Universidad del Valle de Guatemala

Facultad de Ciencias y Humanidades

Departamento de Bioquímica y
Microbiología

Práctica en casa 3: Cálculos de una Curva de Crecimiento bacteriano

Objetivos
● Entender los cálculos detrás de una curva de crecimiento exponencial.
● Graficar una curva de crecimiento exponencial con datos reales provistos.
● Determinar la concentración bacteriana en diferentes puntos de la curva
de crecimiento.
● Entender y calcular los parámetros y constantes que definen una curva
de crecimiento exponencial.

Marco teórico

Curva de crecimiento
Los microorganismos que crecen en ambientes con condiciones químicas y físicas
limitadas siguen un patrón de crecimiento reproducible conocido como curva de
crecimiento. El crecimiento microbiano usualmente se describe como el tiempo que
necesita un microorganismo en duplicar la concentración o número de células en una
suspensión. La densidad bacteriana se conoce como el número de células por una unidad
de volumen. El crecimiento bacteriano se divide en diferentes etapas de crecimiento: fase
de lag (retraso), fase exponencial, fase estacionaria y muerte celular.

Figura 1. Etapas de una curva de crecimiento bacteriana (OpenStax Microbiology).

La Figura 1 diagrama la curva de vida normal que se aprecia en cualquier microorganismo
al cultivarlo in vitro. En cada estadío (lag, crecimiento exponencial, fase estacionaria y
declive) la célula activa distintos genes, lo que cambia la fisiología celular. El conocer los
tiempos en los que los microorganismos cambian de fase permite estudiar los cambios en
fisiología, así también, permite aislar distintos compuestos que son producidos en distintas
fases.

Densidad óptica, turbidez.

La densidad óptica (OD), también llamada turbidez, es la medida por excelencia del
crecimiento en tiempo real de células. El OD depende de un espectrofotómetro UV/Vis, y es
crítico hacer la distinción entre OD y absorbancia. El OD está midiendo la atenuación de un
haz de luz cuando éste pasa a través de un objeto; esta atenuación puede ocurrir por la
absorbancia de la luz en el objeto, y por la dispersión de la luz cuando el haz de luz llega al
objeto. Al igual que la absorbancia, el OD es una medida sin unidades (es decir, relativa).

Esta medida se usa para bacterias porque cada célula tendrá un efecto en la densidad
óptica neta del caldo. Cada vez que se duplican las células, aumenta la densidad óptica y,
por ende, se puede medir el crecimiento relativo de un cultivo celular. Normalmente, se
utiliza el OD600, es decir se mide el OD a 600nm.

Hay otros métodos de medir la densidad óptica además de un espectrofotómetro. Por

ejemplo, se pueden usar estándares MacFarland. Estos consisten en una mezcla de
cloruro de bario y ácido sulfúrico, dependiendo de la siguiente reacción:

BaCl2(𝑎𝑞) + H2SO4(𝑎𝑞) → BaSO4(𝑠) + 2HCl(𝑎𝑞)

En donde las proporciones de los reactivos varían para alterar el equilibrio de la reacción final, y
la cantidad del precipitado producido. Esto, por su parte, alterará cuán turbio se percibe el tubo
donde se llevó a cabo la reacción. Entonces, para poder utilizar un estándar MacFarland, hay
dos estatutos que se deben cumplir:

1. El estándar debe estar dentro de su vida útil.

2. Debe estar en un tubo transparente, que debe ser el mismo material que la muestra a
medir (es decir, si usar un MacFarland en tubos de vidrio, sus muestras deben estar en
tubos de vidrio).

También hay estándares MacFarland producidos con látex, esto prolonga su vida útil y reduce
los riesgos que conllevan trabajar con ácido clorhídrico, por lo que son una opción bastante
viable para usos prácticos.
Cálculos de crecimiento exponencial

Entender la relación entre el OD y el crecimiento es clave para poder cuantificar el

crecimiento. Sin embargo, como el OD solo da un crecimiento relativo al cultivo en cuestión,
no se pueden presentar los datos crudos como un resultado; la técnica debe
complementarse con una segunda técnica de conteo para saber cuántas células se tienen y
asignar una relación matemática entre el OD medido y la cantidad de células viables en el
medio.

