El impacto de la luz pulsada sobre la descontaminación, la calidad y la fijación bacteriana de las

frambuesas frescas
Abstracto
Las frambuesas han servido como vehículos para la transmisión de patógenos transmitidos por los alimentos
a través de la ruta fecal-oral y han resultado en 11 brotes en los Estados Unidos desde 1983 hasta 2013. El
primer objetivo de nuestro estudio fue investigar la eficacia de inactivación de Salmonella y Escherichia coli
O157: H7 de la luz pulsada (PL) en frambuesas frescas durante 10 días de almacenamiento a 4 _C. Las
cualidades de las frambuesas después del tratamiento con PL, que incluyen color, textura, contenido fenólico
total (TPC), contenido total de antocianinas (TAC), recuento total de bacterias (TBC) y recuento total de
levaduras y mohos (TYMC) también se evaluaron durante los 10 días de almacenamiento.
El segundo objetivo fue estudiar el apego a las bacterias, así como el efecto de descontaminación de PL sobre
las frambuesas. Bajo microscopía electrónica de barrido (SEM), PL mostró daño severo a la membrana
celular en la superficie lisa. La estructura superficial de las frambuesas afectó la unión de las células
bacterianas y la rugosidad de la superficie proporcionó protección para las bacterias patógenas. Nuestra
investigación demostró por primera vez que el procesamiento exitoso de frambuesas PL debe evaluarse por
sus impactos en la seguridad y calidad de los productos durante el almacenamiento. PL con una fluencia de
5.0 J / cm2 mantuvo la seguridad y la calidad de las frambuesas frescas durante el almacenamiento
refrigerado.
Introducción
Las frambuesas son la tercera baya más popular en los Estados Unidos para su uso en fresco, después de las
fresas y los arándanos. Como el tercer productor más grande del mundo, la mayoría de los productores de
frambuesas en los EE. UU. Tanto las frambuesas frescas como las congeladas se han asociado con brotes.
Los brotes de enfermedades transmitidas por los alimentos en los Estados Unidos asociados con frambuesas
importadas afectan no solo a los consumidores y productores del producto contaminado, sino también a otros
proveedores del mercado estadounidense, incluidos los productores estadounidenses (Calvin, 2004, Calvin et
al., 2003; Mishen, 1996). C. cayetanensis, hepatitis A y el norovirus contaminan frambuesas por vía fecal-
oral. Indica que otros patógenos transmitidos por los alimentos como Salmonella y Escherichia coli O157:
H7 que comparten la misma ruta de transmisión tienen todos el riesgo potencial.
La contaminación de las frambuesas frescas puede provenir de la entrada de animales en los campos y las
empacadoras, el agua de riego, la recolección de bayas cerca de la línea del suelo y los trabajadores poco
higiénicos. El desafío para la descontaminación de la frambuesa existe porque, (1) las frambuesas se
componen de muchas frutas individuales (drupelets) unidas por pelos (tricomas) y ceras (Mackenzie, 1979)
que proporciona refugio para los patógenos transmitidos por los alimentos, y (2) a diferencia de la fruta de
árbol , las frambuesas frescas del mercado no se lavan. Por lo tanto, no hay forma de usar desinfectantes
líquidos para limitar el riesgo microbiano potencial.
La luz pulsada (PL) es un método no térmico para la conservación de alimentos que implica el uso de pulsos
intensos de corta duración de amplio espectro para asegurar la descontaminación microbiana en la superficie
de alimentos o materiales de empaque (Elmnasser et al., 2007). El tratamiento con PL de alimentos ha sido
aprobado por la FDA (1996) bajo el código 21CFR179.41 con un tratamiento acumulativo total que no
excede 12.0 J / cm2. La lámpara puede generar luz desde UV a nearinfrared (100e1100 nm) y se informó que
la región UV es crítica para la eficacia del tratamiento PL (Takeshita et al., 2002). Hasta donde sabemos, la
investigación sobre la inactivación de PL de Salmonella o E. coli O157: H7 en frambuesas es todavía
limitada. Por ejemplo, aunque Bialka (2007) informó que PL podría reducir E. coli O157: H7 y Salmonella
en frambuesas, pero no estudiaron el perfil de supervivencia del patógeno durante el almacenamiento.
Además, ninguna de las investigaciones anteriores informó los impactos del tratamiento de PL sobre la
calidad y los compuestos bioactivos asociados de las frambuesas durante su almacenamiento refrigerado.
Las frambuesas son frutas delicadas y altamente perecederas por muchas razones. La calidad estética de las
frambuesas se determina principalmente por el color, la firmeza y el contenido de moho. El cambio de color

