Universidad Nacional de MSc.

DANIEL LUQUE ZURITA

San Agustín de Arequipa

Facultad de Ciencias Biológicas y

Agropecuarias
Escuela Profesional y Académica de
Biologia

Guía de Prácticas:
HEMATOLOGIA

Profesora:
 Diana Lucia Díaz Montoya Arequipa – Perú
Alumna:
 Shirley Huancahuire Mamani
Turno: 2021
 Miércoles 4:30 – 7:50 pm
 PRÁCTICA N° 5

RETICULOCITOS, CITOMETRIA HEMATICA

AUTOMATIZADA Y SU INTERPRETACION EN
DIVERSAS PATOLOGIAS.

COMPETENCIA: El alumno realiza el conteo de Reticulocitos y su aplicación junto con la

Citometría hemática en el diagnóstico de los diferentes tipos de anemias.

1. INTRODUCCION:

Mientras estaba bajo contrato con la Armada de los Estados Unidos en la década de 1940,
Wallace H. Coulter desarrollado una tecnología de contar y de tamaño de partículas. La
tecnología fue desarrollada principalmente para contar las células de la sangre rápidamente.
En la actualidad más del 98% de los contadores automáticos de células incorporar el principio
de Coulter. En los últimos cincuenta años, la tecnología también ha sido utilizada para
caracterizar a miles de diferentes ramas industriales, así como materiales de partículas.
Cualquier instrumento que utiliza este principio se denomina un Coulter. Las drogas,
pigmentos, excipientes, toners, alimentos, productos abrasivos, explosivos, arcilla, minerales,
materiales de construcción, materiales de recubrimiento, metales, materiales de filtración, y
muchos otros han sido analizados por el principio de Coulter. Se puede usar para medir
cualquier material en partículas, que pueden ser suspendidos en un electrólito. Partículas tan
pequeñas como 0,4 micras y tan grandes como 1200 micra de diámetro se puede medir de
forma rutinaria. Con los años, contador Coulter se ha convertido en sinónimo de tecnología de
la caracterización de partículas en muchos campos. Más de 8000 referencias a los usos de esta
tecnología han sido documentados.
En un contador Coulter, un tubo con una pequeña abertura en la pared se encuentra inmersa
en un vaso que contiene partículas en suspensión en un electrolito de baja concentración. Dos
electrodos, uno en el interior del tubo de abertura y otro fuera del tubo de abertura, pero en el
interior del vaso, se colocan y una ruta de acceso actual es proporcionada por el electrolito
cuando un campo eléctrico se aplica (Figura 1). La impedancia de entre los electrodos se
mide. La apertura crea lo que se denomina una "zona de detección." Partículas en baja
concentración, suspendidos en el electrolito, se puede contar al pasar a través de la apertura.
Cuando una partícula pasa a través de la abertura, un volumen equivalente de electrolitos para
volumen sumergido de la partícula se desplaza desde la zona de detección. Esto causa un
cambio a corto plazo en la impedancia a través de la abertura. Este cambio puede ser medido
como un pulso de tensión o de un pulso de corriente. La altura del pulso es proporcional al
volumen de lo sentido de partículas. Si se supone que la densidad de partículas constante, la
altura del pulso es también proporcional a la masa de las partículas. Esta tecnología también
se llama así la tecnología de apertura.
Uso de recuento y la altura del pulso analizador de circuitos, el número de partículas y el
volumen de cada partícula que pasa por la zona de detección puede ser medida. Si el volumen
de líquido que pasa a través de la abertura puede ser controlado con precisión y medida, la
concentración de la muestra puede ser determinado. En los modernos contadores Coulter,
como MS Beckman Coulter 3 instrumentos, se digitalizan los pulsos y se guarda con varios
parámetros clave que describen cada pulso como la altura del pulso, ancho de pulso, marca de
tiempo, el área de pulso, etc Estos parámetros permitirán un mejor instrumento para
discriminar entre el ruido y las legumbres real y entre los pulsos normales y legumbres
distorsionado debido a diversas razones, cuando las partículas de tránsito a través de la
abertura. Los pulsos ahorrados pueden ser utilizado también para controlar los cambios de la
muestra durante el período de tiempo de medición, si los pulsos están dispuestos en secuencia
de tiempo. En la práctica, el volumen de las partículas se representa a menudo en términos de
diámetro esférico equivalente. El volumen medido de partículas (o tamaño) puede ser
entonces utilizada para obtener una distribución de tamaño de partícula.
 Figura 1. Esquema de un contador Coulter.

