Detección de SARS-CoV-2 basada en CRISPR y postamplificación acoplada con un

biosensor portátil de ondas evanescentes

Resumen
La continua pandemia del síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-
2), que causa la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19), se ha extendido a nivel
mundial y su diagnóstico confiable es una de las principales prioridades para proteger la
salud pública. Aquí se informa una plataforma de biosensores de fluorescencia de onda
evanescente basada en CRISPR rápida (<1 h), fácil de implementar y precisa para la
detección de SARS-CoV-2. El efecto colateral de Cas13a se combina con una reacción en
cadena de hibridación (HCR) autónoma universal sin enzimas mediante el diseño de un
indicador de horquilla de escisión, que se escinde al reconocer el objetivo y, por lo tanto,
libera la secuencia iniciadora para activar los circuitos HCR descendentes. La detección de
conjuntos de HCR se logra adsorbiendo primero a la fibra óptica modificada con
destiobiotina, seguido de la emisión de fluorescencia inducida por un campo evanescente.
Tres crRNA de Cas13a que se dirigen a los genes de S, N y Orf1ab del SARS-CoV-2 están
programados para dirigirse específicamente al SARS-CoV-2 o detectar en general cepas de
coronavirus relacionadas, como MERS-CoV y SARS-CoV. La plataforma de biosensores
basada en Cas13a acoplada con amplificación HCR es capaz de detectar rápidamente el
SARS-CoV-2 con sensibilidad attomolar. Este método se valida aún más mediante la
adición de ARN objetivo de SARS-CoV-2 en hisopos orofaríngeos negativos. La buena
capacidad de discriminación de esta técnica demuestra su potencial prometedor para el
diagnóstico de COVID-19 en el punto de atención.
Introducción
La infección por coronavirus 2 (SARS-CoV-2) del síndrome respiratorio agudo severo, que
causa la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19), se ha extendido a nivel mundial
desde su descubrimiento en la ciudad de Wuhan, China, en diciembre de 2019 (Zhou et al.,
2020). Hasta el 3 de enero de 2021, la enfermedad se ha propagado a al menos 219 países /
área, ha infectado al menos a 83 millones de personas y ha provocado al menos 1,8
millones de muertes en todo el mundo. La aparente facilidad con que se propaga de persona
a persona presenta una amenaza inminente para la salud pública mundial (Li et al., 2020;
Wrapp et al., 2020). La detección simple, de bajo costo y, sin embargo, precisa, sensible y
cuantitativa de este virus ha sido una de las principales prioridades para facilitar las
intervenciones de salud pública. El virus SRAS-CoV-2 está envuelto y generalmente es
esférico con un diámetro que varía de 60 nm a 140 nm, y su morfología similar a una
corona solar es consistente con la familia Coronaviridae (Zhu et al., 2020). El SARS-CoV-2
tiene un genoma de ARN monocatenario de sentido positivo que tiene aproximadamente
30.000 nucleótidos de longitud. Su primer genoma completo se descubrió mediante el uso
de una combinación de secuenciación de Sanger, Illumina y nanoporos, lo que proporciona
datos importantes para que los investigadores diseñen cebadores y sondeen secuencias para
otras pruebas de ácidos nucleicos (CDC, 2020; Tan et al., 2020). Además, las
comparaciones de genoma completo revelaron que el SARS-CoV-2 tiene una secuencia
genética similar al linaje del coronavirus beta B, mostrando ~ 80%, ~ 50% y ~ 96% de
similitud con el genoma del virus del síndrome respiratorio agudo severo. (SARS-CoV),
virus del síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS-CoV) y coronavirus de
murciélago RaTG13, respectivamente (Lu et al., 2020; Zhou et al., 2020). Aunque la
secuenciación de alto rendimiento en el diagnóstico e identificación de patógenos
respiratorios, especialmente para pacientes con infecciones de origen desconocido, se está
volviendo cada vez más popular, no se utiliza de forma rutinaria para detectar cepas
específicas de virus debido a las desventajas en simplicidad, costo y tiempo. -eficacia
(Zhang et al., 2020b). La reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcripción
inversa (RT-qPCR) es el método principal actual para detectar SRAS-CoV-2 debido a su
sensibilidad, especificidad y facilidad de cuantificación (Corman et al., 2020; Shen et al.,
2020b). Se han diseñado varios kits de RT-qPCR para detectar el SARS-CoV-2
genéticamente desde que la secuencia génica del SARS-CoV-2 se dio a conocer
públicamente el 12 de enero de 2020 (OMS, 2020). Sin embargo, el requisito del
termociclado limita sus aplicaciones no de laboratorio y de bajo costo con recursos
limitados (Zhou et al., 2018).
Los sistemas inmunitarios adaptativos microbianos utilizan CRISPR (repeticiones
palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas) y proteínas asociadas a
CRISPR (Cas) para la escisión de ácidos nucleicos guiada por ARN (Horvath y Barrangou,
2010; Li et al., 2019). Las endonucleasas programables contenidas pueden adaptarse para
apuntar a cualquier secuencia (Koonin et al., 2017). Si bien algunas enzimas Cas se dirigen
al ADN (Chen et al., 2018; Li et al. 2018a, 2018b; Zhou et al., 2018), el efector CRISPR
dirigido por ARN dirigido por ARN Cas13a (anteriormente conocido como C2c2) se puede
reprogramar con CRISPR RNA (crRNA) para escindir un objetivo de ARN específico
(Abudayyeh et al., 2016; Shmakov et al., 2017). Cas13a exhibe tanto la escisión del
objetivo como un "efecto colateral" de la actividad promiscua de RNasa tras el
reconocimiento del objetivo (Abudayyeh et al., 2016; East-Seletsky et al., 2016;
Gootenberg et al., 2017; Shmakov et al., 2015). Revelado por la difracción de cristales de
rayos X, Cas13a y crRNA experimentan un cambio conformacional significativo en la
unión de diana altamente específica de secuencia y, por lo tanto, activan Cas13a para
escindir cualquier molécula de ARN monocatenario de una manera no específica (East
Seletsky et al., 2016 ; Liu et al., 2017). Sin embargo, la actividad colateral de Cas13a
exhibe las preferencias de base y la escisión podría mejorarse con la optimización del
diseño de búfer y crRNA (Gootenberg et al., 2018; Wu et al., 2021). Una plataforma,
denominada desbloqueo de reportero enzimático específico de alta sensibilidad
(SHERLOCK), permite la detección multiplexada, portátil y ultrasensible de ARN o ADN
viral basada en la escisión colateral mediada por Cas13a de un reportero de ácido nucleico
diseñado racionalmente (East-Seletsky et al., 2016; Gootenberg et al., 2017). La técnica de
diagnóstico basada en CRISPR ha sido diseñada para detectar SARS-CoV-2 a fin de
acelerar la respuesta al brote de virus (Arizti-Sanz et al., 2020; Guo et al., 2020; Patchsung
et al., 2020). Para lograr una alta sensibilidad y una aplicación en el campo, se exploraron
diferentes pasos de amplificación isotérmica basados en enzimas para amplificar los ácidos
nucleicos diana, seguidos de la detección de Cas13a (Gootenberg et al.2017, 2018; Shen et
al., 2020a). Estas estrategias de amplificación emplean costosas enzimas, tediosa
transcripción inversa, y el diseño adecuado de cebadores específicos de especies es
complicado, ya que sufre de compensaciones entre sensibilidad, especificidad, simplicidad,
costo y velocidad (Corman et al., 2020; Huang et al. ., 2020a; Park et al., 2020; Vogels et
al., 2020).
Debido a la alta capacidad de programación y modularidad, los circuitos autónomos de
ácidos nucleicos sin enzimas están atrayendo un interés cada vez mayor como
amplificadores de señal en el desarrollo de técnicas de biodetección ultrasensibles. Los
propios ácidos nucleicos podrían diseñarse como módulos independientes que lleven a cabo
múltiples funciones (Memon et al., 2020; Seelig et al., 2006). En los circuitos de ácidos
nucleicos sin enzimas, los ácidos nucleicos actúan como un conjunto de "hardware" que
ejecuta un algoritmo que obedece las reglas de pares de bases de Watson-Crick y funcionan
como "circuitos" en la computación basada en carbono / silicio. Los circuitos de ácido
nucleico con diferentes funciones se pueden modularizar y conectar en cascada fácilmente
debido a su alta controlabilidad y programabilidad, lo cual es especialmente importante
para el diseño preciso asistido in silico de sistemas complicados a gran escala (Chirieleison
et al., 2013; Wang et al. , 2014). Una de las funciones más atractivas de los circuitos de
ácidos nucleicos sin enzimas es la amplificación de señales. Basado en el mecanismo
elemental de desplazamiento de hebra mediado por el dedo del pie (TSD), varios circuitos
amplificadores de ácido nucleico han logrado sensibilidades impresionantes en aplicaciones
de biosensores (Jung y Ellington, 2014; Zhuang et al., 2013). Estos esquemas de
amplificación sin enzimas pueden operar en condiciones que de otro modo podrían inhibir
las proteínas (Li et al., 2011). En general, la ejecución de circuitos de ácido nucleico
requiere un oligonucleótido como entrada para desencadenar reacciones de desplazamiento
de la hebra mediadas por los dedos del pie aguas abajo, lo que ha allanado el camino para la
detección ultrasensible de ácidos nucleicos, ya que los circuitos de ácidos nucleicos podrían
diseñarse con precisión utilizando una secuencia diana específica como entrada. (Li et al.,
2011; Liu et al., 2013). Las reacciones de desplazamiento de la hebra mediadas por los
dedos de los pies se pueden conectar en cascada con propiedades superiores en cuanto a
costo, programación, modularidad y universalidad (Zhang y Seelig, 2011). En particular, la
amplificación de la reacción en cadena de hibridación (HCR), un tipo de reacción de
desplazamiento de la hebra mediada por puntos de apoyo desarrollada por primera vez por
Dirks y Pierce (Dirks y Pierce, 2004), se explora ampliamente debido a su naturaleza libre
de enzimas, condiciones isotérmicas y protocolos simples. , flexibilidad estructural y
excelente eficiencia de amplificación (Bi et al., 2017; 2020a).
Para combinar las ventajas de dirigirse al ARN con CRISPR-Cas13a y la amplificación de
ácidos nucleicos sin enzimas, informamos sobre el desarrollo y la validación de un ensayo
basado en CRISPR-Cas13a acoplado a HCR (CasHCR) para la detección de SARS-CoV-2.
El rendimiento de detección del ensayo CasHCR se demostró en un biosensor de
fluorescencia de onda evanescente de fibra óptica hecho en casa capaz de recolectar la
fluorescencia excitada dentro de un campo evanescente que decae exponencialmente
alrededor de la fibra óptica, uno de los primeros ensayos de dispositivos biosensores de
ácido nucleico reutilizables (Liu et al., 2018; Wang et al. 2017, 2019).

2. Materiales y métodos
2.1. Material y aparato
Información detallada sobre reactivos, oligonucleótidos, tampones y
Los aparatos utilizados en este trabajo se proporcionan en la Información complementaria
S1. El biosensor de fluorescencia de ondas evanescentes de fibra óptica se describió en
nuestros trabajos anteriores (Liu et al., 2018; Wang et al., 2017), y su fotografía se muestra
en la Fig. S1. En pocas palabras, el láser He – Ne de 635 nm se introdujo en una fibra
óptica biofuncionalizada para generar la onda evanescente en la superficie de la fibra. Los
tintes fluorescentes unidos a la interfaz debido a la presencia de los objetivos fueron
excitados por la onda evanescente. Las señales de fluorescencia emitidas se adquirieron
luego utilizando el fotodiodo con un amplificador de bloqueo y se registraron en una Tablet
PC industrial incorporada. En este sistema de biosensor, se adoptó una combinación de
fibra óptica ahusada como se describe en nuestro trabajo anterior (Wang et al., 2015). La
preparación de la superficie de detección de fibra óptica funcionalizada con destiobiotina
(DTB) se proporciona en la Información complementaria S2 y el esquema de modificación
de la superficie de la fibra óptica con conjugado de BSA-destiobiotina (BSA-DTB) se
muestra en la Fig. S2.
2.2. La preparación de ácidos nucleicos de los ARNr del sistema
CRISPR-Cas13a y los ARN diana de SARS-CoV-2, SARS-CoV y MERS-CoV se
diseñaron según las pautas informadas (Freije et al., 2019; Patchsung et al., 2020).
Específicamente, una ventana de 28 nt altamente conservada fue la que tenía ≤2 posiciones
polimórficas (≤95% de la frecuencia del alelo principal) y menos del 50% de datos faltantes
en todos los sitios. Los genomas virales se descargaron de NCBI
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) y luego se alinearon usando el mafft v7.31 (Katoh et al.,
2019), y la información de consenso se mostró en Jalview v2 .11 (Waterhouse et al., 2009).
A continuación, los sitios objetivo de LwaCas13a en el SARS-CoV-2 se filtraron mediante
voladuras contra la base de datos GenBank (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi). Entre
las secuencias de crRNA, se seleccionó la secuencia final de 28 nt considerando la
complejidad de la estructura secundaria predicha por el servidor web NUPACK (Zadeh et
al., 2011).
2.3. Actividad de escisión colateral de Cas13a
Para formar horquillas recocidas, el crRNA y la baliza Reporter 1 se desnaturalizaron
individualmente a 76 ◦C durante 5 min y luego se enfriaron a temperatura ambiente durante
más de 1 h. La actividad de escisión colateral de Cas13a se investigó usando LwaCas13a 45
nM, crRNA 22,5 nM, baliza Reporter 1 125 nM, inhibidor de ARNasa 1,25 μl y cantidades
variables de ácido nucleico diana en tampón de ensayo de nucleasa. Las reacciones se
incubaron a 37 ◦C durante 1-2 h en un lector de microplacas de 384 pocillos con
mediciones fluorescentes cada 5 min.

