimiento de los ácidos nucleicos.
décadas del siglo XXI, incluso se puede considerar
En el lado de la detección se incluye un electrodo y un
que todavía se encuentra en desarrollo. En abril de
circuito integrado (ASIC) (Figura 3A) para detectar
2014, el MinION, un equipo de secuenciación minia-
la corriente eléctrica generada como consecuencia del
turizado y portátil que tiene un tamaño ligeramente
paso de cada nucleótido a través de un poro y así
mayor que el de una memoria USB, fue distribuido a
registrar los datos en un nuevo formato de archivo
más de 1.000 laboratorios para realizar pruebas beta
de secuenciación FAST5 (los formatos generalmente
a través del Programa de Acceso MinION (MAP).
obtenidos en secuenciación son los FASTQ). Estos
Un año después, comenzó su comercialización. Desde
archivos contienen la información bruta de los datos
2015 han aparecido dispositivos con diferentes capaci-
de corriente eléctrica de cada poro de la membrana
dades incluso algunos que permiten la secuenciación
que es traducido a nucleótidos cuando se realiza el
sin la asistencia de un ordenador adicional para hacer
proceso de basecalling [10] . Los poros incrustados en la
secuenciación en el terreno [13] .
membrana están formados por proteínas como la lipo-
Se trata de una tecnología de secuenciación to-
proteína CsgG de Escherichia coli con modificaciones
talmente diferente al resto de las presentadas y, a
que permiten el paso específico a través de ella de
diferencia de ellas, no se basa en la complementarie-
ácidos nucleicos (Figura 3B) [17] . Además, los ácidos
dad de los ácidos nucleicos. Su principio técnico se
nucleicos a secuenciar deben unirse previamente a
basa en los estudios iniciados por David Deamer du-
adaptadores de ADN unidos a una proteína motora,
rante la década de los 90. Se aprovecha de los perfiles
como la helicasa, que se unen al poro y promueven
de corriente eléctrica que genera cada molécula (en
el paso de la hebra del ácido nucleico a través de és-
este caso nucleótidos) al pasar a través de un poro en
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te [16] (Figura 3C). Gracias a ello, es posible generar lecturas de hasta 2,3 Mb [10] , tamaño superior que el
lecturas extremadamente largas, llegando a obtenerse de algunos genomas bacterianos.

Figura 3. Representación de los principales componentes de la secuenciación de Oxford Nanopore. A) Ilustración esquemática
de los componentes del soporte de secuenciación de la tecnología de Oxford Nanopore (ONT). B) Estructura de la proteína
CsgG de Escherichia coli, una variante del poro proteico utilizado en el soporte MinION, PDB ID: 4UV3. C) Representación del
complejo de secuenciación de ácidos nucleicos de la tecnología de Oxford Nanopore (ONT). Las figuras A y C fueron creadas
usando Biorender.
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En teoría, una de las ventajas de esta técnica
sería que permitiría identificar cualquier molécula
que atraviese el poro, incluyendo ácidos nucleicos,
proteínas y metabolitos [17] . Por el momento, se usa
solamente para la secuenciación de ácidos nucleicos,
ADN y ARN. Esto convierte a ONT en la única pla-
taforma de secuenciación distribuida en la actualidad
que realiza la secuenciación directa de ARN sin nece-
sidad de realizar una reversotranscripción. Además,
como ocurre con la secuenciación SMRT de PacBio,
al ser posible secuenciar directamente una muestra
sin necesidad de realizar un proceso de amplificación,
la tecnología ONT permite que en los análisis de
RNA-Seq se necesiten menos lecturas para obtener
un análisis estadístico robusto de las muestras [18] ,
puesto que se evitan los sesgos derivados de los pasos
de reversotranscripción y amplificación. La capacidad
de detección de la huella eléctrica de cualquier ácido
nucleico permite además la identificación de bases
nitrogenadas con modificaciones químicas, pues éstas
implican cambios en la corriente generada por la mo-
lécula al atravesar el poro con respecto al cambio que
originaría el nucleótido en cuestión sin modificaciones
químicas. Al igual que ocurre con el sistema SMRT
de PacBio, estas características hacen idónea esta
plataforma para su empleo en campos como la epige-
nómica, así como para la epitranscriptómica (estas
marcas también se pueden detectar en el ARN [19] ).
