UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

ESCUELA DE POSTGRADO
PROGRAMA DOCTORAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

EFECTO DEL ACIDO FOLICO EN LA FRECUENCIA

DE ALTERACIONES CROMOSOMICAS INDUCIDAS
POR DICROMATO DE POTASIO EN Vicia faba y
Mesocricetus auratus.

Tesis para optar el Grado de Doctora en Ciencias Biológicas

Mg. ZULITA ADRIANA PRIETO LARA

ASESOR: Dr. RADIGUD FERNANDEZ ROMERO

TRUJILLO – PERU

1
 2008

A mi esposo Manuel y mi hijo Jesús, amores de mi vida.

A mi madre, como ejemplo de amor y trabajo.

En memoria de mi padre, ejemplo de superación, amor y trabajo.

A mis hermanos, amigos de siempre y apoyo constante.

A mis alumnos, motivo de superación.

2
 Agradecimientos

A la Universidad Nacional de Trujillo y a la Escuela de Postgrado, que por intermedio de sus autoridades
me brindaron su apoyo con el financiamiento económico para realizar los estudios de doctorado.

A mi asesor. Dr.Radigud Fernández Romero, por su afecto y enseñanzas en mi formación académica.

A mis alumnos: Julio León Incio, Carlos Quijano Jara, Carmen Aguilar Palmer, Roger Vallejo
Rodríguez, Lilibeth Cisneros Gonzales, Sophia Mendoza Amaya y a todos, que de manera desinteresada
contribuyeron en el desarrollo de la presente tesis.

A los profesores: Edgardo Polo Benites, María Cruz Briceño, Leticia Amésquita Cárdenas y a todos los
profesores por su apoyo en la ejecución de la tesis.

A todos mi sincera gratitud.

3
INDICE DE TABLAS

Tabla1.Frecuencias de fases del ciclo celular en muestras aleatorias de meristemos

radiculares de Vicia faba expuestos a dicromato de potasio (0.5mg/ml)
durante 8h y 40h de recuperación.
Tabla 2. Valores promedios y desviación estándar de células anafase-telofases con
puentes cromosómicos (ATp) a las 8h de exposición a dicromato de
potasio (0.5mg/ml) y micronúcleos a las 40h de recuperación en
meristemos de raíces de Vicia faba.
Tabla 3. Índices mitótico y profásico en meristemos radiculares de Vicia faba,
control negativo (C ), control dicromato de potasio (DP), control ácido
fólico (AF) y ácido fólico-dicromato de potasio (AF-FD) después de 8
horas de tratamiento a dicromato de potasio (0.5mg/ml) y después 40
horas de recuperación.
Tabla 4. Frecuencia de anafase-telofase con puentes cromosómicos a las 8 horas
de tratamiento con dicromato de potasio 0,5mg/ml y frecuencia de
micronúcleos 40 horas después de recuperación en meristemos
radiculares de Vicia faba expuestos previamente con ácido fólico 5
µg/ml.
Tabla 5. Frecuencias de eritrocitos policromáticos con micronúcleos en sangre
periférica de individuos de Mesocricetus auratus suplementados con
ácido fólico (1µg/ml) durante 7 días
Tabla 6. Frecuencias de eritrocitos policromáticos con micronúcleos en sangre
periférica de Mesocricetus auratus expuestos a ácido fólico (1µg/ml) y
dicromato de potasio (50mg/Kg).
Tabla 7. Frecuencias de eritrocitos policromáticos micronucleados en
Mesocricetus auratus, después de 96 horas de tratamiento con ácido
fólico (AF=1µg/ml) y dicromato de potasio (DP=50mg/Kg). Acido
fólico y dicromato de potasio (AF-DP).

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INDICE DE FIGURAS

Figura 1. Esquema del diseño experimental en Vicia faba. Control = 0.0 de ácido
fólico (AF) y 0.0 de dicromato de potasio (DP), AF = 5 µg/ml y DP= 0.5
mg/ml.

Figura 2. Esquema del diseño experimental, etapa 1, seguido en Mesocricetus

auratus. Acido fólico (AF=1mg/ml), Dicromato de potasio
(DP=50mg/Kg). Solución fisiológica de cloruro de sodio. Agua
bidestilada estéril.

Figura 3. Esquema del diseño experimental, etapa 2, seguido en Mesocricetus

auratus. Acido fólico (AF=1mg/ml), Dicromato de potasio
(DP=50mg/Kg). Solución fisiológica de cloruro de sodio. Agua
bidestilada estéril.

Figura 4. Telofases con puentes cromosómicos (Tp) en meristemos radiculares de

Vicia faba expuestos a dicromato de potasio (0.5mg/ml). a) un puente, b
y c) puentes múltiples, c) cariocinesis con variación en el tamaño
nuclear.

Figura 5. Alteraciones cromosómicas en meristemos radiculares de Vicia faba

expuestos a dicromato de potasio (0.5mg/ml). a) célula con núcleo
lobulado y portador de un micronúcleo, b) brote nuclear. c)metafase
alterada, cromosoma en anillo. d) telofase con un cromosoma rezagado.

Figura 6. Micronúcleos en meristemos radiculares de Vicia faba expuestos a

dicromato de potasio (0.5mg/ml). a) metafase con micronúcleo pequeño.
b) interfases con micronúcleos que difieren en la compactación.

Figura 7. Alteraciones en la segregación cromosómica en meristemos radiculares

de Vicia faba expuestos a dicromato de potasio 0.5mg/ml. a y b)
migración alterada y falta de condenzación cromosómica, c y d)
cromosoma segregado e inicio de citocinesis, e y f) citocinesis con
variación del tamaño de núcleos. Barra 10µm. A) Migración de un grupo
reducido de cromosomas, B y C) Citocinesis con diferencias en el
tamaño de los núcleos segregados. D) Células hijas, minicélula y célula
con mayor contenido nuclear.

Figura 8. Índices mitótico y profásico en meristemos radiculares de Vicia faba

Control negativo ( C), ácido fólico (F), dicromato de potasio (D) y ácido
fólico-dicromato de potasio (FD), después de 8h y después de la fase de
recuperación (40h).

5
Figura 9. Frecuencia de puentes cromosómicos en anafase y telofases después de
8h de exposición a dicromato de potasio y micronúcleos después de 40h
de recuperación a los tratamientos con ácido fólico y dicromato de
potasio de meristemos radiculares de Vicia faba. C= Control negativo,
F=control acido fólico (5µg/ml), D=control dicromato de potasio
(0.5mg/ml) y FD= tratamiento simultáneo de ácido fólico y dicromato de
potasio.

Figura 10. Eritrocitos policromáticos de sangre periférica de un individuo de

Mesocricetus auratus después de 48h de tratamiento con dicromato de
potasio (50mg/1Kg). Se indica un eritrocito policromático con un
micronúcleo.

Figura 11. Eritrocitos policromáticos de sangre periférica de un individuo de

Mesocricetus auratus después de 48h de tratamiento con dicromato de
potasio (50mg/Kg). Se indica un eritrocito policromático con dos
micronúcleos.

Figura 12. Placa metafásica con número poliploide de cromosomas en un

individuo de Mesocricetus aratus después de 48 horas de la aplicación
intraperitoneal de dicromato de potasio (50mg/Kg).

Figura 13. Placas metafásicas en médula ósea de un individuo Mesocricetus

auratus después de 48 horas de aplicación intraperitoneal de dicromato
de potasio (50mg/Kg).

Anexo, figura 1. Posible estructura del Cr(III) en unión con un nucleótido de

guanina. Esta figura está citado como Fig. 6 en Arakawa et al. 2006.
Carcinogenesis 27(3):639-645.

Anexo, figura 2. Modelo esquemático de la represión transcripcional del cromo.

Esta figura está citada como Fig. 9 en Schnekenburger et al. 2007. Mol
Cell Biol, 2007. 27(29):7089-101.

Anexo, figura 3. Metabolismo del folato. Esta figura esta citada en Fenech. 2001.
Mutation Research 475 (2001): 57–67.

Anexo, figura 4. Placa metafásica de un individuo macho de Mesocricetus

auratus. 2n=44.

Anexo, figura 5. Placa metafásica de un individuo hembra de Mesocricetus

auratus. 2n=44.

Anexo, figura 6. Eritrocitos policromáticos y maduros de Mesocricetus

auratus. Se señala un eritrocito policromático.

6
Anexo. Figura 7. Representación de probables mecanismos del origen de
micronúcleos (MN). A) Micronúcleo de origen aneugénico. Como
consecuencia de una alteración a nivel centromérico de un cromosoma,
este queda rezagado durante la migración anafásica y conduce a la
formación de un MN. B) Micronúcleo de origen clastogénico. A causa
de una rotura cromosómica, un fragmento cromosómico queda excluido
del núcleo, dando origen a un MN. La célula portador de MN continúa
las fases de G1, S, G2 e inician una siguiente división celular
manteniendo el MN en la célula, como se observa en metafase con MN.
El daño cromosómico se habría producido en interfase.

7
 RESUMEN

El cromo hexavalente (Cr(VI)) es un estado biológicamente activo del cromo y

está implicado con la producción de especies de oxigeno reactivo. Por las
propiedades de eliminación de radicales libres y posible actividad antioxidante
del acido fólico, el presente trabajo tuvo como objetivo analizar los efectos de
protección del acido fólico en meristemos radiculares de Vicia faba y eritrocitos
policromáticos de sangre periférica de Mesocricetus auratus expuestos a
dicromato de potasio. Para lo cual, raíces secundarias de V. faba fueron tratadas
con acido fólico (5µg/ml) y dicromato de potasio a 0.5mg/ml durante 8h seguido
de 40h de recuperación en agua potable declorinada. En esta especie fueron
evidentes alteraciones en la cariocinesis y citocinesis de las células en división y
las frecuencias de alteraciones cromosómicas después de 48 horas de
recuperación en el tratamiento simultáneo de ácido fólico y dicromato de potasio
no presentaron diferencias con el control negativo en Vicia faba. En la evaluación
con M. auratus, los individuos fueron suplementados con acido fólico durante
una semana seguido de la aplicación intraperitoneal de dicromato de potasio.
Después de dos días de tratamiento con dicromato de potasio, las frecuencias de
micronúcleos, fueron significativamente menores en los individuos que
recibieron acido fólico a diferencia de aquellos, tratados solo con dicromato de
potasio. Se demostró el efecto citotóxico y genotóxico del dicromato de potasio
y su interacción con el ácido fólico. El ácido fólico disminuye las frecuencias de
alteraciones cromosómicas en los individuos expuestos a dicromato de potasio.

Palabras clave: Vicia faba, Mesocricetus auratus, hamster, acido folico,

genotoxicidad, dicromato de potasio, meiosis, micronúcleo, alteraciones
cromosómicas.

