Practica 1 - Micros

MICROBIOLOGÍA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
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LA OBSERVACIÓN EN FRESCO DE MICROORGANISMOS Y TIPOS DE

TINCIONES
DOCENTE:
Dr. Anhuamán Azabache, Raúl
ESTUDIANTE:
Castillo Sánchez, Fiorella Alexandra
ÁREA:
PRÁCTICA DE MICROBIOLOGÍA
ESCUELA:
Ingeniería Agroindustrial
CICLO:
IV
AÑO:
2020
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Título:
PRACTICA 01
MICROSCOPIA
EL MICROSCOPIO
I. INTRODUCCIÓN
El microscopio ha sido una gran herramienta en la historia de la ciencia, por lo que resulta
de vital importancia conocer su estructura para manejarlo y cuidarlo adecuadamente, de
modo que esto permita realizar satisfactoriamente observaciones de diferentes
organismos u objetos. Es difícil datar con exactitud sus orígenes, si bien podemos
situarlos en torno a las décadas finales del siglo XVI y las primeras del XVII. (Castell,
2013). El microscopio óptico es uno de los varios microscopios que existen en la
actualidad, como el microscopio de sonda de barrido, el microscopio electrónico, el
microscopio quirúrgico, el microscopio digital, entre otros.(Sosa,2018).
En microbiología, el microscopio se utiliza para observar la nitidez y fineza detallada de

la imagen. En la valoración de las muestras, es trascendente el poder de resolución del
microscopio, el cual se define como la capacidad que posee un objetivo para distinguir la
distancia mínima entre dos puntos del objeto para que se puedan visualizar como dos
puntos separados. (López, Hernández, Colín, Ortega, Cerón & Franco-Cendejas, 2014)
II. OBJETIVOS:
 Observación microscópica de los extendidos.
 Conocer las partes del microscopio compuesto de luz
 Adiestrar al estudiante en el manejo del microscopio compuesto de luz. para
la visualización correcta de microorganismos.
 Adiestrar al estudiante en la preparación en fresco de una muestra biológica.
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III. MATERIALES:
3.1. Material Biológico:
Agua estancada
Agua destilada
Cultivo de levadura
3.2. Material de vidrio:
Pipeta serológica o pipeta Pasteur.
Lamina portaobjetos y láminas cubreobjetos.
3.3. Equipos:
Microscopio compuesto de luz convencional.
3.4. Otros:
Asa de siembra.
Gotero
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IV. PROCEDIMIENTO
Identificar en el esquema los tres sistemas del microscopio de luz visible:
SISTEMA ÓPTICO
Oculares:
Están colocados en la parte superior del tubo. Se denominan así porque están muy
cercanos al ojo.
Las principales funciones del ocular son las siguientes:
- Amplificar la imagen real del objeto que forma el objetivo,

- Corregir algunos defectos del objetivo,
- Reflejar retículos, escalas u otros objetos que se coloquen en el ocular.
Objetivos:
Están colocados en la parte inferior del tubo ocular insertados en una pieza metálica,
denominada revólver, que permite cambiarlos fácilmente. Son las lentes de mayor
importancia en un microscopio, pues de sus propiedades depende que se consiga o se
frustre la imagen final. Generan una imagen real invertida y aumentada. Los más
frecuentes son los de 4, 10, 40, y 100 aumentos.
En la superficie de cada objetivo se indican sus características principales: aumento,
apertura numérica y llevan dibujado un anillo coloreado que indica el número de
aumentos.
Las principales funciones del objetivo son:
- Reunir los rayos luminosos de cualquier punto del objeto,