Una medición típica utilizando Coulter Counter toma menos de un minuto como el recuento y
tamaño de las tasas de hasta 10.000 partículas por segundo son posibles. La precisión de las
mediciones de tamaño puede ser superior al 1%. Tamaño de la abertura normalmente oscila
entre 15 micras hasta 2000 micras. Cada abertura puede ser utilizado para medir las partículas
dentro de un rango de tamaño de 2% a 60% de su diámetro nominal. Por lo tanto, la gama
global de tamaño de partículas de 0.4 micras hasta 1200 micras es posible. La capacidad de la
tecnología para analizar las partículas se limita a las partículas que pueden estar
convenientemente suspendidas en una solución electrolítica. El límite superior, por tanto,
puede ser de 500 micras de arena, pero sólo 75 micras de partículas de carburo de tungsteno.
El límite inferior de tamaño está limitado por el ruido electrónico generado principalmente en
la apertura en sí. La selección del tamaño de la abertura más adecuado depende de las
partículas a medir. Si la muestra a analizar se compone de partículas en gran medida dentro de
un rango de diámetro de 30:1 tamaño, la apertura más adecuado puede ser elegido. Por
ejemplo, una apertura de 30 micras puede medir las partículas de alrededor de 0,6 a 18 micras
de diámetro. A 140 micras de apertura puede medir las partículas de alrededor de 2,8 a 84
micras. Si las partículas que se medirán cubrir una gama más amplia de una sola abertura
pueden medir, dos o más aberturas tienen que ser utilizados y los resultados pueden ser
superpuestos para ofrecer un completo servicio de distribución de tamaño de partícula.
Los sistemas COULTER poseen 2 baños, uno de eritrocitos y otro de leucocitos, en el baño de
eritrocitos se encuentra una apertura de 50µm y en el de los leucocitos otra de 100µmEn cada
apertura se realizan 3 recuentos de 4 segundos y se obtiene el promedio (en el caso de STKS y
GEN-S, estos poseen 3 aperturas de eritrocitos y 3 de leucocitos por lo que la lectura sólo dura
4 segundos y se obtiene el promedio de las 3 aperturas)
En el baño de los eritrocitos el sistema identifica los eritrocitos como aquellas partículas que
poseen un volumen igual o mayor que 36 fL(femtolitro), en este mismo baño se realiza el
recuento de plaquetas las cuales tienen un volumen entre 2 y 20 fL, en los contadores
COULTER si existe un recuento pequeño de plaquetas, el tiempo de recuento se extiende por
4 segundos más, a fin de tener un mayor valor estadístico.
En el baño de leucocitos posterior a la dilución con diluyente isotónico, se aplica agente
lisante, el cual destruye la membrana citoplasmática de eritrocitos y leucocitos,
permaneciendo los núcleos intactos. Es así que las partículas que midan 35 fL o más son
contadas como leucocitos. Hay que hacer notar que los núcleos de eritroblastos si existiesen
también son contados, por lo que si el instrumento señala sospecha de su presencia se deben
buscar en el frotis y de tener un número considerable, se debe corregir el recuento de
leucocitos.
Posterior al recuento de leucocitos y utilizando la reacción química del lisante con la
hemoglobina libre en la mezcla, se mide un complejo químico estable a 525 nm, el cual,
dependiendo del instrumento, puede ser realizado en el mismo baño o en una cubeta de flujo
especialmente diseñada. Consecuentemente los parámetros medidos son: Eritrocitos (RBC),
Leucocitos (WBC), Plaquetas (PLT) y Hemoglobina (Hgb). Los parámetros derivados de las
mediciones de volumen: Volumen corpuscular medio (VCM), Ancho de distribución
eritrocitaria (ADE) y Volumen plaquetario medio (VPM).
Los parámetros calculados son: Hematocrito (Hct), Hemoglobina corpuscular media (HCM) y
concentración corpuscular media (CHCM

1.2. CUENTA DE RETICULOCITOS.

Los eritrocitos anucleados que contienen organelos y un sistema ribosómico extenso para
sintetizar hemoglobina, se conocen como reticulocitos, los cuales son retenidos de dos a tres
días en médula ósea y después permanecen otro día en la circulación periférica, indicando la
actividad eficaz de la médula ósea para producir eritrocitos.

MATERIAL.