2.4. Electroforesis en gel

El CRISPR-Cas13a se diluyó usando tampón de carga 6X con una relación de volumen de
5: 1 para electroforesis en gel. Se preparó un gel de poliacrilamida desnaturalizante de urea
al 15% con tampón TBE 10 x. Después de precalentar y calentar el gel durante 30 min a 50
V y luego cargar las muestras, se realizó la electroforesis a 80 V durante 100 min en
tampón TBE 1x. Los geles se empaparon en 1X TBE durante aproximadamente 10 min y
luego se tiñeron con SYBR Green I Gel Stain y se fotografiaron bajo iluminación UV
usando película FLS-5100 (Fuji Photo Film Co., Ltd., Tokio, Japón).
Para caracterizar la formación de conjuntos de HCR, se preparó un gel de poliacrilamida
fresco al 15% con tampón TBE 10 x. La electroforesis se realizó a 60 V durante 100 min en
tampón TBE 1x. Los geles se tiñeron y se formaron imágenes como la forma en la
electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante.
2.5. Detección de SARS-CoV-2 en tampón / hisopos orofaríngeos humanos utilizando la
técnica de biosección Cas-HCR
En las condiciones optimizadas, 2 μL de LwaCas13a en tampón de almacenamiento
(concentración de stock de 63,3 μg ml stock 1), 2 μL de crRNA (stock de 225 nM), 2 μL de
Reporter 2 (stock de 1,25 μM), 2 μL de genes sintéticos del SARS-CoV-2 en Se mezclaron
concentraciones variables, 0,5 µl de inhibidor de RNasa y 11,5 µl de tampón de ensayo de
nucleasa para el reconocimiento de Cas13a. Después de la incubación de la mezcla durante
20 min, se agregaron 20 μL de tampón SPSC, 5 μL de Bio-H1 recocido (stock de 1 μM) y 5
μL de Cy5.5-H2 recocido (stock de 1 μM) y luego las mezclas se incubaron más a 37 ◦ C
durante 30 min. El proceso de recocido contenía que 1 μM de Bio-H1 y Cy5.5-H2 se
desnaturalizaron respectivamente a 95 ° C durante 5 min y luego se enfriaron a temperatura
ambiente durante más de 1 h para formar horquillas recocidas. Por último, se agregaron 500
μl de tampón SPSC al tubo de reacción que contenía productos HCR amplificados para
ajustarse al requisito de volumen para la detección de biosensores fluorescentes de ondas
evanescentes. La detección basada en fibra óptica procedió como sigue: 1) primero se
administró estreptavidina 20 nM a la celda de flujo para unirse al DTB inmovilizado sobre
la superficie de detección de la fibra durante 2 min; 2) Se bombeó tampón SPSC para eluir
la SA ilimitada; 3) los productos HCR amplificados con marcadores de biotina se
bombearon para reaccionar con estreptavidina unida a la interfaz durante 10 min; 4) se
bombeó tampón de lavado para eluir la estreptavidina unida a la interfaz y los productos de
HCR durante 10 min; 5) Se bombeó tampón de equilibrio durante 1 min para regenerar la
superficie de detección para la siguiente ronda del ciclo de reacción. La capacidad de
aplicación de la técnica de biosensores Cas-HCR se investigó mediante la detección de los
genes S del SARS-CoV-2 en muestras de hisopos orofaríngeos negativos que se
adquirieron de donantes sanos en el hospital del campus con la aprobación de la
Universidad de Tsinghua. El ARN total de las muestras se extrajo con el kit Qiagen Viral
RNA Mini siguiendo las instrucciones del fabricante. Se agregaron 2 μl de la muestra de
ARN extraída a 18 μl de mezclas de reacción que contenían Cas13a, crRNA, Reporter 2 y
diferentes cantidades de ARN diana como se muestra en el tampón, seguido de la
amplificación de HCR para la medición de fluorescencia. La intensidad de la señal relativa
se calculó mediante la siguiente ecuación.
Intensidad relativa de la señal =
(SMea 􀀀 SMin)
(SMax 􀀀 SMin) (1)

donde SMea significa la intensidad de la señal medida; SMin significa la intensidad de la

señal correspondiente a la muestra de control; SMax significa la intensidad de la señal
correspondiente a la concentración máxima.
2.6. Análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó con el software Origin 2018. Cada experimento se realizó
tres veces en paralelo. Los resultados se presentaron como valor medio medido ±
desviación estándar. Las barras de error en todas las figuras representan las desviaciones
estándar de las mediciones por triplicado independientes.
3. Resultados y discusión

