UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO

FACULTAD DE QUMICA

LA GENERACIN DE H2O2 EN LA RESPUESTA DE

HIPERSENSIBILIDAD MEDIADA POR LAS BASES DE CADENA
LARGA EN Arabidopsis thaliana y Phaseolus vulgaris.

TESIS

QUE PARA OBTENER EL TTULO DE

QUMICA DE ALIMENTOS

PRESENTA

ARIADNA GONZLEZ SOLS

MXICO, D.F. 2009

 JURADO ASIGNADO:

PRESIDENTE Profesora: Marina Gavilanes Ruiz

VOCAL Profesor: Felipe Cruz Garca
SECRETARIO Profesor: Euclides vila Chvez
1er. SUPLENTE Profesora: Laura Carmona Salazar
2do. SUPLENTE Profesora: Mara del Consuelo Plata Ramos

Sitio donde se desarroll el tema:

Laboratorio 101, Departamento de Bioqumica, Conjunto E,

Facultad de Qumica UNAM.
Donald Danforth Plant Science Center St. Louis MO, USA.

Asesora Dra. Marina Gavilanes Ruiz

______________________

Supervisora tcnica M. en C. Mariana Saucedo Garca

_______________________

Sustentante Ariadna Gonzlez Sols

______________________
 Agradecimientos

Durante la realizacin de este trabajo de tesis Ariadna Gonzlez Sols recibi una beca de PAPIIT
DGAPA UNAM IN207806 y particip en el Subprograma 127 de Formacin Bsica en
Investigacin, Facultad de Qumica, UNAM.

Esta tesis se llev a cabo gracias al financiamiento de los Proyectos PAPIIT DGAPA, UNAM
IN207806 e IN211409 y del proyecto de CONACYT 55610.

Agradecemos al Dr. Edgar B. Cahoon del Center for Plant Science Innovation & Department of
Biochemistry, University of Nebraska-Lincoln, USA, por haber proporcionado las semillas de
Arabidopsis thaliana de las lneas silvestre, Atlcb2a-1 y Atlcb2b-hp/Atlcb2a para la realizacin de
este trabajo de tesis. As mismo agradecemos su asesora, supervisin y el acceso a su laboratorio
y a las instalaciones del Donald Danforth Plant Science Center, St. Louis MO, EE.UU., durante mi
estancia para llevar a cabo el anlisis de bases de cadena larga por HPLC/ESI-MS/MS.

Agradecemos al Dr. Jonathan E. Markham y al Dr. Jan G. Jaworsky del Donald Danforth Plant
Science Center, St. Louis MO, EE.UU., por la realizacin de las ltimas fases del anlisis de bases
de cadena larga por HPLC/ESI-MS/MS.

Agradecemos a la Dra. Sonia Vzquez Santana del Laboratorio de Desarrollo en Plantas, Facultad
de Ciencias, UNAM, por su apoyo y asesora tcnica en los anlisis de microscopa ptica.

Agradecemos a la MFP Ana Isabel Bieler Antolin de la Unidad de Microcine de la Facultad de

Ciencias, UNAM, por su colaboracin en el anlisis para obtencin de las fotomicrografas.

Agradecemos a Alonso Zavaleta Fernndez de Crdova por su colaboracin en el procesamiento

de las imgenes de microscopa ptica.

Agradecemos la ayuda tcnica de la Q.F.B. Consuelo Enrquez Arredondo durante la realizacin

de este trabajo de tesis.

Agradecemos a la Q. Laurel Fabila Ibarra por su apoyo tcnico en el manejo de los cultivos en
invernadero.
 A mis paps, por su ejemplo y su cario
A mis hermanos Dafne y Memo, por creer en mi
A Sergio, por acompaarme en este camino
 Muchas gracias!
A mi familia por todo su apoyo.

En especial, a la Dra. Marina Gavilanes, no slo por orientarme en la realizacin de

esta tesis sino por todas las oportunidades, el apoyo incondicional y las enseanzas
diarias.

A la M. en C. Mariana Saucedo por sus valiosos consejos y comentarios en la

realizacin de esta tesis.

Al Dr. Felipe Cruz Garca por sus comentarios y propuestas para el enriquecimiento de
este proyecto.

Al Dr. Euclides vila Chvez por sus comentarios.

A Poncho por su ayuda en la culminacin de la tesis.

A todos mis compaeros del Lab. 101.

A mis amigos por todos los momentos compartidos.

A la UNAM por mi formacin profesional.

