PREPARACIN DE

MEDIOS DE CULTIVO

Equipo #5

LABORATORIO DE MICROBIOLOGA Y PARASITOLOGA

DRA. LETICIA GOMEZ
FACULTAD DE MEDICINA UAEM

 El medio de cultivo constituye el

aporte de nutrientes indispensables
para el crecimiento de los
microorganismos.La composicin
precisa depender de la especie que
se quiera cultivar, porque las
necesidades nutricionales varan
considerablemente.Hay
microorganismos muy poco exigentes
que crecen bien en medios de
laboratorio normalesy
microorganismos muy exigentes que
necesitan determinadas sustancias
como vitaminas, suero o sangre para
crecer.

 Los medios de cultivo poseen una serie de

componentes:
1.Indispensables: Entre los primeros se incluye
elagua, nutrientes orgnicos (hidratos de
carbono, aminocidos, vitaminas, etc.) y
nutrientes inorgnicos (P, Fe, N, Mg, S, etc.)
2.Alternativos: sustancias isosmotizantes
(NaCl),agente solidificante (agar-agar),
tampones, indicador de pH, etc.

 Las instrucciones a seguir dependern del nmero del medio de

cultivo asignado, pero en todos los casos, los pasos son los
siguientes:
1. Disolver los componentes del medio en agua destilada. En
muchos casos se parte de un preparado comercial con todos los
componentes deshidratados. Siguiendo las instrucciones del
fabricante o del profesor, aadir la cantidad de agua adecuada
para conseguir la concentracin deseada de los mismos. Si el
medio contiene un agente solidificante (agar-agar) hay que
calentar el preparado hasta la ebullicin del mismo agitando de
vez en cuando, para asegurar una completa disolucin del agar
(medios slidos y semislidos); para medios lquidos no es
necesario calentar, nicamente se agita la mezcla hasta la
completa disolucin de la misma.

2. Esterilizar la disolucin.- Una vez disuelto el medio se

debe esterilizar para evitar el crecimiento de
contaminantes. Dependiendo de la forma en que vaya a
utilizarse el medio, el procedimiento ser diferente:
a)Medios slidos en placa.- Tapar el matraz con tapn de
algodn y cubrir con papel de aluminio. Llevar a esterilizar
al autoclave(1210C) durante 15-20 minutos. Una vez
estril repartir en placas de Petri estriles y dejar en reposo
para que solidifique.
b)Medios lquidos.- Una vez disueltos los componentes
repartir en tubos a razn de unos 2-4 ml por tubo, tapar con
tapn de aluminio y llevar a esterilizar enautoclave.

Agar Sangre
Elagar sangrees una combinacin de unagarbase (
agar nutritivo) con el agregado de 5% desangreovina,
tambin puede usarse sangre humana, para cultivos en
unaplaca de Agar. El agar sangre aporta muchos
factores de enriquecimiento. Se usa tambin para ver la
capacidad hemoltica de los microorganismos patgenos
(que es un factor de virulencia). Observando los halos
hemolticos alrededor de las colonias se determina el tipo
de hemlisis que posee:
alfa: halos verdosos (reduccin de la hemoglobina de los
glbulos rojos a metahemoglobina en el medio)
beta: halos incoloros (hemolisis total)
gamma: inexistencia de halos (sin hemolisis)

Agar Sangre

El agar sangre base se elabora de acuerdo

con la frmula descrita por Brown
Proteosa Peptona
Extracto de carne
Extracto de levadura
Cloruro sdico
Agar
pH final: 7,3 0.2

Preparacin del medio:

Homogeneice el polvo contenido en el frasco.
Aada 40 gramos de medio deshidratado a un litro de agua
destilada estril. Caliente suavemente, agitando con
frecuencia y luego caliente hasta hervir y que se consiga la
disolucin completa. Esterilice en el autoclave a 121C
durante 15 minutos y dispense en placas de Petri o en
frascos.
Para agar sangre fresco:
Aada 5% a 10% de sangre estril (sangre de oveja o de
caballo) a la base estril derretida enfriada a 45C.
Despus de agitar cuidadosamente, evitando la inclusin
de burbujas de aire, dispense en placas de Petri o frascos.

