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Manual de Procedimientos Operativos Estándar Del Laboratorio de Micologia
Manual de Procedimientos Operativos Estándar Del Laboratorio de Micologia
MANUAL DE PROCEDIMIENTOS
Fecha: agosto 2011
GOBIERNO DE LA CIUDAD
DE BUENOS AIRES
OPERATIVOS ESTÁNDAR
Versión: 2
HOSPITALES DE LA
RED DE MICOLOGIA
MANUAL DE
PROCEDIMIENTOS
OPERATIVOS ESTÁNDAR DEL
LABORATORIO DE MICOLOGIA
RED DE MICOLOGIA
GCBA
Elaborado por: Dra. S. Cataldi, L. Guelfand, M. Perrone Aprobado por: Integrantes y Coordinador de la RM
Fecha: mayo 2008 Fecha:
Versión original
Revisado por: Dra. Alicia Arechavala, L. López Moral
Fecha: junio 2011
APOE
MANUAL DE PROCEDIMIENTOS
Fecha: agosto 2011
GOBIERNO DE LA CIUDAD
DE BUENOS AIRES
OPERATIVOS ESTÁNDAR
Versión: 2
HOSPITALES DE LA
RED DE MICOLOGIA
PRÓLOGO
CONTENIDO
9 PIEL
9 CUERO CABELLUDO
9 UÑAS
9 MUESTRAS RESPIRATORIAS
9 ORINAS
9 MUCOSAS Y SEMIMUCOSAS
9 SANGRE
9 MÉDULA ÓSEA
9 LIQUIDOS DE PUNCIÓN
9 LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO
9 INMUNODIAGNÓSTICO
9 PRUEBAS DE SENSIBILIDAD ANTIFÚNGICA
APOE- P
Fecha: agosto 2011
MANUAL DE PROCEDIMIENTOS Versión: 2
GOBIERNO DE LA CIUDAD
DE BUENOS AIRES
RED DE MICOLOGIA EXAMEN MICOLOGICO DE PIEL
Página 1 de 8
HOSPITAL.:....................
1. OBJETIVOS:
2. ALCANCE:
3. PERSONAL AFECTADO:
4. REFERENCIAS:
5. DEFINICIONES:
Etapa Analítica
AMID: Manual de Identificación
01. Dermatofitos
02. Levaduras
03. No Dermatofitos
04. Levaduras Lipofílicas
APOE: Manual de procedimiento Operativo
6. RESPONSABILIDADES:
7. DESARROLLO:
7.5.3 Resultados:
a) Examen directo:
b) Cultivos:
Si durante el lapso indicado de incubación no se obtuvo desarrollo se
descartan los cultivos y se informan “No se obtuvo desarrollo de hongos” o
“Cultivo Negativo para hongos”
APOE- P
Fecha: agosto 2011
MANUAL DE PROCEDIMIENTOS Versión: 2
GOBIERNO DE LA CIUDAD
DE BUENOS AIRES
RED DE MICOLOGIA EXAMEN MICOLOGICO DE PIEL
Página 6 de 8
HOSPITAL.:....................
c) Interpretación:
d) Tiempo de entrega :
8. FORMULARIOS Y REGISTROS:
Registro de pacientes:
General del Laboratorio (libro, informático, etc)
Libro interno de Micología
Ficha de derivación de la Red de Micología GCBA
Ficha de derivación fuera de la Red
Informes:
Protocolo resultado de Micosis Superficiales
Fotocopia de informe de Hospital emisor de resultado a través de la Red
9. DOCUMENTOS ASOCIADOS:
APOE- P
Fecha: agosto 2011
MANUAL DE PROCEDIMIENTOS Versión: 2
GOBIERNO DE LA CIUDAD
DE BUENOS AIRES
RED DE MICOLOGIA EXAMEN MICOLOGICO DE PIEL
Página 7 de 8
HOSPITAL.:....................
10. ANEXOS
Flujograma
Planillas
1. OBJETIVOS:
2. ALCANCE:
3. PERSONAL AFECTADO:
4. REFERENCIAS:
5. DEFINICIONES:
6. RESPONSABILIDADES:
7. DESARROLLO:
Gancho en L
Agujas de disección
Guantes de látex descartables
Agar Sabouraud glucosado con cloranfenicol u otro antibiótico o Agar lactrimel
con cloranfenicol
Agar Dermatophyte Test Médium o Agar Sabouraud glucosado con cloranfenicol
y cicloheximida
Agar Dixon
Agar Sabouraud glucosado con cloranfenicol y aceite de oliva (SAO)
Agar Bilis de Buey (ABB)
Agar Danker (ADK)
Precauciones de seguridad:
Consultar el Manual de Bioseguridad (MB)
Procesamiento de la muestra:
A cada muestra se le asigna un número interno correlativo, siguiendo el orden
consecutivo del libro correspondiente o sistema informático propio de cada
Laboratorio. De la muestra obtenida se destinará una parte para el examen
directo microscópico, otra para el cultivo y de ser posible reservar material para
confirmar -si hiciera falta- el resultado del examen directo.
RESULTADOS:
a) Examen directo:
Si no hubo hallazgo se informa:
b) Cultivo:
Si durante el lapso indicado de incubación no se obtuvo desarrollo se
descartan los cultivos y se informan “No se obtuvo desarrollo de
hongos” o “Cultivo negativo para hongos”
Si hubo desarrollo se debe recurrir al POE de identificación (AMID)
correspondiente a cada caso:
POE Identificación Dermatofitos (AMID01), POE Identificación
filamentosos (AMID04), POE Identificación Levaduras Lipofílicas
(AMID03)
c) Interpretación:
d) Tiempo de entrega :
8. FORMULARIOS Y REGISTROS:
Registro de pacientes:
General del Laboratorio (libro, informático, etc.)