- Concentrar la luz en un punto de la imagen, y
- Amplificar la imagen.
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Lentes:
Pueden ser convexas o cóncavas en ambas superficies, planas en una cara o tener
cualquier combinación de éstas dos formas en su superficie.
SISTEMA MECÁNICO
Tubo:
Es una cámara oscura unida al brazo mediante una cremallera. Tiene el revólver con los
objetivos en su parte inferior y los oculares en su extremo superior.
Brazo:
Es una columna perpendicular al pie. Puede ser arqueado ó vertical y une al pie con el
tubo.
Platina:
Es una plataforma horizontal con un orificio central, sobre el que se coloca la

preparación, que permite el paso de los rayos procedentes de la fuente de iluminación
situada por debajo. Dos pinzas sirven para retener el portaobjetos sobre la platina y un
sistema de cremallera guiado por dos tornillos de desplazamiento permite mover la
preparación de delante hacia atrás o de izquierda a derecha y viceversa. En la parte
posterior se encuentra un nonio que permite fijar las coordenadas de cualquier campo
óptico; de ésta forma se puede acudir a él cuando interesa.
Revólver:
Sistema giratorio relacionado con el tubo, que porta los lentes objetivos para diversos
aumentos, pudiendo utilizarlos alternativamente.
Pie:
Es la base del microscopio y tiene un peso suficiente para dar estabilidad al aparato. Es
una plataforma rectangular y en él se integra la fuente luminosa.
Tornillo macrométrico y micrométrico:
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Son tornillos de enfoque. Mueven la platina hacia arriba y hacia abajo. El macrométrico
lo hace de forma rápida y el micrométrico de forma lenta.
SISTEMA DE ILUMINACIÓN
Condensador:
Es un sistema de lentes situadas bajo la platina. Su función es la de concentrar la luz

generada por la fuente de iluminación hacia la preparación. En el interior del
condensador existe un diafragma-iris cuya función es limitar el haz de rayos que
atraviesa el sistema de lentes eliminando los rayos demasiado desviados.
Diafragma:
Abertura que regula la cantidad de luz que ingresa hacia la preparación.
Fuente:
Se trata de una lámpara halógena de intensidad graduable. Está situada en el pie del
microscopio. Se enciende y se apaga con un interruptor y en su superficie externa puede
tener una especie de anillo para colocar filtros que facilitan la visualización.
OCULAR
BRAZO
OBJETIVO CONTROL DE
INTENSIDAD DE
PLATINA LUZ
CONDENSADOR
DIAFRAGMA
TORNILLO
MICROMÉTRICO
FOCO
BASE TORNILLO MACROMÉTRICO
MICROSCOPIO COMPUESTO
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OBSERVACIÓN EN FRESCO PROCEDIMIENTO:
- En un portaobjeto limpio y desengrasado colocar con un gotero, una gota de agua

estancada, luego colocar una laminilla sobre la muestra.
- Con la ayuda de un asa de Cole, extraer una pequeña muestra de un cultivo de
levadura y realizar una suspensión con agua destilada estéril (ADE) sobre la superficie
de una lámina porta objeto, luego colocar una laminilla sobre la preparación.
- En ambos casos colocar la lámina sobre la platina del microscopio
- Enfocar con el objetivo de 10X
- Observar la preparación
- Otra forma es la de observar las levaduras con una gota de azul de lactofenol
IV. RESULTADOS
Algas filamentosas
Observación: (rotíferos) de color verde; Observación: Saccharomyces
Cereviseace
tiene forma phytoconis de
color verde brillante. -Hongo unicelular
Aumento: Aumento:
10x 400 x
Muestra: Muestra:
Agua estancada Levadura de pan
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V. COMENTARIO
 El microscopio es una herramienta de laboratorio que se usa para explicar las

propiedades y funcionalidad de diversos organismos unicelulares y pluricelulares,
es importante identificar las piezas ópticas y mecánicas para saber sobre el manejo
del microscopio y así emplearlo para análisis e investigación de elementos de las
muestras.
 El agua estancada tiene agentes patógenos: bacterias, virus, protozoarios y
parásitos que entran al agua proveniente de desperdicios orgánicos. De lo
observado en la muestra se concluye que el agua estancada se considera no apta
para consumo humano y que por otro lado constituye un peligro para la salud de
los usuarios.
VII: REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
 Castell, P. (2013). Instrumentos para el estudio de la Historia Natural: del

microscopio óptico al microscopio electrónico. Memorias R. Soc. Esp. Hist.
Nat.(2ª época), 11, 127-135.
 Sosa, J. M. M. R. (2018). Reseña de un microscopio. Logos Boletín Científico de
la Escuela Preparatoria No. 2, 5(9).
 López-Jácome, L. E., Hernández-Durán, M., Colín-Castro, C. A., Ortega-Peña,

S., Cerón-González, G., & Franco-Cendejas, R. (2014). Las tinciones básicas en
el laboratorio de microbiología. Investig. en discapacidades, 3(1), 10-18.
 Rubeglio, E., Garrahan, J. P., Lopardo, H., & Hernández, B. C. (2014).