NDICE
NDICE
NDICE
 NDICE DE FIGURAS

Figura 1. Respuesta de Hipersensibilidad 6

Figura 2. Especies reactivas de oxgeno derivadas del oxgeno molecular... 7
Figura 3. Cintica de la acumulacin de ERO en clulas vegetales despus de la
inoculacin con patgenos bacterianos virulentos y avirulentos.. 11
Figura 4. Estructura bsica de un esfingolpido. 14
Figura 5. Estructuras de bases de cadena larga presentes en plantas.. 15
Figura 6. Biosntesis de novo de los esfingolpidos 17
Figura 7. Estructura de la fumonisina B1................................................................................. 18
Figura 8. Especies vegetales usadas en este estudio 23
Figura 9. Controles negativos de los tejidos vegetales utilizados en este trabajo. 30
Figura 10. Efecto de la fumonisina B1 y del patgeno P. syringae DC3000 avrRPM1 en la
produccin de H2O2 de P. vulgaris. 34
Figura 11. Efecto del patgeno avirulento (Pst DC3000 avrRPM1) y del patgeno virulento
(Pst DC3000 vir) en la produccin de H2O2 hojas de A. thaliana silvestres (Col-0).. 37
Figura 12. Efecto del patgeno avirulento (Pst DC3000 avrRPM1) y del patgeno virulento
(Pst DC3000 vir) en la produccin de H2O2 de hojas mutantes Atlcb2a-1 y Atlcb2b
hp/Atlcb2a.. 39, 40
Figura 13. Efecto del patgeno avirulento (Pst DC3000 avrRPM1) y del patgeno virulento
(Pst DC3000 vir) en la produccin de H2O2 de hojas de la mutante Atmpk6. ... 42
Figura 14. Efecto de la FB1 en la produccin de H2O2 en hojas de A. thaliana (WT y
Atlcb2a-1)... 44
Figura 15. Cuantificacin de BCL en plntulas de A. thaliana lneas silvestre y mutante
Atlcb2a-1 a diferentes tiempos... 47
Figura 16A. Controles negativos de las plntulas de A. thaliana WT y Atlcb2a-1. 48
Figura 16B. Efecto de la FB1 en la produccin de H2O2 en plntulas de A. thaliana
(silvestres y Atlcb2a-1). 49
Figura 17. Hipertincin con DAB para detectar el efecto de la FB1 en la produccin de H2O2
en plntulas de A. thaliana (WT y Atlcb2a-1)... 50
Figura 18. Localizacin subcelular de H2O2 en hojas de A. thaliana... 51
Figura 19. Localizacin subcelular de H2O2 en hojas de P. vulgaris 52
Figura 20. Modelo de la relacin entre la acumulacin de BCL y la produccin de ERO en
las respuestas de inmunidad de las plantas 64

ABREVIATURAS
AB cido benzoico
AS cido saliclico
AVR genes de avirulencia
BCL bases de cadena larga
BCL-P base de cadena larga fosforilada
CERK ceramida cinasa
d18:0 esfinganina
d18:0-P esfinganina fosfato
d18:1 esfingosina
d18:2 esfingadienina
DAB 3,3- diaminobencidina
dpi das post infiltracin
ERO especies reactivas de oxgeno
FB1 fumonisina B1
GluCer glucosilceramida
h hora
hpi horas post-infiltracin
H2O2 perxido de hidrgeno
HPLC cromatografa de lquidos de alta
resolucin
HPLC/ESI-MS/MS HPLC fase reversa
acoplada a espectrometra de masas
con ionizacin por electroaspersin
HR respuesta de hipersensibildad
IPC inositolfosforilceramida
ABREVIATURAS
IPCS inositolfosforilceramida sintasa
MAPK protenas cinasas activadas por
mitgeno
MCP muerte celular programada
mg miligramo
min minuto
mL mililitro
L microlitro
mM milimolar
M micromolar
MTF metoxifenozida
O2.- ion superxido
OH radical hidroxilo
Pst DC3000 avrRPM1 Pseudomonas
siringae pv. tomato cepa DC3000
avrRPM1 (avirulenta)
Pst DC3000 vir Pseudomonas syringae
cepa DC3000 (virulenta)
RSA respuesta sistmica adquirida
SOD superxido dismutasa
SPT serina palmitoiltransferasa
t18:0 hidroxiesfinganina (fitoesfingosina)
t18:1 hidroxiesfingenina
UFC Unidades formadoras de colonias
WT silvestre
 RESUMEN

