RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Extracción de ADN en sangre periférica

La técnica de extracción por GeneClean empleada en este trabajo dio un buen

rendimiento, ya que la cantidad de ADN y el nivel de purificación del mismo fueron
muy buenos y las concentraciones obtenidas estuvieron entre 19.23 hasta 30.33 pg/μL,
el cual se encontró como de buen rendimiento de la cantidad de DNA total obtenido por
la técnica de GeneClean empleada en este trabajo.
En la extracción del ADN proveniente de las células mononucleares no fue buena
en comparación con el ADN extraído en sangre total ya que se observaron en el DNA
proveniente de la capa de blancos, una calidad de banda con poca intensidad, se realizó
una cuantificación del ADN extraído para ver la concentración, en donde se obtuvieron
19.33 pg/μL; lo cual nos llevó a considerar que pudo ser debido a la presencia de algún
componente que se encuentra en sangre que está interfiriendo, y considerar el hecho que
la concentración del bacilo a nivel sanguíneo, el número de células mononucleares
infectadas es bajo, como se ha reportado por otras investigaciones que se han realizado.
Mientras, que en el caso del ADN proveniente de sangre total siguiendo el mismo
protocolo de extracción dio un mejor resultado, la intensidad de la banda esperada fue
mayor, por lo que se optó por la extracción en sangre total (ver figura 3). Sin embargo
debido a este hecho y a la necesidad de tener un control positivo franco, se probó la
extracción en esputo, el cual provino de uno de los pacientes positivos, y se obtuvo una
excelente intensidad de banda, lo cual permitió corroborar el protocolo de extracción, y
poder tener un control positivo confiable, así también permitió asegurar las condiciones
de amplificación y la cepa control positivo H37Rv dio una buena intensidad de banda
ver figura 4.

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 2000pb
1200pb
800pb
400pb
200pb 245pb
100pb

Figura 3.- Electroforesis productos amplificación de extracción en sangre total y

capa de blancos “células mononucleares”.
Carril 4: marcador Low Ladder (100pb), Carril 5: ADN TB positivo muestra sangre
total, Carril 6: ADN TB positivo muestra sangre periférica separación de células
mononucleares.

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 2000pb
1200pb
800pb
400pb
200pb 245 pb
100pb

Figura 4.- Electroforesis de los productos de PCR expectoración TB positiva y

Cepa control positivo H37Rv.
Carril 1: Marcador peso molecular Low –ladder, Carril 2: ADN expectoración TB
positivo, Carril 3: ADN cepa control cepa H37Rv y Carril 4: Negativo agua.

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Condiciones de Amplificación

Los ADN obtenidos se sometieron a los protocolos tomados de referencia donde

los productos de amplificación se analizaron y el programa de amplificación con el que
se obtuvieron mejores resultados fue el proporcionado por Laboratorios Clínicos de
Puebla y fueron bajo estas condiciones que se partió la estandarización de la PCR.
Se realizó un gradiente de temperatura para encontrar la mejor condición de
alineación. De las amplificaciones por gradiente se tomaron las temperaturas
recomendadas como la guía, tomando como temperatura mínima de alineación de 60 °C,
62°C, 63°C, 64°C hasta 69°C para establecer la temperatura de alineación la cual fue de
67°C, ver figura 5, así mismo se probaron los tiempos de cada etapa en la amplificación
y estos no variaron con respecto a la referencia. En cuanto a los números de ciclos de
cada etapa de la PCR se movieron ya una vez elegido las temperaturas, y estos ciclos se
modificaron de 33, 35 y 40 ciclos; pero no se obtuvieron buenos resultados, ya que al
momento de correr la electroforesis para observar el patrón de bandeo, se presentaba la
banda esperada de 245 pb la cual identifica la presencia del bacilo, pero se observaron
bandas inespecíficas en estas reacciones, mientras que con los iniciadores del control
interno no se tuvo presencia de bandas inespecíficas, con ello se realizaron distintas
pruebas para descartar contaminación durante el proceso de extracción, al momento de
preparar las reacciones de PCR, por contaminación del agua, ya que es común este
problema, así también se descartó la posibilidad de algún problema con los iniciadores
por contaminación o que estuviesen mal sintetizados.
Una vez descartadas las posibles causas; se realizaron modificaciones; una fue
realizar una PCR con una etapa de hot start previo, es decir, antes de colocar las
muestras de ADN al termociclador se pre-calentó por 5 minutos a 93°C, ya que se ha
visto que se minimiza la producción de productos inespecíficos y decrementa
sensiblemente la reacción, así como se puso cuidado al momento de agregar el ADN a la

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 Figura 5.- Electroforesis productos amplificación TB positivos a gradientes
en temperatura de alineación.
ADN TB positivo con iniciador LCP11.- Carril 1: Muestra 60°C ,Carril 2: Muestra
63°C, Carril 3: Muestra 65°C, Carril 4: Muestra 66.7°C, Carril 5: Control negativo agua
60°C . ADN TB positivo con iniciador LCP13.- Carril 7: Muestra 60°C, Carril 8:
Muestra 63°C, Carril 9: Muestra 65°C, Carril 10: Muestra 66.7°C, Carril 11: Control
negativo agua 60°C.