Microbiología clínica: desde la microscopía a la biología molecular. Med. infant,
65-65.
 https://practicasdehematologiaycitologia.wordpress.com/2014/11/02/practica-
no-3/
 http://academic.uprm.edu/~lrios/3725/Ejercicio4.pdf
 https://fiestadelosmicroorganismos.wordpress.com/2016/12/14/practica-1-
visualizacion-microscopica-de-una-gota-de-agua-estancada/
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PRÁCTICA
COLORANTES Y COLORACIONES
I. INTRODUCCIÓN
Para aprovechar la ventaja de los microscopios, se han desarrollado técnicas
como la observación en fresco, observación de espora, cápsula y coloración
Gram, etc. Cualquier análisis bacteriológico se basa en la observación
microscópica de la muestra. Una observación directa, sin coloración, nos dará
escasos datos sobre los microorganismos. Para obtener más grande información
debemos colorear el material que iremos a aprender y lo haremos con una o
numerosas técnicas que nos den las propiedades deseadas (López, Hernández,
Colín, Ortega, Cerón & Franco-Cendejas, 2014).
Hay una gran variedad de tinciones, que se han ido desarrollando para la
detección de los diferentes agentes infecciosos, en los que se incluyen bacterias,
parásitos y hongos ;ejemplo de esto es la tinción de Gram se considera básica en
la valoración inicial de muestras para análisis bacteriológico(Campo &
Bolaños,2017).
Para observar las características de las bacterias es necesario hacer preparaciones

(extendidos o frotis) sobre una lámina porta objetos y lograr luego de un proceso
de coloración, ver las células al microscopio. (Reynoso, Magnoli, Barros &
Demo, 2015).
En la aplicación de coloraciones o tinciones se necesitan los colorantes que son
compuestos orgánicos que tienen una afinidad particular por sustancias celulares
específicas. Las coloraciones comúnmente usadas son coloración simple, de
Gram, de cápsula y de espora (Campo & Bolaños,2017).
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II. OBJETIVOS.
- Familiarizar al estudiante con las técnicas básicas de coloración.

- Mediante las coloraciones hacer visibles los gérmenes y observar su estructura.
III MATERIAL:
A. COLORACIÓN SIMPLE
3.1. Material biológico y Reactivos:
- Muestras de: mucosa labial y sarro dental.
Colorantes:
- Azul de metileno
3.2. Equipos:
- Microscopio compuesto
3.3. Otros:
B. COLORACIÓN COMPUESTA COLORACIÓN DE GRAM

- Sarro dentario
- Agua destilada
- Lugol
- Alcohol acetona
- Aceite de inmersión
- Agua corriente
Colorantes:
- Cristal violeta
- Safranina
3.2. Equipos:
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3.3. Otros:
- Láminas y laminillas
- Mecheros
- Gradilla
C. COLORACIÓN DE CAPSULA: MÉTODO DE MANEVAL

- Cultivo de Klebsiella sp.
Colorantes:
- Rojo de Congo
- Fucsina ácida
3.2. Equipos:
3.3. Otros:
D. COLORACIÓN DE ESPORAS: METODO DE WIRTZ

- Cultivo de Bacillus sp.