I. RESUMEN
La produccin de especies reactivas de oxgeno (ERO) es una caracterstica del patrn de defensa
contra patgenos en plantas. Estudios realizados en nuestro laboratorio y datos recientes indican
que la acumulacin de bases de cadena larga (BCL) precede a la formacin de ERO en una va
conducente a la muerte celular programada (MCP). En este proyecto se estudi la relacin entre
las BCL y la produccin in situ de H2O2 que conduce a la MCP como respuesta de defensa contra
patgenos. Para ello, se utilizaron dos estrategias que alteran la acumulacin de BCL. Una de
ellas est enfocada en disminuir la sntesis de BCL a travs de la modificacin de la actividad de la
serina palmitoiltransferasa (SPT) en mutantes de Arabidopsis thaliana. La segunda aproximacin
consisti en favorecer la acumulacin de BCL utilizando a la FB1 (inhibidor de la ceramida sintasa)
o bien exponiendo las plantas a Pseudomonas syringae avrRPM1, un patgeno no hospedero para
Phaseolus vulgaris o avirulento para A. thaliana. Los experimentos se realizaron tanto en A.
thaliana como en P. vulgaris. Los resultados en P. vulgaris indican que la acumulacin de BCL a
tiempos muy tempranos (1 h) precedi a la formacin de H2O2 en la regin infiltrada. Adems, en
este sitio se desarroll progresivamente la MCP de defensa conocida como respuesta de
hipersensibilidad (HR). En la mutante de A. thaliana Atlcb2b-hp/Atlcb2a con LCB2B silenciado, no
se observ la generacin de H2O2 ni a las 4 ni a las 12 h, en el sitio de la infiltracin con patgeno
avirulento, a diferencia de los controles. A nivel de plntula, la mutante nula Atlcb2a-1 de A.
thaliana acumul menores cantidades de BCL, en comparacin con las plntulas silvestres
tratadas con FB1. La magnitud de la produccin de H2O2 a tiempos intermedios se present en
relacin directa a la acumulacin de las BCL. Para dilucidar si la produccin de H2O2 dispara una
cascada de sealizacin mediada por la MAP cinasa 6 (MPK6) que se activa en vas de defensa, a
la mutante nula AtMPK6 de A. thaliana se le evalu la capacidad de producir H2O2 como respuesta
al ataque del patgeno o a la FB1. Los resultados mostraron que en este entorno gentico la
produccin de H2O2 no se alter, aunque si result mas sensible al patgeno bacteriano. El H2O2
se localiza mayoritariamente en los cloroplastos alrededor de las 18 h, en condiciones en las que
se estaba iniciando la manifestacin de la HR. Los resultados de los tres modelos experimentales
sealan que hay una asociacin entre la acumulacin de BCL endgenas y la formacin in situ de
H2O2. Esta relacin podra suceder en dos etapas. La primera relacionada con el papel sealizador
de los ERO y la segunda probablemente asociada con un estrs oxidativo dentro del proceso de la
MCP. Nuestra conclusin es que tanto las BCL como la formacin de ERO inducida por BCL es
importante en la inmunidad mediada por la interaccin gen por gen y confirman que la primera
etapa de produccin de ERO, posterior a un aumento en las BCL, se produce en la inmunidad a
patgenos no hospederos.