Agar chocolate
Agar Chocolate(CHOC) es unmedio de cultivo
enriquecido y no selectivo. Es una variante delagar
sangre. Contiene glbulos rojos, que han sido lisados
por el suave calentamiento a 56C. Este agar se usa
para el delicado y exigente crecimiento de bacterias
respiratorias, como por ejemploHaemophilus
influenzae.
Estas bacterias necesitan factores de crecimiento,
como elNADy hematina, componentes que
podemos encontrar dentro de los glbulos rojos; por
lo tanto, un prerrequisito lgico para el crecimiento
es la lisis de los glbulos rojos.

Agar chocolate
Debido a que este medio soporta muchos
tipos de bacterias, no es muy til
paracoprocultivos.

 Suspender 40 g del polvo en un litro de

agua destilada. Dejar reposar 5 minutos y
mezclar perfectamente hasta obtener una
suspensin homognea. Calentar con
agitacin frecuente y hervir 1 minuto.
Esterilizar 20 minutos a 121C. Enfriar a
45-50C agregar sangre desfibrinada al
5%. Homogeneizar y distribuir en placas.
Preparacin de Agar Chocolate:despus
de aadir la sangre y agitando
frecuentemente se mantiene el medio de
cultivo a 80C por 10 minutos hasta que
adquiera un color pardo chocolatado.

Agar MacConkey
Elagar MacConkeyes
unmediodecultivoespecfico
parabacteriasgramnegativasycepasque
fermentenlalactosa.

Agar MacConkey
Los ingredientes necesarios para este medio
son los siguientes:sales biliares(medio
inhspito para el crecimiento de
bacteriasGram positivas,
exceptoEnterococcusy algunas especies
deStaphylococcus), colorantecristal
violeta(inhspito para cierto tipo de bacterias
Gram-positivo), coloranterojo neutro(el cual
marca microorganismos que fermenten la
lactosa),lactosa,peptonaycloruro sdico.

Lac+
Al utilizar la lactosa en el medio, bacterias
Lac+ comoEscherichia
coli,EnterobacteryKlebsiellaproducenacidez
, lo cual baja el pH bajo 6,8 lo que tiene como
consecuencia la aparicin de colonias de color
rosadas o rojas.
LacBacterias que no fermenten la lactosa
comoSalmonella,ProteusyShigellautilizaran
peptonaen su lugar, formandoamoniaco, lo
cual incrementa el pH delagar, formando
colonias blancas o incoloras.

Agar MacConkey
Suspender 50 g del polvo en 1 litro de
agua purificada.
Reposar 5 minutos.
Calentar con agitacin frecuente y llevar
a ebullicin 1 a 2 minutos hasta disolver
completamente.
Distribuir en recipientes apropiados y
esterilizar en autoclave a 121C durante
15 minutos.

MULLERHYNTON:

medio slido estndar para antibiogramas con

discos y por difusin

Suspender 37g de polvo de agar en 1lt de

agua purificada .
Dejar absorber de 10-15 min
Calentar con agitacion frecuente y hervir
durante un minuto.
Esterilizar a 121C durante 15 min
Enfriar a 45--50C y distribuir en placas de
petri esteriles
Y permitir que el espesor sea de 4mm sobre
una superficie horizontal

MULLER-HYNTON:

MULLER-HINTON/SANGRE :
ATB bacterias que requieran sangre (Neumo.Strepto)

THAYERMARTIN:

selectivoNeisseriaspatg.(N.lactamica,Gono/Meningo)
para atmsfera de CO2

Oxidacin-Fermentacin
El metabolismo de un glcido puede seguir la va oxidativa
o fermentativa. En va oxidativa el aceptor final de
electrones debe ser el oxgeno y por consiguiente el
proceso es aerobio y produce poca acidez, mientras que en
va fermentativa el aceptor final de electrones es un
compuesto orgnico y el proceso es anaerobio, originando
mucha acidez en poco tiempo.
La fermentacin u oxidacin del glcido se puede ver en
dos tubos con medio de cultivo glucosado, uno abierto
(aerobio) y otro cerrado con parafina (anaerobio).
Utilizamos para esta prueba el medio semislido de HughLeifson al que se le aade glucosa para observar si el
metabolismo de este azucar es llevado a cabo por va
oxidativa o fermentativa.