Hay varias maneras de hacer esto, conteo de células vivas en un microscopio con una
cámara de Neubauer, o bien métodos de conteo en agar, como el método de vaciado.
Entonces, se realiza una relación matemática entre un método de conteo y las mediciones
de OD.

Las mediciones de OD se convierten en cuantificaciones celulares y se grafican a través del

tiempo. Y esto se usa para encontrar el tiempo de duplicación celular. El tiempo de
duplicación celular varía según especie, medio, y condiciones de crecimiento (agitación,
cantidad de oxígeno, temperatura, pH, concentración de CO 2, etc.).

Para obtener el tiempo de duplicación (td) de una fase exponencial, primero debe definirse
matemáticamente. Este valor representará el tiempo que toma una célula en multiplicarse.
Entonces, si n0 es el número de células en el inóculo inicial, después de una multiplicación,
el número de células es 2n0, Después de Z generaciones la ecuación es la siguiente:

𝑛 = 2 𝑍𝑛0

Esta se puede reescribir así:

log(𝑛) = log(𝑛0) + 𝑍 log(2)

Resolviendo para Z, la ecuación se vuelve:

log(𝑛) − log(𝑛0)
𝑍=
log(2)

Si Z es el total de las generaciones en un periodo dado de tiempo, entonces Z se

puede reescribir así, donde t es el periodo total del crecimiento exponencial;

𝑡𝑑
𝑍=
𝑡

Entonces el tiempo de duplicación (td) de una población bacteriana puede calcular de la

siguiente manera:

log(𝑛𝑓) − log(𝑛0)
𝑡𝑑 =
𝑡 ∗ log(2)

Donde nf es el valor final de n.

 Los valores de n se pueden calcular a partir de la linealización de los conteos celulares (descritos
arriba), obteniendo, al final, una tasa (o razón, proporción) de crecimiento para la bacteria en
cuestión, en las condiciones de crecimiento dadas, una tasa de crecimiento específica (µmax).

La tasa de crecimiento específica puede definirse como la pendiente en la curva de crecimiento

logarítmico, matemáticamente, así:

∆ ln(𝑐𝑟𝑒𝑐𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜)
𝜇𝑚𝑎𝑥 =
∆𝑡
Donde crecimiento se puede expresar como 𝑛𝑓 − 𝑛0.

Fuente: Biochemical Engineering Fundamentals by Bailey and Ollis (McGraw-Hill, 1977).

Estos cálculos se complementan a los cálculos presentados en la publicación anexa a esta

guía. La lectura de este artículo es obligatoria a esta práctica.

Metodología

Basándose en la teoría expuesta arriba, y el artículo compartido, además de fuentes

externas que encuentren de utilidad, utiliza la siguiente base de datos para contestar las
preguntas adjuntas.

Figura 1. Lecturas de OD600 para tres curvas de crecimiento, dos de 2L (A y B) y una de 72L.
Por la naturaleza del fermentador, para la fermentación de 72L solo tuvo una lectura por
cada punto, mientras que las fermentaciones de 2L, tienen dos réplicas para cada punto. Se
tomó una muestra antes de iniciar el cultivo y cada 30min después de iniciado.

Fermentación 2L Fermentación 2L Fermentación

A B 72L
Mx. 1 2 1 2
To 0.006 0.005 0.011 0.011 0.0515
T1 0.149 0.15 0.138 0.138 0.0915
T2 0.099 0.102 0.123 0.111 0.0995
T3 0.12 0.12 0.149 0.149 0.154
T4 0.148 0.149 0.18 0.179 0.1645
T5 0.192 0.192 0.204 0.204 0.192
T6 0.252 0.251 0.242 0.239 0.226
T7 0.361 0.364 0.326 0.321 0.284
T8 0.52 0.524 0.423 0.423 0.3565
T9 0.686 0.686 0.604 0.582 0.436
T10 0.846 0.846 0.77 0.752 0.5635
T11 1 0.99 0.96 1 0.634
T12 1.04 1.1 0.96 1.11 0.669
T13 1.01 1.05 1.1 1.04 0.682
T14 1.134 1.12 1.116 1.097 0.68
T15 1.081 1.1 1.242 1.14 0.67
T16 1.1 1.106 1.093 1.092 0.729
T17 0.661
 Se utilizó una cepa de E. coli estandarizada en caldo mínimo de sales fortificado con glucosa
y lactosa. Para esta cepa 1.0 de OD 600 es equivalente a 1.0g/L de biomasa bacteriana.