Libro interno de Micología
Ficha de derivación de la Red de Micología GCBA
Ficha de derivación fuera de la Red
Informes:
Protocolo resultado de Micosis Superficiales
Fotocopia de informe de Hospital emisor de resultado a través de la Red
9. DOCUMENTOS ASOCIADOS:
10. ANEXOS
Flujograma
Planillas
1. OBJETIVOS:
2. ALCANCE:
3. PERSONAL AFECTADO:
4. REFERENCIAS:
5. DEFINICIONES:
Elaborado por: S.Cataldi, M.C Perrone, L.Guelfand Aprobado por: Integrantes y Coordinador de la RM
Fecha: 6 de marzo 2008 Fecha: julio de 2011
Versión Original
Revisado: ,L.L.Moral, I.Maldonado
Fecha: julio 2011
APOE- UN
Fecha: julio 2011
MANUAL DE PROCEDIMIENTOS Versión: 2
GOBIERNO DE LA CIUDAD
DE BUENOS AIRES
RED DE MICOLOGIA EXAMEN MICOLÓGICO DE UÑAS
Página 2 de 8
HOSPITAL.:....................
Etapa Analítica
AMID: Manual de Identificación
01. Dermatofitos
02. Levaduras
03. Hongos Filamentosos
APOE: Manual de procedimientos operativos Estándar
6. RESPONSABILIDADES:
7. DESARROLLO:
Portaobjetos de vidrio
Cubreobjetos de vidrio
Hojas de Bisturí descartables estériles o sindesmótomo estéril
Ansa bacteriológica
Gancho en L
Aguja de disección
Guantes de látex descartables
Agar Sabouraud glucosado con cloranfenicol
Agar lactrimel con cloranfenicol
Agar Dermatophyte Test Medium
Agar Sabouraud glucosado con cloranfenicol y actidiona
Agar Miel Sabouraud
PRECAUCIONES DE SEGURIDAD:
Consultar el Manual de Bioseguridad (MB)
PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA:
RESULTADOS:
b) Cultivo:
Interpretación:
c) Tiempo de entrega :
8. FORMULARIOS Y REGISTROS:
Registro de pacientes:
General del Laboratorio (libro, informático, etc)
Libro interno de Micología o sistema informatico
Ficha de derivación de la Red de Micología GCBA
Ficha de derivación fuera de la Red (ej: Inst. C.Malbran)
Informes:
Protocolo resultado de Micosis Superficiales
Fotocopia de informe de Hospital emisor de resultado a través de la Red
9. DOCUMENTOS ASOCIADOS:
10. ANEXOS
Flujogramas
Planillas
1. OBJETIVOS:
2. ALCANCE:
3. PERSONAL AFECTADO:
4. REFERENCIAS:
5. DEFINICIONES:
Etapa Analítica
AMID: Manual de Identificación
APOE: Manual de procedimiento Operativo
6. RESPONSABILIDADES:
7. DESARROLLO:
7.5.3 Resultados:
a) Examen microscópico:
Tinta china:
Coloración de Giemsa:
Coloración de Gram-Weigert:
Coloración de Grocott
b) Cultivo:
APOE- RE
MANUAL DE PROCEDIMIENTOS Fecha: abril 2011
Versión: 2
GOBIERNO DE LA CIUDAD
DE BUENOS AIRES EXÁMEN MICOLÓGICO DE
RED DE MICOLOGIA Página 8 de 9
MATERIALES RESPIRATORIOS
HOSPITAL.:....................
7.5.4 Interpretación:
Tiempo de entrega:
De 1 a 4 semanas
8. FORMULARIOS Y REGISTROS:
Registro de pacientes:
Informes:
9. DOCUMENTOS ASOCIADOS:
10. ANEXOS:
Flujogramas
Planillas
1. OBJETIVOS:
2. ALCANCE:
3. PERSONAL AFECTADO:
4. REFERENCIAS:
5. DEFINICIONES:
Etapa Analítica
AMID: Manual de Identificación
APOE: Manual de procedimientos operativos
Estándar
Etapa Post- Analítica
PPFI: Formularios e Informes
6. RESPONSABILIDADES:
7. DESARROLLO:
7.5.3 Resultados:
a) Examen microscópico:
b) Cultivo:
Monoespecie:
Polimicrobiano:
7.5.4 Interpretación:
Tiempo de entrega:
8. FORMULARIOS Y REGISTROS:
Registro de pacientes:
Informes:
9. DOCUMENTOS ASOCIADOS:
10. ANEXOS:
Flujograma
Planillas
MUESTRA DE ORINA
Chorro medio Sonda (OSV)
(OCM) Al acecho Punción suprapúbica Nefrosomía
EXAMEN CULTIVO
MICROSCÓPICO del (OCM :siembra 5 µl/10 µl CLDE)
sedimento (OSV, PSP:siembra 100µl CLDE – AS)
“Se observan Si No
levaduras y/o
No seudomicelios”
“Sin desarrollo”
“No se observan ó “Negativo”
elementos micóticos” Poli Mono
microbiano microbiano
Nueva muestra
por mezcla
polimicrobiana
Recuento de colonias
Desarrollo de levaduras (ID Pres)
Se solicita 2° muestra para confirmar Candida albicans
el hallazgo (menos PSP) Levadura no Calbicans
2° muestra Positiva
(con la misma identificación presuntiva)
1.000 a 10.000 UFC/ml (OCM)
100 UFC/ml (OSV)
1. OBJETIVOS:
2. ALCANCE:
3. PERSONAL AFECTADO:
4. REFERENCIAS:
Etapa Analítica
AMID: Manual de Identificación
01. Levaduras
APOE: Manual de procedimiento Operativo
6. RESPONSABILIDADES:
7. DESARROLLO:
Cubreobjetos
Hojas de bisturí descartables estériles y/o sindesmótomos estériles
Ansa bacteriológica
Gancho en L
Agujas de disección
Guantes de látex descartables
Agar Sabouraud glucosado con cloranfenicol
Agar lactrimel con cloranfenicol
Agar Miel Sabouraud
Agar cromogénico
PRECAUCIONES DE SEGURIDAD:
PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA:
10x y 40x
• Luego, dejar secar, fijar y teñir con Giemsa al 10%, 30 minutos o con Azul
de metileno al 1% durante 30 minutos y si es necesario, realizar coloración
de Gram.
b) Cultivos:
• Sembrar el hisopo en agar Sabouraud (SDA) y/o en agar cromogénico.
• Incubar a 35º - 37º C durante 10 días.
• Examinar los cultivos una ó dos veces por semana hasta completar el
período de incubación.
