PROTOCOLO DE ENSAYO PARA LA CÓDIGO: PS-O-### LI

DETERMINACION DE AMINAS AROMATICAS

EDICIÓN: 01
PRIMARIOS EN SIMULANTES DE
ALIMENTOS FECHA: 2021-09-08

Revisó: Andrés Gallo Aprobó: Claudia E. Restrepo

Cargo: Coordinador laboratorio Instrumental Cargo: Directora técnica de servicios

TITULO: Protocolo de ensayo para la determinación de aminas aromáticas primarias* en simulantes

de alimentos

*Aminas Aromáticas Primarias: 2,4-Diaminotolueno, 2,6-Diaminotolueno, 2,4-Dimetilanilina, 2,6-

Dimetilanilina, 1,3-Fenilendiamina, 1,4-Felinendiamina, 2-Metoxi-5-Metilanilina, 3,3’-Dimetilbencidina
(o-Tolidina), 4,4’-Aminofenileter, 4,4’-Metilendianilina, 4-Aminobifenilo, 4-Cloroanilina, 4,4’-Metilen-di-
o-Toluidina, 4-Metoxi-m-fenilendiamina,2-Anisidina, 0-Toluidina, Anilina, Bencidina, 4-cloro-2-
metilanilina, 2,4,5-Trimetilanilina, o-Dianisidina, 1,5-Diaminonaftaleno, 2-Naftilamina, 4,4’-Tioanilina

1. OBJETIVO

Describir la metodología para la determinación de aminas aromáticas primarias en los simulantes de

alimentos; agua, ácido acético al 3% p/v en solución acuosa, solución acuosa de etanol al 10% v/v,
solución acuosa de etanol al 95% v/v. El contenido de Aminas Aromáticas Arimarias determinadas
se expresa como miligramo de (AAP= por kilogramo de simulante de alimento.

2. ALCANCE

Este procedimiento aplica para la determinación cuantitativa de Aminas Aromáticas Primarias en un

rango de concentración de 0,001 mg/kg a 0,100 mg/kg de simulante de alimentos, obtenidos por
inmersión total (UNE EN 1186-1 y 3.2002), llenado (UNE EN 1186-1 y 9.2002) y bolsa (UNE EN
1186-7.2002), además de los lineamientos establecidos en los métodos UNE-EN 13130-1:2004 y
EUR 24815 EN 2011.

3. Contenido

3.1. Principio y aplicaciones

De acuerdo con la preocupación a nivel mundial relacionada con la salud de los consumidores y los
aspectos relacionados con la alimentación y los posibles contaminantes que pueden estar contenidos
en estos y que provengan de los materiales de empaque usados para contenerlos y que se
transfieren (migran) a los alimentos, en Colombia en 2012 y 2013, se han emitido resoluciones
relacionadas con la aptitud sanitaria de los empaques y envases en contacto con alimentos y bebida
para consumo humano.

La preocupación sobre la exposición a las AAP se da porque podrían estar asociados con cáncer en
el cuerpo humano. De ahí la importancia de determinar la cantidad de estas que pueden migrar
hacia el alimento y ser ingerida por los consumidores.

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Las AAP, se generan por reacción de monómeros de isocianato con agua, si el monómero es soluble
en agua, el agua reaccionaria con los isocianatos como alcohol secundario, donde la hidrolisis
liberaría CO2 y por lo tanto se generaría la AAP.

La concentración de AAP en simulante de alimentos se determina por cromatografía líquida de ultra

alta eficiencia (UHPLC) con detección por espectrometría de masas en tándem (Triple cuadrupolo).

La espectrometría de masas en tándem (MS/MS), analizador triple cuadrupolo (constituido por cuatro
barras paralelas equidistantes), consiste en tres cuadrupolos sucesivos (QqQ), en este arreglo, el
primer y el tercer cuadrupolo actúan como filtros de masas, mientras el segundo funciona como una
celda de colisión en la cual se aplica la energía de colisión –CE- y fluye un gas inerte (argón) a través
de ésta. Uno de los modos de funcionamiento es el Selected Reaction Monitoring (SRM), en este
modo de operación, un ion seleccionado en el cuadrupolo 1 (Q1) es fragmentado en la celda de
colisión y uno de estos fragmentos en específico es seleccionado por el tercer cuadrupolo (Q3), este
modo es conocido como SRM. El monitoreo de varios SRM produce un MRM (Multiple Reaction
Monitoring).

3.2. Interferencias

 Interferencias del método

Las interferencias dadas en el desarrollo de esta metodología, pueden originarse en la contaminación

ocurrida durante el manejo y preparación de la muestra o cualquier sustancia relacionada
(estándares, estándares de control, entre otros). Otras fuentes probables de contaminación, pueden
estar relacionadas con la calidad de los solventes, reactivos, limpieza de los elementos de vidriería y
el equipo para el procesamiento de las muestras, lo cual es probable que produzcan señales
discretas o aumentar el ruido de la línea base.

Rutinariamente, para el análisis; se debe demostrar que todos los implementos usados durante su
ejecución, se encuentran libres de interferencias y bajos las condiciones preestablecidas, para esto
se trabaja con blanco reactivos, además, se debe limpiar meticulosamente los equipos, materiales y
suministros utilizados, según lo establecido en el Instructivo de lavado y desinfección de material de
laboratorio de instrumental (PS-I-001 LI) y en los diferentes instructivos de los equipos.