8
 ABSTRACT

Chromium hexavalent (Cr(VI)) is a biologically active state of chromium. It is

involved in the production of reactive oxygen species. Free radical scavenging
properties and possible antioxidant activity of folic acid have been reported,
the present study examined possible protective effects of folic acid on root
apical meristems of Vicia faba and polychromatic erythrocytes of
Mesocricetus auratus exposed to potassium dichromate. Secondary roots were
treated with folic acid (5µg/ml) and potassium dichromate at 0.5mg/ml during
8h and recovery in dechlorinated tap water during 40h. The individuals of M.
auratus were folic acid supplements during a week followed by the
intraperitoneal injection of potassium dichromate (50mg/Kg body weight).
Alterations in the karyokinesis and cytokinesis were evident in mitosis of V.
Faba by the effect of potassium dichromate; after 48 hours of recovery in the
simultaneous treatment of folic acid and dicromato of potassium didn't present
differences with the negative control. In M. Auratus, the micronuclei
frequencies after two days of the potassium dichromate, one oberves
diminished in the individuals that received folic acid contrary to those, alone
treaties with potassium dichromate. It was demonstrated the effect citotoxic
and genotoxic of the dicromato of potassium and their interaction with the
folic acid. The folic acid diminishes the frequencies of cromosome alterations
in the exposed individuals to dicromato of potassium.

Keywords: Vicia faba, Mesocricetus auratus, hamster, folic acid, genotoxicity,

potassium dichromate, meiosis, micronuclei, chromosomal abnormalities.

9
 INTRODUCCIÓN

Evidencias epidemiológicas sobre la carcinogenicidad de los cromatos en

trabajadores1-3 y en otros organismos expuestos4-6, han contribuido para catalogar
al cromo en su estado hexavalente Cr(VI), dentro del grupo I de los carcinógenos
humanos por la Internacional Agency for Research on Cancer7.

La población humana está expuesta al Cr(VI) de manera masiva y permanente

debido al aumento progresivo de la contaminación ambiental a causa de emisiones
industriales8-10. Una fuente importante de Cr(VI) lo constituyen los dicromatos de
potasio y de sodio, que son utilizados en la industria de cromados, manufactura de
pigmentos, colorantes, curtido de pieles, preparación de antisépticos, limpieza de
material de vidrio de laboratorio e inclusive en vegetales11. En el Perú, no existen
monitoreos de las emisiones de Cr(VI), como se realiza en otros países; las
industrias, en muchos casos, trabajan de manera artesanal y no cuentan con
medidas de bioseguridad suficientes.

El Cr(VI) en las formas aniónicas CrO42- , HCrO4- o Cr2O7-, dependiendo del

pH del medio tiene la capacidad de ingresar a la célula por la vía general de los
canales proteicos transportadores de aniones12,13, en el espacio intracelular es
14,15
reducido a la forma pentavalente Cr(V), y luego a los estados Cr(IV) y Cr(III)
y forman complejos con ligandos de aminoácidos, proteínas, RNA y DNA16,17. La
interacción del Cr(V), principalmente del Cr(III) con el DNA conducen a la
formación de aductos que alteran los procesos de replicación y transcripción18,19,
producen roturas de cadenas simples del DNA (SSB)20 y cadenas dobles
(DSBs)21, entre otras alteraciones. Así mismo, la oxidación de reductantes da
lugar a la generación masiva de especies de radicales reactivos (ROS), con alta
capacidad de alterar la constitución química de proteínas, lípidos y DNA 22,23. Los
mecanismos moleculares que subyacen a los efectos citológicos, mutagénicos y
carcinógenos del complejo Cr(VI) no son totalmente conocidos, en particular a su

10
complicada química intracelular, múltiples blancos y vías metabólicas
involucradas. Se presentan probables mecanismos de la acción del Cr(VI) a nivel
intracelular (Figuras 1 y 2, anexo).
En relación a la actividad genotóxica de los cromatos particulados y solubles,
el daño genético es más persistente con el cromato de plomo (particulado)
comparado a los efectos del cromato de sodio (soluble), con este último, en
células de fibroblastos bronquiales, los efectos del Cr(VI) decaen a las 72h luego
de la primera dosis. Se reportaron espectros similares de daño cromosómico en
células de epitelio bronquial expuestas a compuestos particulados y solubles 24.
Estudios con dicromato de potasio, el más soluble de los cromatos, demuestran su
genotóxicidad en los sistemas genéticos tales como: mutaciones en bacteris,
alteraciones cromosómicas en líneas célulares, micronúcleos en ratones4,
alteraciones cromosómicas durante la división mitótica en Vicia faba25,
mutaciones en levadura 26, micronúcleos en Procambarus clarkii27, correlación de
bandas polimórficas (amplified fragment length polymorphism, AFLP) con la
concentración de dicromato de potasio en Pseudokirchneriella subcapitata28,
roturas cromosómicas en células de ratones 29,30.

El estrés oxidativo generado con la exposición al Cr (VI) puede ser

neutralizada con la suplementación de antioxidantes. Estudios en ratas reportan
que Alpha tocopherol disminuye el daño oxidativo renal causada por el dicromato
de potasio31; en ratones se ha demostrado que el ácido ascórbico reduce el Cr(VI)
a Cr(III)32, compuestos como: thiola (2-mercaptopropionylglycine) y semillas de
soya (Glycine max) han sido probadas como anticarcinógeno y antimutagénico en
animales y humanos33. Por la capacidad del acido fólico en la eliminación de
radicales libres que el ácido fólico tiene34,35, puede ser considerado un
antioxidante potencial, con efecto neutralizante del estrés oxidativo que genera el
dicromato de potasio.

La utilización del ácido fólico como suplemento vitamínico surge desde los
reportes de su efectividad en el tratamiento de anemia36 y posteriormente, por la

11
reducción significativa de casos con defectos al tubo neural asociada a la
administración de ácido fólico37-39. El mecanismo metabólico de folatos y otras
vitaminas del grupo B, como B12, están íntimamente involucradas en la
remetilación de la homocisteina (Hey), la conversión de Hey a metionina para la
40,41
síntesis de S-adenosilmetionina (SAM), importante agente metilante in vivo .
Estudios in vitro e in vivo en células humanas indican que la deficiencia de folatos
produce elevada concentración de homocisteina, cromosomas frágiles, roturas
cromosómicas, excesivo uracilo en el DNA, hipometilación del DNA y formación
de micronúcleos42,43 (Figura 3, anexo).

Cuando existe deficiencia de folato, la conversión de dUMP a dTMP está

reducida y durante la replicación se puede incorporar dUMP en el DNA. Estudios
en células de mamíferos demuestran la asociación de elevada concentración de
dUMP y roturas de DNA44. Por otro lado, la existencia de nucleótidos dUMP en
el DNA induce la actividad de enzimas de reparación por escisión, donde las
DNA glicosilasas rompen el enlace glucosídico produciendo los sitios apúricos o
apirimídicos seguidos por la actividad de las endonucleasas que cortan el enlace
fosfodiester para su resíntesis y reparación, de ocurrir de manera reiterada la
probabilidad de roturas es alta45,46 (Figura 4, anexo).

En años recientes el ácido fólico ha sido utilizado de manera conjunta con

dosis bajas de radiación en el tratamiento de tumores en ratas y reportaron un
efecto sinérgico con una efectiva eliminación de tumores47. En conejos, después
de la aplicación de ácido fólico y dicromato de potasio indican la disminución de
los efectos lesivos del Cr(VI) en la morfología espermática48. Investigaciones
adicionales son necesarios para conocer los efectos de la actividad del ácido fólico
a nivel de células en proliferación, células germinales y frente a la inducción de
daño genético expuestos a agentes genotóxicos como el dicromato de potasio.

Entre los marcadores de daño cromosómico, la frecuencia de micronúcleos en

una población en estado proliferativo es aceptado como una alternativa frente a la

12
laboriosa cuantificación de aberraciones de las estructuras cromosómicas 49.
Basado en el origen de los micronúcleos, ya sea por fragmentos acéntricos o
cromosomas rezagados durante la segregación cromosómica en anafase, la
determinación de frecuencias de micronúcleos es considerado un parámetro
potencial para la evaluación de químicos que inducen alteraciones cromosómicas,
estructurales o numéricas50-52. En los ensayos in vivo, en animales como el ratón,
la frecuencia de eritrocitos inmaduros (RET) con micronucleos son comúnmente
evaluados para determinar la genotoxicidad de compuestos químicos, debido a
que en los RET se muestra los daños recientes, a diferencia de los eritrocitos
maduros que conservan y acumulan los daños previos a la inducción 53.

El ácido fólico ingresa a las células a través de proteínas receptoras de folatos

(Folbps)54,55 y constituye uno de los micronutrientes esenciales para el
crecimiento en organismos animales y el hombre, por ello, los estudios del ácido
fólico en estos organismos es numerosa. No obstante, en especies vegetales como
Vicia faba, es posible evaluar los efectos del ácido fólico en células proliferativas
de meristemos radiculares, considerando la solubilidad y la permeabilidad celular
del acido fólico en raíces en crecimiento. Este último, ha sido demostrado y
validado como el “test de Vicia faba”, “test de Allium” u otra especie vegetal para
los ensayos de citotoxicidad y genotoxicidad de múltiples sustancias químicas.

Considerando tales antecedentes el presente trabajo ha tenido como finalidad

estudiar la variación de las frecuencias de alteraciones cromosómicas en Vicia
faba “haba” y Mesocricetus auratus “hámster” por aplicación conjunta de ácido
fólico y dicromato de potasio. Teniendo en cuenta el problema: / ¿Cuál es el
efecto del ácido fólico en la frecuencia de alteraciones cromosómicas inducidas
por dicromato de potasio en Vicia faba y Mesocricetus auratus?, y como
hipótesis: El ácido fólico como agente antioxidante disminuye el daño genético
inducido por dicromato de potasio, lo cual se evidencia por la disminución de la
frecuencia de alteraciones cromosómicas en Vicia faba y Mesocricetus auratus.

13
Para lo cual se consideró los objetivos siguientes:
 Determinar la frecuencia de alteraciones cromosómicas en meristemos
radiculares de Vicia faba expuestos a dicromato de potasio.
 Estimar la variación de las frecuencias de alteraciones cromosómicas en
meristemos radiculares de Vicia faba por tratamiento simultáneo de ácido
fólico y dicromato de potasio.
 Determinar las frecuencias de micronúcleos en eritrocitos policromáticos
de sangre periférica por efecto del dicromato de potasio en Mesocricetus
auratus.
 Comparar las frecuencias de micronúcleos en eritrocitos policromáticos de
sangre periférica de Mesocricetus auratus expuestos a dicromato de
potasio y tratamiento simultáneo con ácido fólico y dicromato de potasio.
 Explicar los posibles mecanismos del origen de las alteraciones
cromosómicas en Vicia faba y Mesocricetus auratus por efecto del
dicromato de potasio.