• Luego del cultivo primario es recomendable la siembra en un medio
cromogénico (si no se hizo como siembra primaria).El medio cromogénico
permite reconocer si en la muestra hay una o más especies.Con la
colonia/s aisladas se puede iniciar la identificación presuntiva
RESULTADOS:
b) Cultivo:
c) Interpretación:
d) Tiempo de entrega :
8. FORMULARIOS Y REGISTROS:
Registro de pacientes:
General del Laboratorio (libro, sistema informático, etc.)
Libro interno de Micología
Ficha de derivación de la Red de Micología GCBA
Ficha de derivación fuera de la Red
Informes:
Protocolo examen Micológico
Fotocopia de informe de Hospital emisor de resultado a través de la Red
9. DOCUMENTOS ASOCIADOS:
.
PAMR: etapa Pre-analítica- Manual de Medios y Reactivos
PATT: etapa Pre-analítica- Manual de Toma y Transporte de muestras
AMID: etapa Analítica -Manual de Identificación.
APOE: etapa Analítica -Manual de Procedimientos Operativos Estándar
PPFI: etapa Post-Analítica -Formularios e Informes
APOE-MUC
Fecha: agosto 2011
MANUAL DE PROCEDIMIENTOS Versión: 2
GOBIERNO DE LA CIUDAD
DE BUENOS AIRES
RED DE MICOLOGIA EXAMEN MICOLOGICO
DE MUCOSAS Y SEMIMUCOSAS Página 6 de 6
HOSPITAL.:....................
10. ANEXOS
Planillas
1. OBJETIVO:
Desarrollar el procedimiento a seguir para el cultivo de hongos presentes en
muestras de sangre.
2. ALCANCE:
Todas las muestras de sangre recolectadas de acuerdo a las indicaciones de
toma de muestra (PRTT).
3. PERSONAL AFECTADO:
Personal profesional y Técnicos del sector Microbiología y Guardia
4. REFERENCIAS:
Esencial Procedures for Clinical Microbiology. H.D. Isenberg. ASM press,
American Society for Mirobiology, Washington, D.C. 1998.
Manual de Procedimientos para Laboratorios de Micología Médica, Prof. Dr.
Ricardo Negroni, Dra. Liliana Guelfand y col. Acta Bioquímica Clínica
Latinoamericana supl. 1, editado por la Federación Bioquímica de la Pcia.
De Bs. As. Argentina, 1999.
Manual of Clinical Microbiology. Murray y col. 8th Edition ASM press U.S.A
2003.
Bianchi M, Robles AM, Vitale R, Helou S, Arechavala A, Negroni R. The
usefulness of blood culture in the diagnosis of HIV-related systemic
mycoses: evaluation of a manual lysis centrifugation method. Med Mycol
2000; 38: 77-80.
5. DEFINICIONES:
6. RESPONSABILIDADES:
Jefe de Sección Microbiología o Micología
Bioquímico a cargo del área Micología
7. DESARROLLO:
b) Cultivos:
En el método de LC, se siembra todo el sedimento en 4 tubos conteniendo
medio de Sabouraud y agar infusión de cerebro y corazón (Ver PRMR).
7.5.3 Resultados:
Si durante el lapso indicado de incubación no se obtuvo desarrollo se
descartan los cultivos y se informan “Negativo”
Las colonias que desarrollen en los medios sólidos, deben ser examinadas
al microscópico para su reconocimiento preliminar.
Si son colonias de aspecto levaduriforme y se observaron levaduras
redondas, se efectúa una preparación montada en tinta china y se
determina la producción de ureasa por un método rápido, así como la
detección de fenoloxidasa en el medio de extracto de semillas de girasol
(ver PRMR). En las colonias que dan resultados negativos se seguirá la
secuencia de identificación de levaduras (POE ID Lev).
Si se trata de colonias de aspecto micelial debe hacerse una preparación
por disociación montada en azul lactofenol o en líquido de Gueguen,
teniendo las precauciones descriptas en el Manual de bioseguridad y
continuar su tipificación de acuerdo al flujograma de hongos filamentosos
(AMID 04)
7.5.4 Interpretación
El hallazgo de un hongo tiene valor diagnóstico por si solo si se trata de un
patógeno primario.
APOE-HEMO
Fecha: agosto 2011
MANUAL DE PROCEDIMIENTOS Versión: 2
GOBIERNO DE LA CIUDAD
DE BUENOS AIRES
PARA EL EXÁMEN MICOLÓGICO
RED DE MICOLOGIA DE HEMOCULTIVO
Página 1 de 8
HOSPITAL.:....................
8. FORMULARIOS Y REGISTROS
8.2 Informes:
Protocolo resultado de Hemocultivos
Fotocopia de informe de Hospital emisor de resultado a través de la Red
9. DOCUMENTOS ASOCIADOS
PR ( Manual de Procedimiento Pre- analítico)
PRMR (Manual de Procedimiento : Medios de cultivo y Reactivos)
PAID (Manual de Procedimiento: Identificación Micológica )
MB (Manual de Procedimiento: Bioseguridad)
10. ANEXOS
Tabla de Volemia
Planillas
SET 1 SET 2
>36 10 10 10 10 10 10 2.8
1. OBJETIVO:
Desarrollar el procedimiento a seguir para el cultivo de hongos presentes en
muestras de médula ósea.
2. ALCANCE:
Todas las muestras de medula ósea recolectadas de acuerdo a las indicaciones
de toma de muestra (PRTT).
3. PERSONAL AFECTADO:
Personal profesional y Técnicos del sector Microbiología y Guardia
4. REFERENCIAS:
Esencial Procedures for Clinical Microbiology. H.D. Isenberg. ASM press,
American Society for Mirobiology, Washington, D.C. 1998.
Manual de Procedimientos para Laboratorios de Micología Médica, Prof. Dr.
Ricardo Negroni, Dra. Liliana Guelfand y col. Acta Bioquímica Clínica
Latinoamericana supl. 1, editado por la Federación Bioquímica de la Pcia.
De Bs. As. Argentina, 1999.
Manual of Clinical Microbiology. Murray y col. 8th Edition ASM press U.S.A
2003.
Bianchi M, Robles AM, Vitale R, Helou S, Arechavala A, Negroni R. The
usefulness of blood culture in the diagnosis of HIV-related systemic
mycoses: evaluation of a manual lysis centrifugation method. Med Mycol
2000; 38: 77-80.