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del rosa al rojo oscuro conduce a la pérdida de atractivo para los consumidores. Las frambuesas cultivadas
para mercado fresco deben ser capaces de conservar la firmeza durante la cosecha, la manipulación y el
almacenamiento, y tienen una vida útil de 10 días o más (Toivenon et al., 1999). Desde perspectivas de
beneficios para la salud, las bayas son una buena fuente de polifenoles, especialmente antocianinas,
micronutrientes y fibra.
Materiales y métodos
2.1. Cepa bacteriana y preparación de inóculo
En nuestro estudio se utilizaron cepas individuales de tipo salvaje que incluían Salmonella (S. Newport
H1275, brote de brote aislado) y E. coli O157: H7 (250, brote de brote aislado). Las cepas silvestres se
obtuvieron de la recolección de cultivos en el Departamento de Ciencias Animales y Alimentos de la
Universidad de Delaware. La cepa de Salmonella se adaptó para crecer en presencia de ácido nalidíxico (50
mg / ml, Fisher Scientific, Hampton, NH, EE. UU.) Solo para crear una única cepa de resistencia a
antibióticos, mientras que la cepa de E. coli O157: H7 se adaptó para crecer en presencia de ácido nalidíxico
(100 mg / ml) más estreptomicina (100 mg / ml, Sigma, St. Louis, MO, EE. UU.) para crear una cepa de
resistencia doble a los antibióticos. Ambas cepas de resistencia se cultivaron en agar de soja tríptica (TSA,
Difco Laboratories, Sparks, MD, EE. UU.) Más 0,6% de extracto de levadura (YE, Difco) suplementado con
ácido nalidíxico únicamente (TSAYE-N para Salmonella) o ácido nalidíxico y estreptomicina (TSAYE). -NS
para E. coli O157: H7) durante 2e3 días a 35 _C. Las colonias individuales se recogieron y se transfirieron a
10 ml de caldo de soja tríptico (TSB, Difco) más 0,6% de extracto de levadura (Fisher) suplementado con los
mismos antibióticos simples o dobles (TSBYE-N para Salmonella o TSBYE-NS para E. coli O157: H7). El
cultivo se incubó a 35 ° C durante la noche y luego se transfirió a 10 ml de TSBYE-N o TSBYE-NS frescos
para producir una población aproximada de 109 UFC / ml después de 24 horas de incubación a 35 ° C. El
cultivo se diluyó a 108 CFU / ml usando agua de peptona estéril al 0,1% (Difco) y se usó como inóculo.
2.2. Preparación e inoculación de frambuesas
Las frambuesas frescas se compraron en un supermercado local y se almacenaron a 4 ± 2 ° C durante un
máximo de 4 h antes de su uso. Se seleccionaron frambuesas de tamaño mediano (~ 5 g) con color rosado y
firmeza ideal. Las frambuesas seleccionadas estaban intactas y no tenían ninguna lesión física notable. Para
detectar la inoculación de frambuesas, se depositaron 50 ml de inóculos de 108 CFU / ml en la superficie
exterior de las frambuesas en forma de cinco gotas.
Se aplicó una inoculación puntual para simular la contaminación causada por gotas de heces de animales,
salpicaduras de agua de riego o toques antihigiénicos. Las frambuesas inoculadas se secaron en la campana
de bioseguridad durante 2 h antes de su uso futuro.
2.3. Inactivación de Salmonella y E. coli O157: H7 utilizando el tratamiento PL y la población de
sobrevivientes de patógenos durante el almacenamiento.
El PL se generó mediante un sistema de luz de pulso de sobremesa (SteriPulse-XL, modelo RS-3000C,
Xenon Corp., Wilmington, Massachusetts, EE. UU.). El sistema incluye un módulo controlador, una cámara
de tratamiento y un módulo de enfriamiento de aire. La lámpara PL de cuarzo fundido claro lineal de 16
pulgadas (LH840) generó PL en la longitud de onda de 200e1100 nm, con 40% de la energía en la región
UV. Los pulsos recibieron 505 J / pulso (1.27 J / cm2) de energía con una frecuencia de pulso de 3 pulsos /
seg, según las especificaciones del fabricante. La energía de banda ancha de cada pulso, expresada en J /
cm2, se cuantificó utilizando un medidor de potencia láser Vega (Ophir Optronics Inc., Wilmington, MA)
equipado con un sensor de energía piroeléctrico (PE-50C, Ophir Optronics). Para el tratamiento PL, las
frambuesas se colocaron en una cámara PL en placas de Petri estériles sin cubiertas. La distancia entre la
lámpara y la ventana de cuarzo era de 5,8 cm y la distancia entre la parte superior de las frambuesas y la
ventana de cuarzo era de aproximadamente 13 cm. Los tratamientos con PL se realizaron durante un tiempo
total que varió desde 5 s hasta 30 s, que incluyó la duración de los pulsos y el intervalo entre cada pulso.
Como se observó una pérdida de frambuesas de calidad grave cuando se aplicó PL por más de 30 s, elegimos
5, 15 y 30 s como tiempos de tratamiento. La pérdida de calidad incluía el tejido encogido, el color más

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oscuro y el olor cocido. La fluencia para nuestro sistema fue de 5.0, 14.3 o 28.2 J / cm2 para tratamientos PL
de 5, 15 o 30 s, respectivamente. Las frambuesas tratadas y de control (inoculadas pero no tratadas) se
analizaron inmediatamente o se colocaron en bolsas estériles con aberturas para respirar y luego se
almacenaron a 4 ± 1 ° C durante 10 días. Se llevaron a cabo tres ensayos independientes usando bacterias
patógenas que crecieron en tres días diferentes y las frambuesas se procesaron en tres días diferentes.
2.4. Análisis microbianos
Las frambuesas se analizaron microbiológicamente el día 0, el día 5 y el día 10. Se transfirieron a bolsas
stomacher estériles con caldo neutralizado D / E (Difco) a una relación 1: 9 (p: v) y se homogeneizaron
mediante stomacher (Circulator 400, Seward Co ., West Sussex, Reino Unido) a 260 rpm durante 1 minuto
para ayudar a liberar y distribuir patógenos de manera uniforme. El homogenado se diluyó en serie usando
0,1% de agua de peptona y se plaqueó en placas TSAYE-N (para Salmonella) o TSAYE-NS (para E. coli
O157: H7) usando un esparcidor estéril. Las colonias se enumeraron después de la incubación durante 48 ha
37 ° C. La población de sobrevivientes de patógenos se informó como log 10 CFU / g.
2.5. Efecto de PL sobre el color y la textura de las frambuesas
Las frambuesas sin inoculación artificial se trataron con PL como se describe anteriormente o se usaron
como control (sin PL) y luego se almacenaron en bolsas limpias con aberturas a 4 ± 1 ºC durante 10 días. El
color y la textura de las frambuesas se analizaron el día 0, el día 5 y el día 10. El color se analizó utilizando
un cromámetro (Minolta CR-400, Minolta, Osaka, Japón). Los parámetros de color se cuantificaron en el
espacio de color Hunter L * (claridad / oscuridad), a * (enrojecimiento / verdor) yb * (amarillez / azul). La
textura de las frambuesas se midió como resistencia al corte usando un analizador de textura (TA. XT2i,
Texture Technologies, Nueva York, EE. UU.). Las muestras se colocaron en la plataforma TA-91 y se
llevaron a cabo pruebas de compresión. Se informó la fuerza máxima (Fmax) necesaria para comprimir las
muestras.