3.1. Mecanismo de detección de la técnica de biosección Cas-HCR

La técnica de biosensores Cas-HCR realizó el reconocimiento y escisión de Cas13a hacia
su secuencia de ARN diana según lo especificado por la secuencia de crRNA, seguido de la
activación de la actividad promiscua de RNasa de Cas13a para escindir el indicador de
ácido nucleico diseñado racionalmente y desencadenar la amplificación de HCR aguas
abajo. Los productos de HCR biotinilados fueron capturados por la fibra óptica
funcionalizada con estreptavidina, después de lo cual los fluoróforos Cy5.5 marcados en los
conjuntos de HCR fueron excitados por la onda evanescente y recolectados para generar la
señal usando la plataforma de biosensor de fluorescencia de onda evanescente de fibra
óptica. para confirmar la detección de los genes del virus (Fig. 1a). La especificidad de la
plataforma no solo se derivó del emparejamiento de bases, sino también de la alta fidelidad
de Cas13a (Shan et al., 2019). Diseñamos tres crRNA Cas13a con dos dirigidos
específicamente a los genes S (con picos) y N (nucleoproteína) del SARS-CoV-2 y uno
dirigido ampliamente al gen Orf1ab de tres coronavirus altamente patógenos (SARS-CoV-
2, MERS-CoV, SARS -CoV) (Fig.1b) según las pautas de diseño de ARN CRISPR
informadas anteriormente (Freije et al., 2019). Los crRNA que constan de una región de
repetición directa de 36 nt y una región de guía programable de 28 nt (espaciador) pueden
ensamblarse con Cas13a. A continuación, diseñamos el indicador de horquilla de ácido
nucleico que contiene sitios de escisión de ARN (UUUUUC) en amarillo para la actividad
promiscua de ARNasa de Cas13a (Abudayyeh et al., 2016; Gootenberg et al., 2018). Para
demostrar la especificidad de CRISPR-Cas13a con un diseño de ARNr diferente, un
indicador de ácido nucleico de doble marcación, una baliza del indicador 1 con un extremo
5 'marcado con FAM y una molécula extintora en el extremo 3' marcado con BHQ1 y una
horquilla de tallo-bucle que constituyen 8 hibridaciones pares de bases, se aplicó (Tabla
S1). Después del recocido, la formación del indicador de horquilla colocó el fluoróforo
muy cerca de su extintor, lo que dio como resultado un fondo de baja intensidad de
fluorescencia; después del reconocimiento específico, la baliza Reporter 1 se escindió y
separó FAM de BHQ1, lo que condujo a una obvia recuperación de fluorescencia.
3.2. Diseño y verificación del sistema CRISPR-Cas13a
Los crRNA de Cas13a se programaron para apuntar específicamente al SARS-CoV-2 o
detectar en general cepas de coronavirus relacionadas. Como se muestra en la Fig. S3, el
gen N y el gen S de SARS-CoV y MERS-CoV fueron significativamente diferentes de los
de SARS-CoV-2. Si bien, solo hubo una diferencia de dos bases entre el gen Orf1ab de tres
secuencias virales. Por lo tanto, teóricamente, los crRNA del gen N y del gen S utilizados
en el ensayo eran específicos para el SARS-CoV-2, sin embargo no pudieron detectar el
SARS-CoV y MERSCoV, mientras que el crRNA del gen Orf1ab fue capaz de detectar tres
cepas de coronavirus altamente patógenas. Como lo revela la fluorescencia neta restando la
de la muestra en blanco en la Fig.2a, demostramos que el sistema CRISPR-Cas13a fue
capaz de distinguir el SARS-CoV-2 sin reactividad cruzada para otros dos coronavirus
altamente patógenos utilizando los crRNA dirigidos a N gen y gen S, sin embargo, con
reactividad cruzada esperada para las cepas de coronavirus relacionadas utilizando el
crRNA dirigido al gen Orf1ab. El sistema CRISPR-Cas13a mostró una mayor sensibilidad
al dirigirse al gen S en comparación con el gen N dirigido. El ensayo de electroforesis en
gel de poliacrilamida desnaturalizante (PAGE) reveló que las dianas y los indicadores de
ácido nucleico, la baliza del Indicador 1, se escindieron en fragmentos cortos de ARN
debido a la actividad de escisión de CRISPR-Cas13a (Fig. 2b). Sin embargo, se observó
una ligera banda de fragmentos informadores escindidos incluso en ausencia de las dianas
(carril 3), lo que indica la potencial actividad de RNasa promiscua no inducida por la diana
de Cas13a. El fenómeno similar también fue encontrado por otros investigadores (East-
Seletsky et al., 2016; Huang et al., 2018). La baliza del indicador 1 liberó la secuencia I,
que exhibió una velocidad de migración mucho mayor que otras hebras más largas, como
se muestra en el carril 4. Los cambios de intensidad fluorescente dependientes del tiempo
del indicador se midieron en presencia de secuencias de ARN de SRAS-CoV-2 en
diferentes concentraciones (Fig. 2c). La fluorescencia aumentó significativamente en los
primeros 20 a 30 minutos debido a la actividad promiscua de RNasa de Cas13a, que
muestra el proceso de autoamplificación dependiente del tiempo (Bruch et al., 2019; Wu et
al., 2021). Para ahorrar tiempo, se seleccionó el tiempo óptimo para el reconocimiento
CRISPR-Cas13a en 20 min. El aumento obvio de la intensidad fluorescente se observó con
el aumento de las concentraciones de ARN (Fig. S4), lo que confirma además que la baliza
Reporter 1 se escindió bajo la actividad promiscua de RNasa de Cas13a y liberó las
secuencias I marcadas con BHQ1. El límite de detección (LOD) del sistema CRISPR-
Cas13a para los genes S del SARS-CoV-2 sin amplificación de señal fue de 25 pM, es
decir, aproximadamente 1,5 × 107 copias / μL, que se consideró como la concentración
mínima en la que la señal fue significativamente diferente del punto de corte definido como
la señal promedio de las muestras en blanco más tres veces la desviación estándar. Sin
duda, el sistema CRISPR-Cas13a no solo exhibe la capacidad precisa de reconocimiento de
diana de ácido nucleico, sino que también amplifica la señal basándose en la actividad
promiscua de RNasa.
3.3. Diseño de reportero de horquilla de ácido nucleico
Diseñamos el indicador de horquilla de ácido nucleico que contiene la región del iniciador
(I) en rojo para desencadenar la amplificación de HCR aguas abajo. El reportero de
horquilla debería liberar la secuencia I confiando adecuadamente en la presencia de la
secuencia de ARN rival objetivo, desencadenando así la formación de ensamblajes
marcados con Cy5.5. Las horquillas de tallo-bucle constituidas por 8, 12, 14 y 16 pares de
bases hibridados, denominados Reporter 1, Reporter 2, Reporter 3 y Reporter 4,
respectivamente, como se muestra en la Tabla S1, se examinaron utilizando el biosensor de
ondas evanescentes hecho en casa. (Insertar de la Fig. 2d). Después de eso, diseñamos el
TSD activado por secuencia I de horquillas (Bio-H1 y H2-Cy5.5) para generar múltiples
ensamblajes dúplex lineales I⋅ (H1⋅H2) n como productos de amplificación de señal. Al
usar una fibra óptica casera, la hibridación espontánea de horquillas H1 y H2 fue
insignificante (línea de base, línea 1) debido a los dominios complementarios bloqueados
en ausencia de I (Dirks y Pierce, 2004). Las rutas en cascada robustas se pueden lograr
sobre la base de herramientas computacionales (Wolfe et al., 2017) y pautas prácticas de
diseño (Ang y Yung, 2016). La horquilla con un tallo de 8 pares de bases hibridadas, es
decir, el Reporter 1, exhibió un aumento de señal obvio en comparación con la línea de
base (línea 2), probablemente como resultado de la inestabilidad de la estructura del tallo-
bucle, lo que desencadenó las reacciones de HCR de forma independiente. Las otras tres
horquillas permanecieron estables, mostrando así una respuesta de señal similar a la línea
de base (líneas 3-5). El indicador con un tallo de 12 pares de bases hibridados, es decir, el
indicador 2, se utilizó en los siguientes experimentos. La formación de productos
ensamblados también se demostró mediante PAGE nativo (Fig. 2e), donde los ensamblajes
de HCR formados en el carril 5 exhibieron velocidades de migración menores y variables
que otras hebras cortas. El recocido de secuencias mostró una ligera mejora en la señal del
biosensor (Fig. S5a). Para ahorrar tiempo y dinero, las concentraciones de H1 y H2, la
temperatura y el tiempo de reacción óptimo para el reconocimiento viral desencadenaron
reacciones de HCR fueron 5 μL, 37 ◦C, 0.5 h, respectivamente (Figs. S5b – d). También
comparamos el rendimiento de adoptar dos pasos individuales (es decir, reconocimiento
CRISPR-Cas13a y amplificación HCR) con el de fusionarlos en un solo recipiente. La señal
del biosensor exhibió solo la mitad del valor original después de fusionar dos pasos juntos
(Fig. 2f). Por lo tanto, no se recomendó la reacción en un solo recipiente, aunque prolongar
el tiempo de reacción ayudó a mejorar la señal hasta cierto punto. Se necesitan más
investigaciones para desarrollar un búfer común que pueda acomodar tanto el
reconocimiento mediado por CRISPR como la amplificación de HCR (Ladha et al., 2020).
3.4. Detección de señales mediante emisión inducida por ondas evanescentes
Para reducir el costo de la detección única, utilizamos moléculas de DTB con afinidad de
unión moderada hacia la estreptavidina para preparar una superficie de fibra óptica
reutilizable (Wang et al., 2019). Los conjuntos de HCR biotinilados se diseñaron para
anclarlos a la superficie de la fibra funcionalizada con DTB mediante un “pegamento” de
estreptavidina, lo que proporciona distancias físicas aproximadamente unificadas para los
fluoróforos marcados. Las señales emitidas por estos conjuntos de HCR marcados con
Cy5.5 bajo la excitación de la onda evanescente se pueden medir mediante la plataforma de
biosensores. Además, los complejos de estreptavidina-HCR se pueden lavar eficazmente
para regenerar la superficie de la fibra modificada con DTB. Se evaluaron los rendimientos
de la fibra óptica funcionalizada con DTB para gobernar el equilibrio de la captura del
ensamblaje de HCR y la regeneración de la superficie. Específicamente, se sintetizaron
conjugados de BSA-DTB con relaciones molares óptimas de 50 X y se inmovilizaron
covalentemente sobre la superficie de la fibra. La capa de estreptavidina de "pegamento"
era lo suficientemente robusta como para resistir la elución del tampón (Wang et al., 2019),
que se aplicó antes de la inyección del conjunto de HCR para garantizar las interferencias
mínimas de SA no unida, y se pudo lavar de manera eficiente utilizando tampón de lavado
(0.5 % SDS, pH 1,9) (Wang et al., 2019).
3.5. Evaluación del rendimiento de la técnica de biosensores Cas-HCR
Según la investigación anterior, el ensayo Cas-HCR se puede ejecutar y visualizar en un
biosensor de fluorescencia de onda evanescente de fibra óptica hecho en casa en
aproximadamente 1 h, que consiste en una reacción de reconocimiento CRISPR-Cas13a a
37 ◦C durante 20 min. Reacción de amplificación de HCR a 37 ◦C durante 30 min y
detección de señal mediante el uso de fibra a temperatura ambiente durante
aproximadamente 10 min. Dada la amplificación específica de alta fluorescencia hacia
conjuntos biotinilados, se compararon las actuaciones de detección utilizando crRNA_S,
crRNA_N y crRNA_Orf1ab hacia los genes sintéticos del SARS-CoV-2. Como era de
esperar, los sensogramas originales correspondientes a las diferentes concentraciones de
genes del SARS-CoV-2 demostraron que el ensayo Cas-HCR utilizando crRNA_S
funcionó de manera confiable con desviaciones de la señal del biosensor en presencia de
0.01 fM a 1 nM de ARN diana del SARS-CoV-2 secuencia (Fig. 3a). Una rápida
disminución de la señal después de usar la elución del tampón de lavado también indicó
que la regeneración de la superficie de la fibra podría lograrse de manera eficiente. Al
representar gráficamente las señales del biosensor frente a las concentraciones de genes en
la Fig. 3b, se observó un aumento gradual de la señal con el aumento de las concentraciones
de genes. La técnica de biosensores Cas-HCR podría detectar rápidamente genes S de
SARSCoV-2 en concentraciones tan bajas como 10 aM, es decir, aproximadamente 6
copias / μL, obedeciendo la regla similar de que LOD se consideraba como la
concentración mínima en la que la señal era significativamente diferente. desde el punto de
corte definido como la señal promedio de las muestras en blanco más tres veces la
desviación estándar. Los puntos de datos experimentales se analizaron y ajustaron mediante
una función de y = a-b × ln (x + c), donde y era la señal yx era la concentración del gen del
SARS-CoV-2 (recuadro izquierdo de la Fig. 3b). El coeficiente de correlación (R2) alcanzó
0,962 en el rango de 0-1 nM. Utilizando un enfoque similar, se investigó el rendimiento de
esta técnica de biosensores Cas-HCR utilizando crRNA_N hacia los genes N del SARS-
CoV-2 y crRNA_Orf1ab hacia el Orf1ab del SARS-CoV-2, respectivamente. Los
resultados mostraron que esta técnica era capaz de detectar hasta 100 aM, es decir, 60
copias / μL, gen SARS-CoV-2 N y 10 aM, es decir, 6 copias / μL, gen SARS-CoV-2
Orf1ab, respectivamente (Fig.3c yd). El R2 del ajuste de la curva entre la señal y las
concentraciones de genes N y genes Orf1ab fueron 0,997 y 0,966, respectivamente, en el
rango de 0-1 nM. Además, a la luz de la afinidad de unión moderada entre DTB y
estreptavidina y la estrategia de inmovilización de la molécula de DTB en la superficie
sólida (Wang et al., 2019), la fibra óptica permitió reutilizar más de 100 ciclos sucesivos
con menos del 2.5% disminución de la señal usando tampón de lavado (Fig. S8a). En
general, usamos la fibra para la prueba si continuamos el experimento dentro de un mes
durante no más de 150 ciclos sucesivos. Por ejemplo, se utilizaron tres fibras ópticas para
obtener todos los datos de la Fig. 3. Además, evaluamos el problema del arrastre para tratar
la fibra con proteína estreptavidina marcada con Cy5.5 4 nM. Al observar el sensorgrama
durante la unión, elución del tampón de lavado y regeneración del tampón de equilibrio
como se muestra en la Fig. S8b, la señal fluorescente bajó a la línea de base cuando se
eluyó con tampón de lavado durante no más de 10 min, y luego con tampón de equilibrio
durante 1 min. , lo que indica que el tampón de lavado fue eficaz para romper la interacción
de unión entre el DTB y la estreptavidina, por lo que el problema potencial de arrastre
debería ser insignificante para garantizar la regeneración de la superficie de manera
eficiente.
Por último, investigamos la capacidad de aplicación de esta técnica de biodetección Cas-
HCR mediante la detección de genes S de SARS-CoV-2 enriquecidos en extractos de ARN
de hisopos orofaríngeos de tres donantes sanos. El ARN de SARSCoV-2 se confirmó como
negativo mediante la técnica RT-qPCR. El recuadro derecho de la Fig. 3b muestra el mapa
de calor de tres niveles de concentración (10 aM, 100 aM y 1000 aM) de genes S de
medición de SARS-CoV-2 utilizando esta técnica. La relación de la barra de color
representa la intensidad de la señal relativa calculada por la ecuación. 1, que mostró una
diferencia significativa con el control y también una buena correlación entre la
concentración objetivo y la señal de Cas-HCR. En particular, observamos la disminución de
la señal contra la misma concentración en los hisopos orofaríngeos en comparación con los
obtenidos en el tampón, lo que refleja la posible interferencia de la matriz (Figs. S9 y S10).
A pesar del problema, todavía observamos discriminación de señales contra diferentes
concentraciones de objetivo en todas las muestras de hisopos orofaríngeos. Las
derivaciones estándar comparables tanto en hisopos orofaríngeos como en tampones
confirmaron la sensibilidad y aplicabilidad satisfactorias de la plataforma de biosensores
Cas-HCR desarrollada para la detección de SARS-CoV-2 en diagnósticos clínicos. Desde el
brote de COVID-19, se han desarrollado muchas tecnologías basadas en CRISPR para la
detección del gen SARS-CoV-2, que se basa principalmente en un paso de amplificación de
ácido pre-nucleico para lograr sensibilidades ultra altas (Chen et al. , 2020; Huang et al.,
2020b; Tian et al., 2021; Wang et al., 2021; Xiong et al. 2020, 2021). El biosensor CRISPR
sin preamplificación solo mostró LOD a nivel nM o pM (Li et al., 2019; Wang et al., 2020).
Aquí, presentamos una nueva estrategia, que empleó el producto específico de la reacción
CRISPR para desencadenar la reacción HCR libre de enzima para la amplificación de la
señal. En particular, tanto el LOD como el tiempo de respuesta de esta técnica fueron
comparables a los de las detecciones de ácidos nucleicos virales basadas en CRISPR
informadas (Tabla S2). Este intento proporciona una referencia valiosa para el desarrollo
posterior de tecnologías CRISPR más post amplificadas.
4. Conclusión
En resumen, se estableció una técnica de biodetección basada en CRISPR-Cas13a acoplada
a HCR para detectar SARS-CoV-2 con alta sensibilidad y bajo costo de prueba en una
plataforma de biodetección de fluorescencia de onda evanescente de fibra óptica hecha en
casa. Esta técnica combinó los méritos no solo de la destacada capacidad de reconocimiento
de genes virales específicos del sistema CRISPRCas13a, sino también de la amplificación
barata, sin enzimas e isotérmica de ácidos nucleicos por HCR sin la necesidad de una
operación de ciclos de temperatura para mejorar drásticamente la sensibilidad de detección.
En las condiciones optimizadas, esta técnica proporcionó un LOD de nivel attomolar hacia
tres genes específicos (genes S, genes N y genes Orf1ab) del SARS-CoV-2. El análisis del
SARS-CoV-2 en hisopos orofaríngeos negativos demostró de manera convincente que la
técnica de biosensores tenía un gran potencial para el diagnóstico de COVID-19 en el punto
de atención. Este intento proporciona una referencia valiosa para el desarrollo posterior de
tecnologías CRISPR más post amplificadas.