5. DEFINICIONES:
7. DESARROLLO:
b) Cultivos:
Se siembra todo el sedimento. Para el cultivo de hongos se utiliza los
medios de agar Sabouraud y agar Infusión de cerebro y corazón (Ver
PRMR). Es aconsejable sembrar 4 a 6 tubos. También deben sembrarse en
medios para micobacterias (Lowenstein Jensen, Bactec®, Bact’Alert® u
otros) y para gérmenes intracelulares como Salmonella, Listeria, etc. (agar
sangre y agar Levine).
7.5.3 Resultados:
Si durante el lapso indicado de incubación no se obtuvo desarrollo se
descartan los cultivos y se informan “Negativo”
Las colonias que desarrollen en los medios sólidos, deben ser examinadas
al microscópico para su reconocimiento preliminar.
Si son colonias de aspecto levaduriforme y se observaron levaduras
redondas, se efectúa una preparación montada en tinta china y se
determina la producción de ureasa por un método rápido, así como la
detección de fenoloxidasa en el medio de extracto de semillas de girasol
(ver PRMR). En las colonias que dan resultados negativos se seguirá la
secuencia de identificación de levaduras (AMID Lev). Si se observan
levaduras redondas, de pared gruesa y refringente, multibrotadas, en “oreja
de Mickey” o catenuladas, se debe pensar en Paracoccidioides brasiliensis.
APOE-MO
Fecha: agosto de 2011
MANUAL DE PROCEDIMIENTOS Versión: 2
GOBIERNO DE LA CIUDAD
DE BUENOS AIRES
EXÁMEN MICOLÓGICO DE
RED DE MICOLOGIA MÉDULA ÓSEA
Página 5 de 6
HOSPITAL.:....................
7.5.4 Interpretación
El hallazgo de un hongo tiene valor diagnóstico por si solo si se trata de un
patógeno primario.
El hallazgo de un hongo saprófito ó comensal tiene valor diagnóstico
cuando se conjuga con los datos clínicos y epidemiológicos del paciente.
8. FORMULARIOS Y REGISTROS
8.2 Informes:
Protocolo resultado de Medula Ósea o Hemocultivos
Fotocopia de informe de Hospital emisor de resultado a través de la Red
9. DOCUMENTOS ASOCIADOS
PAMR: etapa Pre-analitica- Manual de Medios y Reactivos
PATT: etapa Pre-analitica- Manual de Toma y Transporte de muestras
AMID: etapa Analítica -Manual de Identificación.
APOE: etapa Analítica -Manual de Procedimientos Operativos Estándar
PPFI: etapa Post-Analítica -Formularios e Informes
MC: Manual de Calidad
MB: Manual de Bioseguridad
APOE-MO
Fecha: agosto de 2011
MANUAL DE PROCEDIMIENTOS Versión: 2
GOBIERNO DE LA CIUDAD
DE BUENOS AIRES
EXÁMEN MICOLÓGICO DE
RED DE MICOLOGIA MÉDULA ÓSEA
Página 6 de 6
HOSPITAL.:....................
10. ANEXOS
Planillas
1. OBJETIVO:
Desarrollar el procedimiento a seguir para el cultivo de hongos presentes en
muestras de líquidos de punción.
2. ALCANCE:
Todas las muestras de líquidos de punción recolectadas de acuerdo a las
indicaciones de toma de muestra (PRTT).
3. PERSONAL AFECTADO:
Personal profesional y Técnicos del sector Microbiología y Guardia
4. REFERENCIAS:
5. DEFINICIONES:
6. RESPONSABILIDADES:
Jefe de Sección Microbiología
Bioquímico a cargo del área Micología
7. DESARROLLO:
b) Cultivos:
La siembra debe realizarse por toques (por lo menos tres) en tubos de ensayo
con medio de SDA y agar BHI. Se emplean en general 6 tubos por muestra, la
mitad se incuba a 28º C y los restantes a 37º C, ambos durante 4 semanas. Los
medios de cultivo deben contener cloranfenicol-estreptomicina en la
concentración final de 100 µg/ml, en general no se utiliza la cicloheximida
porque puede impedir el desarrollo de Aspergillus, Cryptococcus,
Penicillium, etc.
Cuando se observan actinomicetos en el examen microscópico no debe
utilizarse esta técnica de cultivos pues los antibióticos antibacterianos son
letales para estos microorganismos. Si se trata de elementos ácido-resistentes,
sospechosos de ser Nocardia, se siembra la muestra en tres placas de Petri
con agar infusión de cerebro-corazón sin antibióticos, agar Thayer Martin,
Lowestein- Jensen y agar sangre. La incubación puede hacerse a 37º C o de
preferencia a 42º C. Las colonias se observan microscópicamente al estado
fresco, aquellas que acusen la presencia de bacterias filamentosas son
examinadas en extendidos teñidos por la técnica de Gram y repicadas en el
APOE- LP
Fecha: julio 2011
MANUAL DE PROCEDIMIENTOS Versión: 02
GOBIERNO DE LA CIUDAD
DE BUENOS AIRES
Página 5 de 7
RED DE MICOLOGIA EXAMEN MICOLÓGICO
HOSPITAL.:.................... LÍQUIDOS DE PUNCIÓN
c) Identificación:
Se observan los cultivos, al menos una vez por semana y se identifican por
disociación de la colonia desarrollada en solución fisiológica con o sin azul de
lactofenol y observación microscópica.
7.5.3 Resultados:
a) Examen microscópico:
Coloración de Giemsa:
b) Cultivo:
7.5.4 Interpretación
El hallazgo de un hongo tiene valor diagnóstico por si solo si se trata de un
patógeno primario.
El hallazgo de un hongo saprófito ó comensal tiene valor diagnóstico
cuando se conjuga un examen directo positivo, con los datos clínicos y
epidemiológicos del paciente.