Rutinariamente, se debe demostrar que todos los implementos usados en análisis están libres de
interferencias bajo condiciones del análisis, mediante el análisis en el lote de muestras de blancos de
reactivos. Limpiar meticulosamente los equipos, materiales y suministros utilizados en el análisis de
acuerdo a lo establecido en el Instructivo de lavado y desinfección de material de laboratorio de
instrumental (PS-I-001 LI) y en los diferentes instructivos de los equipos.

 Interferencias de matriz

Siguiendo el método descrito, no se han detectado interferencias en los simulantes de alimentos

acuosos.

3.3. Toma y almacenamiento de muestras

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Las muestras (simulantes de alimentos) para analizar, se deben obtener como se describe en el
Protocolo de Ensayo para la Migración Especifica de Sustancias Procedentes de Materiales Plásticos
a los Alimentos y Simulantes de Alimentos, Determinación de Sustancias en los Materiales Plásticos
y Selección de las Condiciones de Exposición a los Simulantes de Alimentos (PS-O-XXX LI). Las
muestras se deben mantener refrigeradas a 4°C ± 4°C en recipientes cerrados y en ausencia de luz.
Los simulantes de alimentos, exentos de analito del mismo tipo de aquellos que van a ser analizados,
se deben preparar también con fines de calibración.

3.4. Equipos, materiales y suministros

- Microbalanza (Sartorius ME36S) con rango de precisión de 0.001 mg

- Microjeringas de vidrio de 10 µL, 25 µL, 50 µL, 100 µL, 250 µL, 500 µL, 1000 µL.
- Balones volumétricos de 1, 5, 10, 500 y 1000 mL de capacidad. CLASE A.
- Probeta graduada de 50, 100, 500, 1000 mL.
- Cromatógrafo líquido UHPLC (Thermo Scientific) Ultimate 3000 acoplado a espectrometría de
masas (TSQ Vantage).
- Columna analítica: Hypersil GOLD aQ (Thermo Scientific) 100 mm x 2,1 mm ID; 1,9 µm de
tamaño de partícula.
- Refrigerador.
- Congelador.
- Viales para automuestreador de 9 mm cuello rosca 32 x 11,6 mm, vidrio ámbar en borosilicato
con tapa rosca para vial de 9 mm, tapa de PP, septa de silicona y PTFE.
- Desionizador de agua, resistividad de 18,2 MΩ.cm corregida a 25 °C.
- Vortex.
- Material de apoyo.
- Material usual de laboratorio.

3.5. Condiciones ambientales

La determinación se debe realizar de acuerdo con las condiciones de temperatura y humedad

descritas en el Procedimiento de requisitos técnicos y de gestión de calidad del laboratorio de
instrumental (PS-P-015), numeral 8.2 Descripción de áreas. Las condiciones ambientales son
monitoreadas en tiempo real a través del software OMICROM, el cual emite una alarma en tiempo
real si las condiciones ambientales no son las adecuadas para realizar las determinaciones.

3.6. Reactivos

Estándar Certificado de cada una de las AAP, de pureza mayor o igual a 98%.
 2,4-Diaminotoluene 99.0% (2,4 TDA) [C6H3(NH2)2CH3] CAS: 95-80-7.
 2,4-Dimethylaniline 99.5% (2,4 DMA) [C6H5N(CH3)2] CAS: 95-68-1.
 2,6- Diaminotoluene 99.8% (2,6 TDA) [C6H3(NH2)2CH3 CAS: 823-40-5.
 2,6- Dimethylaniline 99.5%, (2,6 DMA) [C6H5N(CH3)2] CAS: 87-62-7.
 2-Methoxy-5-Methylaniline 99.5% (2-M-5MA) [CH3OC6H3(CH3)NH2] CAS: 120-71-8.
 3,3'-Dimethylbenzidine (o-tolidine) 99.0% (3,3-DMB) [C6H3(CH3)NH2)2] CAS: 119-97-7.
 4,4’-Aminophenylether 98.5% (4,4-DPE) [(C6H4NH2)2O] CAS: 101-80-4.
 Bis-(4-Aminophenyl) methane 97.5% (4,4’-Methylenedianiline, 4,4-MDA) CAS: 101-77-9.
 4-aminobiphenyl 98.5% (4-ABP), [(C6H5)(C6H4)NH2] CAS: 92-67-1.
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 4-Chloroaniline 98.5% (4-CA), [C6H4ClNH2] CAS: 106-47-8.