Biosensor de ADN ultrarrápido y reciclable para la detección en el punto de atención

del SARS-CoV-2 (COVID-19)
1. Introducción
Desde finales de diciembre de 2019, el nuevo coronavirus, es decir, el coronavirus del
síndrome respiratorio agudo grave respiratorio severo 2 (SARS-CoV-2) que se reportó
por primera vez en la ciudad de Wuhan, China, se ha extendido por todo el mundo, con
miles de muertes (Islam et al., 2020). Además, actualmente no se dispone de ninguna
vacuna o agente antiviral. Los signos de la infección por el SARS-CoV-2 son muy
inespecíficos, e incluyen diarrea, fiebre, tos, disnea y neumonía viral (Cascella et al.
neumonía viral (Cascella et al., 2020). En particular, se ha informado de que este virus
se propaga en gran medida durante su periodo de incubación en pacientes asintomáticos
(Rothe et al., 2020). Según un modelo reciente, los pacientes sintomáticos deben ser
aislados dentro de las 24 horas siguientes a la aparición de los síntomas para controlar
la propagación de la enfermedad por coronavirus (COVID-19) (Chowell et al., 2020).
La detección y el aislamiento rápidos de los casos en detección y el aislamiento de los
casos sería lo más eficaz para suprimir la escalada del brote. Además, es muy
importante construir plataformas de prediagnóstico para evitar sacrificios innecesarios.
En la actualidad, el protocolo de diagnóstico estándar se basa en la reacción en cadena
de la polimerasa (PCR) para amplificar el material genético necesario para la detección
del SARS-CoV-2 (Corman et al., 2020). Es un método altamente sensible y fiable, pero
no está exento de limitaciones. El tiempo medio de entrega de los resultados de las
pruebas es de 24 a 72 horas, pero el desfase entre la recogida de la muestra y la entrega
es imprevisible a gran escala para lade la muestra y la entrega es impredecible a gran
escala para la COVID-19 pandemia mundial. Además, requiere profesionales bien
formados, así como laboratorios, instrumentos y consumibles caros y sofisticados que
limitan considerablemente su uso generalizado. El número de casos de COVID-19 ya
ha superado la capacidad de las pruebas de PCR debido a la escasez de kits de pruebas,
lo que ha creado una nueva ola de desafíos (Sharfstein et al., 2020). En este contexto, la
implementación de un método de detección de bajo coste y en tiempo real para el
cribado del SARS-CoV-2 es de alta prioridad. Los biosensores de diagnóstico en el
punto de uso son una alternativa eficaz a la detección basada en la PCR debido a su
sencillez de funcionamiento, su bajo coste y su idoneidad para la producción en masa
(Whitesides, 2006). Entre los biosensores anteriores, los métodos electroquímicos han
llamado mucho la atención por su facilidad de detección, su idoneidad para la
miniaturización flexibilidad en el tamaño del sensor, y controlabilidad de los
parámetros sensibles (Singhal et al., 2018). Estos biosensores miden el cambio en la
señal electroquímica tras la hibridación entre un ADN diana biotinilado y una sonda de
ADN tiolada inmovilizada en la superficie de un electrodo de oro. En ejemplo, un
biosensor que detecta el ADN del virus del Ébola mediante un proceso de amplificación
enzimática ha sido reportado (Ilkhani y Farhad, 2018). Posteriormente, la detección del
síndrome respiratorio de Oriente Medio respiratorio de Oriente Medio (MERS-CoV)
utilizando electrodos de matriz de carbono modificados con nanopartículas de oro se
realizó mediante inmunosensores voltamétricos (Layqah y Eissa, 2019). Estos sensores
eran de naturaleza técnica, requiriendo reactivos y materiales analíticos de alta calidad.
De la muestra y la entrega es impredecible a gran escala para la COVID-19 pandemia
mundial. Además, requiere profesionales bien formados, así como laboratorios,
instrumentos y consumibles caros y sofisticados que limitan considerablemente su uso
generalizado. El número de casos de COVID-19 ya ha superado la capacidad de las
pruebas de PCR debido a la escasez de kits de pruebas, lo que ha creado una nueva ola
de desafíos (Sharfstein et al., 2020). En este contexto, la implementación de un método
de detección de bajo coste y en tiempo real para el cribado del SARS-CoV-2 es de alta
prioridad. Los biosensores de diagnóstico en el punto de uso son una alternativa eficaz a
la detección basada en la PCR debido a su sencillez de funcionamiento, su bajo coste y
su idoneidad para la producción en masa (Whitesides, 2006). Entre los biosensores
anteriores, los métodos electroquímicos han llamado mucho la atención por su facilidad
de detección, su idoneidad para la miniaturización flexibilidad en el tamaño del sensor,
y controlabilidad de los parámetros sensibles (Singhal et al., 2018). Estos biosensores
miden el cambio en la señal electroquímica tras la hibridación entre un ADN diana
biotinilado y una sonda de ADN tiolada inmovilizada en la superficie de un electrodo
de oro. En ejemplo, un biosensor que detecta el ADN del virus del Ébola mediante un
proceso de amplificación enzimática ha sido reportado (Ilkhani y Farhad, 2018).
Posteriormente, la detección del síndrome respiratorio de Oriente Medio respiratorio de
Oriente Medio (MERS-CoV) utilizando electrodos de matriz de carbono modificados
con nanopartículas de oro se realizó mediante inmunosensores voltamétricos (Layqah y
Eissa, 2019). Estos sensores eran de naturaleza técnica, requiriendo reactivos y
materiales analíticos de alta calidad. Además, se requería un etiquetado adicional y una
amplificación de la señal para lograr sensibilidad de alto nivel, lo que puede suponer
costes adicionales durante la futura miniaturización
Muy recientemente, se construyó con éxito un biosensor de transistor de efecto de
campo para la detección de la proteína de espiga del SARS-CoV-2 (Seo et al.,2020).
Este dispositivo fue diseñado para utilizar anticuerpos de espiga del SARS-CoV-2
anclados por éster de N-hidroxisuccinimida del ácido 1-pirenebutírico (PBASE) en
capas de canales de grafeno. A pesar de la ventaja de un flujo de trabajo conveniente
que requiere poca preparación de la muestra, esta nueva prueba mediante un enfoque
serológico fue menos sensible que la RT-PCR utilizando el ARN viral; por lo tanto, es
necesario explorar diferentes materiales y plataformas para mejorar la señal/ruido.
Siguen existiendo retos para desarrollar plataformas de detección rápidas y de bajo
coste para la detección viral de alta sensibilidad, ya que el cambio mínimo de la
hibridación molecular es difícil de distinguir en las estructuras de los dispositivos
verticales. Por lo tanto, es importante desarrollar bancos de pruebas fiables para
identificar las reacciones moleculares en una interfaz a nano escala. En este estudio,
desarrollamos un nuevo sensor de SARS-CoV-2 basado en electrodos Inter digitados
(IDE) que detecta la hibridación sin etiqueta entre una sonda y el ADN objetivo. Sus
distintas señales eléctricas resultantes de la hibridación selectiva de secuencias
específicas de ADN se demostraron con éxito mediante exhaustivos análisis eléctricos y
fisicoquímicos. Esperamos que nuestra demostración permita nuevas posibilidades en el
desarrollo de sensores de ADN en tiempo real, de bajo coste y sin etiqueta para la
detección oportuna y eficaz de COVID19.

2. Materiales y Métodos
2.1. Reactivos y Materiales

Se utilizó un gen sintético del SARS-CoV-2 y un gen del síndrome respiratorio

agudo severo (SARS)-CoV como prueba de concepto. Se seleccionó una secuencia
diana de los genes de la ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp) específica
para el SARS-CoV-2 (Corman et al., 2020). El ADN complementario se sintetizó
mediante la transcripción inversa del gen RdRp del virus SARS-CoV-2 y se utilizó
como ADN diana en este estudio. El ADN de la sonda se diseñó para formar un
dúplex estable con la secuencia diana (Tabla Suplementaria 1). La secuencia del gen
del SARS-CoV contiene cuatro pares de bases no coincidentes con la secuencia de
la sonda. El ADN de la sonda (5′-Fosfato-GCA TCT CCT GAT GAG GTT CCA
CCT G-3′) el analito objetivo complementario (5′-CAG GTG GAA CCT CAT CAG
GAG ATG C-3′) y el analito no complementario (5′-CCA GGT GGA ACA TCA
TCC GGT GAT GC-3′) se adquirieron en Bionics (Seúl, S. Corea). El ácido
sulfúrico, el peróxido de hidrógeno y el etanol anhidro se obtuvieron de Samchun
(Seúl, Corea del Sur). El 3-Aminopropiltrietoxisilano (APTES) se adquirió en
Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.) y se almacenó en un lugar seco y ventilado
antes de su uso. La solución salina tamponada con fosfato (PBS) se compró a
CUREBIO (Seúl, Corea del Sur). Todos los demás reactivos y disolventes eran de
grado analítico, y se utilizó agua desionizada (DI) (sistema Milli-Q®, 18,2 MΩ cm,
25 ◦C) durante todos los experimentos.
2.2. Construcción de un electrodo interdigitado (IDE) en una oblea de
vidrio
Se preparó una oblea de vidrio de 6 pulgadas mediante una limpieza secuencial en
acetona alcohol isopropílico y agua destilada en un baño de ultrasonidos durante 5
minutos. Tras el proceso de limpieza, la oblea de vidrio se sopló suavemente con
gas nitrógeno y se mantuvo a 70 ◦C para eliminar la humedad redundante. Las IDEs
fueron de vidrio mediante un proceso de fotolitografía convencional. Se depositaron
capas gruesas (150 nm) de titanio (Ti) y platino (Pt) mediante evaporación por haz
de electrones sobre la oblea de vidrio. La capa de Ti ayuda a la adhesión entre el Pt
y el sustrato de vidrio. Por último, la oblea oblea se cortó en trozos individuales. La
anchura del canal era de 4100 μm, incluyendo los 64 electrodos interdigitales, y la
longitud del canal era de 100 μm, proporcionando un área de detección total de unos
13,12 mm2
2.3. Tratamiento de la superficie para la hibridación del ADN
En primer lugar, se modificó la superficie para introducir grupos hidroxilos en la
superficie de vidrio de los sensores IDE. Los sensores se limpiaron a 80 ◦C en una
solución de H2SO4/H2O2 (aq) concentrado 3:1 (en lo sucesivo, solución piraña) y
luego se enjuagaron con agua DI para eliminar los reactivos. A continuación, se
llevó a cabo un tratamiento con UV/ozono durante 10 minutos (UVO Cleaner,
modelo 30, Jelight Company, Inc.), lo que dio lugar a que los grupos hidroxilos con
una transformación de la superficie de hidrofóbica a hidrofílica (Fan et al., 2019).
En segundo lugar, se dejó caer APTES al 5% (v/v) en etanol sobre la superficie y se
secó para funcionalizar los grupos de amina como moléculas enlazadoras para
reaccionar con el ADN de la sonda (Jang y Liu, 2009; Syga et al., 2018).
Finalmente, las sondas se enjuagaron con agua desionizada para eliminar el
adsorbido APTES y se secaron a temperatura ambiente antes de la caracterización.
El ADN de la sonda se suspendió en agua DI a una concentración de 5 μM. A
continuación, 10 μL de esta solución se dejaron caer sobre el sensor e
inmediatamente colocado en un recipiente cerrado durante 3 h a 60 ◦C. Durante la
reacción, el ADN de la sonda se inmovilizó en la superficie de vidrio funcionalizada
con amina a través de un enlace de fosforamidato mediante una reacción de un solo
paso. Tras la incubación, los sensores se enjuagaron a fondo con agua destilada para
eliminar ADN de la sonda redundante y se secaron en el contenedor a temperatura
ambiente. El enlace entre APTES y el ADN de la sonda es un enlace covalente
causado por la reacción molecular entre la amina y el fosfato (Chen et al., 2015).
Las sondas preparadas se almacenaron en un recipiente cerrado inmediatamente
antes de su uso.
2.4. Detección del objetivo analítico
Todos los experimentos se realizaron en quíntuple. En primer lugar, el ADNc
complementario del SARS-CoV-2 y el cDNA no complementario de SARS-CoV se
disolvieron en agua destilada y luego se diluyeron en PBS para obtener una solución
de 5 μM. Para la hibridación en hibridación, se dejaron caer 10 μL de cada solución
de analito en el sensor y se incubó durante 1 h a 60 ◦C para reducir las reacciones no
específicas. Después de esto, los sensores se lavaron individualmente con agua
destilada para eliminar el ADN no hibridado y se secaron a temperatura ambiente.
Los valores de capacitancia se midieron en el rango de frecuencia de 10 Hz-103 Hz,
utilizando un analizador de impedancia (HIOKI, IM3570) en pocos segundos
(Mishra et al., 2020). Se aplicó una tensión de CA de 500 mV al cuadrado medio
(RMS) a través del sensor IDE. Todos los resultados se recogieron y analizaron
estadísticamente estadísticamente utilizando una prueba t emparejada y un valor p
para la significación estadística.