1
 INTRODUCCIN

II. INTRODUCCIN
1. RESPUESTAS DE DEFENSA CONTRA PATGENOS EN LAS PLANTAS.
En general, las plantas pueden ser atacadas por muchos tipos de patgenos como hongos,
bacterias, virus, nemtodos e insectos que invaden el tejido vegetal para explotarlo como una
fuente de energa (Dangl y Jones, 2001; Bonfig et al., 2006). No todos los ataques resultan
exitosos, ya que las especies vegetales desarrollaron sofisticados mecanismos que permiten
percibir el ataque de un patgeno y desencadenar respuestas de defensa (Dangl y Jones, 2001;
Wouter et al., 2005). En las plantas, los mecanismos de defensa contra el ataque de patgenos se
dividen en dos clases: aquellos que estn presentes constitutivamente y los que se inducen por la
exposicin al patgeno. En ambos contextos, las plantas combaten a los patgenos con
caractersticas estructurales que actan como barreras fsicas que dificultan la entrada del agente
invasor y evitan su expansin a travs de la planta, o bien, a travs de reacciones bioqumicas en
las clulas hospederas que producen sustancias que pueden ser txicas para el patgeno o crean
condiciones que inhiben su crecimiento.
En la interaccin planta-patgeno la manifestacin de la enfermedad ocurre cuando hay
compatibilidad entre el agente invasor y el hospedero1 (susceptibilidad), mientras que cuando la
planta combate de forma exitosa la infeccin ocurre una relacin incompatible o de resistencia.
Los patgenos pueden ser clasificados de acuerdo a sus caractersticas y a los efectos en la
planta hospedera (Wit, 2007). Existen patgenos intra y extracelulares; necrtrofos, hemibitrofos
o bitrofos; avirulentos o virulentos (Greenberg, 1997; Dangl y Jones, 2001, Wit, 2007). Los
patgenos necrtrofos son aquellos que se benefician de los nutrimentos de clulas sin requerir
una activa participacin del hospedero, comnmente proliferan en tejidos vegetales senescentes o
que presentan heridas (Morel, 1997). Adems, estos patgenos frecuentemente producen toxinas
para destruir el tejido vegetal antes de la colonizacin (Wit, 2007). Por su parte, los patgenos
bitrofos requieren de la planta viva para completar su ciclo de vida dependiendo de la planta
hospedera (Dangl y Jones, 2001).
De acuerdo a la interaccin con la planta hospedera se puede diferenciar entre patgenos
avirulentos y virulentos. Se conoce como patgeno avirulento aquel que presenta una interaccin
incompatible (no enfermedad) con una planta resistente, mientras que los patgenos virulentos
establecen una relacin compatible que se manifiesta con sntomas de enfermedad en el
hospedero susceptible (Flor, 1971; Keen, 1990; Agrios, 1997).

1
Una especie vegetal susceptible a una especie o subespecie de un patgeno se denomina
hospedero de este parsito (Zimmerli et al., 2004).

2
 INTRODUCCIN

1.1. Mecanismos de resistencia a la infeccin por patgenos.

1.1.1. Resistencia mediada por evocadores: inmunidad innata.
Las plantas poseen un eficiente sistema de inmunidad natural bsico llamado inmunidad innata
que permite el reconocimiento de agentes invasores (Da Cunha, et al., 2006; Boller y Yang He,
2009). Cuando un patgeno ataca una planta, la primera lnea de defensa es la que se
desencadena por reconocimiento de molculas llamadas evocadores que pueden ser protenas,
oligosacridos, glicoprotenas o lpidos, los cuales se denominan endgenos si son producidos por
la planta o exgenos si los secreta el organismo invasor (Hammond-Kosack y Jones, 1996). Una
vez que estas molculas son reconocidas por la planta hospedera se despliega una serie de
seales con el propsito de iniciar una respuesta de defensa. Por ejemplo; alteraciones en la pared
celular, deposicin de callosa y acumulacin de protenas relacionadas con la defensa que
incluyen quitinasas, glucanasas y proteasas (Chisholm et al., 2006; Boller y Yang He, 2009).
A los evocadores exgenos se les llama genricamente Patrones Moleculares Asociados a
Microbios (MAMPs, de Microbe-Associated Molecular Patterns) o bien Patrones Moleculares
Asociados a Patgenos (PAMPs, de Pathogen-Associated Molecular Patterns). Entre los
evocadores exgenos que son reconocidos por las clulas vegetales se han identificado: la
flagelina (protena presente en los flagelos bacterianos), el factor de elongacin Tu y
lipopolisacridos presentes en bacterias Gram-negativas, as como la quitina y ergosterol que son
componentes de la pared celular de hongos (Wit, 2007). Estas molculas son reconocidas
mediante receptores presentes en la superficie de la clula vegetal. Estos receptores poseen un
dominio extracelular de unin al ligando (dominio repetido rico en leucina), un dominio
transmembranal y un dominio intracelular denominado receptor-cinasa (Bittel y Robatzek, 2007).
Por ejemplo, las plantas que se han infectado con el patgeno bacteriano Pseudomonas syringae
pv. tomato reconocen a la flagelina (o al pptido ms conservado de la flagelina, el flg22) mediante
el receptor membranal FLS2, lo que restringe el crecimiento bacteriano (Zipfel et al., 2007).
Si bien la inmunidad mediada por los evocadores produce resistencia, es una defensa general no
especfica para el patgeno que infecta, ya que independientemente de la naturaleza qumica del
evocador, los mecanismos de defensa que se desencadenan son muy similares.
Las vas de sealizacin y los diferentes mecanismos moleculares que se inician tras el
reconocimiento de los evocadores no han sido completamente dilucidados; sin embargo, existen
evidencias genticas y bioqumicas que relacionan las respuestas de defensa con parmetros
como la produccin de especies reactivas de oxgeno (ERO), la sealizacin mediada por cinasas
activadas por mitgenos (MAP cinasas) y la activacin transcripcional temprana de genes de
defensa (Serrano et al., 2007).