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mezcla reacción de PCR, se colocaron los tubos de reacción inmediatamente a hielo para
evitar cualquier reacción inespecífica como se ha visto en otros estudios.
Por otro lado, se probaron distintas concentraciones de ADN purificado, se
realizó PCR con distintas cantidades de iniciadores; con ello se logró eliminar las
bandas inespecíficas y aparte ajustar la cantidad de muestra ADN y de iniciadores en la
reacción de PCR.
Las condiciones óptimas de amplificación encontradas para el diagnóstico del
complejo M. tuberculosis en sangre periférica se encuentra especificada en la tabla II.

Análisis de ADN amplificado

Los productos de amplificación analizados provenientes de los dos pacientes con

diagnóstico a TB positivo con cultivo fueron analizado por PCR, ambos DNAs fueron
positivos, por el método estandarizado observándose la banda esperada de 245pb; en el
caso del ADN proveniente de tres pacientes presuntamente sanos, dos de los productos
amplificados dieron negativo, mientras que la tercera de las muestras extraídas dio
positivo. Por lo que se realizó nuevamente la amplificación, se tomó el ADN extraído y
se amplificó por duplicado dando positivo una ves más, para asegurar y corroborar que
el ADN si es positivo, se mandó parte del ADN extraído por nuestra técnica y muestra
de sangre de la persona al laboratorio estatal de referencia, que ya cuenta con una
técnica de PCR para tuberculosis validada, obteniéndose la prueba de PCR positiva tanto
en el ADN como en la muestra directa de sangre (ver figura 6). Por lo que se identificó
como positivo a tuberculosis pero no se puede asegurar o hacer un diagnóstico definitivo
como tuberculoso ya que para ello se tiene que dar un seguimiento médico y hacer un
estudio clínico detallado, pasar por la batería de pruebas aprobadas para diagnóstico y
realizar el estándar de oro, es decir el cultivo y así poder decir que es una persona con
tuberculosis ya que es la única prueba de diagnóstico definitivo validada y aprobada.

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 Tabla II. Condiciones de amplificación por PCR.

Proceso
Temperatura (°C) Tiempo (minuto:segundo) Ciclos

1 Desnaturalización 95°C 10:00 minutos 1

2 Desnaturalización 94°C 0:15 segundos

Hibridación o 67°C 0:20 segundos 40

Alineación

Extensión 72°C 0:030 segundos

3 Extensión final 72°C 2:00 minutos 1

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 268 pb
245pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Figura 6.- Electroforesis de los productos de PCR en sangre periférica,

expectoración TB positiva y negativa en gel de agarosa.
Carril 1:Muestra sangre negativa (TB positiva),Carril 2:Muestra sangre positiva, Carril
3: Muestra expectoración positiva, Carril 4: Muestra negativa, Carril 5: marcador peso
molecular (100pb Low DNA Ladder) y Carriles 6,7,8: Control interno de sangre muestra
negativa (TB positiva), sangre positiva, expectoración respectivamente y Carril 9:
control negativo agua.

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Análisis de Restricción de los productos de amplificación TB positivos

El fragmento amplificado de 245 pb (muestras control positivo y sangre

periférica positivo) del fragmento de inserción IS6110 se digirieron incubando con la
enzima de restricción Sac II, la cual reconoce el sitio de restricción de 55pb de la
secuencia. Cuando la muestra sanguínea contiene al bacilo M. tuberculosis, en la
digestión del producto de 245 pb con SacII, se obtiene un fragmento de 190 pb, y si el
bacilo no se encuentra presente o el ADN extraído no es de TB no hay digestión. La
figura 7 muestra que en el control positivo de expectoración TB positivo si presenta una
diferencia en el patrón de bandeo en donde se observó una banda de 190 pb en el
producto digerido y en la no digerida se observó solamente la banda de 245 pb, en el
caso de la muestra proveniente de sangre periférica se observó el mismo patrón. Esto
indica que la enzima reconoció el sitio de restricción que existe solo en la secuencia del
segmento de inserción IS6110 específico del complejo M tuberculosis y por tanto, se
confirma que el producto purificado y amplificado en sangre periférica y en
expectoración como control son efectivamente del complejo M tuberculosis.
La enzima de restricción se eligió en base al análisis en un banco de genes, se
realizó el mapa de restricción con diversas enzimas específicas que reconocen algún
sitio específico de la secuencia utilizada y se eligió la enzima que se tubo disponible.

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 1 2 3 4 5
2000pb
1200pb
800pb

400pb

245 pb
200pb
190 pb

100pb

Figura 7.- Electroforesis de productos de digestión con SacII.

Carril 1: DNA sangre periférica sin digerir, Carril 2: DNA sangre digerido, Carril 3:
marcador de peso molecular Low Ladder Mass, Carril 4: DNA expectoración sin digerir
y Carril 5: DNA expectoración digerido.

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