2.5. Caracterización de la superficie

La energía superficial de la hidroxilación en la superficie del vidrio, la
funcionalización con amina de amina y la inmovilización de la sonda de ADN se
estimaron de contacto, que se llevaron a cabo dispensando agua destilada sobre
diferentes superficies químicas. La fotografía de la vista lateral de la La fotografía
de vista lateral de la medición del ángulo de contacto se tomó con una cámara
digital (Navitar) y se procesó con un software de análisis de imágenes (UNI-CAM).
Se utilizó la técnica de medición de espectroscopia infrarroja de reflexión total
atenuada por transformada de Fourier (ATR-FTIR, Nicolet iS50, Thermo) para
investigar el esqueleto de carbono (-CH2) y los grupos aminos terminales (-NH2) en
el APTES anclados a la superficie del vidrio. La intensidad de la fluorescencia se
fluorescencia se confirmó con un microscopio de fluorescencia (EVOS M5000,
Thermo) y lector ELISA (Synergy H1, BioTek). La inmovilización del ADN de la
sonda y la hibridación del analito objetivo se validaron además utilizando la captura
fluorescente de la diana en la superficie del sensor.
2.6. Prueba de reciclabilidad
La reciclabilidad del sensor se comprobó verificando la capacitancia entre los
sensores desnudos y los sensores hibridados cada vez que se reutilizaba. El proceso
 se repitió cinco veces, y se midió el cambio en la capacitancia después de cada
ciclo.

3. Resultados y discusión
3.1. El mecanismo de funcionamiento del biosensor SARS-CoV-2
La Fig. 1A muestra un diagrama esquemático de la secuencia del ADN de la sonda
utilizando secuencias específicas de ARNm del gen del SARS-CoV-2 y la hibridación
entre el ADN de la sonda y el ADNc del SARS-CoV-2. De los genes RdRp específicos
del SARS-CoV-2 (Corman et al., 2020), se seleccionó una secuencia principal para el
ADN de la sonda fue seleccionada. Como experimentos de ADN diana, SARS-CoV-2
(ADN complementario con el ADN de la sonda) y el gen del SARS-CoV (ADN no
complementario que contiene cuatro pares de bases no coincidentes con secuencia de la
sonda) se sintetizaron para este estudio. La fotografía de La fotografía del montaje de
medición de capacitancia-frecuencia (C-f) se muestra en la Fig. 1A suplementaria. Al
montar y retirar varios chips repetidamente, se puede lograr la detección de la señal de
manera fiable y rápida. En comparación con el diseño convencional de electrodos,
nuestro novedoso diseño de IDE es de los electrodos convencionales, nuestro novedoso
diseño de IDE es beneficioso debido a su mayor área efectiva para especies biológicas y
permite una mejor capacidad espacial y reactividad (Fig. 1B suplementaria). La
estructura de electrodos interdigitados consta de 64 dedos de electrodo, y la anchura y
la longitud de la IDE son de 4100 y 100 μm, proporcionando un área de detección total
de 13,12 μm2. Después de construir el IDE, se llevó a cabo la modificación de la
superficie del sustrato de vidrio, como se muestra en Fig. 1B. Existen varios informes
sobre la modificación de la superficie de sustratos de vidrio sustratos de vidrio con
diferentes grupos funcionales para hacer enlaces covalentes con el ADN. Entre los
silanos funcionalizados, el APTES es el más utilizado ampliamente para la
inmovilización de ADN (Albala ' et al., 2004; Chen et al, 2015; Olmos et al., 2003;
Wang et al., 2006; Watson et al., 2001). La formación de silanos funcionalizados de
cadena corta bien definidos se puede lograrse bajo un control preciso del tiempo de
reacción y de la concentración del medio (tratamiento con APTES). A continuación, se
produce la inmovilización del ADN de la sonda sobre sustratos de vidrio modificados
con APTES (inmovilización del ADN de la sonda). La capa ordenada de ADN sonda en
la superficie es un requisito previo para garantizar la accesibilidad a los ADN objetivo
(Dufva, 2005). Para maximizar el número de moléculas de ADN sonda quimisorbidas
en la superficie, en nuestros experimentos se eligió una concentración de 5 μM con un
tiempo de incubación de 3 h, ya que la inmovilización del ADN es susceptible a la
superficie rugosa del vidrio, el tiempo de incubación y la concentración (Rashid y
Yusof, 2017). Sobre la base de la secuencia de ADN el ADN diana complementario
puede hibridarse con el ADN de la sonda para de doble cadena (dsDNA) a través de
enlaces de hidrógeno (hibridación del ADN hibridación del ADN), pero el ADNc del
SARS-CoV no complementario no puede (no hibridación del ADN). Cuando el ADN
 diana reacciona y se hibrida con el ADN de la sonda, la distribución de carga espacial
reforzada entre los electrodos conduce a un aumento de los valores de capacitancia

3.2. Análisis fisicoquímico en el sitio reactivo del biosensor SARS-CoV-2

La optimización de la superficie del sensor para la hibridación del ADN es crucial para
asegurar una alta especificidad y sensibilidad, que depende principalmente del estado del
ADN de la sonda inmovilizado. Durante el proceso de construcción del dispositivo paso a
paso, se realizó un análisis fisicoquímico de la superficie reactiva para verificar la
compatibilidad entre la sonda y el ADN diana. La figura 2A muestra la medición del ángulo
de contacto de la superficie después de la modificación química. El ángulo de contacto de
la superficie desnuda fue de 45,8◦. Después del tratamiento con pirañas y UV / ozono, el
ángulo de contacto de la superficie modificada con hidroxilo disminuyó a un valor
inconmensurable (<3◦); esto se corresponde con investigaciones anteriores (Schrader et al.,
2018). El ángulo de contacto se incrementó a 39,4◦ después del tratamiento con APTES, lo
que implica que se logró la cobertura uniforme de la capa molecular de silano que consta de
grupos amina hidrófilos libres expuestos. El ángulo de contacto superior a 41◦ se lograría
debido a la exposición parcial de hidrocarburos hidrófobos y grupos funcionales amina
hidrófila de APTES (Kyaw et al., 2015), lo que indica menos sitios de unión de moléculas
de ADN sonda. Según un estudio anterior, se logró el ángulo de contacto ideal de 41◦
donde cada enlace de Si de las moléculas APTES se unió covalentemente como una
estructura de trípode, conduciendo los grupos amina hacia el sustrato (Kyaw et al., 2015).
Por lo tanto, se eligió cuidadosamente un pH neutro para el tratamiento de lavado de
superficies después del tratamiento con APTES (Fig. 2A complementaria). Nuestros
resultados indican que la superficie efectiva del sensor se modificó con éxito con
hidroxilación, seguida de aminación. Cuando el ADN de la sonda se inmoviliza en APTES,
el ángulo de contacto aumenta gradualmente debido a los cambios en las propiedades de la
superficie debido a la presencia del ADN (Chaudhary et al., 2014; Elder y Jayaraman,
2013).
Para confirmar la presencia de una reacción química en la superficie efectiva, se realizó un
análisis ATR-FT-IR, como se muestra en la Fig. 2B. ATR-FT-IR es una herramienta útil
para examinar grupos funcionales en capas moleculares delgadas con una profundidad de
penetración de alrededor de 1 a 2 nm. El ensamblaje efectivo de la capa APTES sobre la
superficie del vidrio se reflejó en la presencia de un fuerte pico de absorción a 1568 cm􀀀 1
y 2800-2980 cm􀀀 1, lo que indica un estiramiento N – H (Wang et al., 2014) y C – H
(Gunda et al., 2014), respectivamente. En la Fig. 2C, la inmovilización del ADN de la
sonda se verificó con éxito produciendo una fuerte expresión de fluorescencia. Para
optimizar la frecuencia de la señal de estímulo, la caracterización eléctrica C-f se realizó
midiendo los valores de capacitancia del chip desnudo, APTES, sonda de ADN en rangos
de frecuencia de 10 a 103 Hz como se muestra en la Fig. 2D (Wang et al., 2017). A una
frecuencia baja de 10 Hz, se observaron cambios de capacitancia confiables en cada paso
de la modificación de la superficie en nuestro experimento. Los valores de capacitancia
disminuyeron rápidamente al aumentar la frecuencia de los estímulos. Cuando la frecuencia
aplicada al condensador aumenta, la reactancia capacitiva (Xc) disminuye porque la carga
eléctrica en el espacio interno entre los electrodos puede pasar rápidamente de uno a otro
electrodo a frecuencias variables. La reactancia capacitiva se puede expresar mediante la
siguiente ecuación:
Xc =
1
2πfC

Donde Xc es la reactancia capacitiva en ohmios, f es la frecuencia en hercios y C es la

capacitancia en faradios.
Observamos grandes aumentos de los valores de capacitancia a 10 Hz producidos por la
inmovilización del ADN de la sonda en comparación con el chip desnudo y el tratamiento
APTES debido a la propiedad intrínseca de la constante dieléctrica. De hecho, se informa
que la constante dieléctrica de APTES funcionalizados (Macambira et al., 2018) y la
cadena de carbono compleja del ADN (Cuervo et al., 2014) es aproximadamente ε = 3.57 y
ε = ~ 8, respectivamente.
3.3. Sensibilidad, identificación y reciclabilidad del dispositivo del ADNc del SARS-CoV-
2
Después de la inmovilización del ADN de la sonda, se evaluaron la sensibilidad y la
especificidad del analito diana complementario del SARS-CoV-2. Para validar la
sensibilidad mínima de los sensores, se probó una concentración diferente de ADN diana
complementario del SARS-CoV-2 como se muestra en la Fig. 3A. Se confirma que la
respuesta capacitiva lineal para el ADNc del SARSCoV-2 complementario (0,843 nF / nM,
10 nM del límite de detección (LoD)) y la respuesta invariante para el ADNc del SARS-
CoV no complementario se detectaron con un cambio logarítmico de la concentración
objetivo de 5 µM a 10 nM. Vale la pena señalar que nuestro sensor capacitivo exhibe una
sensibilidad prominente en comparación con los sensores de ADN electroquímicos
reportados anteriormente (Faria y Zucolotto, 2019) y está validado para ser utilizado como
biosensores de diagnóstico en el punto de uso siempre que el preacondicionamiento y el
ADN de alta concentración La plataforma de extracción en el sitio está bien establecida. El
cambio medio de los valores de capacitancia de los sensores incubados con ADN de analito
complementarios y no complementarios se evaluó en la Fig. 3B. El analito no
complementario del SARS-CoV no indujo un cambio de capacitancia significativo,
mientras que el analito diana complementario del SARS-CoV-2 exhibió aumentos
estadísticamente significativos en la capacitancia (ΔC = ~ 2 nF), con una distribución
estadística estrecha (p <0.05) . Tras la introducción del ADNc de SARS-CoV-2
complementario, la formación exitosa de ADNdc fue confirmada por el aumento
estadísticamente significativo en los valores de capacitancia (Fig. 3A suplementaria). Como
se ha demostrado previamente en la literatura, el aumento de la capacitancia se produjo
cuando las propiedades de los materiales dieléctricos entre los electrodos cambiaron (Tsouti
et al., 2011). La captura del analito objetivo se validó aún más midiendo la señal
fluorescente sobre la superficie del vidrio. Como se muestra en la Fig. 3C, la fuerte
fluorescencia verde reveló la hibridación exitosa entre la diana de SARS-CoV-2 y el ADN
de la sonda. Todos estos resultados apoyan la detección específica de ADNc
complementario del SARS-CoV-2 por nuestros sensores. Finalmente, se realizó una prueba
de reciclabilidad para cada ciclo experimental, como se muestra en las Fig. 3D y E.
Mediante el simple proceso de limpieza de pirañas y tratamiento con UV / ozono, el
sustrato de vidrio limpio de los sensores fue regenerado sin quitar los transductores. La
solución de piraña se utilizó como agente desnaturalizante para eliminar el ADN unido a la
superficie del vidrio, y se logró la regeneración del grupo hidroxilo en la superficie del
vidrio mediante el siguiente tratamiento con UV / ozono. Sin tratamiento adicional, se
repitieron los mismos pasos de construcción para que el sensor detectara el ADNc del
SARS-CoV-2. Con base en el análisis estadístico ANOVA de una vía, se confirmó que las
diferencias de todos los datos de capacitancia medidos en cada ciclo repetido no eran
estadísticamente significativas (Fig. 3D), con un valor de p superior a 0,05. Más importante
aún, el cambio de capacitancia (ΔC) permaneció constante dentro de un rango de ~ 2 nF
cuando se reutilizaron los sensores, conservando una excelente sensibilidad a través del
reciclaje (Fig. 3E y Fig. 5 complementaria).
4. Conclusiones
En este estudio, se desarrolló un sensor capacitivo rápido y de bajo costo para la detección
sensible de ADNc del SARS-CoV-2. Los resultados demostraron que la capacitancia
cambió tras la introducción del analito SARS-CoV-2 objetivo a nuestro sensor construido
sin reactividad cruzada significativa con el SARS-CoV. La formación de dsDNA mediante
hibridación a nivel molecular se verificó mediante un exhaustivo análisis de superficie
eléctrico y óptico. La reciclabilidad también se demostró mediante la regeneración de la
superficie del vidrio después de un proceso de construcción simple, lo que permite su
reutilización en entornos de bajos recursos. Debido a su alta sensibilidad y especificidad
(Tabla complementaria 2), los sensores reportados tienen un gran potencial en el uso
práctico y la comercialización como diagnósticos en el punto de atención para COVID-19.