3
 INTRODUCCIN

1.1.2. Resistencia gen-por-gen.

El modelo de resistencia gen-por-gen describe una forma de defensa que solamente se presenta
entre una planta resistente y un patgeno avirulento. En esta interaccin, denominada
incompatible, la planta reconoce al patgeno y dispara un programa de defensa para combatir el
ataque del organismo invasor (Hammond-Kosack y Jones, 1997). El reconocimiento est
gobernado por interacciones especficas entre los productos codificados por genes de avirulencia
(AVR) del patgeno y el producto del correspondiente gen de resistencia a la enfermedad de la
planta (R) (Flor et al., 1971; Wang et al., 2007).
De forma contraria, en la interaccin compatible no se obedece el modelo gen-por-gen debido a
que el patgeno no presenta un gen de avirulencia correspondiente al gen de resistencia en la
planta. Como consecuencia, la planta no induce respuestas de defensa y es susceptible al
crecimiento del patgeno y por lo tanto a la infeccin. En este caso, se presentan sntomas de
enfermedad que no se limitan al sitio de infeccin y por lo tanto la lesin puede extenderse hasta la
total invasin de la planta (Wang et al., 2007).

1.1.3. Resistencia no hospedera.

El fenmeno por el cual una especie vegetal es inmune a un patgeno en particular, se denomina
resistencia no hospedera y ocurre cuando el patgeno no es capaz de vencer los sistemas de
defensa de la planta, tales como barreras estructurales o compuestos txicos, que limiten su
crecimiento. En este caso, no se presenta la enfermedad (Mishina y Zeier, 2007). Los trminos
planta no hospedera y patgeno no hospedero se refieren al hecho de que los patgenos tienen
un intervalo limitado de plantas en las cuales pueden causar enfermedad. Con frecuencia,
nicamente plantas de un solo gnero son hospederas para un patgeno particular; ste es el
caso de muchos mohos y patgenos bacterianos. El resto de las plantas son, por definicin:
plantas no hospederas y los microbios que las atacan son patgenos no hospederos (Zimmerli
et al., 2004).

1.2. Muerte celular programada.

La muerte celular programada (MCP) es una secuencia de eventos que llevan a la destruccin de
las clulas de una manera organizada y controlada como parte normal del desarrollo o en
respuesta a un estmulo (Smirnoff, 2005; Reape et al., 2008). sto se logra mediante la activacin
de una maquinaria genticamente regulada que requiere de una activa participacin celular
(Gilchrist, 1998).

4
 INTRODUCCIN

En las plantas, la MCP es esencial para el desarrollo y la sobrevivencia (Greenberg, 1996). Por
ejemplo, durante el desarrollo de plantas monocotiledneas las clulas de la aleurona, forman un
tejido que secreta hidrolasas para digerir al endospermo y alimentar el embrin. Estas clulas
resultan innecesarias despus del desarrollo embrionario y mueren cuando la germinacin se ha
completado (Pennell et al., 1997). Por otro lado, la senescencia que se presenta como la fase final
del desarrollo vegetativo tambin es un proceso de MCP que involucra vas de sealizacin
coordinadas (Pennell et al., 1997). La senescencia est asociada a niveles decrecientes de
fitohormonas que estn naturalmente presentes en las plantas como reguladores de crecimiento y
desarrollo. Aunque an no se conocen con certeza los cambios bioqumicos que se presentan
durante el proceso de senescencia, se sabe que hay alteraciones importantes a nivel del
cloroplasto, en donde se modifican los grana (Nooden, 2004). Uno de los ejemplos ms conocidos
en plantas en el que se expresa la MCP, es en las respuestas de defensa contra patgenos. En
este caso, la MCP tiene como funcin restringir el avance del organismo invasor y se conoce como
Respuesta de Hipersensibilidad (HR) (Reape et al., 2008) como se detalla en una seccin
posterior.
El estudio de la MCP comenz en 1972 cuando se introdujo el trmino de apoptosis que describa
el proceso de cada de los ptalos de las flores o las hojas de los rboles (Kerr et al., 1972).
Posteriormente, se reconoci la existencia de una serie de alteraciones tanto morfolgicas como
bioqumicas durante la apoptosis en animales, que comprenden encogimiento celular, prdida del
contacto celular de los tejidos, fragmentacin del ADN y la formacin de cuerpos apoptticos
(Gilchrist, 1998).
En contraste con la apoptosis en animales, en la MCP que ocurre en plantas no se ha podido
establecer una secuencia de eventos celulares y moleculares. Sin embargo, algunas respuestas
comunes que se presentan en las plantas durante la muerte celular son: desarreglo del
citoesqueleto, condensacin de la cromatina, fragmentacin del ADN y generacin de ERO (Balk
et al., 2003). Al final del proceso se presentan alteraciones tanto en el tonoplasto como en la
membrana plasmtica que conllevan a un colapso celular. La liberacin de enzimas hidrolticas
vacuolares determina un importante papel en la degradacin de componentes celulares (Nooden,
2004).
La necrosis, a diferencia de la MCP, es la muerte que se presenta tras la exposicin a compuestos
altamente txicos, estrs por intenso calor o fro o heridas traumticas que causan un dao
inmediato en la membrana u organelos celulares (Gilchrist, 1998).