 4,4'-Diamino-3,3'-Dimethyldiphenyl methane 99.0% (4,4’-Metilendi-o-toluidina, 4,4-MDoT),
[(C6H3CH3NH2)2CH2] CAS: 838-88-0.
 4-Methoxy-1,3-Phenylendiamine 99.0% (4-metoxi-m-fenilendiamina, 4-M-m-PDA),
[C6H3OCH3(NH2)2] CAS: 615-05-4.
 Aniline 99.5% (ANL), [C6H5NH2] CAS: 62-53-3.
 Benzidine 98.2% (BNZ), [(C6H4NH2)2] CAS: 92-87-5.
 1,3-Phenylenediamine 99.5% (m-fenilendiamina, m-PDA), [C6H4(NH2)2] CAS: 108-45-2.
 2-Anisidine 99.5% (o-Anisidine, o-ASD), [C6H4OCH3NH2] CAS: 90-04-0.
 o-Toluidine 99.5% (o-T), [C6H4CH3NH2] CAS: 95-53-4.
 1,4-Phenylendiamine 98% (p-fenilendiamina, p-PDA), [C6H4(NH2)2] CAS: 106-50-3.
 4-Chloro-2-methylaniline 98.6% (4-Cloro-o-Toluidina, 4-CoT), [C6H4CH3NH2Cl] CAS: 95-69-2.
 2,4,5-Trimethylaniline 99.0% (2,4,5-TMA), [C6H2(CH3)3NH2] CAS: 88-05-1.
 O-Dianisidine 99% (o-diASD), [(C6H3OCH3NH2)2] CAS: 119-90-4.
 1,5-Diaminonaphthalene 99.4% (1,5-DAN), [C10H6(NH2)2] CAS: 2243-62-1.
 4,4’-Thioaniline 99.5% (4,4’-thioANL), [(C6H4NH2)2S] CAS: 139-65-1.
 2-Naphtylamine 99% (2-NA), [C10H7NH2] CAS: 91-59-8.

 Metanol grado LC-MS, demostrado estar libre de analitos e interferencias. (CH3OH).

 Ácido acético glacial (CH3COOH).
 Agua desionizada, usar agua purificada que no contenga cantidades apreciables de alguno de los
analitos objetivos o interferencias mayores al 30 % del límite de cuantificación para cada una de las
AAP. (H2O).
 Etanol Absoluto, demostrado estar libre de analitos e interferencias (CH3CH2OH).
 Acetona grado residuos, demostrado estar libre de analitos e interferencias (CH3COCH3).
 Argón ultrapuro (Ar).
 Ácido Pentafluoropropiónico – PFPA- de pureza mayor o igual al 97%, (C3HF5O2).

3.7. Preparación de soluciones

3.7.1 Solución estándar de trabajo de AAP 1000,0 mg/L: Pesar 10,0 ± 0,01 mg del estándar de
cada una de las aminas amina aromática primaria que se listan en la tabla 1, en balón de 10 ml y
aforar con 10 ml del solvente que se indica en la tabla 1. En el caso de estándares líquidos medir
con microjeringa la cantidad equivalente a 10 mg.
Control calidad: No aplica. Solución patrón.
Tipo de recipiente: Vial ámbar de vidrio de tapa rosca de PTFE de 12 ml.
Control calidad: Almacenar protegida de la luz en congelación (-20º ± 4º C).
Estabilidad: Esta solución es estable en congelación hasta por un año. La solución estándar de p-
fenilendiamina – p-PDA – solo es estable en congelación hasta por 1 mes.
Recomendaciones: Descartar si observa cambios en la solución.

Tabla 1. Preparación Soluciones estándar de trabajo 1000.0 mg/L

Amina Aromática Primaria Sigla Cantidad a Pesar en mg Solvente
2,4,5-Trimetilanilina 2,4,5-TMA 10,10 Etanol
2,4-Dimetilanilina 2,4-DMA 10,05 (10,255 µL) Etanol
2,4-Toluendiamina 2,4-TDA 10,10 Etanol

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Amina Aromática Primaria Sigla Cantidad a Pesar en mg Solvente

2,6- Toluendiamina 2,6-TDA 10,02 Etanol
2,6-Dimetilanilina 2,6-DMA 10,05 (10,214 µL) Etanol
2-Metoxi-5-metilanilina 2-M-5-MA 10,05 Etanol
3,3-Dimetilbencidina 3,3-DMB 10,10 Etanol
4,4-Diaminodifenileter 4,4'-DPE 10,15 Acetona
4,4'-Metilendianilia 4,4'-MDA 10,10 Etanol
4,4-Metilendi-o-toluidina 4,4'-MDoT 10,26 Etanol
4-aminobifenilo 4-ABP 10,15 Etanol
4-Cloroanilina 4-CA 10,15 Etanol
4-Cloro-o-toluidina 4-CoT 10,14 (8.52 µL) Etanol
4-metoxi-m-fenilendiamina 4-M-mPDA 10,10 Etanol
Anilina ANL 10,05 (9,8 µL) Etanol
Bencidina BNZ 10,18 Etanol
m-fenilendiamina m-PDA 10,05 Etanol
o-Anisidina o-ASD 10,05 (9.22 µL) Etanol
o-Toluidina o-T 10,26 (9.97 µl) Etanol
p-fenilendiamina p-PDA 10,20 Etanol
O-Dianisidine o-diASD 10,10 Etanol
1,5-Diaminonaphthalene. 1,5-DAN 10,06 Etanol
4,4’-Thioaniline 4,4´-thioANL 10,05 Etanol
2-Naphtylamine 2-NA 10,10 Etanol

3.7.2 Solución estándar de trabajo 1 de AAP 100.0 mg/L1: Tomar con microjeringa 1000 µl del
estándar de trabajo de 1000,0 mg/L y llevarlo a balón de 10 ml, aforar con el solvente (Etanol
Absoluto). Se pueden preparar soluciones multiestándar, preparando independientemente el p-PDA
de la misma forma (tomar 1000 µl con microjeringa y llevarlos a balón de 10 ml, aforar con Etanol
Absoluto).
Control calidad: No aplica. Solución patrón.
Tipo de recipiente: Vial ámbar de vidrio de tapa rosca de PTFE de 8.0 ó 12.0 mL.
Almacenamiento: Almacenar protegido de la luz en congelación (-20º ± 4º C).
Estabilidad: Esta solución es estable en congelación hasta por un año. La solución de p-PDA es
estable hasta por un mes.
Recomendaciones: Descartar si observa cambios en la solución.