Detección de SARS-CoV-2 basada en CRISPR: una revisión de la muestra al

resultado
RESUMEN
La pandemia actual del nuevo coronavirus de 2019 (COVID-19) causada por el SARS-
CoV-2 (síndrome respiratorio agudo severo coronavirus-2) ha planteado importantes
preocupaciones de salud pública. El diagnóstico rápido, asequible y preciso del SARS-
CoV-2 es esencial para el tratamiento temprano y el control de la propagación de la
enfermedad. En los últimos años, la tecnología CRISPR ha mostrado un gran potencial para
diagnósticos moleculares altamente sensibles y específicos. En medio de la pandemia de
COVID-19 en curso, existe un interés creciente en implementar los principios de
diagnóstico basados en CRISPR para desarrollar métodos rápidos y precisos para detectar
el SARS-CoV-2. En este trabajo, revisamos y resumimos estos sistemas de diagnóstico
basados en CRISPR, así como sus características y desafíos. También proporcionamos
perspectivas futuras de detección basada en CRISPR hacia aplicaciones de diagnóstico
molecular en el punto de atención.
1. Introducción
Los coronavirus son virus de ARN de sentido positivo con envoltura, que se asocian
comúnmente con infecciones respiratorias agudas en humanos (Phan 2020). A finales de
diciembre de 2019, varios centros de salud locales informaron sobre pacientes con
neumonía de causas desconocidas en Wuhan, provincia de Hubei, China (Zhu et al., 2020).
El patógeno causante se ha identificado como un nuevo betacoronavirus de ARN envuelto
(Wang et al., 2020d). Dada la similitud con el coronavirus del síndrome respiratorio agudo
severo (SARS-CoV) previamente aislado, el nuevo virus se ha denominado SARS-CoV-2
(Castagnoli et al., 2020). El 9 de enero de 2021, hay un total de 87.589.206 casos
confirmados y 1.906.606 muertes de SARS-CoV-2 reportados a nivel mundial por la
Organización Mundial de la Salud (OMS) (OMS 2020). En esta pandemia de SARS-CoV-
2, el diagnóstico confiable, temprano y preciso es crucial para brindar apoyo médico
oportuno a la persona infectada y facilitar que las agencias gubernamentales eviten su
propagación a otras personas y salve vidas. El diagnóstico actual de coronavirus incluye la
detección de virus mediante técnicas genómicas utilizando el método basado en PCR
cuantitativa de transcripción inversa (RT-qPCR) o secuenciación (Corman et al., 2020; Li
et al., 2020; Lu et al., 2020). ). En los últimos años, la aparición y el desarrollo de
repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR) y
proteínas Cas asociadas a CRISPR abrieron una nueva vía de investigación hacia el
diagnóstico molecular (Doudna y Charpentier 2014). El descubrimiento de CRISPR tuvo
lugar en 1987 cuando Ishino et al. descubrió una secuencia de ADN repetitiva inusual en
Escherichia coli (Barrangou y Marraffini, 2014; Ishino et al., 1987). Los descubrimientos
posteriores han revelado los mecanismos del sistema CRISPR-Cas, estableciendo una
nueva era de inmunidad adaptativa mediada por CRISPR-Cas (Barrangou et al., 2007;
Deveau et al., 2010; Horvath y Barrangou 2010; Murugan et al., 2017). La aplicación
revolucionaria de la tecnología CRISPR-Cas9 en el campo de la edición de genes (Cong et
al., 2013) allanó el camino para las aplicaciones posteriores en otros sistemas CRISPR-Cas
para ciencias básicas y medicina clínica (Ishino et al., 2018). En 2016, los diagnósticos
basados en CRISPR-Cas9 se utilizaron por primera vez para detectar el virus Zike (Pardee
et al., 2016), y en 2017 para detectar Staphylococcus aureus (Guk et al., 2017). Más tarde,
el descubrimiento del efector CRISPR dirigido por ARN y guiado por ARN Cas13
(Gootenberg et al., 2017) y posteriormente fundado Cas12 (Gootenberg et al., 2018) y
Cas14 (Harrington et al., 2018) estableció una etapa de Detección de ácidos nucleicos
basada en CRISPR-Cas12, 13 o 14 (Karvelis et al., 2019; Kellner et al., 2019; Li et al.,
2018b; Myhrvold et al., 2018). El mecanismo de los sistemas Cas12, 13 o 14, que están
programados por ARN guía, permite la especificidad de una sola base en comparación con
las técnicas de diagnóstico molecular basadas en amplificación como la PCR (Gootenberg
et al., 2017). Los métodos generales de detección de ácidos nucleicos basados en CRISPR
se revisaron en varios estudios anteriores (Anson et al., 2020; Ibrahim et al., 2020; van
Dongen et al., 2020; Wang et al., 2020c). Debido al creciente interés en desarrollar sistemas
basados en CRISPR para diagnósticos sensibles y específicos de SARS-CoV-2 en medio de
la pandemia de COVID-19 en curso, en este trabajo, nos enfocamos específicamente en el
progreso reciente de la aplicación de Cas12 y Cas13 para el SARS-CoV -2 detección y
revisó su ensayo, métodos de lectura y la integración del sistema. También discutimos los
desafíos y las perspectivas futuras del diagnóstico de SARS-CoV-2 basado en CRISPR.
2. Flujo de trabajo de muestra a respuesta en la detección de SARS-CoV-2 basada en
CRISPR
La Fig. 1a ilustra los pasos generales para el flujo de trabajo de muestra a respuesta de los
diagnósticos basados en CRISPR de SARS-CoV-2. En el primer paso, se recogen las
muestras de los pacientes. La Tabla 1 resumió las muestras clínicas típicas de SARS-CoV-2
con sus materiales de recolección, temperatura de almacenamiento y rangos de carga viral.
Las formas más generales de las muestras de SARSCoV-2 son hisopos nasofaríngeos y
orofaríngeos (NPS y OPS) (Lin et al., 2020; Yang et al., 2020). Un proveedor de atención
médica puede recolectarlos utilizando hisopos flocados de dacrón o poliéster.
Recientemente, se han introducido muestras de saliva como una fuente alternativa de
muestras para la detección del SARS-CoV-2 (McCormick-Baw et al., 2020; Williams et al.,
2020b). Dado que no requiere consumibles especializados, causa menos molestias al
paciente y reduce el riesgo de exposición de los trabajadores de la salud. Con respecto a la
temperatura de almacenamiento, todos los tipos de muestras se pueden almacenar a 2-8 ◦C
por un período corto (menos de 2-5 días); sin embargo, las muestras deben almacenarse a 􀀀
70 ◦C para almacenamientos y envíos más prolongados. Pan y col. utilizaron ensayos
cuantitativos de RT-PCR para analizar diferentes tipos de muestras de 82 individuos
infectados (Pan et al., 2020). Descubrieron que las muestras obtenidas de esputo mostraron
cargas virales más altas que las muestras de OPS, seguidas de las muestras de heces.
Después de la recolección de la muestra, los ARN virales deben extraerse de la muestra sin
procesar. Los procedimientos de aislamiento de ARN típicamente involucran tres pasos
generales: lisis, separación de ARN de otras macromoléculas como ADN, proteínas y
lípidos, seguida de elución de ARN. Los kits de extracción de ARN se utilizan
generalmente para procesar muestras de pacientes (Eisen et al., 2020; Nalla et al., 2020). La
separación del ARN viral se puede lograr mediante uno de estos tres métodos principales
(Ravi et al., 2020). Purificación de perlas magnéticas. En este método, se utilizan perlas
magnéticas para capturar el ARN viral. Un campo magnético externo mantiene las perlas en
su lugar durante el lavado y la recolección. El formato magnético permite una rápida
recolección / concentración de la muestra. Sin embargo, la captura / liberación de partículas
puede resultar laboriosa cuando se realiza manualmente. Aislamiento de columna giratoria.
En este método, las membranas generalmente fabricadas con fibra de vidrio, sílice
derivatizada o membranas de intercambio iónico se utilizan para atrapar los ARN virales.
Posteriormente, se aplica una fuerza centrífuga o vacío para los pasos de lavado y
recolección. Este método es fácil de realizar y puede automatizarse, pero las membranas
pueden obstruirse con materiales particulados. Extracción orgánica. En este método, las
muestras se homogeneizan en una solución que contiene fenol y luego se centrifugan.
Durante la centrifugación, la fase acuosa superior contiene el ARN viral.
Por lo tanto, se recupera la fase acuosa superior y se recoge el ARN por precipitación con
alcohol y rehidratación. Este método se considera el mejor método para la extracción de
ARN; sin embargo, este método es difícil de automatizar y es laborioso y manualmente
intensivo (Ravi et al., 2020). Tras el aislamiento del ARN viral, se suele adoptar un paso de
amplificación como la RT-PCR, la RTLAMP o la RT-RPA para aumentar el límite de
detección (LoD) (van Dongen et al., 2020). Después, una región específica del SARS-CoV-
2 sería reconocida por el complejo Cas-CRISPR RNA (crRNA) (ARNcr). El tamaño del
genoma del SARS-CoV-2 varía de 29,8 a 29,9 kilo nucleótidos (knt). Más de dos tercios
del genoma comprenden el ORF1ab que codifica las poliproteínas orf1ab; el otro tercio
consiste en genes que codifican proteínas estructurales, incluyendo las de superficie (S), de
envoltura (E) membrana (M), y proteínas N de la nucleocápside (Khailany et al., 2020; Kim
et al., 2020a) (Fig. 1b). Los cebadores de amplificación y los ARNcr deben ser diseñados
específicamente para dirigirse a la misma región del SARS-CoV-2. Para la lectura de la
señal, se puede utilizar la fluorescencia (Li et al., 2018b) o la colorimetría (Bai et al., 2019)
fueron dos de los enfoques más comunes enfoques.
3. Detección del SARS-Cov-2 basada en Cas12
3.1. Sistema Cas12
La proteína Cas12 es uno de los miembros de la familia CRISPR, que puede ser
programarse con un ARN CRISPR (ARNcr) para unirse específicamente a los objetivos
complementarios de ADN de cadena simple y doble (Aman et al, 2020; Pickar-Oliver y
Gersbach 2019). Cas12 ha surgido como una alternativa a Cas9 debido a sus características
distintivas, como la capacidad de dirigirse a motivos ricos en T y no necesitar un ARNcr
transactivador. Hasta la fecha se han descubierto varios subtipos de proteínas Cas12 (Wang
et al, 2020a). La Tabla 2 resume varios subtipos de proteínas Cas12 y sus características. El
tamaño de las proteínas Cas12 varía entre 870 y 1228 aminoácidos (aa). Entre ellas, Cas12a
(cpf1) (Zetsche et al, 2015) y Cas12b (C2c1) (Liu et al., 2017) son las más conocidas.
Recientemente se ha descubierto que Cas12 puede escindir indiscriminadamente los ADN
circundantes que no son objetivos (véase los objetivos de escisión en la Tabla 2) una vez
activada por una molécula de ADN objetivo que coincide con su secuencia espaciadora
(Chen et al., 2018). Esta actividad de transdivisión de Cas12 la convierte en una poderosa
herramienta para detectar un ADN diana específico en una mezcla (Chen et al., 2018;
Gootenberg et al. 2017, 2018; He et al., 2020; Li et al. 2018a, 2019b; Qin et al., 2019;
Wang et al., 2019). Hasta ahora, solo Cas12a y Cas12b se han utilizado para aplicaciones
de diagnóstico, mientras que otros subtipos quedan por explorados (Tabla 2). A
continuación, nos centramos principalmente en el ensayo de Cas12a y sus reglas de diseño
de crRNA debido a su predominio en las aplicaciones. La proteína Cas12 es uno de los
miembros de la familia CRISPR, que puede ser programarse con un ARN CRISPR
(ARNcr) para unirse específicamente a los objetivos complementarios de ADN de cadena
simple y doble (Aman et al, 2020; Pickar-Oliver y Gersbach 2019). Cas12 ha surgido como
una alternativa a Cas9 debido a sus características distintivas, como la capacidad de de
dirigirse a motivos ricos en T y no necesitar un ARNcr transactivador. Hasta la fecha se han
descubierto varios subtipos de proteínas Cas12 (Wang et al, 2020a). La Tabla 2 resume
varios subtipos de proteínas Cas12 y sus características. El tamaño de las proteínas Cas12
varía entre 870 y 1228 aminoácidos (aa). Entre ellas, Cas12a (cpf1) (Zetsche et al, 2015) y
Cas12b (C2c1) (Liu et al., 2017) son las más conocidas. Recientemente se ha descubierto
que Cas12 puede escindir indiscriminadamente los ADN circundantes que no son objetivos
(véase los objetivos de escisión en la Tabla 2) una vez activada por una molécula de ADN
objetivo que coincide con su secuencia espaciadora (Chen et al., 2018). Esta actividad de
transdivisión de Cas12 la convierte en una poderosa herramienta para detectar un ADN
diana específico en una mezcla (Chen et al., 2018; Gootenberg et al. 2017, 2018; He et al.,
2020; Li et al. 2018a, 2019b; Qin et al., 2019; Wang et al., 2019). Hasta ahora, solo Cas12a
y Cas12b se han utilizado para aplicaciones de diagnóstico, mientras que otros subtipos
quedan por explorados (Tabla 2). A continuación, nos centramos principalmente en el
ensayo de Cas12a y sus reglas de diseño de crRNA debido a su predominio en las
aplicaciones.

