Generalidades Interacciones Ácidos Nucleicos - Proteína

Generalidades de las
interacciones ácidos nucleicos -

proteína
Dr. Manuel Sanguinetti

Sección Bioquímica, Fcien
msanguinetti@fcien.edu.uy
2
Interactores – repaso estructural
ADN
PROTEÍNAS
ARN
3
Principios de reconocimiento AN-Proteína
• las proteínas de unión a ácidos nucleicos (AN) discriminan entre

potenciales sitios de unión basándose en su secuencia,
estructura o una combinación de ambos.
• A pesar de las diferencias entre ARN y ADN, las proteínas utilizan

estrategías similares para reconocerlos.
4
• Fuerzas que contribuyen a la formación de complejos
ácidos nucleicos-proteína
- no covalentes, todas relativamente débiles y la afinidad global resulta

de la suma de muchas interacciones.
Interacciones:
- Electróstaticas
- hidrofóbicas. (proteína-bases
nitrogenadas, participan AAs
aromáticos)
- polares (enlaces de H directos o

mediados por moléculas de agua).
- de Van der Waals. 5


Interacciones:
- Electróstaticas
aromáticos)

AN son polianiones

Interacciones:
- Electróstaticas
aromáticos)


• Estas interacciones son transitorias, dinámicas,

sucesivas. Ejemplo: topoisomerasa tipo I
8
Annu. Rev. Biochem. 2001.70:369-413
A tomar en cuenta…..
• duplex ADN es un desafío para el reconocimiento debido a su
homogeneidad estructural.
• los AN simple cadena desestructurados son los más flexibles,

permitiendo un acceso más fácil a sus grupos funcionales.
• el reconocimiento ARN-Proteína se asemeja al reconocimiento

proteína-proteína, debido a la gran variedad de superficies que el ARN
plegado puede crear.
• las interacciones AN-Proteína involucran frecuentemente cambios

conformacionales en uno o ambos participantes.
9
• Clasificación de las interacciones moleculares de

los AN-proteína:
Interacciones inespecíficas:
• independientes de la secuencia / estructura
• carga esqueleto azúcar-fosfato
• simple y doble hebra
10
Interacciones inespecíficas
• Ejemplo: ADN polimerasas Fragmento Klenow ADNpol I
Pulgar: interacciones con carga

(-) de la columna de fosfatos
Palma: enlaces de H con surco

menor, pero sin especificidad
de secuencia.
11
Interacciones inespecíficas
• Ejemplo: Histonas
- 142 puentes de hidrógeno (entre aminoácidos y O del

enlace fosfodiéster cerca del surco menor).
- enlaces por cargas (+, de Lys y Arg) de histonas y P del

ADN.
12
Interacciones inespecíficas:
cómo aprovecharlas para purificar proteínas de unión a ADN
• Uso de competidor inespecífico: Heparina
glucosaminoglucano
altamente sulfatado
https://www.york.ac.uk/chemistry/news/deptnews/cracking-the- 13
chiral-code-of-dna-binding
• Clasificación de las interacciones moleculares

de los AN-proteína:
Interacciones específicas:
Dependientes de secuencia Dependientes de estructura

(lectura directa): (lectura indirecta):
interacciones específicas con reconocimiento de una

grupos funcionales de bases secuencia a través de
nitrogenadas. propiedades conformacionales y
dinámicas de los AN.
Reconocimiento de secuencias
específicas (secuencias
consenso) 14
Dependientes de secuencia
• La mayoría de las proteínas de unión al ADN que

hablaremos en el curso reconocen secuencias específicas.
15
Lectura directa por dominios de unión a ADN
16
A = aceptores de enlaces de H
D = donadores de enlaces de H
H = hidrógenos no polares
M = grupos metilo
17
• una HÉLICE DE RECONOCIMIENTO que se inserta en el surco

mayor es la característica más común de proteínas que se unen
de manera específica al ADN. 18
Dependientes de estructura
Variaciones globales de estructura