2.6. Efecto de PL en TPC y TAC de frambuesas.

El TPC de frambuesas con o sin tratamiento de PL se determinó según lo descrito por Xu et al. (2010) con
ligera modificación. Las frambuesas se homogeneizaron en bolsas Stomacher con 25 ml de etanol con una
relación de 1: 5 (p / v). Las bolsas se sellaron con calor y se dejaron reposar durante 30 minutos con un
masaje suave para extraer los compuestos polifenólicos. Los homogeneizados se centrifugaron a 4000 rpm
durante 10 minutos (Beckman Coulter, Inc. Microfuge®, Indianápolis, IN, EE.UU.) y se recogieron los
sobrenadantes. Se añadieron treinta ml de sobrenadantes (diluidos si es necesario) a una placa transparente de
96 pocillos con un fondo transparente, seguido de la adición de 60 ml del reactivo FolineCiocalteau (1_10_4
M) y 120 ml de solución de carbonato de sodio (20%, p: v ) La placa se cubrió con una tapa transparente, se
sacudió horizontalmente para mezclar y se incubó durante 30 minutos a 35 _C. Se usó una serie de
concentración conocida de ácido gálico como estándar. La absorbancia se midió a 765 nm usando el lector de
microplacas multimodo Synergy TM 2 (BioTek Instruments, Inc. Winooski, VT, U.S.). Los resultados se
expresaron como mg de equivalentes de ácido gálico (GAE) por 100 g de peso fresco (FW).
TAC de frambuesas se midió utilizando el método diferencial de pH reportado por Li et al. (2013) con ligera
modificación. Las frambuesas con o sin tratamientos de PL se colocaron en tubos de centrífuga cónicos de 50
ml con 30 ml de solución de metanol-agua (80:20, v: v) que contienen 0,1 ml / l de ácido acético. La mezcla
se homogeneizó con ultra-turrax (IKA Works, Inc., Wilmington, NC) durante 2 minutos, se incubó en la
oscuridad durante 1 hora y luego se sometió a ultrasonidos durante 15 minutos para ayudar a la extracción de
antocianinas. Después de la centrifugación a 5000 rpm durante 30 minutos a temperatura ambiente, se
registró el volumen de los sobrenadantes, que era extracto de antocianina de frambuesa. El extracto de
antocianina se mezcló con un tampón de cloruro de potasio 0,025 M (pH 1,0) y tampón de acetato de sodio
0,4 M (pH 4,5) con un factor de dilución a 6,0. La absorbancia de cada mezcla se midió a 510 nm y 700 nm
para la neblina correcta. La absorbancia (A) del extracto de antocianina se calculó mediante la siguiente
fórmula:

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 A ¼ ðA510 _ A700Þ pH 1:0 _ ðA510 _ A700Þ pH 4:5
Donde A fue la absorbancia del extracto de antocianina. A510 significaba la absorbancia medida a 510 nm, y
A700 significaba la absorbancia medida a 700 nm.
La concentración monomérica de pigmento de antocianina en la muestra original de frambuesa se expresó en
equivalencia de cianuración-3-glucósido usando la siguiente fórmula:
Contenido de antocianinas ¼ ðA _MW _ DF _ 1000Þ=ðε _ 1Þ
Donde MW (449.2 g / mol) era el peso molecular de cianidin-3-glucósido; DF fue el factor de dilución (6 en
nuestro estudio); y ε era la absortividad molar, que era igual a 26, 900 para cianidin-3-glucósido.
2.7. Efecto de PL en TBC y TYMC de frambuesas.
Se usaron frambuesas sin inoculación artificial para la evaluación TBC y TYMC. En el día 0, día 5 y día 10,
se colocaron frambuesas con o sin tratamiento de PL en bolsas stomacher estériles con 45 ml de agua de
peptona al 0,1% (relación 1: 9, p: v) después del tratamiento con PL y se homogeneizaron mediante
stomacher a 260 rpm por 1 min. El homogeneizado se sembró en TSA para la enumeración de TBC o en agar
de patata dextrosa (PDA, Difco) para la enumeración de TYMC. Antes de contar las colonias, las placas de
TSA se incubaron a 35 ° C durante 48 h, mientras que las placas de PDA se incubaron a 25 ° C durante 3 e 5
días (Tournas et al., 2001).
2.8. Preparación de muestras de microscopía electrónica de barrido (SEM).
Para observar el comportamiento de los patógenos transmitidos por los alimentos en la superficie de las
frambuesas, se aplicó la inoculación por inmersión para proporcionar las máximas posibilidades de fijación.
E. coli O157: H7 se usó como modelo patógeno para su unión y descontaminación en respuesta al
tratamiento con PL. Se preparó una cepa doble resistente a antibióticos como en 2.1. Las frambuesas se
sumergieron por completo en 108 inóculos de UFC / ml de E. coli O157: H7 en una bolsa estéril en la
proporción de 1: 5 (peso de las frambuesas: volumen del inóculo). Las bolsas se sellaron con calor
inmediatamente y se aplicaron sacudidas ligeras durante 1 minuto. Las frambuesas se tomaron con pinzas
estériles, se colocaron en placas de Petri limpias y se secaron al aire en la campana de bioseguridad durante 4
h antes de los tratamientos de descontaminación. Se usó un tiempo de secado más largo debido a que se
utilizó más volumen de líquido de cultivo de bacterias en la inoculación por inmersión que la inoculación de
punto. El tratamiento con PL (15 s) se aplicó como se describe en 2.3.
Las frambuesas tratadas y no tratadas se cortaron en trozos pequeños y luego se colocaron en placas de
cultivo celular estériles transparentes de 6 pocillos y las células bacterianas se fijaron con glutaraldehído al
2% durante 1 h antes del secado de puntos críticos (CPD) para estabilizar los componentes del tejido y
reducir su extracción en la deshidratación y solventes de transición. La fijación se realizó en una campana de
humo inflamable.
Para comparar el comportamiento diferente de E. coli O157: H7 en superficie lisa y frambuesa, se inocularon
cubreobjetos con E. coli O157: H7 y se trataron con PL durante 15 s. Los cubreobjetos para microscopios
Fisherbrand ™ (círculos n. ° 1, 0,13e0,17 mm de grosor, tamaño: 18 mm) se colocaron en placas de Petri
limpias. El 0,1% de poli-L-lisina se aplicó en el centro de los cubreobjetos y se incubó a temperatura
ambiente durante 5 min. El líquido se pipeteó y los cubreobjetos se secaron en la campana de bioseguridad a
temperatura ambiente durante 12 h. El inóculo de E. coli O157: H7 (0,3 ml) se colocó en el centro de
cubreobjetos recubiertos con poli-L-lisina y se incubó a 37 ºC durante 30 minutos. Se eliminó inóculo
adicional y se formó una sola capa de células bacterianas en la superficie. Los cubreobjetos inoculados se
colocaron en placas de Petri estériles sin cubiertas en una cámara PL y se trataron durante 15 segundos como
se describe en 2.3. Los cubreobjetos inoculados sin tratamiento PL sirvieron como control. Luego se
colocaron vasos de cobertura tratados y no tratados en placas de cultivo celular estériles transparentes de 6
pocillos y se fijaron células bacterianas en un 2% de glutaraldehído durante 1 h antes de secado de puntos
críticos (CPD) para estabilizar los componentes del tejido y reducir su extracción en la deshidratación y
solventes transicionales. La fijación se realizó en una campana de humo inflamable.
2.9. Microscopía electrónica de barrido (SEM)

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Después de la fijación, los cubreobjetos y las frambuesas se lavaron 3 veces (30 min / hora) con tampón
filtrado (1 _ PBS) y se sometieron a un proceso de fijación posterior incubando con Osmium Tetroxide
(OsO4) durante 2 ha temperatura ambiente. Luego, los cubreobjetos y las frambuesas se enjuagaron tres
veces con agua ultrapura filtrada (30 minutos / tiempo) y luego se deshidrataron en series de etanol (25%,
50%, 75%, 95% y 100%) con 30 minutos para cada concentración. El etanol al 100% se aplicó dos veces
para asegurar la deshidratación completa. Los cubreobjetos y las frambuesas se transfirieron a las cestas
metálicas que venían con el aparato CPD. Las muestras deshidratadas se secaron inmediatamente con
Autosamdri-815B Critical Point Dryer (Tousimis® Rockville, MD, EE. UU.) Seguido de montaje en tiras
SEM y recubrimiento por pulverización (Denton Vacuum Bench Top Turbo III, Moorestown, NJ, EE. UU.)
Con una capa fina de oro-paladio. Las muestras revestidas se observaron en SEM (Hitachi S4700 FESEM,
Hitachi Ltd, Tokio, Japón) a un voltaje de aceleración de 3 kV. Las imágenes se adquirieron a diferentes
aumentos, que van desde 2,5 K a 20,0 K.
2.10. Análisis estadístico
Todos los experimentos se replicaron 3 veces en cada ensayo independiente, todos los experimentos se
realizaron en tres ensayos independientes y los resultados se informaron como Media ± DE. Se usó el
software JMP 10 (SAS Cary, NC, EE. UU.) Para análisis estadísticos. Para la población de supervivencia de
patógenos y calidad de frambuesas (incluyendo color, textura, TBC, TYMC, TPC y TAC) durante el
almacenamiento, la prueba de Dunnett se utilizó para determinar las diferencias entre muestras tratadas y no
tratadas (control) el día 0, día 5 y día 10 y la prueba t de Student se usó para determinar la diferencia entre
cada muestra tratada y el mismo tratamiento en días diferentes. Se informó una diferencia significativa
cuando P <0.05.