3.2. Flujo de trabajo del ensayo Cas12a

La Fig. 2a ilustra los pasos típicos para la detección del SARS-CoV-2 basada en Cas12a.
Hay tres pasos principales: amplificación de la transcripción inversa (RT), ensayo de
Cas12a y lectura de la señal. Después de la extracción del ARN viral de las muestras
crudas, la transcripción inversa de los ARN objetivo y el proceso de amplificación podrían
realizarse en uno o dos pasos. En el ensayo de Cas12a, las ampliaciones de la diana se
introducirán en el complejo Cas12a/ARNcr (también conocido como RNP no activado).
Tras la unión de la diana guiada por el ARN específico, la Cas12a realizará un corte
colateral en los reporteros circundantes que no son la diana. Los informadores suelen ser
ADN monocatenario marcado con fluoróforo (FQ) o fluoróforo (FB). Después de la
transdiferenciación del de la cadena de ADN no dirigido, la lectura de la señal puede
realizarse como una reacción basada en la fluorescencia o una reacción basada en la
fluorescencia. o una reacción de flujo lateral colorimétrica de reacción
3.3. Reglas de diseño del ARNcr Cas12a
El ARNcr Cas12a es un único ARN guía de 40-44 bases, que comprende una región de
bucle constante de 20 nt (dominio de bucle) y una región específica de la diana de 20-24 nt
(dominio protospacer). El dominio de bucle es específico de las proteínas Cas12a y el
dominio protospacer debe diseñarse en función de la secuencia de la diana. Los crRNAs
utilizados con Cas12a identifican lugares en la región región objetivo con la secuencia del
motivo adyacente al protospacer (PAM), TTTV, donde V es A, C o G. La Fig. 2b ilustra un
ejemplo de reconocimiento de SARSCoV-2 con el complejo Cas12a/crRNA (Ding et al.,
2020). El ARNcr se une a la cadena de ADN opuesta a la secuencia PAM. Por lo tanto, el
dominio protospacer debería estar exactamente 20-24 bases después de la región PAM de la
región PAM. Las reglas de diseño del crRNA para los otros tipos de proteínas Cas12 son
similares a las de Cas12a; sin embargo, la región PAM y la longitud del protospacer deben
ser alterados (Tabla 2).
3.4. Evaluación comparativa de la detección del SARS-CoV-2 basada en Cas12
La Tabla 3 presenta un resumen de los métodos de detección más actuales basados en
Cas12 basados en Cas12 para el SARS-CoV-2. Hemos organizado esta tabla en tres
secciones: ensayo, lectura de la señal y rendimiento.
3.4.1. Ensayo
Fuentes de muestras. La mayoría de los trabajos utilizaron fragmentos de genes sintéticos
para validar su ensayo. Al trabajar con fragmentos de genes sintéticos se omitió la
extracción de ARN en la preparación de la muestra. Broughton et al. (2020) fueron uno de
los pocos estudios que trabajaron con muestras reales sin procesar. Para extraer ARN de las
muestras de hisopo, utilizaron dos kits diferentes: Qiagen DSP Viral RNA Mini kit y el
instrumento MagNA Pure 24. Efector. Tanto Cas12a y Cas12b se han implementado como
efector en el ensayo CRISPR. Aunque está claro que Cas12a domina, Guo et al., (2020)
establecieron un protocolo de detección del SARS-CoV-2 basado en su estrategia de
detección de ADN mediada por Cas12b (Teng et al., 2019). Dirigirse a la región del gen
del SARS-CoV-2. La mayoría de los estudios evaluaron la sensibilidad de su ensayo
basándose en múltiples regiones del genoma del SARS-CoV2 (Fig. 1b). Por ejemplo, Ali et
al. (2020) diseñaron sus cebadores y ARNcr dirigidos a los genes N y E del genoma del
SARS-CoV-2. Para probar Para probar el rendimiento de su sistema, consideraron 21
muestras positivas con qPCR. Mientras que el ensayo del gen N capturó 18 de las 21
muestras (̃ 86%), el ensayo del gen E sólo detectó 8 de las 21 muestras positivas (̃ 38%).
Lucia et al. diseñaron múltiples cebadores dirigidos a diferentes regiones del ORF1ab y
lograron una LoD ~10 copias/μL (Lucia et al., 2020). En diseñar cebadores adecuados, la
longitud de los cebadores y ampliaciones debe ser compatible con el método de
amplificación. Por ejemplo, se prefiere que los cebadores RPA se prefiere que sean más
largos (30-35 nt) que los típicos cebadores de PCR (18-30 nt) (Euler et al., 2013).
Pre-amplificación. Como se ha demostrado previamente, es un reto para el CRISPR
detectar las dianas en un tiempo práctico (menos de 1 h) cuando la concentración de ADN
objetivo es extremadamente baja (inferior a 10 nM) (Nouri et al., 2020; Teng et al., 2019).
Por lo tanto, la mayoría de los sistemas de detección basados en CRISPR utilizaron
diferentes métodos de amplificación como la PCR (Lee et al., 2017; Li et al., 2018b),
LAMP (Li et al., 2019a), y RPA (Gootenberg et al., 2018) para mejorar su sensibilidad. En
el caso de las dianas de ARN, como el SARS-CoV-2, debe realizarse un paso adicional de
paso de RT debe realizarse antes del proceso de aplicación. Hasta ahora la mayoría de los
estudios utilizaban métodos de amplificación isotérmica como RT-LAMP (Ali et al., 2020;
Broughton et al., 2020), RT-RPA (Ding et al., 2020; Lucia et al., 2020), y RT-RAA (Guo et
al., 2020) para sus ensayos basados en Cas12. La utilización de métodos de amplificación
isotérmica de amplificación isotérmica elimina la necesidad de un termociclador y el
ensayo para aplicaciones en el punto de atención (POC).
Número de pasos. Este proceso de preamplificación puede separarse del ensayo CRISPR
en dos reacciones en dos botes o fusionarse como una reacción en un solo bote. Operar el
ensayo en dos pasos complica el proceso de ensayo, aumenta la manipulación de líquidos y
aumenta potencialmente el riesgo de contaminaciones debido a la transferencia de
transferencia de productos de amplificación. Sin embargo, añadir todos los componentes
(reactivos de amplificación y CRISPR) en un solo bote disminuiría la eficacia debido a las
posibles reacciones cruzadas y a la digestión de los productos de amplificación por el
complejo Cas/ARNcr (Ali et al., 2020). Por lo tanto, para realizar el ensayo en un solo bote,
la Cas12 puede separarse del resto de los componentes añadiendo la proteína Cas12 en una
gota en la pared del tubo (Ali et al., 2020; Ding et al., 2020). Después de ejecutar el proceso
de amplificación la proteína Cas12 puede mezclarse con la reacción para iniciar el ensayo
CRISPR.
3.4.2. Lectura de Señal
Varios mecanismos de lectura, como la fluorescencia (Gootenberg et al, 2017),
colorimétrico (Yuan et al., 2020b), electroquímico (Dai et al.,2019), y electrónico (Nouri et
al., 2020) se han introducido para ensayos basados en CRISPR. Los primeros sistemas de
detección basados en Cas12 o Cas13 se basaban en la detección de un aumento de la señal
de fluorescencia tras reconocimiento de la secuencia diana por parte del complejo RNP
(Gootenberg et al, 2018; Li et al., 2019a). Sin embargo, los lectores de fluorescencia son
normalmente voluminosos, caros y no son adecuados para las aplicaciones POC. Varios
estudios han intentado reducir el tamaño y el coste de los fluorómetros (Katzmeier et al.,
2019; Qin et al., 2019). Por otro lado, los sensores colorimétricos son adecuados para las
aplicaciones POC, ya que son fáciles de usar, rentables y accesibles (van Dongen et al.,
2020). Ensayo de flujo lateral (LFA) es el sistema de lectura colorimétrica más común
(Shao et al, 2019; Yuan et al., 2020a). Muchos estudios adaptaron las plataformas LFA
como su sistema de lectura para los métodos de detección CRISPR (Bai et al., 2019; Chang
et al., 2020). Además, la lectura electrónica es un enfoque muy prometedor enfoque debido
a su potencial de integración (Bruch et al., 2019; Dai et al., 2019). Mientras que los
sensores electrónicos, como los nanoporos, se utilizaron con dCas9 (Ashley et al., 2018;
Yang et al., 2018) y con Cas12a (Nouri et al., 2020), su adopción para la detección del
SARS-CoV-2 basada en CRISPR basada en CRISPR aún no se ha desarrollado
3.4.3. Rendimiento
El tiempo de ensayo para la autorización de uso de emergencia (EUA) del CDC qRT-PCR
para detectar el SARS-CoV-2 es de alrededor de 2 horas (sin considerar el tiempo de
preparación de la muestra) (Broughton et al., 2020). En comparación, todos los estudios
basados en Cas12 informaron de que su tiempo de respuesta era inferior a 1 hora (sin tener
en cuenta el tiempo de preparación de la muestra). El LoD para el ensayo CDC probado por
el Departamento de Salud Pública de California fue estimado en 1 copia/μL de reacción
(Broughton et al., 2020). Por otro lado, todos los ensayos basados en Cas12a demostraron
una LoD consistente de 10 copias/μL (Ali et al., 2020; Broughton et al., 2020; Ding et al.,
2020; Guo et al., 2020; Lucia et al., 2020).
4. Detección del SARS-Cov-2 basada en Cas13
4.1. Sistema Cas13
La proteína Cas13 es otro miembro de la familia CRISPR. A diferencia de las
otras proteínas CRISPR, Cas13 se dirige a los ARN en lugar de a los ADN (Aman et al.,
2020). Cas13 abarca cuatro subtipos divergentes (Cas13a a Cas13d) (Cox et al., 2017). Las
características de estos subtipos se resumidas en la Tabla 4. El tamaño de las proteínas
Cas13 oscila entre 954 y 1389 aa. Cas13a (también conocida como C2c2) es la primera y
más conocida proteína Cas13 que se ha implementado en la mayoría de las aplicaciones de
diagnóstico basadas en Cas13. Al igual que Cas12, Cas13 presenta una actividad de corte
cuando es activada por secuencia de ssRNA que se complementa con su espaciador de
crRNA. Sin embargo, Cas13 activado escinde todos los ssRNAs circundantes (Tabla 4) en
lugar de ADNs. Esta propiedad se ha utilizado in vitro para realizar diagnósticos altamente
específicos (Abudayyeh et al., 2019; Gootenberg et al., 2017; Kellner et al., 2019). Hasta
ahora, Cas13a era el más utilizado en la mayoría de los diagnósticos basados en Cas13. A
continuación, nos centraremos en el ensayo Cas13a y sus reglas de diseño de crRNA.
4.2. Flujo de trabajo del ensayo de Cas13a
La Fig. 3a presenta los pasos típicos del SARS-CoV-2 mediante sensores basados en
Cas13a. El proceso es casi idéntico al método basado en Cas12a con algunas pequeñas
variaciones. Dado que las dianas de ARN sólo activarían las proteínas Cas13a, se necesita
una transcripción T7 adicional después de la amplificación para convertir las ampliaciones
de ADN en ARN. Afortunadamente, este paso puede fusionarse con la amplificación y el
ensayo de Cas13a como una única reacción de de reacción (Kellner et al., 2019). Además,
dado que Cas13a activado escinde el ssRNA en lugar del ssDNA, los reporteros deben
diseñarse utilizando ssRNA en contraste con los reporteros de ssDNA utilizados en los
sistemas Cas12a
4.3. Reglas de diseño del ARNcr Cas13a
El ARNcr de Cas13a contiene un único bucle madre específico de Cas13a y un dominio
protospacer específico de la diana. Cas13a requiere un dominio protospacer de al menos 22
nt de longitud para escindir eficazmente los ssRNA (Abudayyeh et al., 2016). La longitud
óptima del protospacer observada para Cas13a es de 28 nucleótidos de longitud (Khan et
al., 2018). La estructura de bucle de tallo del crRNA también es crítica para la escisión del
ssRNA. Abudayyeh et al. (2016) demostraron que se requiere un bucle de tallo de más de
24 nt para que Cas13a medie la escisión del ssRNA. Abudayyeh et al. también analizaron
las regiones flanqueantes de los protoespaciadores. Encontraron que las secuencias que
comienzan con un G inmediatamente después del extremo 3′ del protospacer eran menos