curvatura
R: purina
Y: pirimidina
p: enlace fosfodiéster
(indica nucleótidos
contigüos)
19
Dependientes de estructura
Variaciones locales de estructura:
“KINK” (quiebre): cuando hay una falta

completa o parcial de apilamiento en un solo
paso de par de base.
Estrechamiento del surco menor: se

genera por un patrón de enlaces de H
distinto entre cada para de base y de
apilamiento.
20
Dependientes de secuencia y estructura
Muchas proteínas utilizan LECTURA DIRECTA e INDIRECTA para
identificar sus sitios blanco preferidos
Ejemplo: CAP (Catabolite Activator Protein)
• el ADN en el sitio de unión a CAP esta intrínsecamente curvado.
Sitios que contribuyen a la curvatura del sitio de unión

21
Interacciones ADN- proteína
22
Interacciones ADN-proteína
• las proteínas de unión a secuencias específicas en el ADN

juegan roles clave en distintas actividades reguladoras del
ADN como: replicación, recombinación, reparación y
transcripción.
23
Factores de transcripción
• una de las clases más grandes y diversas de estas proteínas son
los reguladores transcripcionales que se unen al ADN para
iniciar su transcripción a ARN.
24
Interacciones ADN-proteína – Teoría Modular
• En general, las proteínas de unión al ADN tienen dominios

funcionales separados (TEORÍA MODULAR)
Dominio de unión a ADN
Dominio de activación
Región linker
25
Interacciones ADN-proteína
Experimento de intercambio de dominios (Brent and Ptashne. 1985. Cell
43: 729-736)
Watson, 2013
Proteínas quiméricas:
Gal4 – regulación de genes GAL de Saccharomyces cerevisiae.
LexA- represor de Escherichia coli que regula la respuesta SOS.

26
Dominios de unión a ADN
• HÉLICE-VUELTA-HÉLICE (helix-turn-helix)
- Bacterias y bacteriofago:
generalmente homodímeros
Represor fago λ Represor Trp

PDB 2OR1 Bacteria
27
• HÉLICE-VUELTA-HÉLICE (helix-turn-helix)
Eucariotas (en general monoméricos)
N-terminal interacciona con el

SURCO MENOR
Homeodominio
e.g. antennapedia
Variante: Winged helix-turn-helix 28
• CREMALLERA DE LEUCINA Hélice α anfipática
Dímero de hélices alfa extendidas “Coiled Coil” 29

• CREMALLERA DE LEUCINA
Región de DIMERIZACIÓN en el C-terminal que es estabilizada por un repetido
de 7 residuos aminoacídicos (a – g).
Krylov & Vinson, 2001
Vista de “lado” Vista desde “arriba”
a y d son hidrofóbicos
(en general Leucina y Valina). FORMAN
CUIDADO: en este esquema no se muestra INTERFASE DE DIMERIZACIÓN.
el superenrollamiento de las 2 hélices.
• CREMALLERA DE LEUCINA
Región de DIMERIZACIÓN en el C-terminal que es estabilizada por un repetido
de 7 residuos aminoacídicos (a – g).
Krylov & Vinson, 2001
Vista de “lado” Vista desde “arriba”
e y g, flanquean la interfase de dimerización, usualmente corresponden a AAs

cargados que interaccionan entre ambas hélices. Estas interacciones carga-carga son
importantes para la regulación de la especificidad de dimerización. 31
• CREMALLERA DE LEUCINA (basic leucine zipper)
- Se encuentran principalmente en
eucariotas.
- Pueden formar homo o heterodímeros.
- homodímeros reconocen típicamente sitios

palindrómicos.
Región rica en AAs básicos

Adopta su estructura 2ria solo al unirse al ADN
cada extensión de hélice puede unir hasta 5

pb de manera secuencia-específica (dímero
e.g. GCN4
10 pb) 32
• HÉLICE-BUCLE-HÉLICE (basic helix-loop-helix)
Similitudes con el dominio cremallera de

leucina:
- Dominio de dimerización C-terminal (donde se

enrollan las hélices)
- Región N-terminal básica que contacta al ADN en
el surco mayor.
- Pueden formar homo o heterodímeros.
¿En que se diferencia con la cremallera de Leu?
Los segmentos N y C-t no son parte de

las mismas hélices, sino que son 2
hélices separadas que se conectan por
e.g. Max
un "loop" o bucle.
33
La región con el loop también puede participar en el contacto con el esqueleto azúcar-fosfato.
Dominios de unión a ADN que unen ZINC
• Dedos de Zinc
- Dominios que emplean uno a más iones de Zn.