Procedimiento
Se inoculan dos tubos del medio de cultivo
semislido realizando una siembra en
picadura.
A uno de ellos se le aade una pequea
cantidad de parafina estril, y se llevan a
incubar ambos a 37C durante 24 horas.
Si la va es la oxidativa, solamente el tubo
abierto virar ligeramente en la parte
superior a color amarillo. Si la va es la
fermentativa hay un viraje intenso a amarillo
que comienza en el fondo de los dos tubos.

Agar-Hierro-Triple Azcar
Gracias a su composicin es uno de los medios
de cultivo ms empleados para la diferenciacin
de enterobacterias segn:

Fermenten o no glucosa.
Fermenten o no lactosa o sacarosa.
Produzcan o no cido sulfhdrico.
Produzcan o no gas.

Agar-Hierro-Triple Azcar

Si la bacteria problema fermenta la glucosa,

acidificar el medio haciendo virar a amarillo el indicador
en el fondo del tubo, mientras que si no es fermentadora
de glucosa, el medio permanecer de color rojo.

Si la bacteria problema fermenta lactosa o sacarosa,

acidifica el medio en su superficie volvindolo de color
amarillo, mientras que si no lo es, la superficie del medio
continuar de color rojo.

Si produce cido sulfhdrico (debido a la reduccin de

las sales de hierro), se presentar un ennegrecimiento
del tubo. La produccin de sulfhdrico y el consiguiente
ennegrecimiento pueden impedir ver la fermentacin de
la glucosa (fondo amarillo), pero este hecho implica
directamente que la bacteria es fermentadora de
glucosa.

Si aparece rotura o desplazamiento del medio,

significa que la bacteria es productora de gas.

Composicin

Peptona 15g
Extracto de levadura
3g
Extracto de carne
3g
Proteosa de peptona
5g
Glucosa 1g
Lactosa 10g
Sacarosa 10g
Sulfato de hierro 0,20
Cloruro sdico 5g
Tiosulfato de sodio 0,30g
Rojo fenol 0,024g
Agar 12g

Tioglicolato
El medio de cultivo, tiene por sus componentes la
calidad nutricional del caldo triptena soya. Este
permite el desarrollo de una amplia variedad de
microorganismos, incluidos los nutricionalmente
exigentes. Adems, se observa que las bacterias
estrictamente aerobias, crecen en la parte superior,
mientras que las anaerobias facultativas o anaerobias
estrictas crecen en las profundidades del medio. Las
sustancias reductoras como tioglicolato de sodio y
cistena proporcionan una anaerobiosis suficiente y
debido a los grupos -SH- de estos compuestos, se
neutralizan los efectos bacteriostticos de los
derivados mercuriales, arsenicales y de otros metales
pesados. La presencia de una baja cantidad de agar,
retarda la dispersin de CO2 y O2.

Preparacin
Segn la muestra a analizar:
-Muestras lquidas: agregar 1 o 2 gotas de la
muestra a tubos conteniendo medio de cultivo.
-Tejidos y otras muestras slidas: macerar en caldo
estril. Luego sembrar de la misma manera que
para muestras lquidas.
-Hisopos: insertarlos en el medio de cultivo, luego
de haber sembrado el medio slido apropiado.
-Para el cultivo de anaerobios, antes de sembrar,
eliminar el oxgeno presente, mediante el hervido
de los tubos con las tapas flojas, y luego enfriarlos a
temperatura ambiente con las tapas bien cerradas.

Preparacin
El tiempo, temperatura y condiciones de
incubacin dependern del
microorganismo que se quiera recuperar.
Medio preparado: mbar claro ligeramente
opalescente.
Medio deshidratado: a 10-35 C.
Medio preparado: a 2-8 C.