3.7.3 Solución estándar de trabajo 2 de AAP 10.0 mg/L: tomar con microjeringa 1000 µl de los
estándares de trabajo de 100.0 mg/L (Mix1, Mix2 y Mix3) y llevarlos a balón de 10 ml aforar con el
solvente (Etanol Absoluto). Preparar el p-PDA independiente de la misma forma (tomar 1000 ul con
microjeringa y llevarlos a balón de 10 ml, aforar con Etanol Absoluto).
Control calidad: No aplica. Solución patrón.
Tipo de recipiente: Vial ámbar de vidrio de tapa rosca de PTFE de 8.0 ó 12 mL.
Almacenamiento: Almacenar protegida de la luz en congelación (-20º ± 4º C).

1
Se preparan tres soluciones multiestandar (Mix1, Mix2, Mix3) de concentración 100.0 mg/L
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Estabilidad: Esta solución es estable en congelación hasta por un año. La solución de p-PDA es
estable hasta por un mes.
Recomendaciones: Descartar si observa cambios en la solución.

3.7.4 Solución estándar de trabajo 3 diluida de AAP 1.0 mg/L (1000 µg/L) en simulante: tomar
con microjeringa 1000 µl del estándar de trabajo de 10.0 mg/L y llevarlo a balón de 10 ml aforar con
el solvente (Etanol Absoluto).
Control calidad: No aplica. Solución patrón.
Tipo de recipiente: Vial ámbar de vidrio de tapa rosca de PTFE de 8.0 ó 12 mL.
Almacenamiento: Almacenar protegida de la luz en congelación (-20º ± 4º C).
Estabilidad: Esta solución es estable en congelación hasta por un año. La solución de p-PDA es
estable hasta por un mes.
Recomendaciones: Descartar si observa cambios en la solución.

3.7.5 Solución estándar de trabajo 4 de AAP 0.10 mg/L (100 µg/L): tomar con microjeringa 1000 µl
del estándar de trabajo de 1.0 mg/L y llevarlo a balón de 10 ml aforar con el solvente (Etanol
Absoluto).
Control calidad: No aplica. Solución patrón.
Tipo de recipiente: Vial ámbar de vidrio de tapa rosca de PTFE de 8.0 ó 12 mL.
Almacenamiento: Almacenar protegida de la luz en congelación (-20º ± 4º C).
Estabilidad: Esta solución es estable en congelación hasta por un año. La solución de p-PDA es
estable hasta por un mes.
Recomendaciones: Descartar si observa cambios en la solución.

3.7.6 Fase móvil A: 4.7 mM PFPA en Metanol: Transferir 0.504 ml PFPA a un litro de metanol.
Control calidad: No aplica.
Tipo de recipiente: Frasco tapa rosca azul vidrio claro 500 mL.
Almacenamiento: Temperatura Ambiente.
Estabilidad: Esta solución es estable a temperatura ambiente hasta por 6 meses.
Recomendaciones: Si se observa crecimiento de microorganismos o solidos descartar
inmediatamente.

3.7.7 Fase móvil B: 4.7 mM PFPA en Agua: transferir 0.504 ml PFPA a un litro de Agua.
Tipo de recipiente: Frasco tapa rosca azul vidrio claro 500 mL.
Almacenamiento: Temperatura Ambiente.
Estabilidad: Esta solución es estable a temperatura ambiente hasta por 6 meses.
Recomendaciones: Si se observa crecimiento de microorganismos o solidos descartar
inmediatamente.

3.7.8 Simulante ácido (ácido acético 3% m/v): Disolver 30 g (28.6 mL) de ácido acético glacial en 1
L de agua usando matraz aforado de 1000 mL.
Control calidad: No aplica.
Tipo de recipiente: Frasco Ámbar.
Almacenamiento: Temperatura Ambiente.
Estabilidad: 15 días.
Recomendaciones: Si se observa crecimiento de microorganismos o solidos descartar
inmediatamente.

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3.7.9 Simulante Alcohólico (Etanol 10% v/v): Disolver 100 mL de Etanol Absoluto en 1 L de agua
usando matraz aforado de 1000 mL.
Control calidad: No aplica.
Tipo de recipiente: Frasco tapa rosca azul.
Almacenamiento: N.A.
Estabilidad: N.A.
Recomendaciones: Preparar cuando al momento de preparar la curva.