Son los más comunes en eucariotas.
- Existen distintas subfamilias de estos dominios

que se definen por el tipo (Cys o His) y rearreglo de
AAs que median la coordinación TETRAHÉDRICA
del Zn y por lo tanto del plegamiento general del
dominio.
34
• Dedos de Zinc.
- el ión de Zn es utilizado como elemento

estructural para mediar el plegamiento de la
cadena polipeptídica relativamente corta.
- además de unirse al ADN, varios de estos

dominios también actúan como regiones de
interacción PROTEÍNA-PROTEÍNA.
- los dominios más estudiados son:
Cys2-His2
Cys2-Cys2
Cys2-Cys2 GATA-1-like
35
• Dedos de Zinc (Cys2His2)
.
Motivo se secuencia:
Cys-X2-4-Cys-X3-Phe-X5-Leu-X2-His-X3-His
(X es cualquier AA)
e.g. TFIIIA - Xenopus 36

• Dedos de Zinc (Cys2Cys2 GATA like)
Motivo se secuencia:
e.g. GATA
Cys-X2-Cys-X1-3-Cys-X2-Cys
(X es cualquier AA)
Ligan el Zn2+ a través de estas

4 Cys.
- 2 hojas β antiparalelas irregulares y una hélice α, seguido de un loop

C-terminal largo. Este loop y la hélice α interaccionan con el surco
mayor del ADN, mientras que el extremo C-t realiza contactos
adicionales con el surco menor.
- Al contrario que las Cys2His2 este motivo ocurre solo 2 veces por
cadena polipeptídica (y los 2 unen al ADN). 37
• Dedos de Zinc (Cys2Cys2)
1er dedo: unión al ADN
2do dedo: dimerización
e.g. receptor de estrógeno (homodímero)
38
• Dedos de Zinc (Cys2Cys2)
1er dedo: unión al ADN
2do dedo: dimerización
e.g. receptor de estrógeno (homodímero)
39
• Cluster binuclear de Zinc (Zn2Cys6)
Dominio de
homodimerización de - exclusivamente en hongos
tipo “coiled coil”
- el dominio se pliega alrededor de
2 iones de Zn que son coordinados
tetraédricamente por 4 residuos Cys,
(2 Cys compartidos por 2 iones de
Zn)
e.g. Gal4
Los homodímeros se unen a

regiones ricas en CG (CGG)
40
Otros dominios de unión a ADN
• β-ribbon
- en procariotas, bacteriófagos y en
eucariotas (e.g. TBP).
- Reconocimiento de surco mayor por
hojas β.
- Los elementos estructurales por fuera

de la hoja β contribuyen con contactos
para dimerización e interacción con
esqueleto azúcar-fosfato.
e.g. Represor Met

(bacteria) 41
• Plegamiento tipo inmunoglobulina
- en eucariotas superiores
Hojas β: andamiaje
- plegamiento encontrado en los anticuerpos
(sandwich β: hojas β y "loops" de tamaño
variable que conectan las cadenas β –
provee andamiaje para la presentación del
“loop”).
- Un “loop” interviene en el reconocimiento

de surco mayor.
e.g. p53:
“Loop” 1 y hélice 2
interaccionan con el surco
mayor.
“Loop” 3 interacciona con
esqueleto
42
• HMG (“High Mobility Group)
- encontrados desde levaduras a humanos.
e.g. LEF-1 - 2 subclases:

unión inespecífica: varios dominios HMG
unión específica: 1 solo dominio HMG.
- Se unen principalmente al surco menor,

ensanchándolo.
Contiene 3 hélices alfa que se asocian a través de un core hidrofóbico en un

plegamiento en forma de L: 2 hélices alfa cortas forman un brazo de la "L", y la
hélice más larga forma el brazo largo de la "L“ (la superficie cóncava acomoda un
duplex de ADN doblado a lo largo del surco menor, ensanchándolo). 43
Interacciones ARN-proteína
44
Interacción ARN-Proteína
• A tomar en cuenta….
- el ARN se pliega con mayor variedad de estructuras que el ADN, debido a su
síntesis como simple cadena, los contactos estabilizadores realizados por el
grupo 2´OH y apareamientos de bases no canónicos.
Esto permite crear varias superficies que pueden evolucionar para

unirse a un gran número de sustratos 45
• A tomar en cuenta….
- En el ARN doble hebra el reconocimiento del surco menor es facilitado por
los apareamientos de bases no canónicos (no Watson-Crick), que presentan
grupos funcionales distintivos, en un surco que de otra manera sería
desinformativo (cómo ocurre en el ADN):
- Las protuberancias u otras interacciones no Watson-Crick pueden
ensanchar el surco mayor para facilitar su reconocimiento.
apareamientos de
bases no canónicos
46
• Tipos de ARN:
Los complejos ARN-proteína son

participantes clave en los procesos de
regulación de la expresión génica.
47
Dominios de unión a ARN
Lunde et al.
2007
48
La modularidad facilita la función:
- Versatilidad
- Mayor especificidad y afinidad e.g. Pumilio
49
Diálogo cruzado entre las

proteínas y el ARN
Ejemplos de uniones
específicas e inespecíficas
ARN-proteínas
50
• Bases modificadas en el ARNm pueden actuar como
sitio blanco de unión de proteínas:
51
Células humanas
Proteínas de unión a ADN y ARN
TDP-43:
Sobre ADN: reprime la transcripción
Sobre ARN: regula el “splicing” del gen
CFTR.
Hudson & Ortlund, 2014
52
Métodos de estudio de las
interacciones ácidos nucleicos-
proteína
53
Métodos de estudio de las interacciones AN-proteína
a) Búsqueda de la proteína que reconoce una secuencia blanco

hipotética
- Cromatografía de afinidad–espectrometría de masas
- Bioinformatica de motivos de unión al ADN
b) Búsqueda de la secuencia blanco de una proteína

- SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)
- IP-secuenciación
- ChIP/RIP-SEQ
c) Mapeo de la interacción:
- EMSA
- Footprinting. Ensayos de protección y de interferencia
54
d) Estudio estructural de la interaccion:

- Cristalografía de rayos X, NMR, Dicroismo circular, Microscopía
Electrónica (Cryo-EM).
e) Ensayos funcionales
- Mutaciones en el sitio blanco
- Mutaciones en la proteina
- Ensayos de genes reporteros
55
a) Búsqueda de la proteína que reconoce una secuencia

blanco hipotética
Cromatografía de
afinidad–espectrometría
de masas
Alberts, 2014 56
b) Búsqueda de la secuencia blanco de una proteína
Alberts, 2014 57
c) Mapeo de la interacción:
- EMSA Alberts, 2014
- Footprinting. Ensayos de protección y de interferencia
EMSA – geles de retardo 58

“Footprinting”
c) Mapeo de la interacción: EMSA (geles de retardo) – ADN y ARN
≤ 250 pb
a y b: tipos
celulares distintos
Retardo (provocado
por la unión de la
proteína a la sonda)
(+) y (-): presencia o