- Agua corriente
Colorantes:
- Verde malaquita
- Safranina
3.2. Equipos:
3.3. Otros:
- Mechero
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IV. PROCEDIMIENTO
PASOS GENERALES DE UNA COLORACIÓN
- Extensión:
Extender en una lámina porta objeto una pequeña muestra de material biológico.
- Fijación:
Pasar la lámina porta objeto suavemente por encima de la flama del mechero Tinción:
- Realizarla con el colorante o grupo de colorantes apropiados.
- Lavar la lámina para eliminar el colorante.
- Secar la lámina al calor suave o el aire a presión.
- Observación:
Observar la lámina al microscopio con el objetivo adecuado. En caso de observar con
el lente de inmersión adicionar previamente una gota de aceite de inmersión por sobre
la coloración.
- Con una lámina porta objeto de primer uso, realizar un raspado de la mucosa bucal y
extenderla uniformemente en el centro de otra lámina.
- Fijar al mechero.
- Colorear con azul de metileno durante 60 segundos.
- Eliminar el colorante.
- Lavar con agua hasta que ya no desprenda colorante.
- Secar al ambiente.
- Colocar la lámina sobre la platina
- Enfocar con el objetivo de 10X, posteriormente adicionar sobre la coloración una
gota de aceite de inmersión.
- Observar con el lente de inmersión (100X)
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B. COLORACIÓN COMPUESTA COLORACIÓN DE GRAM
- Con la ayuda de un mondadientes, obtener una pequeña muestra de sarro dental y

extenderla uniformemente en el centro de la lámina porta objeto.
- Fijar la muestra en el porta objeto pasándola tres a cuatro veces a la flama del
mechero de modo que el material no sea lavado durante el procedimiento de tinción.
- Colocar el frotis sobre un soporte para tinción y cubrir la superficie con solución
de cristal violeta por 30 a 60 segundos aproximadamente.
- Después de un minuto (Puede ser menos o más tiempo con algunas
soluciones), eliminar el exceso de colorante y lavar con agua corriente.
- Cubrir con lugol y dejar actuar por espacio de 2 a 3 minutos.
- Lavar con agua corriente.
- Decolorar con alcohol acetona ó alcohol hasta que ya no se desprenda mas
colorante de la lámina.
- Colorear con safranina y dejar actuar por 30 a 60 segundos.
- Lavar, secar y observar el frotis teñido con aceite de inmersión con el objetivo de
100x del microscopio.
- Observación: Las bacterias Gram positivas se observan de color azul oscuro y las
bacterias Gram negativas de color rojo-rosado.
C. COLORACIÓN DE CAPSULA: MÉTODO DE
MANEVAL
- Preparar una suspensión turbia del cultivo de Klebsiella sp.

- Colocar una gota de Maneval A sobre la superficie limpia y desengrasada de una
lámina portaobjeto.
- Trasladar una azada de la suspensión del cultivo de Klebsiella sp. sobre la gota
del colorante y realizar una extensión uniforme. Dejar secar a temperatura ambiente.
- Agregar el colorante de Maneval B por sobre la extensión hasta que la cubra
completamente. Dejar actuar por espacio de un minuto.
- Eliminar el exceso de colorante.
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- Secar a temperatura ambiente y observar el frotis teñido con aceite de inmersión

y con el objetivo de 100X del microscopio.
Observación: Observar el cuerpo bacteriano de color rojo; alrededor del mismo, un halo
claro (cápsula) en un fondo azul.
D. COLORACIÓN DE ESPORAS: METODO DE WIRTZ.
- Realizar la extensión con el cultivo de Bacillus sp en el centro de una lámina porta

objeto. Fijar la muestra a la lámina porta objeto pasándola tres a cuatro veces a la flama
del mechero.
- Cubrir la muestra con verde de malaquita.
- Calentar la lámina hasta el desprendimiento de vapores por 3 a 4 veces.
- Agregar safranina por 30 a 60 segundos.
- Secar y observar el frotis con aceite de inmersión y con el objetivo de 100X del
microscopio.
Observación:
Se observa la espora de color verde y el cuerpo bacteriano de color rojo.
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VI. ESQUEMA DE LA PRÁCTICA
EXTENCIÓN FIJACIÓN
COLORACIÓN LAVAR
LLEVAR EL
SECAR
MICROSCOPIO
AGREGAR
ACEITE DE
INMERSIÓN OBSERVACIÓN
MICROSCÓPICA
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B. COLORACIÓN GRAM
OBSERVAR AL
MICROSCOPIO
LAVAR Y SECAR EL
PREPARADO
AGREGAR
SAFRANINA
DECOLORAR CON
ALCOHOL ACETONA
AGREGAR LUGOL
AGREGAR CRISTAL
VIOLETA
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C. COLORACIÓN DE CÁPSULA
NO FIJAR AL CALOR
Secar a
Colocar una Tomar un Hacer una Secar temperatura
Agregar fucsina
gota de rojo inoculo de suspensión con ambiente y
al aire acida
de Congo Klebsiella el rojo de Congo observar en
microscopio.
D. COLORACIÓN DE ESPORAS
FROTIS Y FIJACIÓN
TOMAR LA MUESTRA EXTENDER SOBRE EL