3.7.10 Simulante Graso (Etanol 95% v/v): Disolver 950 mL de Etanol Absoluto en 1 L de agua
usando matraz aforado de 1000 mL.
Control calidad: No aplica.
Tipo de recipiente: Frasco tapa rosca azul.
Almacenamiento: N.A.
Estabilidad: N.A.
Recomendaciones: Preparar cuando al momento de preparar la curva.

3.7.11 solución de Chequeo: Preparar dos soluciones de chequeo para las PAA: 4,4 MDA y o-ASD.
De estas soluciones stock una muestra de chequeo que contengan 10 µg/L de 4,4’ MDA Y 10 µg/L
DE o-ASD se prepara por dilución con agua destilada. Esta muestra es estable en refrigerador a 4º
C hasta 6 meses.
Control calidad: No aplica. Solución patrón.
Tipo de recipiente: Vial ámbar de vidrio de tapa rosca de PTFE de 8.0 ó 12 mL.
Almacenamiento: Almacenar protegida de la luz en refrigeración (4º ± 4º C).
Estabilidad: Esta solución es estable en Refrigeración hasta por 6 meses.
Recomendaciones: Descartar si observa cambios en la solución.

3.8. Curva de calibración

La curva de calibración para la determinación de AAP en simulantes de alimentos, se prepara como

se indica en la tabla 2. Al momento de poner a punto los estándares, llenar un balón volumétrico de
10,0 mL con ≈ 4 mL de simulante apropiado, luego adicionar la cantidad del volumen del estándar de
trabajo 3 o 4 de acuerdo con la tabla 2 (Medida con microjeringa) y aforar con el mismo simulante
(ver sección reactivos y preparación de soluciones). Finalmente, tapar el balón, agitar, verter el
contenido en un vial de automuestreador. Cada una de los niveles se inyecta por duplicado. Analizar
como se indica en la sección de procedimiento.

La curva de calibración para la determinación de aminas aromáticas primarias en simulantes de

alimentos se prepara como se indica en la tabla 2. Al momento de preparar los estándares, llenar un
balón volumétrico de 10,0 mL con aproximadamente 4 mL de simulante apropiado, luego adicionar la
cantidad del volumen del estándar de trabajo 3 o 4 en el balón de acuerdo con la tabla 2 (Medida con
microjeringa) en el balón y aforar con el simulante correspondiente (ver sección reactivos y
preparación de soluciones). Tapar el balón, agitar, verter el contenido en un vial de automuestreador.
Cada una de los niveles se inyecta por duplicado. Analizar como se indica en la sección de
procedimiento.

La curva se debe preparar por duplicado para realizar la medición.

Tabla 2. Curva de calibración para la determinación de AAP en simulantes de alimentos.

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Concentración solución Volumen solución Volumen de Concentración del

de trabajo (µg/L) estándar de trabajo(µL) aforo (mL) nivel (µg/L)
100 50 10 0,5
100 70 10 0,7
100 100 10 1,0
100 500 10 5,0
100 1000 10 10,0
1000 200 10 20,0
1000 500 10 50,0
1000 1000 10 100,0

NOTA 1: La directiva de la Comisión 90/128/CEE establece que la densidad relativa de todos los simulantes
debería ser asumida convencionalmente como “1”. Los miligramos de sustancia cedidos por litro de simulante
corresponderán así numéricamente a miligramos de sustancia cedidos por kilogramo de simulante, y teniendo
en cuenta las disposiciones establecidas en la Directiva 82/711/CEE, a miligramos de sustancia cedida por
kilogramo de alimento.

4. Procedimiento

4.1. Preparación de la muestra

Transferir 1,0 ml de los simulantes de alimentos, obtenidos de los ensayos de migración especifica de
acuerdo a lo establecido en el Protocolo De Ensayo Para La Migración Especifica De Sustancias
Procedentes De Materiales Plásticos A Los Alimentos Y Simulantes De Alimentos, Determinación De
Sustancias En Los Materiales Plásticos Y Selección De Las Condiciones De Exposición A Los
Simulantes De Alimentos (PS-O-XXX LI) a un vial de automuestreador para su inyección por UHPLC-
QqQ.

4.2. Verificación del equipo o método

El material volumétrico debe ser clase A y garantizar que ha sido verificado a través del instructivo de
verificación volumétrica en el laboratorio instrumental (PS-I-001 LI). Antes de usar el material de vidrio
debe ser purgado 3 veces con acetona grado residuo.

Se debe verificar mediante el formato xxx (lista de chequeo), los siguientes parámetros antes de
iniciar el trabajo en el equipo UHPLC Ultimate 3000 TSQ Vantage:
1. Instalación de columna adecuada (Dirección de flujo correcta).
2. Fases móviles adecuadas para el método y en los canales correctos.
3. Solución de lavado de sellos (H2O:CH3OH, 95:5) de la bomba instalada.
4. Solución de lavado (H2O:CH3OH, 50:50) instalada.
5. Verificación de fugas en la columna.
6. Tornillo de purga de canales cerrado.
7. Generador de nitrógeno funcionando correctamente.
8. Suministro de Argón.
9. Alarmas del generador y del UHPLC desactivadas.
10. Verificar ausencia de sólido sobrenadantes en las fases móviles.
11. Posición correcta del probe (posición D) de la HESI-II.