14
Justificación

Con la finalidad de aportar con nuevas evidencias sobre las propiedades del
ácido fólico, como un agente protector ante una exposición de un genotóxico, es
importante conocer en que medida disminuye el daño genético con la
administración conjunta del ácido fólico y el dicromato de potasio en las células;
para lo cual, se elige una especie vegetal como Vicia faba y una especie animal,
Mesocricetus auratus para los ensayos in vivo. Vicia faba, tiene reducido número
de cromosomas (2n=12), cromosomas con variación en tamaño y morfología, que
permiten su identificación y evaluación de los efectos que producen los
genotóxicos en la población celular meristemática de sus raíces en crecimiento,
validado internacionalmente como un sistema genético por constituir un sistema
que hace posible la evaluación de sustancias químicas por exposición directa de la
población celular proliferativa, similar a un sistema in vitro. Mesocricetus
auratus “hamster” se distingue por su cariotipo 2n=44 y cromosomas
relativamente grandes; en sangre periférica existe una población celular de
eritrocitos policromáticos que se diferencian morfológicamente de los eritrocitos
maduros, en la que es posible evaluar la frecuencia de micronúcleos, que son
consecuencia de alteraciones cromosómicas (clastogénico o aneugénico) que se
produce en las poblaciones celulares en estado proliferativo de médula ósea de los
individuos.

15
 MATERIAL Y MÉTODOS.

1. Material biológico:
1.1. Vicia faba “haba”:
Población: Meristemos radiculares de la variedad señorita
Muestra: Meristemos radiculares de 12 semillas de la variedad señorita.
Unidad de análisis: el meristemo apical de una raíz.
1.2. Mesocricetus auratus “hamster”:
Población: individuos de la cepa Sirio Dorado
Muestra: 16 individuos de sexo masculino, peso en el rango de 90 a 100g,
de 6 meses de edad. Los individuos fueron obtenidos de Instituto
Nacional de Salud, Centro Nacional de productos Biológicos,
Coordinación de Bioterio, Lima, Perú.
Unidad de análisis: un individuo
2. Material químico:
Dicromato de potasio, Sigma/Aldrich.
Acido fólico, Laboratorio Hersil S.A. comprimidos de 0.5 mg.
3. Método:
3.1.Tipo de estudio: experimental
3.1. Diseño experimental:
En Vicia faba: meristemos de raíces secundarias.
Los tratamientos fueron: a) Control negativo (C ), b)control ácido fólico
(AF), c)control dicromato de potasio (DP) y d) tratamiento de ácido fólico
y dicromato de potasio (AF-DP).
Semillas sanas y de tamaños similares se colocaron en sustratos de
algodón para su germinación hasta la emergencia de raíces secundarias.
Las semillas con raíces secundarias en crecimiento, de 1 a 2 cm, fueron
expuestas de manera individual a concentraciones de 5µg/ml de AF,
0.5mg/ml de DP, 5µg/ml de AF y 0.5mg/ml de DP y un control negativo
(0.0 AF y 0.0 DP) durante 8 horas, luego de la toma de muestra (2 a 3
raíces), las raíces restantes de cada semilla se enjuagaron en agua y se

16
dejaron que continúen su crecimiento sin dicromato de potasio (fase de
recuperación) (Figura 1). Después de 40 horas de recuperación se procedió
con la segunda toma de muestra (2 a 3 raíces). Las muestras apicales de
cada semilla fueron fijadas en Carnoy`s y coloreadas con Orceína acética
1% durante 30 minutos25.

Figura 1. Esquema del diseño experimental en Vicia faba. Control = 0.0 de

ácido fólico (AF) y 0.0 de dicromato de potasio (DP), AF = 5 µg/ml y DP=
0.5 mg/ml.

Variables:
Variables independientes:
Concentración de ácido fólico ( 0.0 y 5 µg/ml)
Concentración de dicromato de potasio ( 0.0 y 0.5 mg/ml)

17
Variable dependiente:
Frecuencia de alteraciones cromosómicas, evaluado a través de los
indicadores:
 Frecuencia de fases mitóticas
 Frecuencia de anafase-telofases con puentes cromosómicos (ATp)
 Frecuencia de micronúcleos (MN)
 Frecuencia de cromosomas rezagados

Toma de datos: Las células fueron observadas a 1000X de magnificación

y la cuantificación se realizó de dos maneras:1) Conteo al azar de 2000
células a las 8h de tratamiento y después de 40h de recuperación, en las
que se identificó células en interfase y fases mitóticas con y sin
alteraciones. Se estimaron los índices de mitosis (IM), profases (IP),
metafases (IM), anafases (IA) y telofases (IT); 2) Conteo de células en
anafase y telofase (AT) con y sin puentes cromosómicos,
aproximadamente en todo el extendido celular de cada raíz a las 8h de
tratamiento. Se obtuvieron las frecuencias de anafase-telofases con puentes
cromosómicos (ATp), de la siguiente manera:

%ATp= ATp/Total de células en anafase y telofase.

Se utilizaron como criterios para la identificación de micronúcleos,

estructura redondeada, diámetro significativamente inferior al núcleo
principal, con coloración similar y clara separación del núcleo principal
(Albertini et al., 2000) y, para el registro de células con puentes
cromosómicos se consideró células en anafase y telofase con conexiones
cromosómicas claramente visibles.

Procesamiento estadístico: se estimaron las frecuencias de fases: índice

mitótico, índices de fases celulares con y sin alteraciones. La

18
determinación de diferencias entre tratamientos se realizó con la prueba de
análisis de varianza y la comparación de promedios de Tukey (p<0.05).

En Mesocricetus auratus “hamster”:

Obtención de individuos adultos machos de 6 meses de edad y de 90 a
100g de peso. En cada repetición se utilizaron individuos de una misma
camada.
Tratamientos: control negativo (C), control acido fólico (AF), control
dicromato de potasio (DP), tratamiento conjunto: acido fólico y dicromato
de potasio (AF-DP)
Diseño experimental:
Se procedió en dos etapas:
Etapa 1. Los individuos machos de cada camada fueron separados en
jaulas de manera individual y administrados por vía intragástrica 1 ml de
suspensión de ácido fólico (1mg/ml) cada 48 horas, durante una semana.
Luego, se aplicó la primera dosis de dicromato de potasio vía
intraperitoneal (50 mg/Kg) la cantidad de 0.2ml. Después de dos días se
inyectó una segunda dosis de dicromato en la misma concentración y
cantidad que la primera y dos días después fueron sacrificados (Figura 2).
Etapa 2. Se procedió de manera similar que en la etapa 1, con la variante
en la aplicación de dicromato de potasio vía intraperitoneal en una sola, y
luego de 4 días se sacrificaron a los individuos (Figura 3).
Todos los individuos fueron mantenidos en iguales condiciones de manejo
y alimento.

Toma de muestra
Procedimiento:
Toma de muestra antes de la administración de ácido fólico y antes de la
inyección de dicromato de potasio en las etapas 1 y 2 del diseño
experimental.

19
En la etapa 1: Adicionalmente a las muestras previas se tomó muestras de
sangre periférica después de 2 días y luego de 4 días de tratamiento con
dicromato de potasio, muestras de sangre periférica y médula ósea.
En la etapa 2: Adicionalmente a las muestras previas, se tomó muestras de
sangre periférica y médula ósea a los 4 días de tratamiento con dicromato
de potasio.

Obtención de la muestra
Sangre periférica: Con una aguja estéril se realizó una punción en el
extremo de la cola del individuo y con un capilar heparinizado se obtuvo
dos a tres gotas de sangre y se realizó los extendidos celulares sobre
láminas portaobjetos. Se fijaron en metanol absoluto y se colorearon con
Giemsa 7% por 20 minutos. Luego del enjuague, las láminas secas
sellaron con una gota de Entellan y lámina cubreobjeto.
Médula ósea: los individuos fueron sacrificados por dislocación cervical
previamente anestesiados. Se extrajo la médula ósea y fueron colocados en
una solución de cloruro de potasio 0.075M, se realizaron suspensiones
celulares con rapidez y transferidos a un tubo de centrífuga. Se mantuvo
en reposo por 20 minutos a 37ºC. Se centrifugaron a 800 rpm 10 minutos,
y luego de eliminar el sobrenadante se agregó el fijador, solución de
metanol:ácido acético (3:1) la cantidad aproximada de 7 ml en cada tubo y
se dejó en reposo por 20 minutos a 5ºC. Se realizó la suspensión celular y
fue centrifugado nuevamente. Luego de eliminar el sobrenadante se agregó
1ml de fijador, se resuspendió y se dejó caer una o dos gotas sobre láminas
limpias y secas. Luego de 24 horas de secado fueron coloreados con
Giemsa 7% por 20 minutos56.

Variables:
Variables Independientes:
Dosis de ácido fólico (0.0 y 1mg/ml)
Dosis de dicromato de potasio (0.0 y 50mg/Kg)

20
 Variable dependiente:
Frecuencia de eritrocitos policromáticos con micronúcleos en sangre
periférica.
Instrumentos de recolección de datos
Un microscopio Olympus a 1000X de magnificación. Cámara
fotográfica y contador de células.
Toma de datos:
En eritrocitos policromáticos se cuantificaron 4000 células con o sin
micronúcleos y se estimaron las frecuencias en cada individuo.
Procesamiento estadístico: Las frecuencias determinadas fueron
comparadas mediante el análisis de varianza y pruebas de comparación
múltiple de Tukey.

21
Figura 2. Esquema del diseño experimental, etapa 1, seguido en Mesocricetus
auratus. Acido fólico (AF=1mg/ml), Dicromato de potasio (DP=50mg/Kg).
Solución fisiológica de cloruro de sodio. Agua bidestilada estéril.

Figura 3. Esquema del diseño experimental, etapa 2, seguido en Mesocricetus

auratus. Acido fólico (AF=1mg/ml), Dicromato de potasio (DP=50mg/Kg).
Solución fisiológica de cloruro de sodio. Agua bidestilada estéril.

22
 RESULTADOS

En Vicia faba:
Efecto del dicromato de potasio:
A nivel mitótico:
En los meristemos radiculares de Vicia faba expuestas a dicromato de
potasio a 0.5mg/ml durante 8h, el índice mitótico promedio fue de
1.93±0.06% comparado con 7.88±2.37% en el control, significativamente
disminuida p<0.05. Después de 40h de recuperación, contrariamente a los
resultados anteriores, el índice profásico y el índice mitótico estuvieron
incrementados en el tratamiento con dicromato de potasio, siendo sus valores
promedios: 8,27±1.32% y 13.11±1,81% y del control, 4.44±2.18% y
8.01±3.27%, respectivamente (p<0.05) (Tabla 1).