ausencia de sonda sin
marcar en exceso,
respectivamente.
Sonda libre (sin unirse)
Autoradiografía de gel de
poliacrilamida (se utilizó un
oligonucleótido marcado 59
Transcription factors: a practical approach (1999) radioactivamente como sonda).
c) Mapeo de la interacción: EMSA (geles de retardo) – ADN y ARN
≤ 250 pb
a y b: tipos
celulares distintos
Retardo (provocado
por la unión de la
proteína a la sonda)
Este ensayo posee limitaciones, ya que no revela cuales son los
nucleótidos en la secuencia que son reconocidos por, y que
interaccionan con, la proteína. (+) y (-): presencia o
ausencia de sonda sin
marcar en exceso,
respectivamente.
Sonda libre (sin unirse)
Autoradiografía de gel de
poliacrilamida (se utilizó un
oligonucleótido marcado 60
Transcription factors: a practical approach (1999) radioactivamente como sonda).
c) Mapeo de la interacción: DNA footprinting
Los experimentos de “footprinting” utilizan químicos y enzimas que modifican
el ADN para obtener información detallada de qué nucleótidos participan en la
interacción ADN-proteína.
Cuando las proteínas de unión a secuencias específicas de ADN están unidas a

las mismas, estás protegen a los nucleótidos presentes en el sitio de unión (y
aledaños) de sufrir modificaciones químicas o de ser “cortados” por una nucleasa
(PROTECCIÓN).
61
e.g. Ensayo de protección a DNAsaI
Sonda ADN (75-600 pb)

marcada con 32P en Huella o “footprint” como resultado de la
una sola hebra.
protección de la proteína de unión al ADN en
estudio, a la DNAsaI.
Autoradiografía de un gel de poliacrilamida
Protección: las proteínas de unión a

secuencias específicas en el ADN,
protegen a los nucleótidos comprendidos
en éstas, de sufrir modificaciones
químicas o ser cortados por nucleases
(e.g. DNasaI).
62
Transcription factors: a practical approach (1999)
Los experimentos de “footprinting” utilizan químicos y enzimas que modifican
el ADN para obtener información detallada de qué nucleótidos participan en la
interacción ADN-proteína.
Cuando las proteínas de unión a secuencias específicas de ADN están unidas a

las mismas, estás protegen a los nucleótidos presentes en el sitio de unión (y
aledaños) de sufrir modificaciones químicas o de ser “cortados” por una nucleasa
(PROTECCIÓN – e.g. DNAseI footprinting).
La modificación química del ADN puede inhibir la interacción de proteínas de

unión con sus secuencias específicas, debido a cambios en nucleótidos críticos
para esta unión (INTERFERENCIA – e.g. interference footprinting).
63
Sonda ADN (75-600 pb)
marcada con 32P en e.g. Ensayo de interencia por metilación
una sola hebra.
C: patrón de metilación de ADN que no se unió a
Modificación del ADN la proteína.
previo a la exposición a Huella o D: patrón de metilación de ADN que sí se unión a
la proteína (a ≠ del “footprint” la proteína.
ensayo de protección).
Interferencia: la modificación
química del ADN puede inhibir la
unión de proteínas a secuencias
específicas debido a cambios en
nucleótidos críticos para esta unión.
Autoradiografía de un gel de poliacrilamida
Tomado y modificado de “Transcription factors: a practical

64
approach” (1999) y “Eukaryotic transcription factors” (2008).
- Mutaciones en la proteína
65
- Mutaciones en la proteína
66
Bibliografía
Libros:
• Alberts et al, 2014. Molecular Biology of th Cell. 6th edition.
• Watson et al, 2013. Molecular Biology of the Gene. 7th edition.
• Protein-Nucleic Acid Interactions. 2008. Editores: Rice & Correl.