 2 Tubos de ensayo por equipo

 1 Baño maría por equipo
  1 Termómetro por equipo
 Aceite de inmersión.
 1 Microscopio por equipo

REACTIVOS:

 Azul cresil brillante

PROCEDIMIENTO:

1. En el tubo de ensaye colocar 2 gotas de azul de cresilo brillante con dos gotas de
sangre homogenizada y mezclar nuevamente.
2. Incubar la mezcla por 10 min. en el baño María a 37 º C
3. Transcurrido el tiempo preparar una extensión por el método transversal de la
siguiente manera:
 Coloque una gota de la siguiente preparación de 2 a 3 mm de diámetro en el
borde de un portaobjetos.
 Coloque el otro portaobjetos sobre la gota en un ángulo de 45ª y deje que se
distribuya por capilaridad.
 Extienda la sangre en forma transversal hacia el otro extremo de portaobjetos.
 Unos ambos portaobjetos para que la sangre se extienda homogéneamente a lo
ancho de la superficie.
 Deslice el portaobjetos de arriba para retirar el exceso de sangre quedando una
película delgada.
 Secar y observar a inmersión.
4. Los Reticulocitos se observarán de color azul, con material reticular citoplasmático de
color azul intenso.
5. Contar 1000 eritrocitos y los reticulocitos que se encuentran entre ellos, o bien, contar
el número de reticulocitos que hay en 10 campos

CALCULOS.
PRECAUCIONES:

 Agregar la cantidad de sangre y colorante indicadas para evitar dificultad al examinar

las preparaciones.
 Asegurarse que las células en el frotis se encuentran distribuidas homogéneamente
para evitar que los campos tengan un número confuso de eritrocitos.
 No se debe de contar dos veces la misma célula.
 La sangre a utilizar debe mezclarse perfectamente para no alterar el resultado.

VENTAJAS:

 Es un método económico.
 La preparación del complejo RNA-colorante no requiere temperatura estrictamente
controlada.
 El método utilizado para la realización del frotis asegura una distribución más
uniforme que cualquier otro método.

DESVENTAJAS:

 Debido a número de eritrocitos que se deben de contar el error es relativamente

grande.
 Si no se eligen adecuadamente los campos se pueden contar un mayor o menor
número de reticulocitos.

RESULTADOS

Se realizó como ejemplo el cálculo para hallar el número absoluto de reticulocitos.

% de reticulocitos
nº absoluto de retic. = ∗ 𝑛𝑢𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑒𝑟𝑖𝑡𝑟𝑜𝑐𝑖𝑡𝑜𝑠/𝑚𝑚3
100

4 ∗ 106 𝑒/𝜇𝑙 -------- 100%

1%
nº absoluto de retic. = ∗ 4 ∗ 106 𝑒/𝜇𝑙
100 X -------- 1%
O
nº absoluto de retic. = 4 ∗ 104 𝑟/𝜇𝑙
𝑋 = 4 ∗ 104 𝑟/𝜇𝑙

Valores normales: van de 0.5 a 2% de reticulocitos como máximo

Al ser 1% este está dentro del rango normal pero que pasa si este valor seria mayor a lo
establecido se estaría hablando de una anemia o una baja de glóbulos rojos conocida como
eritopenia; la disminución del número de glóbulos rojos ocasiona que el porcentaje de
reticulocitos aumente, gracias a la medula ósea que envía a la sangre con mayor velocidad los
reticulocitos es decir si antes los retenía por 3 dias ahora será solo por 1.

CUESTIONARIO

1. Con los siguientes datos, calcule VCM, HCM, CHCM. Hb: 16.3, Hto: 50.2,
Hematíes: 5 460,000

𝐻𝑡 % 50.2
VCM (fl) = ∗ 10 VCM = ∗ 10
GR millones 5.46
VCM = 91.94 fl
Valores normales: de 80 a 100 fentolitros

El volumen corpuscular medio del paciente se encuentra en niveles normales, es decir,

que sus eritrocitos tienen un tamaño normal, y se les denomina normocitos. Si el VCM
se encuentra por debajo de los niveles normales los eritrocitos se denominan
16.3
microcitos, por el contrario, si los valores están por HCM
encima
= de lo normal
∗ 10 se denominan
5.46
macrocitos.
HCM = 29.85 pg
𝐻𝑏 𝑔/𝑑𝑙
HCM (pg) = ∗ 10
GR millones

Valores normales: de 27 a 31 picogramos/célula

La hemoglobina corpuscular media del paciente está entre los valores normales, es
decir, la cantidad media de hemoglobina presente en los glóbulos rojos del paciente es
la ideal.
Si la HCM se encuentra por debajo de los normal se dice que existe hipocromía, por el
contrario, valores por encima de lo normal se denomina hipercromía.