eficaces en relación con todos los demás nucleótidos (A, U o C). Por lo tanto, el sitio de
flanqueo del protoespaciador (PFS) debe ser considerado en los diseños de crRNA para el
efector Cas13a. La Fig. 3b muestra un ejemplo de reconocimiento del SARS-CoV-2 con el
complejo Cas13a/ARNcr, dirigido al ORF1ab (Hou et al., 2020). El dominio protospacer
tiene 27 nt de longitud, complementando el sitio objetivo del SARS-CoV-2. El dominio de
bucle es una estructura de bucle de tallo de 36 nt de longitud que se obtuvo a partir de un
diseño de Gootenberg et al. (2017). Los otros subtipos de diseños de ARNcr Cas13a son
similares a los de Cas13a; sin embargo, la región PFS y la longitud del dominio protospacer
son diferentes (Tabla 4).
4.4. Evaluación comparativa de la detección del SARS-CoV-2 basada en Cas13
La tabla 5 ofrece un resumen de los métodos de detección de Cas13 más actuales para el
SARS-CoV-2. A continuación, compararemos sus métodos y rendimiento.
4.4.1. Ensayo
Fuentes de muestras. La mayoría de los trabajos basados en Cas13 probaron su sistema
con muestras reales después de validar sus ensayos con genes sintéticos. Arizti-Sanz et al.
(2020) probaron las muestras de saliva y detectaron con éxito el SARS-CoV-2 mediante el
ensayo Cas13a. Su extracción de ARN se realizó utilizando el kit de aislamiento de ARN
total MagMAX™ mirVana™. En otros estudios (Hou et al., 2020; Patchsung et al., 2020),
se utilizaron hisopos nasofaríngeos.
Efector. Hasta ahora, la mayoría de los estudios emplearon Cas13a como efector del
ensayo para detectar el SARS-CoV-2. Aunque otros miembros de la familia Cas13 aún no
se han implementado para el diagnóstico, es muy deseable explorarlos, ya que podrían
relajar las restricciones de la secuencia del SFP al diseñar la región objetivo específica.
Gen objetivo del SARS-CoV-2 Región. Al igual que en los ensayos Cas12, la mayoría de
los estudios examinaron múltiples genes como sus objetivos para optimizar el rendimiento.
Sin embargo, diferentes estudios genes fueron reivindicados por diferentes estudios como la
mejor diana para lograr sensibilidad más alta. Por ejemplo, Hou et al. (2020) alcanzaron el
mejor sensibilidad y especificidad seleccionando su objetivo de la región ORF1ab.
seleccionando su objetivo de la región ORF1ab (después de evaluar el rendimiento de dos
conjuntos de cebadores dirigidos a los genes N y Orf1ab). Por otro lado, Patchsung et al.
(2020) lograron una LoD de 10 copias/μL dirigiéndose al gen S en comparación con una
LoD de 104 copias/μL para tres conjuntos de cebadores dirigidos a los genes N y Orf1ab.
Pre-amplificación. Se seleccionó la RT-RPA como método de amplificación para la
mayoría de los métodos basados en Cas13 para la detección del SARS-CoV-2. En
comparación con la LAMP, la RPA parece ser una tecnología atractiva para el diagnóstico,
ya que es más rápida y tiene un diseño de cebador más sencillo (Zou et al., 2020). El RPA
también puede realizarse a temperatura ambiente, lo que lo hace ideal para aplicaciones
POC (Crannell et al., 2014).
Número de pasos. En el ensayo de Cas13a, el proceso de amplificación puede fusionarse
con la transcripción de T7 y la detección basada en Cas13. Arizti-Sanz et al., (2020)
compararon la sensibilidad de los ensayos de uno y dos pasos. Inicialmente, observaron que
la sensibilidad del ensayo de dos pasos era drásticamente inferior a la de uno (LoD de 106
copias/μL respecto a LoD de 10 copias/μL para el ensayo de dos pasos). Esto se debió a la
incompatibilidad de las reacciones enzimáticas con las condiciones dadas. Posteriormente,
tras optimizar los pH, la sal monovalente, el magnesio y las concentraciones de cebadores,
lograron una LoD idéntica para los ensayos de dos y un paso (10 copias/μL).
4.4.2. Lectura de la señal
Al igual que los métodos basados en Cas12, la fluorescencia (Hou et al., 2020; Rauch et al.,
2020) y la colorimetría (Metsky et al.,2020) fueron los únicos métodos de lectura de señales
elegidos para los métodos basados en Cas13 para la detección del SARS-CoV-2. Rauch et
al.,(2020) fueron uno de los estudios que exploraron la utilización de instrumentos de bajo
costo, portátiles y listos para el campo para su ensayo y sistema de lectura de señales. Para
la amplificación por PCR, utilizaron el miniPCR mini16, que era un termociclador
asequible y conveniente para las aplicaciones POC. En lugar de utilizar fluorímetros
convencionales, utilizaron un visualizador de fluorescencia de cartón P51 de cartón P51
alimentado por una pila de 9V para su sistema de lectura
4.4.3. Rendimiento
El rendimiento de los ensayos basados en Cas13 fue casi idéntico al de los basados en los
basados en Cas12. La mayoría de los estudios informan de que su LoD de ensayo es de 10
copias/μL, y su tiempo de respuesta fue inferior a 1 hora (Tabla 5).
5. Resumen y perspectiva de futuro
La tecnología CRISPR ofrece una atractiva oportunidad para facilitar alternativas o mejoras
superiores al proporcionar un ensayo rápido, en el campo sensible y específico para la
detección del SARS-CoV-2. Hasta ahora, la mayoría de los sistemas CRISPR-Cas
utilizaban las proteínas Cas12 o Cas13 como hasta ahora, la mayoría de los sistemas
CRISPR-Cas utilizaban proteínas Cas12 o Cas13 como efectores CRISPR en sus ensayos.
Sin embargo, otros tipos de efectores CRISPR como Cas9 (Wang et al., 2020b) y dCas9
(Lee et al., 2018; Yang et al., 2018) se han implementado para la detección de otros
patógenos. La utilización de los otros tipos de proteínas CRISPR podría ampliar el rango de
detección de la señal (Wang et al., 2020a) y proporcionar nuevos métodos de lectura de la
señal (Hajian et al., 2019; Koo et al., 2018). Si bien la detección basada en CRISPR mostró
un gran potencial en la detección específica, sensible y asequible de ácidos nucleicos
detección en el último par de años, este campo todavía está en sus inicios. En particular, el
desarrollo de dispositivos de punto de atención basados en CRISPR es muy deseable. Para
ello, es necesario abordar los siguientes retos.
Preparación integrada de la muestra. Según las directrices de la OMS, las características
clave para acceder a la practicidad de un dispositivo de diagnóstico POC son asequible,
sensible, específico, fácil de usar, rápido y robusto sin equipamiento, y entregable
(ASSURED). Sobre la base de estas directrices el factor más crítico que falta en los
métodos CRISPR es el tiempo de ejecución del ensayo (Anson et al., 2020). La preparación
de las muestras constituye una gran parte de los métodos de diagnóstico basados en
CRISPR. Además, la preparación de la muestra se realiza casi por separado en todos los
estudios existentes. Este proceso Este proceso aumentaría la complejidad de la prueba
basada en CRISPR y reduciría la facilidad de uso del ensayo. Es deseable crear una prueba
de diagnóstico que combine todos los pasos con una sola acción requerida por el usuario.
Afortunadamente, varios estudios ya han estudiado la preparación de las muestras de
SARS-CoV-2 para agilizar y simplificar el proceso (Marais et al, 2020; Rabe y Cepko
2020; Wozniak et al., 2020). Además, algunos estudios también han examinado el ensayo
sin preparación de muestras utilizando RT-PCR (Lübke et al., 2020) y RT-LAMP (Wei et
al., 2020). Los futuros trabajos de trabajos deberían centrarse en el desarrollo de un proceso
totalmente racionalizado (raw muestra en bruto) combinando a la perfección la preparación
de la muestra con el ensayo CRISPR.
Regiones objetivo limitadas. Para los efectores Cas12 y Cas13, la secuencia secuencia
objetivo está limitada a regiones específicas debido a la restricción de PAM o PFS. Esto
podría ser problemático para las secuencias objetivo cortas. Por lo tanto, deberían
explorarse y ampliarse otras variaciones de Cas con especificidades PAM o PFS alteradas
deben ser exploradas y ampliadas. Por ejemplo, Kleinstiver et al. diseñaron una variante
mejorada de Cas12a de Acidaminococcus sp. (enAsCas12a) (Kleinstiver et al., 2019). La
nueva enAsCas12a tiene la capacidad de reconocer las PAMs VTTV/TTTT/TTCN/TATV.
El descubrimiento de las nuevas proteínas Cas y también la utilización de otros tipos de
proteínas Cas como Cas9 (van Dongen et al., 2020) y Cas14 (Harrington et al., 2018)
podrían mejorar significativamente la flexibilidad de elegir y diseñar las regiones objetivo
específicas.
Multiplexación. Muchas aplicaciones requieren la detección de más de una diana en una
sola reacción, lo que se denomina multiplexación. La detección multiplexada a partir de
una sola muestra ofrece numerosas ventajas, como la rapidez tiempos de respuesta y el bajo
consumo de muestras (Dincer et al., 2017). Sin embargo, la detección multiplexada es un
reto debido a la interferencia entre las moléculas de reconocimiento y varios analitos y a las
posibles reacciones cruzadas (Li et al., 2019c). Uno de los principales problemas de los
sistemas Cas12 y Cas13 para la detección multiplexada es la escisión colateral no
específica de todos los ssD. de todas las secuencias de ssDNA/ssRNA, que posiblemente
destruyan los otros objetivos. Gootenberg et al. desarrollaron uno de los primeros sistemas
Cas utilizando cuatro efectores Cas diferentes (PsmCas13b, LwaCas13a, CcaCas13b, y
AsCas12a) para detectar cuatro objetivos diferentes en una sola reacción (Gootenberg et al.,
2018). Si bien este enfoque mostró la posibilidad de detección multiplexada en los sistemas
CRISPR, la ampliación de la detección multiplexada está limitada por la cantidad de
diferentes efectores Cas. Este puede ser un tema de investigación importante para la futura
detección de ácidos nucleicos basada en CRISPR. basado en CRISPR.
Mejora del rendimiento de detección de CRISPR. Se han introducido nanomateriales e
inteligencia artificial para mejorar el rendimiento de la detección CRISPR con respecto a la
mejora de la señal (Rabiee et al.,2020) y la clasificación (Ibrahim et al., 2020). Por ejemplo,
Bao et al. desarrollaron un sencillo sistema de detección visual acoplado con puntos
cuánticos como indicador de ultrabrillo y un ensayo CRISPR-Cas12a para para la detección
isotérmica de objetivos de ADN viral. Evitaron los instrumentos de detección voluminosos
y complicados y utilizaron una linterna de mano para distinguir entre muestras positivas y
negativas. Además, la tecnología de detección en el punto de atención de atención puede
combinarse con la inteligencia artificial (IA) para para mejorar el almacenamiento, la
clasificación y el intercambio de datos (Kaushik et al., 2020). Por ejemplo, Ibrahim et al.
combinaron la tecnología del internet de las cosas y el aprendizaje automático con la
detección CRISPR para la transmisión inalámbrica de señales a través de la nube para
apoyar la toma de decisiones (Ibrahim et al., 2020). Esto abre muchas posibilidades para
mejorar aún más el rendimiento de detección de CRISPR en el futuro.
Declaración de intereses competitivos
Los autores declaran que no tienen intereses económicos en competencia ni relaciones
personales que pudieran parecer influir en el trabajo presentado en este documento.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (R61AI147419), y la
National Science Foundation (1710831, 1902503 y 1912410). Las opiniones, resultados y
conclusiones o recomendaciones expresadas en este trabajo son las de los autores y no
reflejan necesariamente los puntos de vista de la National Science Foundation.