En relación al daño cromosómico, a las 8h de exposición directa al

dicromato de potasio se observó alteraciones durante la división mitótica, tales
como: telofases con puentes cromosómicos (ATp), variando de uno a más
puentes (Figura 4), anafase-telofases con cromosomas rezagados,
deformaciones nucleares, cromosoma en anillo, metafases con ubicación
desordenada al plano ecuatorial, micronúcleos, brote nuclear “buds nuclear,
descondenzación de la cromatina (Figura 5). Los micronúcleos se observaron
en las diferentes fases del ciclo celular, con variación de tamaños y
compactación (Figura 6). En la figura 7, se muestra la migración de un
reducido grupo de cromosomas a un polo; cromosoma segregado, conexión de
cromatina entre los dos grupos separados, inicio de citocinesis y variación de
tamaños de los núcleos segregados.

De la cuantificación, considerando solo anafases y telofases (AT) en

aproximadamente todo el extendido celular en muestras de cada meristemo
radicular, la frecuencia de ATp fue de 34.39 ± 20.64 % a las 8h de exposición
al dicromato de potasio, valores significativos con respecto al control

23
(Tabla 2). Sin embargo, cuando se evaluó ATp aleatoriamente, se registró
0.05±0.07% de 2095 células en promedio, valor no significativo comparado
con el control. Después de 40h de recuperación, se cuantificó micronúcleos
(MN), ATp y ATrz en muestras elegidas al azar de todo el extendido celular y
se encontró 1.98±0.88% de MN (p<0.05), las demás alteraciones no
presentaron diferencias significativas (p>0.05) (Tabla 2).

Se observó variación en las frecuencias de alteraciones cromosómicas

entre semillas por efecto del dicromato y una relación entre la frecuencia de
ATp a las 8h con la frecuencia de MN a las 40h de recuperación, a mayor
porcentaje de ATp a las 8h menor porcentaje de MN a las 40h de
recuperación.

Efecto del acido fólico y del tratamiento simultáneo con ácido fólico y
dicromato de potasio.
El índice mitótico en el tratamiento con ácido fólico fue de 10.43±1.64%,
mientras que en el control fue de 7.75±1.79% (p<0.05). Al comparar los
índices profásicos entre si, se observó similar diferencia. Después de 40h de
recuperación – sin ácido fólico y sin dicromato de potasio - no hubo
diferencias significativas en el índice mitótico entre todos los tratamientos,
aún cuando los valores promedios están aumentadas (Tabla 3, figura 8).

Con respecto a las frecuencias de anafase-telofase con puentes

cromosómicos (ATp), en el tratamiento con ácido fólico–dicromato de potasio
se registró disminución en promedio de 34.39±20.64% a 17.76±11.84%. La
frecuencia de MN después de 40 horas de recuperación, por efecto del ácido
fólico disminuyó notablemente; los valores no fueron diferentes con las
registradas en el control (p<0.05) (Tabla 4, figura 9).

En el tratamiento con acido fólico y dicromato de potasio

simultáneamente, se observó aumento en la frecuencia de micronúcleos y en

24
 algunos meristemos, particularmente en uno, se registró un incremento
significativo de células con segregación y compactación cromosómica
incompleta como se muestra en la figura 7.b, inclusive mayor que en el
tratamiento con dicromato de potasio.

En Mesocricetus auratus:

Mesocricetus auratus se distingue por tener 2n = 44 cromosomas el

cromosoma X metacéntrico de mayor tamaño que el resto de cromosomas
(Anexo, figuras 1 y 2). Los eritrocitos policromáticos en sangre periférica
fueron fácilmente diferenciables de los eritrocitos maduros (Anexo, figura 3).
En las figuras 10 y 11, se muestran eritrocitos policromáticos micronucleados.

Las frecuencias de micronúcleos en los eritrocitos policromáticos de

sangre periférica de los individuos suplementados con ácido fólico por una
semana, no mostraron diferencias con aquellos que no recibieron dicho
tratamiento (Tabla 5). Sin embargo en el tratamiento con dicromato de
potasio las frecuencias de micronúcleos se incrementaron hasta 12,41±0,41 ‰
a las 48 h después de la dosis intraperitoneal, y a las 96 h se observó
notablemente disminuida, aún cuando los individuos recibieron una segunda
dosis de dicromato de potasio. En los individuos suplementados previamente
con ácido fólico se observaron frecuencias de MN sin variación significativa
con respecto al control negativo a las 48h y 96h después del tratamiento con
dicromato de potasio en la primera y segunda dosis (Tabla 6).

En la tabla 7 se muestra los valores promedios de las frecuencias de

eritrocitos policromáticos micronucleados después de 96 horas de la inyección
intraperitoneal de dicromato de potasio única dosis. La frecuencia de MN se
observó aumentada en el tratamiento con dicromato de potasio y disminuida,
en el tratamiento ácido fólico + dicromato de potasio.

25
En médula ósea de los individuos con dicromato de potasio se observó la
presencia de metafases poliploides en los individuos con dicromato de potasio
(Figura 12), con aumento del número de metafases comparada con el resto de
individuos. En la figura 13, se muestra 3 placas metafásicas en un campo a
10X, de un individuo después de cuatro días de la dosis de dicromato de
potasio, via intraperitoneal y sin tratamiento con colchicina.

26
Figura 4. Telofases con puentes cromosómicos (Tp) en meristemos radiculares de
Vicia faba expuestos a dicromato de potasio (0.5mg/ml). a) un puente, b y c)
puentes múltiples, c) cariocinesis con variación en el tamaño nuclear. Barra 10µm.

27
Figura 5. Alteraciones cromosómicas en meristemos radiculares de Vicia
faba expuestos a dicromato de potasio (0.5mg/ml). a) célula con núcleo
lobulado y portador de un micronúcleo, b) brote nuclear. c)metafase
alterada, cromosoma en anillo. d) telofase con un cromosoma rezagado.
Barra 10µm.

28
Figura 6. Micronúcleos en meristemos radiculares de Vicia faba expuestos a
dicromato de potasio (0.5mg/ml). a) metafase con micronúcleo pequeño. b)
interfases con micronúcleos que difieren en la compactación. Barra 10µm.

29
Figura 7. Alteraciones en la segregación cromosómica en meristemos radiculares
de Vicia faba expuestos a dicromato de potasio 0.5mg/ml. a y b) migración
alterada y falta de condenzación cromosómica, c y d) cromosoma segregado e
inicio de citocinesis, e y f) citocinesis con variación del tamaño de núcleos. Barra
10µm. A) Migración de un grupo reducido de cromosomas, B y C) Citocinesis
con diferencias en el tamaño de los núcleos segregados. D) Células hijas,
minicélula y célula con mayor contenido nuclear. Barra 10µm.

30
 16
IM
14 IP
12
Frecuencia (%)

10

0
C F D FD C F D FD
8h 40h
Tratamientos

Figura 8. Índices mitótico y profásico en meristemos radiculares de Vicia

faba Control negativo ( C), ácido fólico (F), dicromato de potasio (D) y
ácido fólico-dicromato de potasio (FD), después de 8h y después de la fase
de recuperación (40h).

31
 60
55
50
45
40
Frecuencia (%)

35
30
25
20
15
10
5
0
C F D FD C F D FD
Puentes Cromosomicos Micronúcleos
(ATp) 8h (MN) 40h

Figura 9. Frecuencia de puentes cromosómicos (ATp) después de 8h de

exposición a dicromato de potasio y micronúcleos (MN) después de 40h de
recuperación a los tratamientos con ácido fólico y dicromato de potasio de
meristemos radiculares de Vicia faba. C= Control negativo, F=control acido fólico
(5µg/ml), D=control dicromato de potasio (0.5mg/ml) y FD= tratamiento
simultáneo de ácido fólico y dicromato de potasio.

32
Tabla 1. Frecuencias de fases del ciclo celular en muestras aleatorias de
meristemos radiculares de Vicia faba expuestos a dicromato de potasio 0.5mg/ml
durante 8h y 40h de recuperación.
__________________________________________________________________________________________
Horas Tratamiento Interfase Mitosis (índice de fases)
%
IM IP IMt IA IT
x ± DE x ± DE x ± DE x ± DE x ± DE x ± DE
__________________________________________________________________________________________

8 Control 92.12± 2.37 7.75 ± 1.79 4.76 ± 0.45 1.20 ± 0.94 0.68 ± 0.35 1.25 ± 0.45
Cr2K2O7 98.07*± 0.06 2,69*± 2,09 1.56**± 1.23 0.10 ± 0.00 0.09 ± 0.07 0.31± 0.10

40 Control 91.99 ± 3.67 8.01 ± 3.27 4.44 ± 2.18 1.19 ± 0.56 0.90±0.41 1.48 ± 0.85
Cr2K2O7 86.89 ± 1.81 13.11*±1.81 8.27* ±1.32 2.09 ± 0.84 0.91±0.36 1.85 ±0.20

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________
n= 2000 células por ápice de raíz.
* p<0.05
** p<0.01

Tabla 2. Valores promedios y desviación estándar de células anafase-telofases con

puentes cromosómicos (ATp) a las 8h de exposición a dicromato de potasio
0.5mg/ml y micronúcleos (MN) a las 40h de recuperación en meristemos de raíces
de Vicia faba.

___________________________________________________________________________________
Tratamiento 8h de exposición 40 h de recuperación

AT (Nº total) %ATp Nº células %MN

x ± DE x ± DE x ± DE x ± DE
____________________________________________________________________________________

Control 357.67± 89.51 0.09 ± 0.16 2073 ±49.96 0.00 ±0.00

Cr2K2O7 29.86 ±34.43 34.39**±20.64 2057 ±31.93 1.98*±0.88
____________________________________________________________________________________
*p<0.05
**p<0.01

33
Tabla 3. Índices mitótico y profásico en meristemos radiculares de Vicia
faba, Control negativo (C ), control dicromato de potasio (D), control ácido
fólico (F) y ácido fólico-dicromato de potasio (FD) a las 8 horas de
tratamiento y después 40 horas de recuperación.