8. FORMULARIOS Y REGISTROS
8.2 Informes:
Protocolo resultado de Líquidos de punción
Fotocopia de informe de Hospital emisor de resultado a través de la Red
APOE- LP
Fecha: julio 2011
MANUAL DE PROCEDIMIENTOS Versión: 02
GOBIERNO DE LA CIUDAD
DE BUENOS AIRES
Página 7 de 7
RED DE MICOLOGIA EXAMEN MICOLÓGICO
HOSPITAL.:.................... LÍQUIDOS DE PUNCIÓN
9. DOCUMENTOS ASOCIADOS
PR ( Manual de Procedimiento Pre- analítico)
PRMR (Manual de Procedimiento : Medios de cultivo y Reactivos)
AMID (Manual de Procedimiento: Identificación Micológica )
MB (Manual de Procedimiento: Bioseguridad)
10. ANEXOS
Planillas
1. OBJETIVO:
Desarrollar el procedimiento a seguir para el cultivo de hongos presentes en
muestras de líquido cefalorraquídeo (LCR).
2. ALCANCE:
Todas las muestras de líquido cefalorraquídeo recolectadas de acuerdo a las
indicaciones de toma de muestra (PRTT).
3. PERSONAL AFECTADO:
Personal profesional y Técnicos del sector Microbiología/ Micología y Guardia
4. REFERENCIAS:
5. DEFINICIONES:
6. RESPONSABILIDADES:
Jefe de Sección Microbiología o Micología
7. DESARROLLO:
Urea de Christensen
Fenol oxidasa
Agar tabaco
Agar cromogénico para identificación presuntiva de levaduras
Tarjetas de identificación de levaduras,tipo Vitek o Api
- Colocar una gota del sedimento con una gota de tinta china diluida
(PAMR), entre porta y cubreobjetos y observar al microscopio con objetivo
40x, en busca de levaduras capsuladas de Cryptococcus.
- Colocar una gota del sedimento entre porta y cubre y observar con
microscopio óptico de 400x o de contraste de fase, en busca de elementos
micóticos (ya sean levaduras, levaduras multibrotadas, cuerpos redondos
con endosporos o filamentos).
APOE- LCR
Fecha: agosto 2011
MANUAL DE PROCEDIMIENTOS Versión: 2
GOBIERNO DE LA CIUDAD
DE BUENOS AIRES
Página 4 de 8
RED DE MICOLOGIA EXAMEN MICOLÓGICO
HOSPITAL.:.................... LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO
b) Cultivos:
c) Identificación:
e) Estudios especiales:
7.5.3 Resultados:
a) Examen microscópico:
Directo:
Es conveniente entregar un resultado de los elementos observados lo más
rápido posible como informe preliminar.
Si no hubo hallazgo se informa: “No se observan elementos micóticos”
Si hubo hallazgo se informa según el caso:
Tinta china:
APOE- LCR
Fecha: agosto 2011
MANUAL DE PROCEDIMIENTOS Versión: 2
GOBIERNO DE LA CIUDAD
DE BUENOS AIRES
Página 6 de 8
RED DE MICOLOGIA EXAMEN MICOLÓGICO
HOSPITAL.:.................... LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO
Coloración de Giemsa:
Si no hubo hallazgo se informa: “Negativa”
Si hubo hallazgo se informa según el caso:
Se observan células levaduriformes con o sin blastoconidias y sin
seudomicelios
Se observan células levaduriformes con blastoconidias y / o
seudomicelios.
Se observan células levaduriformes esféricas de brotación múltiple o en
rueda de timón.
Se observan cuerpos esféricos con endosporos ó esférulas.
Se observan levaduras en casquete intracelulares compatibles con
Histoplasma.
b) Cultivo:
c) Pruebas inmunológicas:
A) Búsqueda de anticuerpos:
Serología para (Paracoccidioides brasiliensis, Histoplasma capsulatum,
Coccidioides posadasii) según el caso
Método:
– Inmunodifusión Cualitativa:
Resultado: Negativa o
Positiva
– Inmunodifusión cuantitativa:
Resultado: Título (la mayor dilución del suero que tenga reacción de
identidad)
APOE- LCR
Fecha: agosto 2011
MANUAL DE PROCEDIMIENTOS Versión: 2
GOBIERNO DE LA CIUDAD
DE BUENOS AIRES
Página 7 de 8
RED DE MICOLOGIA EXAMEN MICOLÓGICO
HOSPITAL.:.................... LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO
– Contrainmunoelectroforésis:
Resultado: Negativa o
Positiva (informar el número de bandas con movilidad catódica y /
o número de bandas con movilidad anódica según el caso).
B) Búsqueda de antígenos:
Detección de antígeno capsular de Cryptococcus
Método:
– Aglutinación de partículas de látex:
Material: LCR (antigenorraquia)
– Antigenorraquia cualitativa:
Resultado: Negativo ó
Positivo
– Antigenemia cualitativa:
Resultado: Negativo ó
Positivo
7.5.4 Interpretación
El hallazgo de un hongo tiene valor diagnóstico por sí solo si se trata de
un patógeno primario.
El hallazgo de un hongo saprófito ó comensal tiene valor diagnóstico
cuando se conjuga con los datos clínicos y epidemiológicos del paciente.
8. FORMULARIOS Y REGISTROS
8.2 Informes:
Protocolo resultado de Líquidos de punción
Fotocopia de informe de Hospital emisor de resultado a través de la Red
9. DOCUMENTOS ASOCIADOS
PR ( Manual de Procedimiento Pre- analítico)
PAMR (Manual de Procedimiento : Medios de cultivo y Reactivos)
MB (Manual de Procedimiento: Bioseguridad)
10. ANEXOS
Planillas
1. OBJETIVO:
Desarrollar el procedimiento a seguir para el inmunodiagnóstico de las micosis
sistémicas.
2. ALCANCE:
Todas las muestras de suero, líquido cefalorraquídeo (LCR), orina, lavado
broncoalveolar, según el tipo de prueba a realizar y recolectadas de acuerdo a las
indicaciones de toma de muestra (PRTT).
3. PERSONAL AFECTADO:
Personal profesional y técnicos del sector Microbiología, Micología
4. REFERENCIAS:
Guía de Diagnóstico de Micosis Sistémicas. “El Laboratorio y el Diagnóstico de
las Micosis Sistémicas”. Curso Teórico-Práctico. Departamento Micología.
INEI. ANLIS “Carlos G. Malbrán”. Canteros C., Davel G. y Rodero L. 2001
Manual de Procedimientos para Laboratorios de Micología Médica, Prof. Dr. R.
