Diapositiva 1 (Mel)

Buenas tardes, somos el grupo 1 y les vamos a hablar sobre el práctico 7.

Diapositiva 2 (Mel)

Diapositiva 3 (Mel)

Diapositiva 4 (Mel)

Diapositiva 5 (Viviana)

Diapositiva 6 (Viviana)

Diapositiva 7 (Viviana)

Diapositiva 8 (Viviana)

Diapositiva 9 (Estrella)

Para estudiar el líquido cefalorraquídeo se utilizaron varios métodos. En primer lugar

tenemos la observación macroscópica del LCR. El LCR normal es claro y transparente,
como agua. Si se presenta turbio es una señal de infección bacteriana y si se prensenta
xantocrómico (amarillo-rojizo) es una señal de hemorragia. Después también se puede
observar directamente un frotis de LCR al microscopio de campo claro con la tinción de
Gram, que ya hemos visto, en busca de bacterias y polimorfonucleares, que el LCR normal
no presenta. Adicionalmente tenemos las pruebas citoquímicas, en las que vamos a
estudiar la composición de ese LCR de forma automatizada. También se realiza un cultivo
del LCR, para lo cual sembramos con un ansa estéril en agar sangre y en agar chocolate,
que son medios sólidos rico y muy rico, respectivamente. Y el resto de la muestra se colocó
en tioglicolato. Todos estos se incuban entre 18 y 24 hs en una estufa a 35-37°C, en el caso
de las placas en atmósfera enriquecida en CO2. Y después, para la identificación
bacteriana, se utilizaron pruebas bioquímicas, según las características de las colonias
obtenidas, y las llaves de identificación que vimos en clase.

Diapositiva 10 (Estrella)

En el caso del hemocultivo, se utilizan botellas especiales con medios de enriquecimiento

para colocar las muestras que son incubadas en estufas con sistemas automatizados que
son capaces de detectar crecimientos y generar una señal para avisar al laboratorista. Una
vez que esto ocurre, se puede realizar un frotis con tinción de Gram igual que antes, para
visualizar la presencia de bacterias en el microscopio de campo claro. El crecimiento de
bacterias del hemocultivo se siembra en agar sangre y se incuba en estufa con atmósfera
enriquecida en CO2.
Por último, se estudió la susceptibilidad a antibióticos de las colonias bacterianas obtenidas.
Para eso se utilizaron dos métodos. En primer lugar tenemos la disco-difusión. Este es un
método cualitativo en el cual se siembra uniformemente la placa de agar con la bacteria a
estudio, y se colocan discos de papel con una concentración conocida de un antibiótico, se
incuba en estufa, y se mide el diámetro de inhibición alrededor de cada disco. Eso permite
determinar la categoría de sensible, intermedio o resistente, según tablas que son
realizadas por EUCAST o CLSI. Por otro lado, para estudiar la susceptibilidad a antibióticos
de forma cuantitativa, se utilizó el E-test. Estas son tiras calibradas con un gradiente lineal
de cada antibiótico que se colocan en placas de agar sembradas de forma uniforme. Luego
de la incubación se determinó la CIM (concentración mínima de inhibición) como el punto de
corte del halo de inhibición con la tira. De nuevo, esos CIM se comparan con puntos de
quiebre tabulados para clasificar la susceptibilidad del aislamiento.

Diapositiva 11 (Estrella)

Pasando a los resultados, entonces, tenemos resultados rápidos (disponibles en media

hora) y resultados lentos que demoran más de 24 horas. Dentro de los rápidos, tenemos,
para el líquido céfaloraquídeo la evaluación macroscópica, el estudio citoquímico y el frotis
con tinción de Gram. Mientras que dentro de los resultados más lentos tenemos todo lo
relativo al cultivo de LCR y el hemocultivo, las pruebas fenotípicas a partir de las colonias
obtenidas, y los estudios de susceptibilidad a antibióticos.