_________________________________________________
Horas Tratamiento IM IP
x ± DE x ± DE
__________________________ _______________________

8 C 7,75 ± 1,79 4,76 ± 0,45

F 10,43*± 1,64 6,25± 0,94

D 2,78*± 1,67 2,17*±1,32

FD 3,39 ± 2,11 2,22*± 1,20

40 C 8,01 ± 3,27 4.44 ± 2,18

F 9,34 ± 2,28 5,51 ± 1,69

D 13,11* ± 1,81 8,27* ±1,32

FD 10,26 ± 2,60 5,88 ± 1,93

__________________________________________________________________________________
* p<0.05

34
Tabla 4. Frecuencia de anafase-telofase con puentes cromosómicos a las
8 horas de tratamiento con dicromato de potasio 0,5 mg/ml y frecuencia
de micronúcleos 40 horas de recuperación en meristemos radiculares de
Vicia faba expuestos previamente con ácido fólico 5 µg/ml.

Tratamiento ATp 8h MN % 40h

x ± DE x ± DE
Control 0,09 ± 0,16 0,00 ± 0,00
Acido fólico 0,40 ± 0,70 0,06 ± 0,08
Dicromato de potasio 34,39 *± 20,64 1,98* ± 0,88
Acido fólico + dicromato de potasio 17,76* ± 11,84 0,22 ± 0,39
* p >0,05

35
Figura 10. Eritrocitos policromáticos de sangre periférica de un individuo de
Mesocricetus auratus después de 48h de tratamiento con dicromato de potasio
(50mg/1Kg). Se indica un eritrocito policromático con un micronúcleo. 1000X.

36
Figura 11. Eritrocitos policromáticos de sangre periférica de un individuo de
Mesocricetus auratus después de 48h de tratamiento con dicromato de potasio
(50mg/Kg). Se indica un eritrocito policromático con dos micronúcleos. 1000X.

37
Figura 12. Placa metafásica con número poliploide de cromosomas en un
individuo Mesocricetus aratus después de 48h de la aplicación intraperitoneal de
dicromato de potasio (50mg/Kg). 1000X.

38
Figura 10. Placas metafásicas en médula ósea de un individuo
Mesocricetus auratus expuesto a dicromato de potasio (50mg/Kg, vía
intraperitoneal).

39
Tabla 5. Frecuencias de eritrocitos policromáticos con micronucleos en sangre
periférica de individuos de Mesocricetus auratus suplementados con ácido fólico.
___________________________________________________________
Tratamientos N° RET MN
______________________________
N° ‰ x ± SD
___________________________________________________________
Control 4066 18 4,43 3,62 ± 1,09
4200 21 5,00
4041 14 3,46
4440 13 2,93
4374 10 2,29

Acido fólico 4576 21 4,59 3,83 ± 1,34

4161 17 4,09
4141 8 1,93
4631 25 5,40
4139 13 3,14
___________________________________________________________
p>0.05
RET, eritrocitos policromáticos
MN, micronúcleos.

40
Tabla 6 . Frecuencia de eritrocitos policromáticos con micronúcleos en sangre periférica de
Mesocricetus auratus expuestos a ácido fólico (1μg/ml) y dicromato de potasio (50mg/Kg).

______________________________________________________________________
Tratamiento Antes de DP Después de 48h de DP Después de 96h de DP
MN ‰ MN ‰ MN ‰
X ± DE
______________________________________________________________________

CONTROL 4,89 5,25 ±1,06 3,24

DP 6,19 12,41 ± 0,41 6,31

AF + DP 7,00 6,38 ± 0,70 6,34

AF + DP +AF 5,28 5,07 ± 0,30 4,38

______________________________________________________________________

Tabla 7. Frecuencias de eritrocitos policromáticos micronucleados en

Mesocricetus auratus después de 96 horas de tratamiento con ácido fólico
(AF=1μg/ml) y dicromato de potasio (DP=50mg/Kg).

_____________________________________
Tratamientos MN después de 96 h de DP
‰ x ± DE
_____________________________________
Control 2,95 ± 0,73
DP 6,77 ± 0,25
AF + DP 4,67 ± 1,55
AF 4,81 ± 0,86
_____________________________________

41
42
 DISCUSIÓN

Efecto del dicromato de potasio

La reducción del índice mitótico en meristemos de raíces en Vicia faba
expuestas 8h a dicromato de potasio revela su efecto citotóxico y la presencia de
fases mitóticas, indica que la disminución de la actividad proliferativa por efecto
del Cr(VI) se habría producido principalmente, en el estado de interfase. Uno de
los mecanismos que explican la acción del Cr(VI) en la inhibición del ciclo
celular en la fase G1 es por activación de la proteína p2157,58 y de otros genes
implicados con la regulación del ciclo celular y/o apoptosis, como consecuencia
del incremento de la proteína p53 inducida por los radicales .OH generados de la
reacción de Fenton - H2O2 + Cr(V)- 30.

Respecto a los índices de fases del proceso mitótico después de 40h de

recuperación, el aumento significativo del índice profásico, sería indicador del
desbloqueo celular en interfase. Por la ausencia de dicromato de potasio en el
medio de crecimiento radicular después de 8h de tratamiento, el nivel del Cr(VI)
intracelular estaría disminuida produciendo la desactivación de genes como la
p21, activación de genes inhibidos, que produjeron el detenimiento del ciclo
celular en interfase. El incremento de profases, podría explicarse también por la
alteración de la expresión de genes que controlan el paso de G2 a mitosis. Los
reportes del efecto del Cr(VI) sostienen que el evento primario en la disrupción de
la expresión génica es la formación del complejo nuclear Cr(III)-DNA en las
regiones promotoras produciendo represión transcripcional59.

La relación inversamente proporcional entre la magnitud de ATp a las 8h con

la frecuencia de MN a las 40 h de recuperación, explicaría la mayor capacidad de
recuperación que tendrían las células con menos lesiones en el DNA, y que
escapan del proceso apoptósico en ventaja de aquellas, que por la presencia de

43
uno o más puentes cromosómicos probablemente tomarían la vía apoptósica o
tardarían más en continuar el proceso proliferativo.

Las diferencias registradas en respuesta al Cr(VI) en las poblaciones celulares

existentes en cada meristemo radicular entre semillas y dentro de cada semilla,
expuestas a una misma concentración de dicromato de potasio, serían indicadores
de que, no todo el DNA celular está igualmente expuesto, por tanto dependerá en
gran medida de su estado funcional y de los efectos aleatorios que produciría el
Cr(VI) en el DNA expuesto, existiendo mayor probabilidad de daño genético en
las secuencias de DNA con elevada actividad de replicación y transcripción.
Estudios en cultivos celulares de fibroblastos encontraron diferencias en el
fenotipo celular y en los patrones de expresión de genes dentro de la misma
población celular expuestas al Cr(VI) del Na2CrO4, aislándose células susceptibles
y resistentes al Cr(VI), éstas últimas, mostraron resistencia a la apoptosis,
potencial de crecimiento incrementado y expresión de genes alterados a diferencia
de las células susceptibles al Cr(VI) 60.

La variación en el tamaño y grado de compactación de los micronúcleos, se

debería al tipo de cromatina existente en ellos, en MN menos condensados
existiría eucromatina y hetecromatina y en los MN más pequeños y de mayor
compactación, principalmente heterocromatina. Observaciones ultraestructurales
en embriones de Triticum aestivum y Pennisetum glaucum revelaron una
correlación positiva entre el tamaño de MN y la proporción de eucromatina y
heterocromatina, MN grandes contienen mayor proporción de eucromatina61.
Probablemente, MN grandes son consecuencia de efectos aneugénicos, asociados
al tamaño del cromosoma rezagado (Anexo, figura, 4).

Las células en anafase-telofase con puentes múltiples se habrían originado por

alteraciones en la compactación cromosómica, los cromosomas descondensados
“pegajosos” se mantendrían unidos durante la segregación cromosómica,
pudiendo segmentarse con la formación del fragmoblasto. El daño sobre el

44
material genético sería tal que la probabilidad de recuperación de estas células
sería escasa. Los mecanismos que explican la alteración en la condensación
19,59
cromosómica por efecto del cromo no se conocen. reportan cambios
conformaciones a nivel de nucleosomas por efecto del Cr(III) que impiden el
inicio de la transcripción.

Por otro lado, la cariocinesis asimétrica mostrada por efecto del Cr(VI)
derivado del dicromato de potasio tanto en células somáticas como en células
meióticas, serían indicadores de alteraciones en el complejo de proteínas
implicados en los procesos de condensación cromosómica, lo cual ocurre, paralelo
a la formación de la banda pre-profásica, importante para la ubicación sincrónica
del conjunto de cinetocoros al huso acromático y segregación cromosómica
equitativa. De acuerdo a las configuraciones adoptadas en la segregación
cromosómica por efecto del Cr(VI) en los meristemos de raíz de vicia faba, se
propone una explicación de la presencia de minicélulas, como consecuencia de la
segregación incompleta y no equitativa del conjunto de cromosomas, falta de
condensación cromosómica, asincronía en el progreso acromático y compactación
cromosómica, generándose la citocinesis con una fisión obligada de los
cromosomas o con la segregación de uno o mas cromosomas, resultando dos
células hijas con núcleos notoriamente distintas, una minicélula y otra, con un
exceso de material genético. En la figura 4A. Inicio de la migración de un grupo
reducido de cromosomas, 4B y 4C. Citocinesis con variación del contenido
nuclear, y en 4D. Minicélula. Un mecanismo alternativo, al origen de un
microcito.

Además fueron evidentes alteraciones en la ubicación de cromosomas en el

plano ecuatorial en metafase, micronúcleos en diferentes estadíos del ciclo celular,
roturas, cromosomas anulares, cromosomas rezagados durante la migración
cromosómica, “nuclear buds”. Alteraciones similares fueron registradas en raíces
apicales de Vicia faba utilizando CrO3 y dicromato de potasio25.

45
 De todas las alteraciones registradas durante la mitosis por efecto del
dicromato de potasio en Vicia faba, a las 8 horas de tratamiento, las células AT
con puentes cromosómicos del total de telofases fueron significativamente altas
comparada a los ATp evaluadas al azar y a las 40 horas de recuperación después
de la exposición al dicromato de potasio, la alteración mas frecuente fue la
presencia de MN. Consideramos estos dos parámetros altamente sensibles para
ensayos de genotoxicidad. Este método de evaluación tiene ventajas de ser
factible de que la cuantificación sea realizada por más de un observador, mayor
objetividad, disminución del error de muestreo, facilidad en la toma de datos y
resultados comparables en diferentes laboratorios. No habiéndose encontrado
publicaciones similares al respecto.