Resultados y discusión
3.1. Inactivación de Salmonella y E. coli O157: H7 utilizando el tratamiento con PL y la población de
sobrevivientes de patógenos durante el almacenamiento.
PL inactivó Salmonella de manera dependiente del tiempo (de 5 s a 30 s), que también era una manera
dependiente de la fluencia (de 5,0 a 28,2 J / cm2). El tratamiento con 5s PL redujo significativamente la
población de Salmonella de 5.5 (control) a 2.1 log CFU / g. La población de Salmonella se redujo a 1,5 o 1,0
log CFU / g después de 15 o 30 s PL tratamiento, respectivamente. La disminución de la población fue
significativa en el nivel alfa de 0.05. La mayor reducción logarítmica (4.5 log CFU / g reducción) de
Salmonella fue proporcionada por
Tratamiento de 30 s PL.
Durante 10 días de almacenamiento, no hubo una diferencia significativa para el control que varió de 5.5 a
5.0 log CFU / g. Las frambuesas tratadas con PL 5s mostraron un ligero aumento de la población en los
primeros 5 días y una ligera disminución en los últimos 5 días. Sin embargo, las frambuesas tratadas con PL
15 s tuvieron una población significativamente mayor de Salmonella. Durante los primeros 5 días de
almacenamiento, la población aumentó significativamente de 1.5 a 2.2 log CFU / g y no hubo un aumento
significativo después del día 5 hasta el final del almacenamiento. Los 30 s PL mostraron básicamente la
misma tendencia que PL 15s. Hubo un aumento significativo en la población de Salmonella durante la
primera mitad del almacenamiento, de 1.0 a 2.3 log CFU / g, y no se han observado cambios significativos
desde el día 5 al día 10 aunque la población disminuyó ligeramente a 2.0 log CFU / g . En el día 10, al final
del almacenamiento, la población de sobrevivientes de Salmonella para los tratamientos PL 15s (2.3 log CFU
/ g) y PL 30s (2.0 log CFU / g) todavía era significativamente menor que el control (5.0 log CFU / g) pero no
había diferencia más significativa comparada con PL 5s (1.8 log CFU / g), que indicó que un mayor tiempo
de exposición de PL proporciona una alta eficacia de inactivación en Salmonella justo después del
tratamiento, sin embargo, la ventaja se pierde después de 10 días de almacenamiento.
La inactivación de E. coli O157: H7 usando PL se muestra en la misma figura (Fig. 1). La población de E.
coli O157: H7 disminuyó significativamente de 5.7 (control) a 2.1 log CFU / g después de 5 s de tratamiento

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con PL, lo que demostró que PL redujo E. coli O157: H7 en 3.6 log CFU / g. A diferencia de Salmonella, con
un aumento del tiempo de tratamiento con PL desde 5 s hasta 30 s, no hubo una mejora adicional
significativa de la inactivación del patógeno. E. coli O157: población H7 en 5 s frambuesas tratadas con PL
se mantuvieron bajas durante los primeros 5 días y disminuyeron significativamente desde el día 5 (2.1 log
CFU / g) hasta el día 10 (1.2 log CFU / g). Los 15 s PL llevaron a una población de sobrevivientes de
patógenos significativamente más baja el día 10 (1.5 log CFU / g) en comparación con el día 0 (2.3 log CFU /
g). Para el tratamiento con PL de 30 s, la población de sobrevivientes de E. coli O157: H7 no cambió
significativamente durante el almacenamiento. Al final de los 10 días, no hubo diferencias significativas
entre los tres tratamientos PL, que también se observaron para la población de Salmonella.
Nuestros resultados mostraron que PL fue una técnica eficiente para inactivar Salmonella y E. coli O157: H7
en frambuesas frescas y mantuvo la población de sobrevivientes de patógenos más bajos durante los 10 días
de almacenamiento. Se ha informado que PL ha inactivado microorganismos presentes de manera natural
(G_omez-L_opez et al., 2005; Hoornstra et al., 2002), así como inoculados (Fine y Gervais, 2004) en
superficies de alimentos. Nuestro estudio anterior mostró que PL proporcionó una reducción logarítmica de
4.9 y 5.2 en la mancha de E. coli O157: H7 inoculada en tallos y hojas de cebolla verde, respectivamente (Xu
et al., 2013). Sharma y Demirci (2003) inocularon semillas de alfalfa con E. coli O157: H7 y se trataron con
PL a diferentes distancias (8 y 13 cm) durante 75 s. Lograron una reducción de 4,89 log a una distancia de 8
cm, pero solo 1,42 log de reducción a 13 cm, lo que indicó que la eficacia de la descontaminación de PL
depende de la distancia. También parece que los productos frescos con una superficie más lisa y una
estructura más simple eran más fáciles de descontaminar utilizando PL. En el estudio de Bialka (2007), se
aplicó PL a diferentes bayas para inactivar E. coli O157: H7 y Salmonella inoculadas artificialmente. Se
lograron reducciones máximas de 4.3 y 2.9 log 10 CFU / g en arándanos después de una dosis UV de 22.6 J /
cm2 para E. coli O157: H7 y Salmonella, respectivamente. En frambuesas, sin embargo, las reducciones
máximas de E. coli O157: H7 y Salmonella fueron de 3.9 y 3.4 log10 CFU / g a una fluencia mucho más alta
(72 y 59.2 J / cm2, respectivamente).
3.2. Efecto de PL sobre el color y la textura de las frambuesas
El color atractivo es una de las principales características sensoriales de las bayas y los productos (Rein y
Heinonen, 2004). El cambio de color de rosa a rojo a rojo oscuro puede no ser atractivo en algunos mercados.
En este estudio monitoreamos los valores L *, a * yb *, pero solo informamos L * y a * que indicaron el
cambio de brillo / oscuridad y enrojecimiento / verdor, respectivamente. Como se muestra en la Tabla 1, no
hubo un cambio significativo para el brillo (L *) después del tratamiento con PL en el día 0 que varió desde
31.6 a 32.3. Durante 10 días de almacenamiento, el brillo de las frambuesas sin tratamiento de PL disminuyó
significativamente de 32,3 a 27,1 mientras que el enrojecimiento no cambió significativamente. Las
frambuesas tratadas con 5s PL mostraron los mismos resultados con la disminución del brillo y sin cambios
significativos de enrojecimiento. Después de ser tratados durante 15 so 30 s, las frambuesas se volvieron de
color rojo más oscuro, lo que incluye una disminución significativa del valor de L * y un aumento de un
valor de * después de 10 días de almacenamiento. Aunque no se incluyó en la Tabla 1, el valor b * de
frambuesas que varía de 11.7 a 12.6 no mostró ningún cambio significativo después del tratamiento con PL o
durante el almacenamiento.
La firmeza es otro indicador de calidad para las frambuesas, no solo para el mercado nuevo sino también para
el procesamiento. La textura de las frambuesas mostró una tendencia similar a la del color, como se muestra
en la Tabla 1. Cuando el análisis de la textura se realizó inmediatamente después del tratamiento con PL,
aquellos que se trataron durante 5 segundos mostraron una textura significativamente más suave debido a la
variación individual. Durante el almacenamiento de 10 días, el control y todas las bayas tratadas con PL
dieron como resultado una textura considerablemente más suave el día 10 en comparación con el día 0. PL
30s causó un ablandamiento significativo durante 10 días de almacenamiento.
En la última década, los consumidores tienen cada vez más requisitos para la calidad de los alimentos
naturales y frescos. La calidad y la seguridad son críticas para la industria de productos frescos. La gente

