UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA

PRACTICA 3

Cultivos y Siembra de los Microorganismos

Alumno: Romero Elías, Albert

Código: 20111340

Curso: Microbiología Pesquera

Grupo: A

Profesora: Nancy Martínez Ordinola

Fecha de ejecución: Martes 2 de septiembre de 2014

Fecha de entrega: Sábado 13 de septiembre de 2014

Introducción:

En el presente informe se desarrollará el tema correspondiente a la tercera práctica

realizada en el laboratorio de microbiología pesquera Cultivos y Siembras de los
Microorganismos, con la finalidad de dar el crecimiento de una colonia de
microorganismos para su visualización.

Un método fundamental para estudiar las bacterias es cultivarlas en un medio de cultivo,

ya sea, líquido o en la superficie de un medio sólido de Agar. Los medios de cultivo
contienen distintos nutrientes que van, desde azúcares simples hasta sustancias complejas
como la sangre o el extracto de caldo de carne.

Para aislar o purificar una especie bacteriana a partir de una muestra formada por muchos
tipos de bacterias, se siembra en un medio de cultivo sólido donde las células que se
multiplican no cambian de localización; tras muchos ciclos reproductivos, cada bacteria
individual genera por escisión binaria una colonia macroscópica compuesta por decenas
de millones de células similares a la original. Si esta colonia individual se siembra a su vez
en un nuevo medio crecerá como cultivo puro de un solo tipo de bacteria (cultivo
Axénico).

Existen diferentes métodos para determinar las características que presentan algunos
microorganismos, ya sea su tipo de respiración (aeróbica o anaeróbica), los nutrientes de
los que se alimentan, etc. Estos métodos se utilizan para lograr obtener microorganismos
de una misma especie.

Objetivos:

 Observar el crecimiento bacteriano en los distintos medios de cultivo.

 Identificar métodos eficaces para el aislamiento de microorganismos.
 Aprender a inocular distintos medios de cultivo contenidos en tubo.
 Diferenciar las formas de las colonias al ir disminuyendo la concentración de
microorganismos.
Revisión Bibliográfica:

El cultivo de microorganismos consiste en proporcionarles las condiciones físicas, químicas

y nutritivas adecuadas para que puedan multiplicarse de forma controlada. En general,
podemos distinguir cultivos líquidos y sólidos en función de las características del medio y
cultivos discontinuos y continuos en función de la disponibilidad de nutrientes en el
medio.

Medio de cultivo:

Es un sustrato o una solución de nutrientes que permite el desarrollo de microorganismos.

Los medios están diseñados para brindar los nutrientes necesarios para permitir (bajo
condiciones favorables de pH, temperatura, humedad, etc.) el crecimiento de los
microorganismos.

Cultivo puro: Se denomina cultivo puro (Axénico) al que contiene sólo un tipo de
microorganismos. Los cultivos puros se inician a partir de colonias aisladas, de manera que
todos los individuos del mismo tengan la misma composición genética. Los cultivos puros
son esenciales para poder estudiar las características de los microorganismos y para poder
identificarlos con seguridad.

Sin embargo, cada vez se va conoce más sobre el funcionamiento de las comunidades
bacterianas lo que debe hacernos reflexionar sobre el hecho de que un cultivo puro
supone unas condiciones no naturales y que, por consiguiente, la fisiología de los
microorganismos en ambientes naturales puede ser diferente de la que presentan en
condiciones de cultivos puros.

Crecimiento microbiano en medio líquido: Si la bacteria crece en un medio líquido, en la

mayoría de los casos las células que se producen en cada división continúan su vida
independientemente formándose una suspensión de células libres.

Cultivo en caldo nutritivo: El crecimiento de las bacterias en medios líquidos se manifiesta

por la aparición de turbidez o sedimento, velo en la superficie del medio y olor
característico. La utilización de medios de cultivo líquidos permite la obtención de una
población microbiana elevada.
Cultivo placa agar:

Posición Inclinada: Con una aguja se toma el material que se quiere sembrar y se lo
introduce en el tubo, con medio semisólido. Este método se utiliza para estudiar la
movilidad de las bacterias. 

Posición Inclinada: Se siembra el material  en la superficie de el agar inclinado en un tubo

de ensayo,  allí se extiende por toda la superficie con el asa bacteriológica, previamente
esterilizada y cargada con el material a sembrar, haciendo estrías no muy amplias, pero
tampoco muy estrechas. Se inicia por la parte más profunda de la superficie inclinada  y se
termina la estría en la parte más cerca de la boca del tubo.

Posición Semiinclinada: En este medio sembraremos por picadura y estrías en superficie,

como ya conocemos, para estudiar los cambios que ocurrirán en superficie y profundidad.
A lo largo del canal se desarrollan los microorganismos, y según lo hagan en la parte
superior o inferior del tubo estarán indicando su comportamiento.