En Mesocricetus auratus (2n=44), el incremento de micronúcleos en

eritrocitos policromáticos de sangre periférica como consecuencia del dicromato
de potasio revelaría su efecto clastogénico y/o aneugénico, que habría ocurrido a
nivel proliferativo en las células precursoras de los eritrocitos en médula ósea.
Las frecuencias de MN a los 2 días se diferencian significativamente del control y
a los 4 días después de la aplicación de dicromato de potasio, no difieren entre los
tratamientos e inclusive en aquellos individuos que recibieron una segunda dosis,
vía intraperitoneal. Esta tendencia de disminución de las frecuencias de MN
fueron registrados en eritrocitos de sangre periférica de Oreochromis niloticus
expuestos de manera permanente a una solución de dicromato de potasio62. Los
mecanismos que expliquen dichos cambios no se reportan. Probablemente se
activan genes de reparación y adaptación al stress oxidativo generado por el
dicromato de potasio implicados en la mantención de la dinámica proliferativa,
diferenciación de las células madres a eritroblastos, estos, luego de la enucleación
a eritrocitos poli cromáticos, y traslado a sangre periférica hasta su maduración a
eritrocitos. Este ultimo proceso, implicaría un tiempo de 1 a 2 dias63.

En ratones, se reportó la frecuencia de micronúcleos en eritrocitos

policromáticos de médula ósea en 9.34 ‰ después de 24 horas, incremento

46
significativo por efecto de la administración intraperitoneal de dicromato de
potasio en madres gestantes y en sangre periférica de fetos provenientes de
madres gestantes con tratamiento intraperitonial de dicromato de potasio,
registraron 12,60 ‰ de MN en eritrocitos policromáticos; en ratones
suplementados vía oral, por periodos prolongados no mostraron diferencias
64
significativas con el control en la frecuencia de micronúcleos . Sin embargo,
con el test del cometa demostraron la presencia de fracturas cromosómicas por
efecto del dicromato de potasio administrados por via oral en ratones65, esto
indicaría mayor sensibilidad del test del cometa en la detección de genotoxicidad.

La frecuencia basal de micronúcleos en eritrocitos policromáticos de sangre

periférica de Mesocricetus auratus (3,62‰±1,09), fue un promedio superior al
basal, registrado en eritrocitos policromáticos en ratón (1.29‰), y de similar
tendencia al incremento de micronúcleos por efecto de dicromato de potasio.

La presencia de células poliploides después de 4 días de la aplicación del

dicromato de potasio, podría deberse a la asincronía en la segregación
cromosómica en anafase, como la observada con frecuencia en meristemos de
Vicia faba. En meristemos radiculares de esta especie se observaron varios casos
de citocinesis seguido de una cariocinesis no equitativa, es decir: reducido
numero de cromosomas e inclusive un cromosoma en un polo y en el otro, mayor
numero de cromosomas.

Efecto del acido fólico

El impacto de micronutrientes como el acido fólico y vitamina B12 en la

estabilidad del genoma han sido estudiados. Encuentran significativa correlación
entre la deficiencia de folatos y alta frecuencia de micronúcleos y brotes nucleares
66,67
“nuclear buds” en linfocitos in Vitro . Los estudios del DNA en
micronucleos en linfocitos cultivados con bajo contenido de acido fólico indicaron

47
la presencia de micronúcleos con fragmentos cromosómicos terminales acéntricos
y micronúcleos con cromosomas completos, como consecuencia de roturas
cromosómicas explicadas por la incorporación de uracilo en la estructura del
DNA68,69. De estas evidencias concluyeron que los folatos tienen efecto protector
del DNA tanto en las alteraciones de estructura como en el número
cromosómico69.

Los resultados del presente trabajo en meristemos radiculares de Vicia faba,

registraron un incremento de células con cariocinesis no equitativa, efecto
sinérgico en el daño cromosómico en el tratamiento simultáneo con dicromático
de potasio a las 8 horas de exposición. Sin embargo a las 40 horas de
recuperación reveló una disminución significativa de micronúcleos y alteraciones
cromosómicas comparada con los efectos del dicromato de potasio sin acido
fólico. Así mismo, se demostró el incremento del índice mitótico de la población
meristemática de raíces en Vicia faba expuestas solo a acido fólico durante dos
días. De ello, se puede postular que el acido fólico estaría implicado en la
activación de los procesos de transcripción relacionados a la replicación y división
celular, lo que aumentaría la vulnerabilidad del tejido meristemático frente a
genotóxicos como el dicromato de potasio, y la probabilidad de recuperación de
estas células estarían disminuidas y por tanto serían eliminadas por efecto del
proceso apoptósico.

Los valores promedios de la frecuencia de micronúcleos en eritrocitos

policromáticos de M. auratus en los individuos tratados con dicromato de potasio
en ausencia de acido fólico fueron mayores comparados con aquellos, que
recibieron dosis de 1µg de ácido fólico por cada 100 g de peso durante una
semana. La suplementacion con acido fólico no produjo aumento de las
frecuencias de micronúcleos en eritrocitos policromáticos de M. auratus.

El efecto sinergizante del folato a dosis bajas de radiación ionizante fue reportada
en ratones, haciéndose efectiva la remoción de tumores con la aplicación de

48
radiación después de 2 a 3 días de tratamiento con folato, hecho que no fue
posible por la terapia convencional -solo con radiación- para inducir apoptosis o
necrosis de células neoplásicas y promover la reducción del tamaño del tumor 47.
Otros trabajos con aplicación conjunta de acido fólico y dicromato de potasio
reportaron disminución de las frecuencias de alteraciones en la morfología de
espermatozoides en conejos debido a la actividad antioxidante del acido fólico 48 .
Elevada frecuencia de eritrocitos micronucleados han sido registrados en
pacientes con diabetes mellitus y con la suplementación de acido fólico reportan
su disminución a diferencia de lo que ocurren en ratas70, la reducción de
eritrocitos micronucleados por efecto del acido fólico reportaron en conejos con
diabetes inducido previamente71.

Los folatos además de reducir las cantidades de homocisteina en el plasma 72,

estarían implicados en el control del ciclo celular. En cultivo de líneas celulares
de epitelio de colon con bajo contenido de folato, se demuestra la inhibición del
progreso del ciclo celular a través de los puntos de control y apoptosis a causa de
la activación de proteínas de reparación del DNA como la ATM (ataxia
telangiectasia mutated)73,74. Esta proteína a su vez induce el aumento de la
proteína p53, vía Chk2, el cual estimula la transcripción de p21 y bloquea el ciclo
75
por inhibición de CDK/ciclina E . En ratas, reportaron roturas del DNA en el
gen p53 en individuos carentes de folatos y la falta de regulación de la
urokinasa76, enzima importante en la remodelación de proteasas (ECM),
migración celular, proliferación celular y su asociación con el cáncer77. Si la
concentración de urokinasa está elevada en tumores primarios es un indicador de
metástasis y mal pronóstico en pacientes con cáncer de mama78,79. No es claro
como el folato afecta los niveles de transcripción de la urokinasa.

De todos los beneficios que la suplementación de acido fólico puede producir

en humanos, los resultados en consenso80 se cita: el efecto del acido fólico en el
tratamiento prenatal de enfermedades del tubo neural (NTD), en la prevención de
anemia megaloblastica causado por deficiencia de folato, y el enmascaramiento de

49
los síntomas hematológicos de la deficiencia de la vitamina B12 por acido fólico.
En relación, al posible rol del folato en la carcinogénesis, por un lado, se
mencionan el efecto protector en pacientes con riesgo al cáncer colorectal 81,82, y
por otro, el acido fólico aumenta la probabilidad de progresión al cáncer en
pacientes con lesiones preneoplásicas83.

50
 PROPUESTA

Numerosas investigaciones han demostrado que la deficiencia de folatos

produce roturas cromosómicas por la incorporación de uracilo en lugar de timina.
La fortificación de alimentos con ácido fólico a menudo 400µg/día ha disminuido
la incidencia de enfermedades al tubo neural, en la curación de algunas formas de
anemia megaloblástica. Debido a su participación en la síntesis de DNA, así como
en regulación epigenética de la expresión génica y en la regulación de la
proliferación celular se asocia con la prevención de cáncer. No obstante la
suplementación en pacientes con lesiones precancerosas en dosis elevada puede
contribuir a un progreso mas acelerado al cáncer. De allí la importancia de
mayores estudios en la dosificación de acido fólico.

Fue evidente el incremento del índice mitótico en la población meristemática

de raíces de Vicia faba por efecto del ácido fólico y la magnificación del daño
cromosómico en el tratamiento de manera conjunta con dicromato de potasio por
8 horas y una disminución significativa de alteraciones cromosómicas después de
40 horas de continuo crecimiento radicular sin dicromato de potasio, lo que no
sucedió con el tratamiento con sólo dicromato de potasio, las frecuencias de daño
genético fue significativa tanto a las 8h de tratamiento como después de 40h de la
fase de recuperación. Estos resultados apoyan a recientes investigaciones, sobre
la utilización conjunta de ácido fólico y radiación o quimioterapia en el
tratamiento del cáncer.

Siendo importante mayores investigaciones acerca de los mecanismos que

tiene el ácido fólico y su interacción con otros fármacos, radiaciones ionizantes,
compuestos utilizados en la quimioterapia del cáncer y químicos contaminantes
del ambiente.

51
 CONCLUSIONES

 La frecuencia de anafase-telofases con puentes cromosómicos después de

8 horas de tratamiento con dicromato de potasio en meristemos radiculares
de Vicia faba fue de 34.39%.
 La frecuencia de micronúcleos después de 40 horas de recuperación al
tratamiento con dicromato de potasio en meristemos radiculares de Vicia
faba fue de 1.98%.
 La frecuencia de micronúcleos en eritrocitos policromaticos en
Mesocricetus auratus fue de 6.77 ‰ después de la aplicación de dicromato
de potasio, significativamente mayor que la frecuencia registrada en el
control (2,95 ‰) a las 48 horas.
 La actividad proliferativa fue incrementada en meristemos radiculares de
Vicia faba por efecto del ácido fólico.
 Después de 7 días de tratamiento con ácido fólico no generó incrementos
en las frecuencias de micronúcleos en eritrocitos policromáticos de
Mesocricetus auratus
 La disminución del daño cromosómico por efecto del acido fólico fue
demostrada en meristemos radiculares de Vicia faba y en eritrocitos
policromáticos de sangre periférica de Mesocricetus auratus.
 Se demostró el efecto genotóxico del dicromato de potasio en Vicia faba y
Mesocricetus auratus.
 El ácido fólico como suplemento alimenticio disminuye el riesgo de
alteraciones cromosómicas.