La verificación de todo el sistema instrumental (cromatógrafo de líquidos, columna y espectrómetro

de masas) se realiza utilizando la solución de chequeo, para esto, se debe inyectar antes de iniciar la

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cuantificación y verificar que se encuentra dentro de los rangos establecidos en la carta de control
(XX-X-XXX LI).

4.3. Descripción de la rutina analítica

4.3.1. Condiciones del Cromatógrafo líquido Ultimate 3000:

 Horno: Temperatura: 40º C.

Figura 1. Condiciones Horno

 Automuestreador-Inyector: Temperatura: 15 º C.

Figura 2. Condiciones automuestreador.

 Bomba: en la Figura 3 se observa la composición de fases móviles

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o Flujo 0.3 mL/min.

o Fase Inicial 5% Fase Movil Metanol y 95% Fase movil Acuosa.
o 3 minutos con gradiente hasta 20% Fase movil metanol.
o 4.5 minutos con gradiente hasta 80% Fase movil metanol.
o 0.5 minuto manteniendo la fase movil 80% metanol.
o 3 minutos en gradiente hasta 5% fase movil metanol.
o 4 minutos se mantiene la fase movil de metanol en 5%.

En la figura 3, se observa composicion de la fase movil.

Figura 3. Condiciones de Flujo.

4.3.2. Condiciones del Espectrómetro de masas TSQ Vantage

 Condiciones HESI-II: Verificar que el espectrómetro de masas se encuentre encendido y que

los valores sean los establecidos en la Figura 4, excepto el valor de Collision Energy que es propio
para cada uno de los compuestos.
 Temperatura Capilar 208º C.
 Temperatura Vaporizador: 384º C.
 Presión Gas Sheath: 50.
 Presión Gas Auxiliar: 5.
 Voltaje Spray Polaridad Positiva: 4000.
 Discharge Current: 4.0.

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Figura 4.Condiciones de la HESI-II.

Condiciones del espectrómetro de masas: Verificar las condiciones mostradas en la Figura 5.

Figura 5.Condiciones del espectrómetro de masas.

En la Figura 6, se tienen los iones precursores, productos, energías de colisión, tiempos de retención,
tiempo de ventanas y polaridad para cada uno de los plaguicidas.

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Figura 6. Iones precursores, productos, energías de colisión, tiempos de retención, tiempo de ventanas y
polaridad para cada una de las AAP.

4.3.3. Creación de la secuencia de análisis.

Finalmente al momento de analizar la muestra se crea la secuencia de análisis como se muestra a

continuación:
 En el computador del equipo TSQ Vantage, dar clic en el icono del Xcalibur ubicado en el
escritorio del computador, o a traves de la ruta: Start/ Xcalibur.
 Acontinuacion, abrir el programa Xcalibur (Figura 7), dar clic en el icono Secuence setup, de
donde se despliega una nueva ventana para crear una secuencia, en la cual se ingresa la
siguiente informacion:
 Sample Type: Seleccionar la opcion “Unknown” para todos los corridos.
 File Name: Para la muestras se ingresa: Codigo interno_Fecha(AAAAMMDD)_contador
numerico iniciando en 001 y para los demas corridos cromatograficos se ingresa el
respectivos nombre, seguido de la fecha y el contador.
 Sample ID: En este ítem, se nombra los corridos cromatográficos como se muestra
acontinución:
Los estándares, nombrar como: STD_#,# , donde #,# es la respectiva concentración del
estándar.
La fase móvil inicial se debe nombrar como: FM.
El blanco reactivos se debe nombrar como: BK.
El blanco de matriz se debe nombrar como: BK_MT#, donde # es un contador.
Las muestas se nombra como: MT#_1 para muestra replica 1 y MT#_2 para la muestra
replica 2, donde # correspondera a un contador.
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Las muestras dopadas se nombra como: MT#_DOP_Y, donde # corresponde al contador de

la respectiva muestra dopada y Y corresponde al valor de concentración al cual se dopo la
muestra.
El material de referencia es nombrado como: MR
 Path: En este item se pone la ruta en la cual se guardaran los archivos,
D:\XCALIBUR\DATA\AAP\ Codigo solicitud servicio_Codigo interno_Parámetro.
 Inst Meth: Se ingresa la ubicación del metodo de analisis (verificar que este corresponda con
lo mostrado en la sección 4.3. Descripción de la rutina analítica): D:\Xcalibur\methods\AAP.
 Position: Indicar la posicion en la cual se encuentran ubicados los viales en los rack del
inyector.
 Inj Vol: Ingresar la cantidad de muestra que se desea inyectar, para el método de AAP dicha
cantidad es 20 µL.
 Para las demas columnas, dejar los valores que se cargan por defecto.

Figura 7. Interfaz del programa Xcalibur.

En la Figura 8, se observa un ejemplo de una secuencia cromatografica de un analisis.

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Figura 8. Secuencia Cromatográfica

 Por último guardar la secuencia de análisis con el nombre: código interno de la muestra _
fecha (AAAAMMDD), en la carpeta en la cual se están guardando los archivos de todo el

análisis de la muestra y dar clic en el icono para comenzar el corrido de las muestras.