Diapositiva 12 (Fabián)

Diapositiva 13 (Fabián)

Diapositiva 14 (Juan)

Volviendo al estudio del LCR, recordamos que se había sembrado la muestra con un ansa
estéril en agar sangre y agar chocolate, y se los había incubado en la estufa a 35-37°C en
atmósfera enriquecida con CO2, mientras que el resto de la muestra fue incubada a la
misma temperatura en tioglicolato. Luego de 24 horas no se observó crecimiento en
ninguno de los medios sólidos, pero sí se observó crecimiento en el tioglicolato. Esto se
puede deber a que el inóculo sembrado en la placa a partir del LCR tuviera una
concentración bacteriana insuficiente. Sin embargo, el medio de enriquecimiento del
tioglicolato si permite recuperar al patógeno. Entonces, a partir del cultivo de tioglicolato,en
primer lugar se realizó un frotis con tinción de Gram para observar las bacterias al
microscopio. Igual que lo que se había observado en el frotis de LCR directo y el frotis del
hemocultivo, volvemos a observar diplococos lanceolados Gram positivos. Se realiza un
re-aislamiento de esta bacteria, sembrando a partir del cultivo de tioglicolato, con un ansa
esteril, en una placa de agar sangre. Luego de 20 hs de incubación en estufa a 35-37°C con
atmósfera enriquecida en CO2 (44 hs en total desde el comienzo del estudio) se obtuvieron
colonias similares a las del hemocultivo: se observa el halo verde característico de la
alfa-hemólisis, y el aspecto mucoide asociado a la cápsula polisacarídica.

Diapositiva 15 (Juan)

Para confirmar nuestra sospecha, y poder clasificar las bacterias obtenidas en los cultivos,
se realizaron pruebas fenotípicas, que son pruebas bioquímicas que permiten identificar
aislamientos bacterianos según los diagramas de flujo que vimos en clase. Por lo observado
en el Gram, ya sabíamos que estábamos estudiando un diplococo gram positivo, y por lo
observado en las placas de agar sangre, sabíamos que presenta alfa hemólisis. Así que la
siguiente prueba, fue la catalasa. Esta prueba indaga la presencia de la enzima catalasa,
que cataliza la conversión de peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno, lo que protege a las
bacterias que la poseen del daño oxidativo de las especies reactivas del oxígeno (ROS).
Para esta prueba se coloca una gota de peróxido de hidrógeno al 3% en un portaobjetos de
microscopio. Luego con un ansa estéril se toman bacterias de una de las colonias en
nuestro cultivo y se unta en círculos sobre el peróxido de hidrógeno. Si se forman burbujas,
como se ve en B la prueba se considera positiva. De lo contrario, la prueba se considera
negativa (como en A). En nuestro caso obtuvimos que nuestro aislamiento es catalasa
negativo.
A continuación realizamos la prueba de la susceptibilidad a la optoquina, que es una prueba
que permite diferenciar Streptococcus pneumoniae de otros estreptococos alfa-hemolíticos.
La optoquina es un antibiótico si bien no se lo utiliza con fines terapéuticos.
La sensibilidad a la optoquina permite la presunta identificación de estreptococos
alfa-hemolíticos como S. pneumoniae, aunque algunas cepas neumocócicas son resistentes
a la optoquina. Para la prueba de susceptibilidad a la optoquina, usamos el método de
disco-difusión que mencionamos en Materiales y métodos. Un halo de inhibición con
diámetro de 14 mm o más se interpreta como susceptible. En nuestro caso, observamos un
halo de inhibición de 16 mm, o sea que es susceptible. Entonces, podemos ahora sí
identificar a Streptococcus Pneumoniae como el agente etiológico de la meningitis del
paciente.

Diapositiva 16 (Erik)

Diapositiva 17 (Erik)

Diapositva 18 (Erik)

Diapositva 19 (Erik)

Diapositiva 20 (Erik)

Los dejamos con la Bibliografía. Muchas Gracias.

Notas:

Fabian diapositivas 12 y 13

*Nombrar exámenes rápidos (30min)

*turbio/límpido de LCR (bacteria/virus)
*PMN/Mono
*xq ↑proteínas y xq ↓ glucosa
*dg presuntivo de neumo, gram síntomas edad del paciente acordes

PARALELAMENTE
¿Qué es el hemocultivo? breve
Fundamento de xq pita el equipo (rapido)
¿que se hace dsp?→ directo de hemo y cultivo
en placa

SE OBSERVA AL GRAM DIPLO G+ IGUAL

QUE EN DIRECTO DE LCR (VAMOS BIEN)

ERIK→ los estudios que no se realizaron pero esta bueno nombrarlos son:
antígeno neumocócico en LCR, se busca específicamente el polisacárido c de la cápsula
del neumo en el LCR resultado
FILMARRAY/genexpert→ pcr para neumo
ambas pruebas son rápidas, el antigeno neumo en LCR demora 15 minutos y
filmarray/genexpert 45 minutos