52
 BIBLIOGRAFÍA

(1) Bidstrup P L. (1951). Carcinoma Of The Lung In Chromate Workers. Brit

J Industr Med. 8(4):302–5.
(2) Doll R . (1959). Occupational Lung Cancer: A Review Brit J Industr
Med.; 16(3): 181–90.
(3) Langard S, Vigander T. (1983). Occurrence Of Lung Cancer In Workers
Producing. Chromium Pigments. Br J Ind Med. 40(1): 71–4.
(4) Léonard A, Lauwerys RR. (1980). Carcinogenicity And Mutagenicity Of
Chromium. Mutat Res. 76(3):227-39.
(5) Levy L S, Martin P A, Bidstrup P L. (1986). Investigation Of The
Potential Carcinogenicity Of A Range Of Chromium Containing
Materials On Rat Lung. Br J Ind Med. 43:243-56.
(6) De Flora S, Bagnasco M, Serra D, Zanacchi P. (1990). Genotoxicity of
chromium compounds. A review. Mutat Res. 238(2):99-172.
(7) International Agency for Research on Cancer. IARC (1990). Monographs
on the Evaluation of the Carcinogenic Risk of Chemicals to Humans.
Chromium, nickel and welding. Agency for Research on Cancer, Lyon,
France.
(8) Barceloux DG. Chromium. (1999). J Toxicol Clin Toxicol; 37:173–194
(9) Shtiza A, Swennen R, Tashko A. (2005). Chromium and nickel
distribution in soils, active river, overbank sediments and dust around
the Burrel chromium smelter (Albania). Journal of Geochemical
Exploration; 87: 92–108.
(10) Krystek P, Ritsema R. (2007). Monitoring of chromium species and 11
selected metals in emission and immission of airborne environment. Int J
Mass Spectrom; 265: 23–29.
(11) Shanker AK, Cervantes C, Loza-Tavera H, Avudainayagam S. (2005).
Chromium toxicity in plants. Environ Int; 31:739– 753.
(12) Fornace AJ Jr, Seres DS, Lechner JF, Harris CC. (1981). DNA-protein
cross-linking by chromium salts. Chem Biol Interact. 36(3):345-54.

53
(13) Gómez V, Callao MP. (2006). Chromium determination and speciation
since 2000. TrAC. 25 (10):1006-15.
(14) Arslan P, Beltrame M, Tomasi A. (1987) Intracellular chromium
reduction. Biochim Biophys Acta 931(1):10-5.
(15) Borthiry GR , Antholine WE, Kalyanaraman B, Myers JM, Myers CR.
(2007). Reduction of hexavalent chromium by human cytochrome b5:
Generation of hydroxyl radical and superoxide. Free Radic Biol Med.
42:738–55
(16) Petrilli FL, De Flora S. (1988). Metabolic reduction of chromium as a
threshold mechanism limiting its in vivo activity. Sci. Total Environ
71(3):357-64.
(17) O’Brien TJ, Ceryak S, Patierno SR. (2003). Complexities of chromium
carcinogenesis: role of cellular response, repair and recovery
mechanisms. Mutat Res. 533(1-2):3-36.
(18) Singh J, McLean JA, Pritchard DE, Montaser A, Patierno SR. (1998).
Sensitive Quantitation of Chromium–DNA Adducts by Inductively
Coupled Plasma Mass Spectrometry with a Direct Injection High-
Efficiency Nebulizer Toxicol Sci. 46(2):260-5
(19) Wei YD, Tepperman K, Huang MY, Sartor MA, Puga A. (2004).
Chromium inhibits transcription from polycyclic aromatic hydrocarbon-
inducible promoters by blocking the release of histone deacetylase and
preventing the binding of p300 to chromatin. J Biol Chem. 279(6):4110-
9
(20) Ueno S, Kashimoto T, Susa N, Furukawa Y, Ishii M, Yokoi K, et al.
(2001). Detection of Dichromate (VI)-Induced DNA Strand Breaks and
Formation of Paramagnetic Chromium in Multiple Mouse Organs.
Toxicol Appl Pharmacol. 170(1):56-62.
(21) Xie H, Wise SS, Holmes AL, Xu B, Wakeman TP, Pelsue SC, Singh NP,
Wise JP (2005). Carcinogenic lead chromate induces DNA double-
strand breaks in human lung cells. Mutat Res. 586(2):60-72.

54
(22) Bagchi D, Hassoun EA, Bagchi M, Muldoon DF, Stohs SJ. (1995).
Oxidative stress induced by chronic administration of sodium
dichromate [Cr(VI)] to rats. Comp Biochem Physiol C Pharmacol
Toxicol Endocrinol. 110(3):281-7.
(23) Levina A, Lay PA. (2005). Mechanistic studies of relevance to the
biological activities of chromium. Coordination Chemistry Reviews.
249:281-98.
(24) Wise SS, Holmes AL, Wise JP Sr. (2006). Particulate and soluble
hexavalent chromium are cytotoxic and genotoxic to human lung
epithelial cells. Mutat Res. 610(1-2):2–7
(25) Qian XW. (2004). Study on teratogenic effect of potassium dichromate
on Vicia faba root tip cells. Yi Chuan. 26(3):337-42
(26) Kharab P, Singh I. (1985). Genotoxic effects of potassium dichromate,
sodium arsenite, cobalt chloride and lead nitrate in diploid yeast Mutat
Res. 155:117-20.
(27) Sienra E., Armienta M.A., Gonsebatt M.E. (2003). Potassium dichromate
increases the micronucleus frequency in the crayfish Procambarus
clarkia. Environ Pollut. 126:367–70.
(28) Labra M , Bernasconi M , Grassi F , De Mattia F , Sgorbati S , Airoldi R,
el al. (2007). Toxic and genotoxic effects of potassium dichromate in
Pseudokirchneriella subcapitata detected by microscopy and AFLP
marker analysis. Aquat Bot. 86(3):229-35.
(29) Devi KD, Rozati R, Saleha Banu B, Jamil K, Grover P. (2001). In vivo
genotoxic effect of potassium dichromate in mice leukocytes using
comet assay. Food Chem Toxicol. 39(8):859-865.
(30) Wang S, Leonard SS, Ye J, Ding M, Shi X. (2000). The role of hydroxyl
radical as a messenger in Cr(VI)-induced p53 activation. Am J Physiol
Cell Physiol. 279(3):C868-75.
(31) Arreola-Mendoza,L, Reyesb,J.L., Melendez,E., Martín,D. et al. (2006).
Alpha-tocopherol protects against the renal damage caused by potassium
dichromate Toxicology. 218: 237–246.

55
(32) Stearns DM, Kennedy LJ, Courtney KD, Giangrande PH, Phieffer LS,
Wetterhahn KE. (1995). Reduction of chromium(VI) by ascorbate leads
to chromium-DNA binding and DNA strand breaks in vitro,
Biochemistry. 34:910–919.
(33) Fahmy, MA, Shomanb HM, Hassan EES. (2002). The protective role of
thiola and soybean seeds against the genotoxicity induced by potassium
dichromate in mice. Mutation Research., 517:1–12.
(34) Joshi,R., S.Adhikari, B.S.Patro, S.Chattopadhyay, T. Mukherjee. (2001).
Free Radical Scavenging Behavior Of Folic Acid: Evidence For Possible
Antioxidant Activity. Free Radical Biology & Medicine, , 30(12): 1390–
1399.
(35) Gliszczyήska-Świgło, A. Folates as antioxidants Food Chemistry. (2007),
101: 1497–1500.
(36) Lucock, M. Folic Acid: Nutritional Biochemistry, Molecular Biology,
and Role in Disease processes. (2000). Molecular Genetics and
Metabolism. 71:121-138.
(37) Czeizel A.E. multivitamin supplementation. (1998). European Journal of
Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology, 78(2):151-161.
(38) McFarland, Johnson MA, Moore CB, Pierce J.M, Robinson C.D., Smith
K.T. et al. (1999). Effects of Folic Acid Public Education on Awareness,
Knowledge and Behavior Change in Women of Childbearing Age in
Preventing Neural Tube Defects. Journal of the American Dietetic
Association, 99(9):A56.
(39) Ray JG, Meier Ch, Vermeulen MJ, Boss Sh, Wyatt PR, Cole DEC
(2002). Association of neural tube defects and folic acid food
fortification in Canada The Lancet, 360(9350): 2047-2048.
(40) Finglas,P.M.; Wright,A.J.A. (2002). Folate bioavailability and health.
Phytochemistry Reviews 1:189-198.
(41) Tokgozoglu,L. (2004). Homocysteine and folate: from genes to greens.
International Congress Series.1262:173– 175.

56
(42) Fenech, M. (2002). Micronutrients and genomic stability: a new
paradigm for recommended dietary allowances (RDAs). Food and
Chemical Toxicology. 40:1113-1117.
(43) Mangasa, A., R. Coven˜asb, K. Geffarda, M. Geffardc, P. Marcosd, R.
Insaustid, M.P. Dabadie. (2004). Folic acid in the monkey brain: an
immunocytochemical study Neuroscience. Letters. 362:258–261.
(44) Ingraham HA, Dickey L, Goulian M. (1986). DNA fragmentation and
citotoxicity from increased cellular eoxyuridylate. Biochemistry;
25:3225-30.
(45) Sousa M.M.L., Krokan HE, Slupphaug G. (2007). DNA-uracil and
human pathology Molecular Aspects of Medicine, 28(3-4):, June-
August, Pages 276-306.
(46) Berger, S.H,. Pittman DL, Michael D. Wyatt Uracil in DNA. (2008).
Consequences for carcinogenesis and chemotherapy Biochemical
Pharmacology, 76(6):697-706.
(47) Sega E.I., Lu Y, Ringor M, Leamon ChP., Philip S. (2008). Low Low-
Dose Radiation Potentiates the Therapeutic Efficacy of Folate Receptor–
Targeted Hapten Therapy. International Journal of Radiation Oncology
Biology Physics, 71(2):559-566.
(48) Yousef M.I., Fatma M. El-Demerdash , Kamil I. Kamil , Fathia A.M.
laswad. (2006). Ameliorating effect of folic acid on chromium(VI)-
induced changes in reproductive performance and seminal plasma
biochemistry in male rabbits. Reproductive Toxicology 21:322–328.
(49) Heddle J.A., Cimino M.C., Hayashi M., Romagna F., Shelby M.D.,
Tucker J.D., et al. (1991). Micronuclei as an index of cytogenetic
damage: past, present, and future, Environ. Mol. Mutagen. 18:277–291.
(50) Hayashi M., Tice R.R., MacGregor J.T., Anderson D., Blakey D.H.,
Kirsh-Volders M., Et al. (1994). In vivo rodent erythrocyte micronucleus
assay, Mutat. Res. 312 293–304
(51) Witt K.L., Knapton A., Wehr C.M., Hook G.J., Mirsalis J., Shelby M.D.,
MacGregor J.T. (2000). Micronucleated erythrocyte frequencyin