Schaedler
Medio de cultivo altamente nutritivo,
adicionado de sangre de cordero, utilizado
principalmente
para la recuperacin de microorganismos
anaerobios especialmente los
pertenecientes a las especies de
Bacteroides, Prevotella y otrasespecies de
anaerobios

Procedimiento
1. Con asa bacteriolgica estril trabajando
siempre a la llama del mechero, tomar una
mnima muestra.
2. Sembrar suavemente sobre la superficie tersa
del medio por el procedimiento de agotamiento.
3. Incubar las placas en posicin invertida a 37C
en anaerobiosis.
4. Al trmino de 18-24 horas de incubacin
examinar el cultivo y determinar los estudios a
seguir segn las caractersticas de las colonias.

 KANA-VANCO:
Con Kanamicina y Vancomicina.
Se utiliza para el aislamiento rpido de
Bacterias.
Contiene 75 g/ml de Kanamicina, que
inhibe a la mayora de los bacilos
aerobios, facultativos y anaerobios y 7,5
g/ml de Vancomicina, que inhibe a la
mayora de los microorganismos.
GramPositivos. Contiene tambin sangre
"lacada" de conejo que permite la
pigmentacin precoz de los Bacteroides
pigmentados.

 SABOURAUD
Este medio de cultivo es utilizado para
cultivo de mohos y levaduras patgenas
y no patgenas.
Suspender 65 g de medio deshidratado en un
litro de agua destila- da. Calentar agitando
frecuentemente y dejar hervir durante 1
minuto para disolver completamente los
ingredientes. Evitar el sobrecalentamiento.
Esterilizar a 121C durante 15 minutos.
Distribuir y enfriar a temperatura ambiente
antes de su utilizacin.

 Medio Sabouraud con Cloranfenicol y

Gentamicina (SAB G+C/ SABHI G+C).
Permite el crecimiento de casi todos los
hongos filamentosos y levaduras mientras
inhiben a muchas bacterias. En tubo o
placa.

Czapek
pH: 7.1-7.5

Agar

Fosfato
dipotsico
Nitrato de
sodio

1
2

Sulfato de
magnesio

Sulfato
ferroso

30
0.0
1
0.5

Czapek

Cloruro de
potasio

15
0.5

Sacarosa

Salmonellashigella
pH: 7.1-7.5

XLD

Selenito

5
Lactosa
4
Fosfato de sodio
10
Selenito de
4
sodio

Selenito-caldo

Peptona

CIN (Agar, Cefsulodin-IrgasanNovobiocin).

Es un medio selectivo de diferenciacin para el
aislamiento de Yersinia enterocolitica, un agente
causante de gastroenteritis.

Las peptonas proporcionan nutrientes junto con el

piruvato para el crecimiento de Yersinia.

La fermentacin de manitol en presencia de rojo neutro

crea el aspecto caracterstico de ojo de toro de las
colonias de Yersinia enterocolitica: incoloras con centros
de color rojo.

La inhibicin selectiva de organismos gram negativos y

gram positivos se obtiene mediante cristal violeta,
desoxicolato sdico y los agentes antimicrobianos:
cefsulodina, Irgasan (Triclosan) y novobiocina.

Preparacin del Medio

Sembrar el medio de cultivo con la muestra problema por
estra cruzada. Incubar 24 48 h a 25C
FORMULA EN GRAMOS POR LITRO DE AGUA
DESTILADA
Agar 12.0
Manitol 20.0
Cefsulodin 0.015
Novobiocina 0.0025
Cloruro de sodio 1.0
Peptona de carne 5.0
Cristal violeta 0.001
Peptona de gelatina
10.0
Desoxicolato de sodio 0.5
Piruvato de sodio 2.0
Extracto de carne 5.0
Rojo neutro 0.03
Extracto de levadura 2.0
Mezcla de sales
biliares 0.004
Sulfato de magnesio 0.001
pH 7.2 0.2