Métodos de aislamiento:

El aislamiento de bacterias a partir de muestras naturales se realiza, en la mayoría de los

casos, mediante la producción de colonias aisladas en cultivos sólidos. El crecimiento
explosivo de las bacterias permite producir un gran número de ellas a partir de una única
célula inicial de forma que, tras un periodo de incubación en las condiciones ambientales
adecuadas, se produce una colonia observable a simple vista y formada por individuos
iguales.

Siembra por agotamiento: En este procedimiento se puede conseguir  una buena

separación de las colonias y aislarlas fácilmente. Para ello se funde el medio de cultivo, se
vuelca en caja de Petri y se deja solidificar. Con el asa previamente esterilizada se toma
material de un cultivo heterogéneo y se descarga sobre la superficie del medio formando
estrías.

Siembra por dilución: Se toma el tubo de ensayo con medio líquido, como el caldo simple.
Se toma el material a diluir y se siembra en el  tubo con el uso del asa cargada con
el  material bacteriológico, se agita con movimientos moderados.
Materiales:
 Agar Nutritivo
 Caldo Nutritivo
 Cultivo Impuro
 Placas con VRBA (Rojo violeta bilis agar)
 Placas con PCA (Plate count agar)
 Diluciones a partir de una muestra de pescado
 Pipetas estériles
 Placas petri estériles
 Espátulas drigalsky
 Asa y ajuga de kolle
 Mechero

Metodología:
En la práctica se desarrollaron diferentes métodos de siembra de microorganismos, con el
fin observar las características, el desarrollo y la distribución de los m.o. en nuevos
medios de cultivo aislándolos de cultivos impuros o manteniéndolos activos en dichos
medios. Por lo que se realizaron dos métodos de siembra de microorganismos, que se
detallaran a continuación:

1. TRANSPLANTE, RESIEMBRA O REPIQUE

 Primero se esteriliza la aguja kolle en la llama del mechero.

 Luego se coge el tubo de ensayo que contiene a la cepa, se destapa con los
dedos meñique y anular de la mano derecha y se flamea la boca del tubo.
 Después se introduce la aguja de kolle esterilizado en el tubo que contiene
la cepa y se procede a extraer el inoculo, rápidamente se coloca el tapón al
tubo de ensayo.
 Posteriormente se destapa el otro tubo de igual forma que el anterior y se
introduce el inoculo extraído al medio virgen, realizando una picadura
profunda en el agar de posición vertical; por estrías en el agar inclinado;
suspensión en el medio liquido (caldo) y por estrías y picadura profunda en
el agar semiinclinado.
 Se flamea la boca del tubo de ensayo y se esteriliza la aguja de kolle.
 Finalmente se incuba los tubos en la estufa a 37°C por 24 horas.
2. CULTIVO POR AISLAMIENTO

 Aislamiento por agotamiento de superficie con aguja de kolle

 En primer lugar, se esteriliza la aguja de kolle en la llama del mechero.
 Luego se extrae el inoculo del tubo de ensayo y se procede a abrir la placa
petri que contiene el medio de cultivo (VRBA).
 Después se traza sobre la superficie del medio de cultivo cuatro líneas
paralelas partiendo de un punto extremo de la placa, sin dañar el agar.
 Seguidamente, se esteriliza el asa de kolle y se enfría.
 Posteriormente sin tomar el inoculo, se trazan nuevamente 4 líneas
partiendo de los extremos de las otras cuatro líneas anteriores trazadas.
 Se realiza la operación anterior una vez más y una sola estría de pasar por
el centro.
 Finalmente se cierra la placa y se incuba de forma invertida a 37°C por 18 a
24 horas.

 Aislamiento por agotamiento en superficie

 Primero se coge tres placas petri que contengan el medio PCA y se anota
con un plumón las diluciones 10-1, 10-2 y 10-3.
 Luego con una pipeta estéril de 1ml se extrae 1ml de una muestra diluida de
0.1g/ml de pescado para agregarle a otro tubo de ensayo para hacerla aun
mas diluida, y con la misma pipeta se extraía 0.1ml para colocarla en su
respectiva placa petri de 10-1.
 Sucesivamente se realiza la misma operación con la dilución 10 -2, se extrae
un 1ml y se coloca en otro tubo de ensayo y 0.1ml en la placa petri de 10 -2;
así hasta la dilución de 10-3.
 Posteriormente, con la espátula drigalsky se extiende el inoculo por toda la
superficie, empezando por la mas diluida 10-3 y sin dañar el medio de
cultivo.
 Finalmente se llevas placas petri de forma invertida a incubar a 37°C por 24
horas.
  Aislamiento por derrame o vertido en placa

 Primero se coge tres placas petri estériles y con un plumón se señala las
diluciones respectivas 10-1, 10-2 y 10-3.
 Con una pipeta estéril de 1ml, se extrae 1ml de la dilución de pescado de
0.1g/ml y se coloca en placa vacía de 10 -1, así sucesivamente se agrega 1ml
en las siguientes placas vacías con sus respectivas diluciones de 10-2 y 10-3.
 Luego en las placas se colocan un medio de cultivo, se mezclan bien
mediante cinco movimientos circulares hacia la derecha y la izquierda.
 Finalmente se llevan a la estufa para su incubación a 37°C por 24 horas.