Como se ha mencionado en la descripción de esta
técnica, un aspecto muy relevante es la longitud de las
lecturas, actualmente las mayores de todas las plata-
formas de secuenciación. Además de en la Genómica
estructural y del análisis de transcriptomas, esto tiene
mucha relevancia en cuanto a los estudios metagenó-
micos, aquellos en los que se analiza el ADN/ARN de
todos los organismos de una muestra biológica, suelo,
medio marino, entre otros (generalmente microorga-
nismos). Los tamaños de las lecturas hacen posible
que la identificación de los organismos sea más pre-
cisa. Por norma general, las lecturas obtenidas en
estos análisis se analizan frente a bases de datos de
ácidos nucleicos, como las contenidas en GenBank,
utilizando herramientas tipo BLAST [20] (Basic Local
Alignment Search Tool, que realiza alineamientos de
secuencias de ácidos nucleicos frente a bases de datos
de ácidos nucleicos conocidos). La ventaja de tener
grandes tamaños de lecturas es que permiten com-
paraciones más ajustadas con las secuencias de los
organismos en las bases de datos. Esto se pudo com-
probar en el seminario Málaga Nanopore celebrado
en la Universidad de Málaga el 25 de abril de 2019 [21] ,
donde se presentó el trabajo de la empresa Xenogen.
Su trabajo con esta tecnología demuestra que es muy
superior para la identificación de microorganismos en
20
estudios de metagenómica. Incluso puede ayudar en
el caso del diagnóstico microbiológico de humanos en
circunstancias en las que las técnicas de diagnóstico
clásicas quedan rebasadas.
En contrapartida, también resulta importante ha-
blar de los inconvenientes o factores limitantes que
presenta esta técnica. La principal limitación es el
desarrollo del software propio de análisis de los ar-
chivos de lecturas FAST5, que hasta el momento
presenta una alta tasa de error. Sin embargo, gracias
al continuo desarrollo de software de interpretación
de datos se está consiguiendo aumentar de fiabilidad
de los resultados obtenidos. Paralelamente a este in-
conveniente está el problema del almacenamiento de
datos. De cada secuenciación se puede obtener más
de 200 Gb de datos crudos, necesitando sistemas con
un gran volumen de almacenaje y transferencia de
datos. Por último, hay que tener en cuenta la na-
turaleza biológica (proteínas) de los nanoporos en
los que se lleva a cabo la secuenciación, esto hace
que las células de flujo que contienen los nanoporos
tengan una vida media limitada. Todo ello marca la
necesidad de una correcta organización para utilizar
con éxito esta tecnología.
Conclusión
Desde las primeras aproximaciones de Frederick
Sanger en los años 60 hasta la actualidad, los méto-
dos de secuenciación de ácidos nucleicos han transfor-
mado las Ciencias Biológicas, dando lugar a que la
Biología Molecular se encuentre presente en múltiples
campos y abriendo el camino al desarrollo de nuevas
disciplinas como la Genómica que comienza a ser
ampliamente utilizada en el campo de la Medicina,
Microbiología o Ciencias Ambientales, entre otros
ejemplos. Estamos cerca de que estas técnicas nos
permitan a un coste asequible la secuenciación del
genoma de cualquier persona para su diagnóstico o
para intentar implementar un tratamiento personali-
zado frente a las enfermedades. Gracias al desarrollo
último de estas técnicas se ha podido secuenciar el
virus SARS-CoV-2 en menos de un mes desde su
detección [22] , incluso realizar estudios sobre su propa-
gación y analizar los diferentes subtipos o cepas que
han aparecido. En retrospectiva, esto es algo increí-
ble ya que el virus de la inmunodeficiencia humana
(VIH) se aisló por primera vez en 1983 [23] y hasta el
año 1985 [24] no se pudo secuenciar su genoma com-
pleto. Actualmente, se están intentando mejorar las
técnicas de secuenciación y realizar nuevas aproxi-
maciones que soslayen los problemas más frecuentes,
como ensayar el uso de nanoporos compuestos de
materiales robustos como el grafeno para sustituir
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a las proteínas [25] . Cabe recalcar el hecho de que el
avance y desarrollo de estas tecnologías no solo pasan
por la mejora y subsanación de sus debilidades. La
empresa de Oxford Nanopore Technology se encuen-
tra en el desarrollo de un mecanismo que permita,
además de la secuenciación de ácidos nucleicos, la
secuenciación y análisis de proteínas utilizando las
mismas plataformas físicas existentes [26,26] , lo que
podría ayudar al incremento en la eficiencia y rapi-
dez de procesos como la identificación y validación
de nuevas proteínas, pasos clave en la detección de
biomarcadores de enfermedades. Partiendo de una
tecnología diseñada para el estudio de los ácidos
nucleicos se podrían revolucionar las Ciencias Bioló-
gicas transformando completamente disciplinas como
la Proteómica y sustituyendo sistemas indirectos de
identificación y cuantificación de proteínas como la
espectrometría de masas. Probablemente, dentro de
poco tiempo haya que añadir un nuevo capítulo a la
historia de los métodos de secuenciación sin incluir
«de ácidos nucleicos».
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