Negroni, Dra. L.Guelfand y col. Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana supl.
1, ed. Federación Bioquímica de la Prov. de Bs. As. Argentina, 1999.
Guía práctica de Identificación y Diagnóstico en Micología Clínica. J. Pemán,
a
E.Martín-Mazuelos, MC Calvo. Rev Iberoamericana Micol. 1 ed. Bilbao,
España. 2001
• Conti-Díaz IA, Somma-Moreira RE, Gezuele E, Giménez AC de, Pena MI,
Mackinnon JE. Immunoelectroosmophoresis-immunodiffusion in
paracoccidioidomicosis. Sabouraudia 1973, 11: 39-41.
• Kaufman L, Reiss E. Serodiagnosis of fungal diseases. En: Rose N, Conway
de Macario E, Fahey J, Friedman H, Penn G. Manual of Clinical Laboratory
Immunology, 4th. Ed. ASM, Washington, 1992, p.506-528.
• Manual of standardized serodiagnostic procedures for systemic micosis. Part I:
Immunodiffusion test. Pan American Health Organization, Washington, 1972.
• Manual of standardized serodiagnostic procedures for systemic micosis. Part II:
Complement fixation test. Pan American Health Organization, Washington,
1974.
• Ouchterlony O. Handbook of immunodiffusion and immunoelectrophoresis. Ann
Arbor Science Publisher Inc. 1970
Elaborado por: S.Cataldi, M.C Perrone, A.Arechavala Aprobado por: Integrantes y Coordinador de la RM
Fecha: julio 2011 Fecha: agosto 2011
Versión Original
Revisado por: L.Guelfand , L López Moral
Fecha: agosto 2011
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5. DEFINICIONES:
6. RESPONSABILIDADES:
Jefe de Sección Micología/Microbiología (según hospital)
Bioquímico a cargo del área Micología
7. DESARROLLO:
Portaobjetos de vidrio
Pipetas automáticas
Perforadores de metal de 1 mm y 3mm de diámetro
Pipetas serológicas de 10 ml y 5 ml graduadas 1/10 o pipetas automáticas
Cuba de electroforesis
Fuente de corriente continua
Cámara húmeda
Lente de aumento o lupa
Papel de filtro tipo Whatman Nº 1 o similar cortado en tiras y en cuadrados
Heladera
Placas de Petri de 15 mm x 100 mm ó 60 mm x 12 mm
Cortador de gel de 7 hoyos ó perforador metálico de 4 mm de diámetro
Centrífuga
Crioviales con tapa a rosca
Lector de placas de ELISA con filtros 405 y 620 nm
Placas con oquedades circulares para pruebas de aglutinación
Centrífuga para tubos Eppendorf
Luz
Agitador horizontal tipo VDRL
Baño termostatizado 56 °C y 100 °C
Jeringas y agujas intradérmicas
Reactivos:
Se indican los reactivos para cada una de las técnicas que se explican más abajo
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a. Inmunodifusión (ID)
Agar purificado (Agar Noble Difco, Agar Oxoid N°3)/ Agarosa
Cloruro de sodio
Citrato de sodio
Solución fisiológica
Fenol
Polietilenglicol 6000
Fosfato monobásico de sodio
Fosfato dibásico de sodio
Azida sódica 1:1000 o mertiolato-borato de sodio 1:10 000
Antígenos estandarizados
Agua destilada
Sueros control positivo
Azul de Coomasie
Acido acético glacial
Etanol
Mezclar bien hasta disolución total del citrato, envasar en un frasco con tapa a
rosca. Mantener a temperatura ambiente.
• Se funde el agar en baño de agua a ebullición y se deja enfriar hasta 55-60 °C.
• Se vierte un tubo de 15 ml si se realiza la ID en placa
• Para preparar portaobjetos, primero se diluye 1 ml de agar en 7 ml de agua
destilada y se cubre el portaobjetos con una capa muy fina y se deja secar
hasta formar una película seca y opaca. Luego se agregan 2,5 ml de agar sin
diluir.
• Se deja solidificar y se puede mantener a 4 °C hasta una semana. Los
portaobjetos así preparados deben conservarse en cámara húmeda.
b. Contrainmunoelectroforesis (CIE)
Pruebas inmunológicas
Son métodos de diagnóstico indirecto (independientes del cultivo) esencialmente de
dos tipos
Realización de la ID
Sacar las placas de la heladera
Cortar con la matriz de 7 hoyos o con los perforadores de metal de 4 mm de
diámetro según Esquema 1
Retirar los siete cilindros del gel con aguja o una pipeta Pasteur. No dañar las
paredes porque provoca una difusión desigual y las bandas luego son difíciles de
interpretar.
Enumerar los hoyos con marcador indeleble como indica el esquema I (anverso
del porta)
Con pipeta automática llenar los hoyos 1 y 4 con suero control positivo de
referencia
Esquema 1
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6 2
5 3
Resultados posibles:
Reacción de identidad
Reacción de no identidad
Identidad parcial
Ausencia de bandas de precipitación
identidad por la interacción del suero del paciente con el antígeno constituye una
“reacción positiva”. Los sueros que dan bandas de precipitación, pero no dan
identidad con el suero control (línea específica de referencia) deben considerarse
sospechosos y requieren nuevos estudios
Ver esquema 2
Pocillo 1: Suero control positivo
Pocillo 2: Suero de paciente
Pocillo 3: Antígeno
Esquema 2
1 1 1
2 2
2 3
3
3
Identidad Identidad parcial No Identidad
Realización de la prueba
Habitualmente se realiza sobre portaobjetos pero puede realizarse en placas de
mayor tamaño si deben analizarse varios sueros simultáneamente.
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Esquema 3:
II.B.2.2. Elisa
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A. Detección de antígenos
Criptococosis
Aspergilosis invasora
Candidiasis
Se ha cuestionado la utilidad de la detección de anticuerpos anti-Candida en
pacientes con candidiasis invasora (CI) por presentar dos limitaciones:
• la detección en pacientes que están sólo colonizados por Candida. Con
antígenos citoplasmáticos habitualmente en pacientes colonizados la ID es
negativa y hay títulos altos en endocarditis, u otras formas diseminadas.