Published by The Royal Society of Chemistry. Capítulos 1, 3, 4 y 7.
• Transcription factors: A practical approach (2nd edition, 1999). Editor:

David. S. Latchman. Oxford University Press. Capítulos 1 y 2.
• Eukaryotic transcription factors (5th edition, 2008). Academic Press

(Elsevier). Editor: David. S. Latchman. Capítulo 2.
67
Bibliografía
Revisiones:
• Origins of Specificity in Protein-DNA Recognition. Rohs et al. Annu. Rev.
Biochem. 2010. 79:233–69
• Specificity and nonspecificity in RNA–protein interactions. Jankowsky &
Harris. 2015. Nature Reviews Molecular Cell Biology;
doi:10.1038/nrm4032
• A brave new world of RNA-binding proteins. 2018. Hentze et al. Nature
Reviews Molecular Cell Biology.
• The structure, function and evolution of proteins that bind DNA and RNA.
Hudson & Ortlund. 2014. Nature Reviews Molecular Cell Biology.
• RNA-binding proteins: modular design for efficient function. Lunde et al.
2007. Nature Reviews Molecular Cell Biology.
• The Discovery of Zinc Fingers and Their Applications in Gene Regulation
and Genome Manipulation. Klug. 2010. Annu. Rev. Biochem. 79:213–31
• Leucine Zippers. Krylov & Vinson. 2001. ENCYCLOPEDIA OF LIFE
SCIENCES.
68

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Generalidades de las

interacciones ácidos nucleicos -

Dr. Manuel Sanguinetti

• las proteínas de unión a ácidos nucleicos (AN) discriminan entre

• A pesar de las diferencias entre ARN y ADN, las proteínas utilizan

- no covalentes, todas relativamente débiles y la afinidad global resulta

- polares (enlaces de H directos o

- de Van der Waals. 5

- no covalentes, todas relativamente débiles y la afinidad global resulta

- polares (enlaces de H directos o

- no covalentes, todas relativamente débiles y la afinidad global resulta

- polares (enlaces de H directos o

- de Van der Waals. 7

• Estas interacciones son transitorias, dinámicas,

• los AN simple cadena desestructurados son los más flexibles,

• el reconocimiento ARN-Proteína se asemeja al reconocimiento

• las interacciones AN-Proteína involucran frecuentemente cambios

• Clasificación de las interacciones moleculares de

• Ejemplo: ADN polimerasas Fragmento Klenow ADNpol I

Pulgar: interacciones con carga

Palma: enlaces de H con surco

- 142 puentes de hidrógeno (entre aminoácidos y O del

- enlaces por cargas (+, de Lys y Arg) de histonas y P del

• Uso de competidor inespecífico: Heparina

• Clasificación de las interacciones moleculares

Dependientes de secuencia Dependientes de estructura

interacciones específicas con reconocimiento de una

• La mayoría de las proteínas de unión al ADN que

• una HÉLICE DE RECONOCIMIENTO que se inserta en el surco

Variaciones globales de estructura

“KINK” (quiebre): cuando hay una falta

Estrechamiento del surco menor: se

Ejemplo: CAP (Catabolite Activator Protein)

• el ADN en el sitio de unión a CAP esta intrínsecamente curvado.

Sitios que contribuyen a la curvatura del sitio de unión

• las proteínas de unión a secuencias específicas en el ADN

• En general, las proteínas de unión al ADN tienen dominios

Dominio de unión a ADN

Gal4 – regulación de genes GAL de Saccharomyces cerevisiae.

LexA- represor de Escherichia coli que regula la respuesta SOS.

Represor fago λ Represor Trp

N-terminal interacciona con el

Dímero de hélices alfa extendidas “Coiled Coil” 29

Krylov & Vinson, 2001

Vista de “lado” Vista desde “arriba”

Krylov & Vinson, 2001

Vista de “lado” Vista desde “arriba”

e y g, flanquean la interfase de dimerización, usualmente corresponden a AAs

- Pueden formar homo o heterodímeros.

- homodímeros reconocen típicamente sitios

Región rica en AAs básicos

cada extensión de hélice puede unir hasta 5

Similitudes con el dominio cremallera de

- Dominio de dimerización C-terminal (donde se

¿En que se diferencia con la cremallera de Leu?

Los segmentos N y C-t no son parte de

- Dominios que emplean uno a más iones de Zn.

- Existen distintas subfamilias de estos dominios

- el ión de Zn es utilizado como elemento

- además de unirse al ADN, varios de estos

- los dominios más estudiados son:

e.g. TFIIIA - Xenopus 36