Procedimiento
Rehidratar 57.5 g del medio en un litro de agua destilada.
Reposar 10 a 15 minutos
Calentar agitando frecuentemente hasta el punto de
ebullicin durante 1 minuto para disolverlo por completo.
NO ESTERILIZAR EN AUTOCLAVE
Enfriar aproximadamente a 45C
Adicionar los inhibidores cefsulodin y novobiocina.
Mezclar perfectamente y distribuir en cajas de Petri
estriles.
Conservar en refrigeracin de 2 a 8C

CLED(Agar cistina-lactosa
deficiente en electrlitos)
Es unmedio de cultivono inhibitorio usado en el
aislamiento y diferenciacin de organismos urinarios.
Al ser deficiente enelectrlitos, previene del
crecimiento exagerado de las especies deProteus.
Lacistinapromueve la formacin de colonias enanas
dependientes de cistina.
Por la accin del azul de bromofenol las colonias de
bacterias fermentadoras de lactosa se tien de color
amarillo mientras que las no fermentadoras se tien
de azul.

Procedimiento
Peptona

4.0

Extracto de carne

3.0

L-cistina

0.128

Triptena

4.0

Azul de bromotimol

0.02

Lactosa

10.0

Agar

15.0
pH final: 7.3 0.2

Suspender 36,2 g del polvo por litro de

agua destilada.
Dejar reposar 5 minutos y calentar
suavemente agitando por rotacin.
Hervir 1 o 2 minutos hasta su disolucin
total.
Distribuir y esterilizar en autoclave durante
15 minutos a 118-121C.
Cubrir totalmente la superficie
Crecerntodo tipo de germenes: cocos
Gram+,
bacilos Gram-, levaduras.
Lascaractersticalactosa (+) => amarillas
Lactosa (-) sin cambio de color => azul
verdosas.

Resultados
Microorganismos

Color de las colonias

Escherichia coli ATCC 25922

Amarillas

Escherichia coli ATCC 35218

Amarillas

Klebsiella pneumoniae ATCC

700603

Amarillas

P. aeruginosa ATCC 27853

Azul-verdoso

P. mirabilis ATCC 43071

Azul-verdoso

S. aureus ATCC 25923

Amarillas

E. faecalis ATCC 29212

Amarillas

CAMPY BAD (Agar Campylobacter con 5

antimicrobianos y sangre de carnero al 10%)
es un medio selectivo para el aislamiento primario de
Campylobacter jejuni y otras especies de Campylobacter
resistentes a la cefalotina, a partir de muestras de
heces.
Las peptonas proveen compuestos de nitrgeno,
carbono, azufre y trazas de otros ingredientes.
El extracto de levadura es una fuente de vitaminas del
complejo B. La sangre de carnero aporta otros
nutrientes.
La adicin de los agentes antimicrobianos amfotericina
B, cefalotina, polimixina B, trimetoprima y vancomicina
suprime el crecimiento de la flora microbiana normal en
muestras fecales, facilitando as el aislamiento de C.
jejuni.

Preparacin del medio

Frmula por litro de agua destilad

Digerido pptico de tejido animal 10,0 g

Digerido pancretico de casena 10,0 g
Bisulfito sdico 0,1
Anfotericina B 2,0 mg
Trimetoprim 5,0
10,0
Polimixina B 2500,0 u.
Sangre de carnero, desfibrinada 10%
levadura 2,0

Glucosa 1,0
Cloruro sdico 5,0
Agar 15,0
Cefalotina 15,0
Vancomicina
pH 7,2 0,2
Extracto de

Procedimiento
Una vez recibida la muestra en el laboratorio, hacer el frotis para su
dilucin tan pronto como sea posible.
Incubar las placas inoculadas a temperatura de 37 2 C o 42 +/2 C en una atmsfera donde se ha reducido la concentracin de
oxgeno y aumentado la de dixido de carbono (microaerbica)

Campylobacter jejuni aparece en forma de colonias mucoides de

pequeas a medianas, generalmente de color grisceo, planas, de
bordes irregulares y no hemolticas, en unas 42 a 48 h

Colonias redondas, de 1 a 2 mm de dimetro, convexas, enteras y

brillantes
Un pequeo porcentaje de las cepas presente un aspecto tostado
ligeramente rosceo.