𝐻𝑏 𝑔/𝑑𝑙 16.3
CHCM (g/dl) = ∗ 100 CHCM = ∗ 100
Ht % 50.2
CHCM = 32.47 g/dl
Valores normales: de 30 a 34 gramos/decilitro
 La concentración de hemoglobina corpuscular media de paciente se encuentra entre los
valores normales, es decir, que sus eritrocitos tienen un contenido normal de
hemoglobina, y se les denomina normocrómicos. Si el contenido de hemoglobina es
bajo hipocrómicos y cuando es alto hipercrómicos.

2. Con los datos de volumen corpuscular de tres hematíes, calcule su IDH. X1= 93
Fl, X2= 92 fL, X3=90fL

𝐷𝑆 − 𝐺𝑅
IDH = ∗ 100
VCM

𝐻𝑡 % 93 + 92 + 90
VCM (fl) = VCM =
GR millones 3
VCM = 91.67 fl

2
√Σ(𝑋 − 𝑚𝑥)
2 2 2
√(93 − 91.67) +(92 − 91.67) + (90 − 91.67)
𝑛−1 3−1
IDH = ∗ 100 IDH = ∗ 100
𝑉𝐶𝑀 91.67
IDH = 1.67

3. Que indica un valor menor de 80 fL de VCM

Niveles ligeramente bajos de 80 fl en adultos indican que los glóbulos rojos presentes
en la sangre son pequeños, siendo denominados microcíticos. Estos niveles suelen ser
característicos de anemias ferropénicas, n la talasemia menor, esferocitosis congénita,
uremia, infecciones crónicas y principalmente en las anemias por deficiencia de hierro,
que también se conocen como anemias microcíticas hipocrómicas.

4. Que se necesita para calcular la CHCM

Para poder calcular la relación hemoglobina (Hb) – hematocrito (Hto), que consiste en
calcular el valor de la hemoglobina al dividir el Hto entre un factor, usualmente entre
3,0 a 3,3, y la relación inversa de obtener el Hto a partir de multiplicar la
concentración de Hb por dicho factor.

5. Que índice eritrocitario detecta la existencia de anisocitosis.

Para medir la anisocitosis se usa el índice de Amplitud de Distribución Eritrocitaria,

también llamada Ancho de Distribución de Eritrocitos (A.D.E.), Intervalo de
 Distribución de Eritrocitos (I.D.E.) o RDW, es un parámetro que aparece en los
hemogramas y se encarga de medir el volumen y el tamaño de los glóbulos rojos.

6. Con los siguientes datos de HCM de 8 hematíes, calcule su ADH. 20 g/dl, 21 g/dl,
21 g/dl, 20 g/dl, 12 g/dl, 12 g/dl, 11 g/dl, 13g/dl.

√Σ(𝑋 − 𝑚𝑥)2
SD =
𝑛−1

√(20 − 16)2 + (21 − 16)2 + (21 − 16)2 + (20 − 16)2 + (12 − 16)2 + (12 − 16)2 + (11 − 16)2 + (13 − 16)2
SD =
8−1

SD = 4.59 g/dl

Valores normales: entre 2.2 a 3.2 g/dl

El aumento del ADH expresa la existencia de hematíes hipercrómicos esto generalmente

ocurre cuando no hay suficiente cantidad del pigmento que transporta el oxígeno
(hemoglobina) en dichos glóbulos rojos.

BIBLIOGRAFÍA

1. Bick L. Roger, M.D. (1993) Hematology Clinical and Laboratory Practice Tomo I y II
Editorial Mosby USA.
2. Carrillo, F.A. (1992), Hematología Casos Clínicos 2ª. Edición Editorial Interamericana
MckGraw Hill. México.
3. Rapaport I. Samuel (1988) Introducción a la Hematología, 2ª. Edición. México Salvat
Editores.
4. Hoffbrand A.V. Pettit J.E. (1987), Hematología Básica I, Editorial Limusa México.
5. Mckenzie. S.B. (1991) Hematología Clínica. Editorial Manual Moderno México.
6. Kaplan. L.A. Pesce. A.J. (1986). Técnicas de Laboratorio, Fisiopatología, Métodos de
Análisis. Editorial Panamericana España.
7. Sans J. Sabafen J. (1988): Hematología Clínica 2ª. Edición. Eitorial Doyma S.A. España.
8. Shirlyn B. MacKenzie: Hematologìa Clìnica. 2ª Ed. Manual Moderno. Mexico 2003
9. Ruiz A. G.J. Fundamentos de Hematologìa: 3º Ediciòn. Edit. Panamericana. México
2003.
10. Rodak B.F. Hematología 2ª Edición, Edit. Panamericana. México 2005.