• la respuesta de anticuerpos puede estar retrasada, reducida o no existir en
pacientes inmunodeprimidos.
Esta prueba al igual que la CIE se deben aplicar a pacientes con candidemias
persistentes, neumonitis, endocarditis, abscesos por heridas intra-abdominales,
pacientes con catéteres urinarios o intravenosos, pacientes debilitados, aquellos que
reciben tratamiento inmunosupresor antibiótico o antineoplásico prolongado, que
presentan fiebre de origen desconocido o cuya enfermedad siga un curso no habitual.
Las pruebas serológicas se usan para determinar la significación clínica de los
aislamientos de C. albicans y otras especies del género a partir de muestras no
estériles. La detección de anticuerpos precipitantes se considera presuntiva de
candidiasis sistémica, pero también puede indicar candidemia transitoria o
colonización.
La ID y la CIE tienen una sensibilidad del 90 % para casos comprobados de
candidiasis sistémica, son específicas para todo el género Candida.
Cuando se sospecha candidiasis y las reacciones de ID son negativas con el
antígeno de C. albicans la prueba debe repetirse con el antígeno de C. krusei.
La decisión de tratar al paciente no debe basarse sólo en los datos serológicos, sino
en todos los datos clínicos y de laboratorio disponibles. En las pruebas de CIE se
debe probar el suero del paciente frente a diluciones del antígeno al ½ y ¼ para
determinar la concentración óptima de éste (el exceso de antígeno o de anticuerpo
provoca ausencia completa de bandas de precipitación por el llamado fenómeno de
zona y se redisuelven por exceso de antígeno o anticuerpo). Un aumento cuádruple
del título o uno mayor de 1/8 se considera sugerente de candidiasis invasora. El
antígeno de Candida da bandas de precipitación A, B y C frente al suero control. Los
sueros de los pacientes que forman de una a tres bandas de identidad con el suero
control se consideran positivos. Debe sospecharse candidiasis sistémica cuando el
estudio de muestras seriadas de suero muestre conversión de negativo a positivo o
aumento del número de bandas de precipitación.
Descensos del número de bandas puede indicar éxito de la terapia antifúngica o
eliminación de la colonización por remoción de catéteres, sondas o válvulas
contaminadas.
Aspergilosis crónicas
Sólo se consideran positivos los sueros que dan una o más bandas de identidad con
el suero control. Cuando hay reacciones de no identidad, pero sí las bandas de
precipitación, se consideran sospechosas y se continúa investigando el caso. Una de
las causas de esto último puede ser la presencia de proteína C reactiva (PCR) en el
suero del paciente. Esta proteína aparece aumentada en enfermedades inflamatorias
y puede reaccionar con un glucopéptido presente en algunos antígenos aspergilares
y se denomina sustancia C.
Esta sustancia se disuelve en presencia de buffer citrato de sodio al 5 % en solución
salina, razón por la cual se lavan las placas con citrato y solución fisiológica (Sol.Fis)
durante 2 horas.
Las bandas que persisten luego de los lavados y no dan identidad con el suero
control, justifican nuevos estudios ya que pueden estar igualmente asociadas a
aspergilosis.
La presencia de una o más bandas puede indicar aspergiloma (bola fúngica),
aspergilosis broncopulmonar alérgica (ABPA) o aspergilosis invasora crónica.
Cuando se observan una o dos bandas puede indicar cualquier forma clínica de la
enfermedad.
Cuando aparecen tres a cuatro bandas está asociada invariablemente a bola fúngica
o aspergilosis invasora crónica.
Los sueros de los pacientes deben probarse frente a los antígenos específicos de A
.fumigatus, A. níger y A. flavus, por este método ya que no hay prácticamente
reacciones cruzadas entre estos antígenos
Las reacciones de ID son positivas en el 90 % de los casos de aspergilomas y en el
70 % de aspergilosis broncopulmonar alérgica.
Coccidioidomicosis
Los enfermos con coccidioidomicosis habitualmente forman anticuerpos
específicos que pueden ser detectados por las técnicas serológicas convencionales
tanto en suero como en LCR. Los métodos estandarizados son la inmunodifusión en
gel de agar, la fijación de complemento, también puede utilizarse la precipitación en
tubo en las formas agudas o de primoinfección, esta reacción puede ser reemplazada
por la inmunodifusión con antígeno calentado (fracción termoestable) que detecta
IgM, en tanto que la fijación de complemento puede suplirse con la inmunodifusión
CF (con antígeno no calentado) que permite detectar los anticuerpos IgG que
persisten luego de la etapa aguda. Los títulos de la fijación de complemento son
proporcionales a la gravedad de la afección pero cuando éstos son ≤ 1/8 puede
tratarse de reacciones cruzadas con antígenos de H. capsulatum o B. dermatitidis. En
las formas diseminadas los títulos serológicos suelen ser superiores a 1/32; en
general cuando el título es ≥ 1/16 se sospecha compromiso extrapulmonar. También
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Paracoccidioidomicosis
El diagnóstico serológico de esta afección se basa fundamentalmente en las pruebas
de inmunodifusión cuali o semicuantitativa y la contrainmunoelectroforesis en tanto
que la fijación de complemento es un método que puede realizarse en centros
especializados.
Los antígenos que brindan mejores resultados son los provenientes de cultivos de
fase levaduriforme, sin embargo también pueden utilizarse filtrados de la fase
micelial. Una de las principales fracciones antigénicas con alta especificidad es una
glicoproteína de 43 kDa, también puede utilizarse el exoantígeno E7. Algunos
antígenos crudos pueden dar reacciones cruzadas.
Los títulos de anticuerpos son proporcionales a la gravedad de la afección y
disminuyen a medida que el paciente mejora. Como habitualmente esta enfermedad
no se presenta en inmunodeprimidos graves (que no forman bien anticuerpos),
generalmente no se requiere la utilización de técnicas serológicas más sensibles y
solamente en laboratorios de investigación se han implementado métodos de
detección de antígenos circulantes.
En caso de compromiso del SNC se puede emplear la ID o la CIE para evidenciar
anticuerpos en el LCR.