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desea desarrollar técnicas con capacidad antimicrobiana satisfactoria sin comprometer la calidad. En este
estudio, los tratamientos con PL de 30 s no afectaron la calidad de las frambuesas inmediatamente después
del tratamiento, sin embargo, la influencia sobre la calidad aumentó significativamente durante los primeros
5 días de almacenamiento. En el estudio de Bialka y Demirci (2007), PL se aplicó a tres distancias (3, 8 y 13
cm) durante 60 s con dosis UV de 32.4, 22.6 y 12.8 J / cm2, respectivamente, para la descontaminación de
arándanos. No hubo una diferencia de color significativa entre los arándanos tratados y no tratados. Sin
embargo, no se monitoreó ninguna calidad durante el almacenamiento. Charles et al. (2013) ha evaluado el
impacto de PL sobre la firmeza y el color de los mangos recién cortados. Los mangos se trataron con PL con
una fluencia de 8 J / cm2 y se colocaron en un frasco de vidrio y se almacenaron a 6 ° C durante 7 días. Los
resultados mostraron que PL conservó la firmeza y el color del tejido de los mangos durante el
almacenamiento. Esta diferencia puede deberse a la mayor fluencia utilizada en nuestro estudio (28,2 J / cm2
para el tratamiento con PL de 30 s), así como a la textura más dura de los mangos en comparación con las
frambuesas utilizadas en nuestro estudio.
3.3. Efecto de PL en TPC y TAC de frambuesas
Aunque los polifenoles se distribuyen ampliamente en frutas y verduras, no todos los alimentos son fuentes
igualmente buenas, y las frutas blandas como las fresas, las frambuesas y los arándanos ahora son
reconocidas como fuentes especialmente ricas (Beattie et al., 2005). Las bayas contienen polifenoles,
incluidos los ácidos fenólicos, flavonoides, taninos y estilbenos. Como se muestra en la Tabla 1, TPC no se
vio afectado por PL justo después del tratamiento. Esto es similar a los hallazgos de Luksiene et al. (2013)
que trataron las fresas con luz pulsada de alta potencia (3.6e10.8 J / cm2) y no se observó una disminución de
TPC después del tratamiento. Otras investigaciones, por otro lado, han informado resultados conflictivos.
Murugesan et al. (2012) ha estudiado los cambios en los polifenoles totales en saúco (Sambucus nigra)
después del tratamiento con varias dosis de luz pulsada. Los resultados mostraron que los tratamientos con
PL mejoraron las propiedades antioxidantes de los frutos de saúco al aumentar su TPC. También encontraron
que el aumento de energía de 4500J / m2 / pulso a 6000J / m2 / pulso trajo una disminución en el TPC. Guner
(2012) trató arándanos con PL y concluyó que 60 so 90 s de PL aumentaron significativamente el contenido
fenólico total de los arándanos. Estos hallazgos previos sugirieron que el TPC variaba entre diferentes
energías y la duración del tratamiento utilizado en PL.
En nuestro estudio, durante 10 días de almacenamiento, el TPC del control disminuyó significativamente de
39.1 a 29.6 mg equivalentes de ácido gálico por 100 g FW. Resultados similares han sido reportados por
Verde et al. (2013). En su estudio, las frambuesas frescas se almacenaron a 4 ºC durante 14 días y los
resultados de TPC indicaron una disminución con el almacenamiento. En nuestro estudio, las frambuesas
tratadas con TPC en PL también disminuyeron durante 10 días de almacenamiento. Sin embargo, una caída
significativa de TPC en los primeros 5 días solo se ha observado en frambuesas tratadas con PL de 15 o 30 s.
Al final del almacenamiento, no hubo diferencias significativas en TPC entre las frambuesas no tratadas y
tratadas con PL, lo que indicó que aunque PL no mejoró el TPC de las frambuesas, tampoco afectó al TPC en
comparación con las frambuesas no tratadas.
TAC se registró ya que las antocianinas contribuyen al color rojo, así como a las capacidades antioxidantes
de las frambuesas. Las frambuesas contienen un espectro distinto de 11 antocianinas diferentes, siendo las
más abundantes la cianidina-3-soforosida, la cianidina-3- (2G-glucosilrutinosida) y la cianidina-3-glucósido
(Mullen et al., 2002). Como se muestra en la Tabla 1, PL 5s (38,7 mg de cianidina-3-glucósido equivalentes /
100 g FW) y 15s
(44,8 mg de equivalentes de cianidina-3-glucósido / 100 g de peso corporal) no afectaron el TAC de las
frambuesas en comparación con las bayas sin tratar (42,6 mg de equivalentes de cianidina-3-glucósido / 100
g de peso corporal) inmediatamente después del tratamiento. PL 30s, sin embargo, aumentó
significativamente el TAC a 48,6 mg de equivalentes de cianidina-3-glucósido / 100 g de peso corporal. Se
ha informado (Rodov et al., 2012) que la exposición breve poscosecha a luz pulsada (10e90s) estimula la
acumulación de coloración y antocianina en la fruta de higo (Ficus carica L.).