PONER UNA GOTA DE
DE UN CULTIVO DE AGUA Y FIJAR A LA
AGUA EN EL PORTA
BACILLUS LLAMA DEL MECHERO
TINCIÓN
LAVAR CON
CUBRIR LA CALENTAR AGUA,DEJAR
HASTA LAVAR CON TEÑIR CON
PREPARACIÓN SACAR Y
DEPRENDER AGUA SAFRANINA
CON VERDE OBSERVAR AL
MALAQUITA VAPORES MICROSCOPIO
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VII. RESULTADOS
COLORACIÓN SIMPLE
Observación:
Células de origen animal y alrededor de ellos
se ve el citoplasma, más claramente teñido, y
la membrana que las rodea en tono más
oscuro.
Coloración:
Coloración Simple
Aumento:
10x
Muestra:
Células de mucosa
oral
COLORACIÓN GRAM
Las bacterias Gram positivas
Observación:
de color azul oscuro y las
bacterias Gram negativas de
color rojo-rosado.
Coloración:
Coloración Gram
Aumento:
100 X
Muestra:
Sarro dentario
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COLORACIÓN DE CÁPSULA
Observación: Cuerpo bacteriano de color

rojo; alrededor del mismo, un
halo claro (cápsula) en un
fondo azul.
Coloración:
Método de Maneval
Aumento: 100x
Muestra:
Cultivo de Klebsiella sp
COLORACIÓN DE ESPORAS
Observación: Se observa la espora de color
verde y el cuerpo bacteriano de
color rojo.
Coloración:
Método de Wirtz
Aumento:
100x
Muestra: Cultivo de Bacillus sp
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VIII. COMENTARIO
Las coloraciones qué se estudiaron en esta práctica son: La coloración simple se da a

través de un colorante que proporciona algún tipo de contraste para observar mejor un
microorganismo. La coloración Gram permite observar bacterias permitiendo así su
distinción entre Gram positivas y Gram negativas. La coloración de cápsula permite
conocer la resistencia de la capsulas de las bacterias, el cuerpo bacteriano se colorea
pero la capsula no; como recomendación después de agregar la fucsina ácida lavar con
un buffer si no se realiza lo mencionado anteriormente no se observará de la forma
correcta. Por último la coloración de esporas las cual son formas de resistencia y se tiñen
con el verde malaquita.
IX. REFERENCIA BIBLIOGRAFICA

 López-Jácome, L. E., Hernández-Durán, M., Colín-Castro, C. A., Ortega-Peña,
S., Cerón-González, G., & Franco-Cendejas, R. (2014). Las tinciones básicas en
el laboratorio de microbiología. Investig. en discapacidades, 3(1), 10-18.
 Reynoso, M., Magnoli, C., Barros, G., & Demo, M. (2015). Manual de
microbiología general.
 CAMPO, N. B., & BOLAÑOS, A. C. (2017). GUÍAS DE LABORATORIO
CURSO DE MICROBIOLOGÍA GENERAL.
 Parte II, A. (2013). Microbiología y parasitología médicas.
 https://www.chegg.com/homework-help/questions-and-answers/1-simple-stains-
different-bacterial-species-performed-using-various-dyes-describe-cell-mor-
q51694499
 https://www.lifeder.com/tincion-de-esporas/
 https://www.lifeder.com/tincion-simple/
 https://es.slideshare.net/ceciliaisabelm1/tincin-negativa
21
ANEXOS
NORMAS GENERALES DE BIOSEGURIDAD

EN EL LABORATORIO
1. Usar guardapolvo blanco.