57
 peripheral blood of B6C3F1 mice from short-term, prechronic, and
chronic studies of the NTP carcinogenesis bioassay program, Environ.
Mol. Mutagen. 36:163–194.
(52) Albertini RJ, Anderson D, Douglas GR, Hagmar L, Hemminki K, Merlo
F, et al. (2000). IPCS guidelines for the monitoring of genotoxic effects
of carcinogens in humans. Mutat Res. 463:111–72.
(53) Witt KL, Livanos E, Kissling GE, Torous DK, Caspary W, Tice RR.,
Recio L. (2008). Comparison of flow cytometry- and microscopy-based
methods for measuring micronucleated reticulocyte frequencies in
rodents treated with nongenotoxic and genotoxic chemicals. Mutation
Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, 649(1-
2):101-113.
(54) Antony, A.C. (1996). Folate receptors. Annu. Rev. Nutr. 16, 501–521.
(55) Spiegelstein O, Lu X, Le XCh, Troen A, Selhubc J, Melnyk S, James S.
J, Finnell RH. (2005). Effects of dietary folate intake and folate binding
protein-2 (Folbp2) on urinary speciation of sodium arsenate in mice.
Environmental Toxicology and Pharmacology 19:1–7.
(56) Verma,RS, Babu A. (1989). Human Chromosomes. Principles and
Techniques. mcGrawHill, Inc.
(57) Mattia M, Gottifredi V, McKinney K, Prives C. (2007). p53-Dependent
p21 mRNA Elongation Is Impaired when DNA Replication Is Stalled.
Mol Cell Biol. 27(4):1309–20.
(58) Hill R, Leidal AM, Madureira PA, Gillis LD, Cochrane HK, Waisman
DM, et al. (2008). Hypersensitivity to chromium-induced DNA damage
correlates with constitutive deregulation of upstream p53 kinases in p21-
/- HCT116 colon cancer cells. DNA Repair. 7(2):239-52.
(59) Schnekenburger M, Talaska G, Puga A. (2007). Chromium cross-links
histone deacetylase 1-DNA methyltransferase 1 complexes to chromatin,
inhibiting histone-remodeling marks critical for transcriptional
activation. Mol Cell Biol. 27(20):7089-101

58
(60) Pritchard DE, Ceryak S, Ramsey KE, O'Brien TJ, Ha L, Fornsaglio JL,
Stephan DA, Patierno SR. (2005). Resistance to apoptosis, increased
growth potential, and altered gene expression in cells that survived
genotoxic hexavalent chromium [Cr(VI)] exposure. Mol Cell Biochem.
279(1-2):169-81.
(61) Gernand D, Rutten T, Varshney A, Rubtsova M, Prodanovic S, Brü C, et
al. (2005). Uniparental Chromosome Elimination at Mitosis and
Interphase in Wheat and Pearl Millet Crosses Involves Micronucleus
Formation, Progressive Heterochromatinization, and DNA
Fragmentation. The Plant Cell. 17:2431–8.
(62) León Incio Julio Jesús. (2008). Evaluación de micronúcleos,
anormalidades morfonucleares y cuantificación de regiones AgNOR en
eritrocitos de Oreochromis niloticus de sangre periférica, expuestos
durante 90 días a dicromato de potasio. (Tesis para optar el titulo de
Biólogo), Trujillo: Diversidad Nacional de Trujillo.
(63) Klinken S. Peter Red blood cells. The International Journal of
Biochemistry & Cell Biology, Volume 34, Issue 12, December 2002,
Pages 1513-1518
(64) De Flora S, Iltcheva M, Balansky RM. (2006). Oral chromium(VI) does
not affect the frequency of micronuclei in hematopoietic cells of adult
mice and of transplacentally exposed fetuses. Mutation
Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, 610(1-
2):38-47.
(65) Wang XF, Xing ML, Shen Y, Zhu X, Xu LH. (2006). Oral administration
of Cr(VI) induced oxidative stress, DNA damage and apoptotic cell
death in mice. Toxicology. 228(1):16-23.
(66) Fenech M, Crott JW. (2002). Micronuclei, nucleoplasmic bridges and
nuclear buds induced in folic acid deficient human lymphocytes—
evidence for breakage–fusion-bridge cycles in the cytokinesis-block
micronucleus assay. Mutation Research/Fundamental and Molecular
Mechanisms of Mutagenesis, Volume 504(1-2):131-136.

59
(67) Beetstra S, Thomas P., Salisbury C., Turner J., Fenech M. (2005).
Periconceptional folic acid containingFolic acid deficiency increases
chromosomal instability, chromosome 21 aneuploidy and sensitivity to
radiation-induced micronuclei. Mutation Research/Fundamental and
Molecular Mechanisms of Mutagenesis, 578(1-2):317-326.
(68) Wang X, Thomas P, Xue J, Fenech M (2004). Folate deficiency induces
aneuploidy in human lymphocytes in vitro-evidence using cytokinesis-
blocked cells and probes specific for chromosomes 17 and 21 Mutat Res.
551(1-2):167-80.
(69) Lindberg HK., Wang X, Järventaus H, Ghita C., Falck M., Norppa H,
Fenech M. (2007). Origin of nuclear buds and micronuclei in normal and
folate-deprived human lymphocytes Mutation Research/Fundamental
and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, 617(1-2):33-45.
(70) Zúñiga-González GM., Cecilia M, Batista-González, Belinda C. Gómez-
Meda, Ramos-Ibarra, ML, Ana L. Zamora-Perez, Muñoz-Magallanes T,
Ramos-Valdés C, Gallegos-Arreola. MP. (2007). Micronuclei in
diabetes: Folate supplementation diminishes micronuclei in diabetic
patients but not in an animal model. Mutation Research 634:126–134.
(71) Shukla N, Angelini GD, Jeremy JY. (2008). The administration of folic
acid reduces intravascular oxidative stress in diabetic rabbits
Metabolism, 57(6):774-781.
(72) Alvares D.,V. D., de Andrade V. A.C., Mocelin A.J., Barbosa, D. S.,
Mise R.A., Matsuo,T. (2007). Folic acid therapy reduces plasma
homocysteine levels and improves plasma antioxidant capacity in
hemodialysis patients. Nutrition, 23(3):242-247.
(73) Bolufer P., Barragan E, Collado M., Cervera J., López JA, Sanz M A.
(2006). Influence of genetic polymorphisms on the risk of developing
leukemia and on disease progression Leukemia Research, 30(12):1471-
1491.
(74) Crott JW, Liu Z, Keyes MK, Sang-Woon Ch, Jang H, Moyer MP, Mason
JB. (2008). Moderate folate depletion modulates the expression of

60
 selected genes involved in cell cycle, intracellular signaling and folate
uptake in human colonic epithelial cell lines. The Journal of Nutritional
Biochemistry, 19(5):328-335.
(75) Crott JW, Liu Z, Sang-Woon Ch, Mason JB. (2007). Folate depletion in
human lymphocytes up-regulates p53 expression despite marked
induction of strand breaks in exons 5–8 of the gene
Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental
Mutagenesis, 626(1-2):171-179.
(76) Kim YI, Shaila Shirwadkar, Sang-Woon Choi, Martina Puchyr, Yang
Wang, Joel B. Mason (2000). Effects of Dietary Folate on DNA Strand
Breaks Within Mutation-Prone Exons of the p53 Gene in Rat Colon.
Gastroenterology, 119(1):151-161.
(77) Blasi F. (2006). The urokinase receptor, cell migration, proliferation and
cancer European Journal of Cancer Supplements, 4(6): 5.
(78) Hildenbrand R., Gandhari M., Arens N., Bleyl U. (2004). Urokinase
induces proliferation of human breast cancer cells. Pathology - Research
and Practice, 200(4):304-305.
(79) Artmann, A., K. Celik, M. Kiechle, M. Schmitt, N. Harbeck (2008). The
prognostic impact of Plasminogen Activator Inhibitor Typel (PAI-I) and
Urokinase-type Plasminogen Aktivator (uPA) concentrations in axillary
lymph node metastasis in patients with primary breast cancer
European Journal of Cancer Supplements, 6(7):102.
(80) Hoekstra J, Verkaik-Kloosterman J, Rompelberg C, van Kranen H,
Zeilmaker M, Verhagen H, de Jong N. (2008). Integrated risk–benefit
analyses: Method development with folic acid as example. Food and
Chemical Toxicology, 46(3):893-909.
(81) Su, LJ., Arab L. (2001). Nutritional Status of Folate and Colon Cancer
Risk: Evidence from NHANES I Epidemiologic Follow-up StudyAnnals
of Epidemiology, 11(1): 65-72.

61
(82) Sanjoaquin, MA, Allen,N;Couto,E.,Roddam,A.W., Key, T.J. (2004).
Folate intake and colorectal cancer risk: a meta-analytical approach. Int.
J.Cancer 113,825-828.
(83) Kim Y.I. (2003). Role of folate in colon cancer development and
progression. J. Nutr., 133,3731-3739.

62
ANEXO

63
Figura 1. Posible estructura del Cr(III) en unión con un nucleótido de guanina.
Esta figura está citado como Fig. 6 en Arakawa et al. 2006. Carcinogenesis
27(3):639-645.

64
Figura 2. Modelo esquemático de la represión transcripcional del cromo. Esta
figura está citada como Fig. 9 en Schnekenburger et al. 2007. Mol Cell Biol,
2007. 27(29):7089-101.

65
Figura 3. Metabolismo del folato. Esta figura esta citada en Fenech. 2001.
Mutation Research 475 (2001): 57–67.

66
Figura 4. Placa metafásica de un individuo macho de Mesocricetus auratus.
2n=44. La flecha indica el cromosoma sexual X, metacéntrico, de mayor tamaño,
1000X.

67
Figura 5. Placa metafásica de un individuo hembra Mesocricetus auratus.
2n=44. Las flechas indican los cromosomas sexuales X, metacéntrico, de
mayor tamaño, 1000X.

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Figura 6. Eritrocitos policromaticos y maduros de Mesocricetus
auratus. Se señala un eritrocito policromático.

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 (A) (B)

Figura 7. Representación de probables mecanismos del origen de micronúcleos

(MN). A) Micronúcleo de origen aneugénico. Como consecuencia de una
alteración a nivel centromérico de un cromosoma, este queda rezagado durante la
migración anafásica y conduce a la formación de un MN. B) Micronúcleo de
origen clastogénico. A causa de una rotura cromosómica, un fragmento
cromosómico queda excluido del núcleo, dando origen a un MN. La célula
portador de MN continúa las fases de G1, S, G2 e inician una siguiente división
celular manteniendo el MN en la célula, como se observa en metafase con MN. El
daño cromosómico se habría producido en interfase.

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