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En nuestro estudio, durante 10 días de almacenamiento, TAC en las muestras control y tratadas disminuyó
significativamente mientras que todas las bayas tratadas con PL mostraron un TAC más alto al final del
almacenamiento. Se ha informado que el TAC se ve afectado por diversos factores, como la madurez de la
fruta, la temperatura de almacenamiento y el tratamiento con luz pulsada. Wang et al. (2009) mostraron que
las antocianinas basadas en cianindina de las frambuesas aumentaron durante el período poscosecha, y las
frambuesas rojas cosechadas en diferentes etapas de desarrollo continuaron su desarrollo de antocianinas
durante el almacenamiento, incluso en condiciones de oscuridad. Kalt et al. (1999) informaron que la
temperatura por encima de 0 ° C ha demostrado que aumenta el contenido de antocianinas de las frambuesas
rojas durante el almacenamiento. Rodov et al. (2012) que estudiaron la influencia de PL en fruta de higo
también informaron que después de 5 días de almacenamiento en la oscuridad a 20 ° C, el contenido de
antocianina de la piel de fruta expuesta a 90e300 s PL fue 20 veces mayor que la observada para el control no
tratado . En nuestro estudio no observamos un aumento significativo de TAC para las frambuesas no tratadas,
pero sí coincidimos con otros investigadores en el efecto positivo de PL en TAC durante el almacenamiento.
No se realizó ninguna evaluación de la vitamina C en el estudio actual debido a la limitación de tiempo y
recursos de investigación. Otros investigadores (Luksiene et al., 2013) informaron que la vitamina C en
fresas no se vería afectada por el tratamiento con PL y no hubo cambios significativos antes y después del
tratamiento con PL, sin embargo, no se evaluaron cambios cinéticos de vitamina C durante el
almacenamiento de fresas. En la investigación futura, es importante determinar el perfil de vitamina C en las
frambuesas inmediatamente después del tratamiento con PL y durante el período de conservación.
3.4. Efecto de PL en TBC y TYMC de frambuesas

Las frambuesas generalmente se pudren al ablandarse y crecer el moho y / o las bacterias. La población
inicial de bacterias totales de frambuesas fue 2.5 log 10 CFU / g. El tratamiento con PL disminuyó
significativamente las poblaciones de bacterias aeróbicas en frambuesas en comparación con el control.
Como se muestra en la Fig. 2, después del tratamiento con PL, el TBC en frambuesas fue 1,8, 1,5 y 1,0 log
10 CFU / g durante 5, 15 y 30 s del tratamiento con PL, respectivamente. Después de 10 días de
almacenamiento a 4 _C, el control tenía 4.2 log 10 CFU / g de TBC, mientras que las frambuesas tratadas con
5, 15 y 30s de PL tenían el TBC de 2.5, 2.3 y 3.3 log 10 CFU / g, respectivamente, que eran
significativamente más bajo que el de control. PL 30s mostró la más alta (1.5 log 10 CFU / g reducción) de
TBC en el día 0. Al final del almacenamiento, aunque aún significativamente más bajo que el control, TBC
de PL 30s fue significativamente mayor que el tratamiento PL con menor tiempo (5 y 15s). Esto puede
deberse a que el tratamiento PL de mayor duración afectó la estructura de las frutas frambuesas, lo que
beneficia el crecimiento de las bacterias, lo que podría estar relacionado con una textura más suave observada
en las frambuesas tratadas con PL 30.
La misma eficacia de inactivación de PL se ha encontrado en levaduras y mohos (Fig. 3). El TYCH inicial de
frambuesas fue 3.4 log 10 CFU / g mientras que después del tratamiento, la población de levaduras y mohos
para frambuesas fue de 2.4, 2.0 y 1.8 log 10 CFU / g con 5, 15 y 30s de tratamiento con PL, respectivamente.
PL 30s proporcionó una reducción de 1,6 log 10 CFU / g de TYMC en frambuesas en el día 0, que fue
comparable con el resultado de Guner (2012). En su investigación, los arándanos se trataron con 120 s PL y
se observó una reducción de 1,27 log 10 CFU / g de levaduras y mohos totales. Durante nuestro
almacenamiento de 10 días, TYMC del control alcanzó 4.2 log 10 CFU / g mientras que las frambuesas
tratadas con 5,
15 o 30s de PL tenían 2.5, 2.2 y 2.8 log 10 CFU / g, respectivamente. En el día 10, las frambuesas tratadas
con PL mantuvieron TYMC significativamente más bajo que el control. No hubo diferencias significativas
entre cada tratamiento de PL, aunque las frambuesas tratadas con PL 30 tenían TYMC leve pero no
significativamente mayor.
3.5. Microscopía electrónica de barrido (SEM)