Resultados:

Una vez finalizado la práctica de laboratorio, transcurrieron aproximadamente 18 horas de

iniciado el cultivo y siembra de los microorganismos para obtener las lecturas de nuestros
medio de cultivo, que se detallaran a continuación. En el primer medio de cultivo por
resiembra o repique, se realizaron dos siembras con dos cepas diferentes, en las que se
obtuvieron diferentes resultados y lecturas.
AISLAMIENTO POR DILUCIÓN:

POR DERRAME POR EXTENSION

10 -1  Las formas de las colonias son
circulares y de tamaño grande.
 La distribución se ha dado en
toda la placa.
 El color es crema.
 El tamaño de las colonias es más
chico.
 Color blanco lechoso.
 Distribución en casi toda la placa.

10-2  La forma de la colonia es circular  Tamaño de las colonias es más

y el tamaño es más chico que por
extensión.
 La distribución es uniforme
 El color es blanco lechoso
10-3  La forma es circular y de tamaño
mayor respecto extensión
 La distribución se da en toda la
placa
 Población al 70%
 El color es crema.
grande.
 Color crema.
 Distribución en casi toda la placa.
 El tamaño de las colonias es chico.
 Distribución no uniforme.
 Color crema.

METODO DE RESIEMBRA Y REPIQUE:

AGAR RECTO (SIEMBRA POR PICADURA PROFUNDA)

 Desarrollo limitado
 No hay desarrollo a través del tubo
 No hay cambio de coloración

AGAR INCLINIDADO (SIEMBRA POR ESTRIAS)

 cantidad : escaso
 borde de crecimiento: irregular
 consistencia: viscoso
 no hay cambio de coloración.

AGAR SEMIINCLINADO (SIEMBRA POR PICADURA PROFUNDA Y POR ESTRIAS)

No hay cambio de coloración, por la parte vertical ni por la parte inclinado

CALDO NUTRITIVO

 Cantidad: moderada
 Distribución del crecimiento: velo o película
 Color lechoso
FOTOGRAFIAS POR AISLAMIENTO POR EXTENSION:

(A) (B)

(C)

* Figura A es 10-1, la figura B es 10-2 y la figura C es 10-3.

FOTOGRAFIAS POR AISLAMIENTO POR DERRAME:

(A) (B)

(C)

*Figura A es 10-1, la figura B es 10-2 y la figura C es 10-3

Discusiones:

 En el aislamiento por diluciones y derrame o vertido en placas, a la cepa que se le

agregó la dilución de mayor concentración 10-1 es la que presentaba mayor cantidad
de colonias, a diferencia de las muestras de concentraciones de 10-2 y 10-3 en donde
encontramos un menor número de colonias.

 Podemos observar que la distribución de desarrollo de lo microorganismo en el medio

de cultivo nos sirve para identificarlos.

 Se puede observar que el número de colonias obtenidas por el método aislamiento

por derramo o vertido en placa nos brinda un mayor número de colonias a
comparación del método de aislamiento por dilución.

 Para la siembra de microorganismos, es substancial tener en cuenta y entender sus

requerimientos nutricionales y entonces suministrárselos. La siembra se puede hacer
en medio líquido, sólido o semisólido.

Conclusiones:

 Se observo el crecimiento bacteriano de los distintos medios de cultivo.

 Se identifico los diferentes métodos eficaces para el aislamiento de

microorganismos.

 Se aprendió a inocular distintos medios de cultivo contenidos en tubo.

 Se diferenció las formas de las colonias al ir disminuyendo la concentración de

microorganismos.
Recomendaciones:

 Efectuar las siembras en habitaciones cerradas, evitando toda corriente de aire.

 Trabajar con llama de mechero.
 Evitar hablar, debido a que puede haber una contaminación.
 Ser ordenados en el trabajo.
 Esterilizar a la llama la aguja y el asa de kolle antes y después de realizadas la siembra.
El flameado debe hacerse hasta que todo el hilo se ponga rojo.
 Flamear la boca de los tubos antes y después de realizada la siembra.
 Marcar conveniente y adecuadamente los tubos y placa a sembrar con el nombre de la
cepa, N˚ de mesa, fecha, para una debida identificación y un correcto trabajo.

Bibliografía:

 Mendo Rubio. Medios de cultivo en microbiología (manual de laboratorio). 3°

edición. Perú. 1990.
 Guía de laboratorio de Microbiología Pesquera
 http://microrosa.wikispaces.com/file/view/Siembra+PRACT5.pdf
 http://www.monografias.com/trabajos-pdf4/cultivo-y-aislamiento-
bacterias/cultivo-y-aislamiento-bacterias.pdf