5. FUNCIONAMIENTO DE LOS EQUIPOS

Ver los Instructivos de uso de los equipos:

 PS-E-### LI Estufa Red Line RF115-UL.
 PS-E-### LI Cromatografo líquido UHPLC (Thermo Scientific) Ultimate 3000 acoplado a
espectrometría de masas TSQ VANTAGE.
 PS-E-008 LI. Instructivo de Sistema de Purificacion de Agua. Desionizador de agua, resistividad de
18,2 MΩ.cm corregida a 25 °C.
 PS-E-011:
o Refrigerador.
o Congelador.
 PS-E-002 LI Microbalanza (Sartorius ME36S).
 PS-E-007 LI Vortex: (REAX TOP), Heidolph – Select vortexer Bioproducts.

6. CONTROL ANALÍTICO

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Se preparan dos curvas de calibración, cada una a partir de dos soluciones madre concentradas
preparadas independientemente, se analizan cada una de las soluciones de calibración,
inyectándolas por duplicado, las curvas de calibración deben ser lineales, con un coeficiente de
correlación ≥ 0,99. Se deben comparar las dos series de soluciones de calibración de forma
independiente a partir de soluciones concentradas.

Para comprobar la validez de los análisis de las muestras realizadas con el método analítico descrito
en este protocolo, se efectúan los siguientes controles, esto aplica para lotes de muestra de 1-15:

Se prepara un blanco de reactivos, agregando 100 ml del simulante de alimento en un frasco ámbar
de vidrio de boro silicato y se procede de acuerdo al ítem Preparación de la muestra. La
concentración de AAP no debe ser mayor al del Límite de cuantificación del método (1 µg/kg), de
presentarse lo contrario, se deberá repetir todo el análisis teniendo en cuenta donde se presentó la
contaminación. Si al realizar nuevamente el análisis cuando las interferencias sean mayores al Límite
de Cuantificación se aplica el método de adición.

Cada muestra se inyecta por duplicado, el criterio de aceptación es:

 Nivel de 2 µg/L 5 – 26% RSD.
 Nivel DE 25 µg/L: 3-17 % RSD.

Se preparan tres muestras dopadas usando balón volumétrico de 10 ml, agregando una alícuota del
estándar de trabajo 3 de AAP de 1,0 mg/L (Tabla 3) sobre 10 ml de simulante alimenticio después de
tener el contacto con la muestra, luego de llevar esta solución dopada a los viales para cromatografía
para determinación por LC-MSMS.

Las muestras se dopan a la concentración del LC (1 µg/kg, con un criterio de recuperación entre el 40
– 120 %), al valor medio de la curva (50 µg/kg, con un criterio de recuperación entre el 60 – 110 %) y
al valor alto de la curva (100 µg/kg, con un criterio de recuperación entre el 80 – 120 %), como se
muestra en la Tabla N°2, de no cumplir se deberá repetir el lote analizado.

Tabla 3. Volumen a adicionar para el dopaje de muestras.

Concentración de Amina Aromática Primaria en el Volumen solución estándar de trabajo 3 Amina
simulante alimentario (µg/kg) Aromática Prmaria 1,0 mg/l (µL)
1 10
50 500
100 1000

Se utilizaran materiales de referencia certificados y patrones de referencia certificados, según

disponibilidad, el criterio de aceptación para estos, se establece como el valor promedio ± la
incertidumbre asociada al certificado, de no cumplir se deberá repetir el lote analizado.

7. CÁLCULOS

La concentración de AAP en la muestra se calcula con la ecuación de la recta de regresión), área del
pico de AAP vs. Concentración de AAP en el simulante de alimento en microgramos por kilogramo
obtenida de la curva de calibración.

Los cálculos de concentración en µg/kg de Amina Aromática se realizan directamente en el equipo de

la manera que se muestra a continuación:

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La ecuación de la recta de regresión es: y = (a * x) + b

Donde:
y: es el área del pico de AAP.
a: es la pendiente de la recta de regresión en miligramos por kilogramo.
x: es la concentración de AAP en el simulante de alimento en miligramos por kilogramo.
b: es la intersección en la recta de regresión.

La concentración de AAP en mg/kg en el simulante de alimentos viene dada por:

CAAP = y – b
a
Donde:
CAAP: es la concentración de AAP en miligramos por kilogramo.

El volumen de simulante utilizado se registra en el formato pretratamiento de muestra PS-F-064, de

no estar disponible este registro se puede usar el formato captura de datos PS-F-089.

Para la cuantificación de los compuesto se ingresa por el icono Road map view
y se da Click en la pestaña Processing Setup.

Se ingresan los datos para el procesamiento e identificación de cada Amina

Aromática.

Figura 9. Identificicación AAP.

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Figura 10. Tipo de Calibración.

Figura 11. Curva de Calibracion.

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Luego se da click en sequence view , se da guardar como y al nombre se le adiciona

“_Cuantificacion”, y en processing method se carga el programa de cuantificación. Se identifican las
muestras de acuerdo a si son blanco, estándar o muestra desconocida en la columna “level”.
o Sample Type: Dar clic en la celda y seleccionar Unknow para las muestras, réplicas y muestras
dopadas, para los estándares se debe seleccionar la opción Std Bracket y finalmente para los
blancos y fase móvil Blank.
o Proc Method: cargar el método de Processing Setup, previamente creado para el método de
plaguicidas, el cual se llama Cuantificacion_PlaguicidasSTDLC y se encuentra en la ruta:
D:\Xcalibur\methods\Processing setup.
o Level: Para los estándares de la curva de calibración, se debe seleccionar el nivel según el Cal
Level en Level del método de Processing Setup de Cuantificacion_PlaguicidasSTDLC.
o

Figura 12. Secuencia cromatográfica para el procesamiento de datos.