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La Fig. 4A muestra las células de E. coli O157: H7 en cubreobjetos sin tratamiento con PL, mientras que la
Fig. 4 B muestra las células de E. coli tratadas con PL seco durante 15 s. Comparando A y B, hubo una clara
diferencia estructural entre las células de E. coli O157: H7 no tratadas y tratadas en los cubreobjetos. Las
células de E. coli O157: H7 no tratadas tenían aproximadamente 2,0 mm de largo y presentaban una
superficie lisa e intacta (Fig. 4A). Algunas células tratadas perdieron por completo su integridad de
membrana, lo que provocó el aplanamiento de las células desde los bordes. Esto puede deberse a que el
tratamiento con PL incrementó repentinamente la temperatura del fluido intracelular que condujo a la
vaporización del agua en un tiempo relativamente corto (Wekhof, 2000). Esta observación fue comparable
con Cheigh et al. (2012) que utilizó el análisis de microscopía electrónica de transmisión (TEM) para
observar el daño celular inducido por la luz pulsada intensa. Sus resultados revelaron la destrucción de
estructuras celulares como la pared celular y la membrana citoplásmica. Se han propuesto varios mecanismos
para explicar el efecto letal de PL. Se ha confirmado que la región UV es crucial para la eficacia del
tratamiento con PL (Takeshita et al., 2002). El mecanismo fotoquímico ha sido ampliamente aceptado porque
el efecto germicida de la luz UV se ha atribuido principalmente a una transformación fotoquímica de las
bases de pirimidina en el ADN de los patógenos para formar dímeros. Sin embargo, algunos otros
investigadores propusieron que el efecto de PL puede no depender por completo del daño en el ADN y la
acción letal de PL también puede deberse al efecto fototérmico (Wekhof, 2000). La absorción de luz UV por
bacterias puede atribuirse al sobrecalentamiento, la vaporización de agua intercelular y luego la disrupción de
la membrana, que ha sido confirmada por nuestros hallazgos de SEM. Para contaminar los productos frescos
y la transferencia en la cadena de producción de alimentos, los patógenos transmitidos por los alimentos
deben unirse a la superficie de la planta para sobrevivir o proliferar. Los patógenos utilizan heridas y
aberturas naturales como estomas, hidatódos y lenticelas como puertas de entrada naturales para el paso a los
tejidos internos de las plantas donde crecen y comienzan a causar enfermedades (Hirano y Upper, 2000;
Melotto et al., 2006). La rugosidad de la superficie puede afectar la unión del patógeno (G_omez-L_opez,
2012). La capacidad de E. coli O157: H7 para unirse a las frambuesas se ha demostrado en SEM. (Fig. 4C y
D). La Fig. 4C representaba las frambuesas no tratadas, mientras que la Fig. 4D representaba las tratadas con
PL. Durante la inoculación por inmersión, las bacterias mostraron una preferencia de fijación específica
cuando las células bacterianas tenían libre acceso a las plantas y podían moverse libremente. Las frambuesas
se componen de muchas frutas individuales (drupelets) unidas por pelos (tricomas) y ceras (Mackenzie,
1979). Como se muestra en la Fig. 4C, parece que se prefirió E. coli O157: H7 para los tricomas de las
frambuesas. Aunque, a nuestro entender, no se han realizado investigaciones para investigar cómo la
estructura superficial de las frambuesas afectaría la unión de E. coli O157: H7, Sirinutsomboon (2011)
construyó las estructuras superficiales sobre silicio para imitar estomas, tricomas y surcos entre las células
epidérmicas de las plantas utilizando la fotolitografía como método de microfabricación para determinar el
efecto de la microestructura sobre la unión bacteriana. Los resultados mostraron que la base de tricoma tenía
niveles de unión 3e5 veces mayores que los de las áreas más distantes, lo que podría ayudar a explicar la
preferencia de fijación para los tricomas de frambuesas en nuestro estudio.
Después del tratamiento con PL durante 15s, las células E. coli O157: H7 en frambuesas (Fig. 4D) mostraron
morfología diferente con las de los cubreobjetos (Fig. 4B). Las células de E. coli O157: H7 en las frambuesas
parecían corrugadas, y había algunas depresiones en estas células, pero su longitud promedio permanecía
inalterada. No se ha observado una ruptura completa de la membrana como en los cubreobjetos. El daño
relativamente menor a las células de E. coli O157: H7 puede deberse a que la microestructura compleja de la
superficie de frambuesa protegió a las bacterias de ser inactivadas por PL. Observado en un estudio previo
por Wang et al. (2009), un aumento en la rugosidad de la superficie del fruto introduciría protección a los
microbios atrapados en la superficie del fruto, lo que resultaría en una menor eficacia de lavado.

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4. Conclusión

Nuestra investigación demostró por primera vez que el procesamiento exitoso de frambuesas PL debe
evaluarse por sus impactos tanto en la seguridad como en la calidad, ya que la descontaminación más
efectiva por tratamiento de PL podría ocasionar defectos de calidad durante el almacenamiento, incluso estos
defectos de calidad pueden no aparecer inmediatamente después tratamiento. Inmediatamente después del
tratamiento, la reducción de Salmonella por PL mostró una manera dependiente de la fluencia con PL 30 que
proporciona la mayor reducción logarítmica de Salmonella (4,5 log 10 CFU / g). La reducción de E. coli
O157: H7, sin embargo, no se vio significativamente afectada por la fluencia. PL 30s proporcionó una
reducción leve pero no significativamente mayor de E. coli (3.9 log 10 CFU / g) en frambuesas frescas.
Todos los tratamientos con PL mantuvieron poblaciones de supervivencia de patógenos más bajas durante 10
días de almacenamiento a 4 ºC en comparación con el control, y PL 30 no logró mantener su ventaja de
inactivación durante el almacenamiento. El color y la textura de las frambuesas tratadas con PL 30 también
cambiaron negativamente en 10 días de almacenamiento. PL 30s proporcionó el TBC y TYMC más bajos en
el día 0, pero no logró mantener su ventaja durante el almacenamiento. PL 30s no tuvo un impacto negativo
en TPC y TAC. Para considerar tanto la seguridad y la calidad de las frambuesas frescas como el costo del
tratamiento, se recomendó un tratamiento de PL de 5 s con una fluencia de 5.0 J / cm2. Bajo SEM, PL mostró
daño severo a la membrana celular en la superficie lisa. La estructura superficial de las frambuesas afectó la
unión de las células bacterianas y la rugosidad de la superficie proporcionó protección para las bacterias
patógenas.

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