Histoplasmosis
La prueba tamiz es la ID y se consideran pacientes con histoplasmosis activa los que
dan reacciones de identidad para una o más bandas con el suero control
(especificidad de la 100 %) (bandas M y H). La banda M se encuentra cerca del hoyo
del antígeno y la banda H cerca del hoyo del suero. Esta última es menos frecuente y
se encuentra con mayor frecuencia en pacientes con histoplasmosis activa y
progresiva. La banda M puede ser indicio de una histoplasmosis aguda o crónica, de
una infección pasada o de una prueba cutánea reciente. Si no hubo una reacción
cutánea previa y aparece la banda M se interpreta como infección precoz, ya que
este anticuerpo aparece antes que la banda H y desaparece más lentamente. El 70 %
de los pacientes con histoplasmosis comprobada tienen la banda M y sólo el 10 % las
bandas M y H.
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Exoantígenos
La producción de exoantígenos puede utilizarse para la identificación de cultivos de
fase micelial de Histoplasma, Coccidioides, Paracoccidioides que no presenten la
morfología característica e independientemente de su capacidad de esporulación.
Estos hongos tienen la capacidad de producir antígenos libres de células
(exoantígenos). Estos antígenos se detectan por ID utilizando la misma metodología
que para la detección de anticuerpos. Se obtienen mediante la extracción con una
solución acuosa (1:5000) de mertiolato de sodio que se añade sobre la superficie de
un cultivo de 8-10 días y se deja 24-48 h a 25 °C. Se concentra el extracto por
ultrafiltración y luego se prueba la presencia de bandas de identidad con un antisuero
específico.
En la actualidad muchos exoantígenos se utilizan para detectar anticuerpos
específicos.
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1.0) OBJETIVO
2.0) ALCANCE
4.0) REFERENCIAS
5.0) DEFINICIONES
6.0) RESPONSABILIDADES
7.0) DESARROLLO
7.1) FUNDAMENTO
7.2) REACTIVOS:
- 25 fichas de resultados
- 1 ficha técnica
7.3) MUESTRA:
76.4) TÉCNICA
Siempre debe realizarse un control del inóculo utilizado sembrando una placa
de agar cromogénico con 10 μl del pocillo control (11) y a las 24 h se cuentan
las colonias, esto permite controlar pureza y concentración del inóculo.
Incubación: las placas se incuban a 35 °C durante 48 h para Candida y 72 h
para Cryptococcus.
Lectura: la lectura visual se realiza con la ayuda de un espejo.
Para los azoles y 5-FC la CIM es la concentración más baja de droga que
produce una reducción aparente del crecimiento de la levadura ≥ 50%
comparada con el control de crecimiento a las 48 h de incubación.
Para las equinocandinas: la lectura es igual que para azoles pero se realiza a
las 24 h.
La CIM de AMB es la concentración más baja de antifúngico que inhibe el
crecimiento de la levadura totalmente (100% de inhibición).
Cepas control de calidad: C. parapsilosis ATCC 22019 y C. krusei ATCC
6258.
Puntos de corte: Se dispone de puntos de corte para: FCZ, VCZ, ITZ,
equinocandinas y 5-FC.
Intervalos de las CIM (μg/ml)
Antifúngico
Sensible S-DD Intermedio Resistente
Fluconazol ≤8 16 - 32 ≥ 64
Itraconazol ≤ 0,12 0,25 - 0,5 ≥1
Voriconazol ≤1 2 ≥4
5-fluorocitosina ≤4 8 – 16 ≥ 32
Caspofungina ≤2 >2
Micafungina ≤2 >2
Anidulafungina ≤2 >2
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Fecha: julio 2011
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ANTIFÚNGICOS Página 10 de 20
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*No hay puntos de corte disponibles, estos son valores sugeridos según las
CIM poblacional de los aislamientos.
Lectura:
Se utiliza un calibre o una regla para medir el diámetro del halo externo de la
zona de inhibición.
Importante: realizar la lectura de las colonias con desarrollo confluente. Dentro
de la zona de inhibición pueden crecer colonias que muestren un diámetro
menor al de las colonias externas. Estas colonias no deben ser consideradas
mutantes resistentes.
μg/ml; FCZ, S ≤ 8 μg/ml, SDD 16-32 μg/ml y R ≥64 μg/ml e ITZ, S ≤0.125μg/ml,
SDD 0.25-0.50 μg/ml y R ≥1 μg/ml, VCZ S ≤ 1μg/ml, SDD 2 μg/ml y R ≥ a
4μg/ml.
*No hay disponibles puntos de cortes, estos son valores sugeridos según las
CIM poblacional de los aislamientos.
Intervalos de las CIM (μg/ml)
Antifúngico
Sensible S-DD Intermedio Resistente
Fluconazol ≤8 16 - 32 ≥ 64
Itraconazol ≤ 0,125 0,25 - 0,5 ≥1
Voriconazol ≤1 2 ≥4
5-fluorocitosina ≤4 8 - 16 ≥ 32
Caspofungina ≤2
Anidulafungina ≤2 >2
Anfotericina B ≤ 1
ATB F3:
CIM µg/ml, 48 hs
Antifúngico
C. parapsilosis C. krusei
Anfotericina B 0.25-1 0.5-2
Anidulafungina 0.5-4 0.016-0.125
Caspofungina 0.25-2 0.25-1
Fluconazol 1-4(8)* -
5-fluorocitocina 0.064-0.25 -
Itraconazol 0.064-0.25 0.25-1
Ketoconazol 0.032-0.125 0.25-1
Posaconazol 0.032-0.125 0.125-0.5
Voriconazol 0.016-0.064 0.25-1
6.10) INTERFERENCIAS
Existen aislamientos poco habituales que podrían no ser evaluados por estos
métodos y deben ser enviados a centros de referencia.
6.11) INTERPRETACION
6.12) INFORME
Para ATB F 3 se informará el valor de la CIM en μg/ml, para AMB, FCZ, ITZ y
VCZ y la categoría de S, SDD o R. Para 5FC si es S o R.
Para las tiras de plástico (E-test) se informará el valor de la CIM en μg/ml, y la
categoría de S, SDD o R. Y de la misma forma para las tarjetas Vitek 2.
7.0) REGISTROS
Cuaderno de Micología.
8.0) ANEXOS
No posee.