Dar click en Batch Reprocess . inmediatamente se abrirá la ventana mostrada en la Figura10,

dar clic en ok y posteriormente aparecerá el icono en la parte inferior de la pantalla, esperar

hasta que desaparezca.

Al terminar de procesar abrir Quan Browser y cargar el archivo generado anteriormente y

verificar los picos encontrados en la pestaña Standards y verificar si hay que excluir algún punto que
no se ajuste a la recta (R 2 ≥ 99.0); luego en la pestaña Unknowns (muestras a analizar) revisar
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también los puntos encontrados (que estén bien definidos y tomados). Dar guardar como y generar el
archivo *.xqn (Quan Browser files); luego de verificar los resultados obtenidos, dar click en file, export
data to Excel y click en Export Short Excel Report, luego en el archivo generado proceder a calcular
los controles analíticos (%RSD y % Recuperación), para lo cual se requiere adicionar columnas para
calcular Blanco (BK), Contenido de cada muestra (M), contenido de la muestra (restando Blanco), y
cálculo de contenido por kg de simulante y Observaciones.
Cada muestra se inyecta por duplicado, el criterio de aceptación es:
 Nivel de 2 µg/L 5 – 26% RSD.
 Nivel DE 25 µg/L: 3-17 % RSD.

8. REFERENCIAS

EUR 24815 en 2011. Technical guidelines on testing the migration of primary aromatic amines from
polyamide kitchenware and of formaldehyde from melamine kitchenware.

UNE-EN 13130-1 Materiales y artículos en contacto con alimentos. Sustancias Plásticas sometidas a
limitaciones. Parte 1: Guía de métodos de ensayo para la migración específica de sustancias
procedentes de materiales plásticos a los alimentos y simulantes de alimentos, determinación de
sustancias en los materiales plásticos y selección de las condiciones de exposición a los simulantes
de alimentos. Febrero 2005.

Resolución 4143 del 7 de diciembre 2012. Ministerio de Salud y Protección Social de Colombia.

Kiroska-Petreska Evjenija, Memeti Shaban, Kostic Vesna. Healt Safety on Plastic Material That Come
into Contact with Food – Migration of Primary Aromatic Amines. Journal of Hygienic Engineering and
Design.

9. REGISTROS

PS-F-064 Pretratamiento de muestra.

Reporte de Resultados: archivo generado por el software Thermo Xcalibur en Excel

“#####_Cuantificacion_Short.xls al cual se le adicionan las siguientes columnas

BK [ug/l] M [ug/l] M [ug/l] - BK [ug/l] [mg/kg] OBSERVACIONES

Dando un archivo con las siguientes columnas:

Sample Are %Dif Unit Sampl BK M

Filename Amount Amount %RSD-AMT M [ug/l] - BK [ug/l] [mg/kg] OBSERVACIONES
Type a f s e ID [ug/l] [ug/l]

Pesar 10 mg de Estándar de Amina Aromática Primaria en balón Página 19 de 20

volumétrico de 10 ml y aforar con el Solvente (realizarlo por
duplicado)
 Preparar soluciones de trabajo (100,0 mg/L, 10,0 mg/L, 1,0 mg/L,
100 µg/L) en balones volumétricos de 10 ml en metanol a partir de
cada solución patrón de 1000 mg/L
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PRIMARIOS
Preparar curvas EN SIMULANTES
(2) de calibración DE de alimentos
en el simulante
(0,5; 0,7; 1,0; ALIMENTOS
5,0; 10,0; 20,0; 50,0; 100,0 µg/L) FECHA: 2021-09-08

10. DIAGRAMA DE FLUJO

Tomar
Pesar 10 mg las muestras
de Estándar y blancos
de Amina y llevarlas
Aromática a los viales
Primaria para
en balón
cromatografía
volumétrico de 10 ml y aforar con Etanol (Acetona para el 4,4-
DPE)

Preparar muestras dopadas (1 µg/L, 50 µg/L y 100 µg/L), en el

simulante de las muestras analizadas
Preparar soluciones de trabajo (100,0 mg/L, 10,0 mg/L, 1,0 mg/L,
100 µg/L) en balones volumétricos de 10 ml en etanol a partir de
cada solución patrón de 1000 mg/L
Analizar por LC-QqQ

Preparar curvas (2) de calibración en el simulante de alimentos

(0,5; 0,7; 1,0; 5,0; 10,0; 20,0; 50,0; 100,0 µg/L)

Tomar las muestras y blancos y llevarlas a los viales para

cromatografía

Preparar muestras dopadas (1 µg/L, 50 µg/L y 100 µg/L), en el

simulante de las muestras analizadas

Analizar por LC-QqQ

Realizar Procesamiento de Datos e Informes

FIN DEL DOCUMENTO

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