2. No comer, no fumar, no aplicarse cosméticos durante las prácticas
ni tocar los materiales sin autorización.
3. Trabajar en silencio prestando atención al profesor,no salir ,no jugar
en el laboratorio.
4. Limpiar el área de trabajo con desinfectante y luego lavarse las manos

antes y después de la práctica.
5. La manipulación del material biológico debe hacerse usando guantes ,
mascarilla ,gorra y respectivo mandil.
6. Evitar que se produzcan aerosoles a salpicaduras cuando se manipulan}
cultivos patógenos de lo contrario cubrir el área con desinfectante
apropiado .
7. Todo manejo de material biológico debe hacerse con supervisión de
profesor de mesa de práctica
8. La siembra de microorganismos en medios de cultivo debe hacerse en
presencia de mechero cámaras para evitar contaminación.
9. Eliminar el material biológico previa esterilización.
10. No se debe probar sustancias con la boca
11. En caso de un accidente avisé al profesor coordinador y ayude a la bioseguridad
las organizaciones pertinentes o solicite ayuda.
22

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MICROBIOLOGÍA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

LA OBSERVACIÓN EN FRESCO DE MICROORGANISMOS Y TIPOS DE

En microbiología, el microscopio se utiliza para observar la nitidez y fineza detallada de

3.1. Material Biológico:

3.2. Material de vidrio:

Pipeta serológica o pipeta Pasteur.

Lamina portaobjetos y láminas cubreobjetos.

Microscopio compuesto de luz convencional.

Identificar en el esquema los tres sistemas del microscopio de luz visible:

- Amplificar la imagen real del objeto que forma el objetivo,

- Reunir los rayos luminosos de cualquier punto del objeto,

Es una plataforma horizontal con un orificio central, sobre el que se coloca la

Es un sistema de lentes situadas bajo la platina. Su función es la de concentrar la luz

OBSERVACIÓN EN FRESCO PROCEDIMIENTO:

- En un portaobjeto limpio y desengrasado colocar con un gotero, una gota de agua

 El microscopio es una herramienta de laboratorio que se usa para explicar las

VII: REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

 Castell, P. (2013). Instrumentos para el estudio de la Historia Natural: del

 López-Jácome, L. E., Hernández-Durán, M., Colín-Castro, C. A., Ortega-Peña,

 Rubeglio, E., Garrahan, J. P., Lopardo, H., & Hernández, B. C. (2014).

Para observar las características de las bacterias es necesario hacer preparaciones

- Familiarizar al estudiante con las técnicas básicas de coloración.

B. COLORACIÓN COMPUESTA COLORACIÓN DE GRAM

3.1. Material biológico y Reactivos:

C. COLORACIÓN DE CAPSULA: MÉTODO DE MANEVAL

D. COLORACIÓN DE ESPORAS: METODO DE WIRTZ

- Cultivo de Bacillus sp.

PASOS GENERALES DE UNA COLORACIÓN

B. COLORACIÓN COMPUESTA COLORACIÓN DE GRAM

- Con la ayuda de un mondadientes, obtener una pequeña muestra de sarro dental y

C. COLORACIÓN DE CAPSULA: MÉTODO DE

- Preparar una suspensión turbia del cultivo de Klebsiella sp.

- Secar a temperatura ambiente y observar el frotis teñido con aceite de inmersión

D. COLORACIÓN DE ESPORAS: METODO DE WIRTZ.

- Realizar la extensión con el cultivo de Bacillus sp en el centro de una lámina porta

VI. ESQUEMA DE LA PRÁCTICA

TOMAR LA MUESTRA EXTENDER SOBRE EL

Observación: Cuerpo bacteriano de color

Muestra: Cultivo de Bacillus sp

Las coloraciones qué se estudiaron en esta práctica son: La coloración simple se da a

IX. REFERENCIA BIBLIOGRAFICA

NORMAS GENERALES DE BIOSEGURIDAD

1. Usar guardapolvo blanco.

4. Limpiar el área de trabajo con desinfectante y luego lavarse las manos

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