Conteste.
1. Los datos de esta curva son para una fermentación donde el medio tenía dos fuentes
de carbono: glucosa y lactosa. La bacteria, para procesar la lactosa, dada su estructura
debe modificar su metabolismo, separándose de la glucólisis regular. Esto produce un
segundo periodo de lag en la curva. Grafica la concentración celular (g/L) como función
en el tiempo. ¿En qué momento de las curvas ocurrió este segundo periodo de lag?
Dry weight of E. coli (g/L)

Cellular growth of E. coli over time.

0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Time elapsed (h)

g/L 2L A g/L 2L B g/L 72L

Ilustración 1. El cambio en uso de fuentes de carbono pasa alrededor de 1.5h después de iniciada la
fermentación. Se puede ver un leve pico de glucosa tras el tiempo cero. Se puede suponer que se usó muy
poca glucosa en el medio para ambas fermentaciones.

Esto sucede en el T=0.05 en donde empieza a separarse la glucólisis regular entre la glucosa y lactosa
por lo que este tiende a aumentar por lo que, en base a la gráfica, se puede deducir que se encuentra
poca glucosa en el medio de fermentaciones.

2. Grafica el logaritmo natural de la concentración celular (g/L) como función del tiempo,
durante la fermentación. Explica por qué se utiliza una función logarítmica para
visualizar estos datos y qué ventajas se tienen de usarse. ¿Cómo cambia la
visualización de los periodos lag?
Una curva logarítmica permite ver una línea casi recta en el crecimiento microbiano, esto
simplifica la forma en que se visualizan los datos, y permiten sacar más conclusiones sobre
la velocidad y producción durante un proceso de fermentación. El cambio en uso de
azúcares se vuelve mucho más obvio en esta gráfica, viéndose como un valle para las
fermentaciones de 2L y como un escalón en la fermentación de 72L. Es importante
mencionar que no incluí el tiempo 0 porque altera mucho la estructura de la gráfica, al estar
muy alejado del resto de los puntos.

3. Especifica la concentración celular en (a): el momento que se acaba la glucosa; (b) el

momento que se acaba la lactosa (el final de la fermentación).

Se pueden usar las figuras de las preguntas 1 y 2 (y los datos de OD originales) para
calcular que el punto final de la glucosa fue alrededor de 1.30h’min’ (que fue el punto donde
tuvo otra fase de ajuste para empezar a usar lactosa. El punto final de la lactosa, según las
gráficas, fue alrededor de 6h.

Conociendo esto, se puede usar la siguiente ecuación (esta igualdad está arriba, solo la
deben despejar).

0.5g
OD6001.0 = peso seco de 𝐸. 𝑐𝑜𝑙𝑖
L
En la tabla, las incertidumbres son las desviaciones estándar.
4. Calcula td para las tres fases exponenciales.
 5. Calcula la tasa específica de crecimiento (µmax) para las tres fases exponenciales.

6. ¿Cómo explica las diferencias en los resultados de las preguntas 4 y 5 en relación con
los volúmenes de la fermentación?

Aquí, los estudiantes pueden sacar varias hipótesis. Creo que las más válidas son las que ellos
hayan investigado con otras fuentes. Pero, en este caso, lo que pasó fue que el inóculo inicial fue
idéntico para ambas fermentaciones, entonces en relación al volumen de la fermentación de 72L, el
crecimiento fue mucho más lento, pues había mucho más medio que cubrir.