5
 INTRODUCCIN

1.3. La Respuesta de Hipersensibilidad.

En ocasiones, cuando una planta es infectada por un patgeno, sta puede desencadenar
respuestas de defensa que finalmente previenen el crecimiento y desarrollo del agente invasor. A
esta respuesta se le conoce como Respuesta Hipersensible o Respuesta de Hipersensibilidad
(HR), que consiste en un tipo de MCP localizada en el sitio de infeccin por el patgeno (Agrios,
1997) (Figura 1).
La HR es un proceso activo genticamente controlado (Morel y Dangl, 1997) que se manifiesta
con la muerte de las clulas del tejido vegetal unas horas despus del ataque del patgeno
(Hammond-Kosack y Jones, 1996) y tpicamente se desencadena por eventos como el
reconocimiento de un gen de avirulencia del patgeno y el correspondiente gen de resistencia de
la planta hospedera (modelo gen-por-gen) (Flor, 1971; Bent, 1996). Tras el reconocimiento, se
activa una cascada de reacciones bioqumicas en las clulas vegetales atacadas y en las que las
rodean, llevando as a nuevas y alteradas funciones celulares y a la produccin de nuevos
compuestos relacionados con la defensa. Las caractersticas identificadas ms comunes son:
incremento del movimiento transmembranal de iones, especialmente K+ y H+ a travs de la
membrana celular, destruccin de membranas y prdida de la compartamentalizacin celular;
entrecruzamiento de compuestos fenlicos con componentes de la pared celular y reforzamiento
de la misma; produccin de sustancias antimicrobianas como fitoalexinas y la sntesis de protenas
antimicrobianas (Morel y Dangl, 1997). Se sabe que durante la HR se presenta una rpida y
transitoria produccin de grandes cantidades de ERO, incluyendo el in superxido (O2.-) y el
perxido de hidrgeno (H2O2) (Agrios, 1997; Greenberg, 1997).

Figura 1. Respuesta de Hipersensibilidad.

La HR presenta caractersticas tpicas de las formas de muerte celular de animales como son la
apoptosis y la autofagia, lo que sugiere que la MCP es un proceso altamente conservado entre
animales y plantas (Mur et al., 2008). Por ejemplo, durante la HR se presentan caractersticas de

6
 INTRODUCCIN

la apoptosis como son incremento de la permeabilidad en la membrana plasmtica, encogimiento

de la clula, condensacin tanto del citoplasma como del ncleo (Morel y Dangl, 1997).
Investigaciones recientes, sugieren tambin una relacin entre la autofagia y la HR (Montrell et al.,
2006). La autofagia, que significa comerse a s mismo, es el mayor sistema de degradacin y
reciclaje en clulas eucariticas (Wouter et al., 2005). Este proceso est caracterizado por la
formacin de vesculas citoslicas de doble membrana, llamadas autofagosomas, que envuelven
parte del citoplasma con o sin parte de organelos, para ser degradados por proteasas en el
lisosoma o en la vacuola (Seay et al., 2006; Toyooka et al., 2006).

2. LAS ESPECIES REACTIVAS DE OXGENO.

2.1. Generalidades de las especies reactivas de oxgeno.
Especies reactivas de oxgeno (ERO) es el trmino utilizado para describir las formas de oxgeno
que son energticamente ms reactivas que el oxgeno molecular. Tpicamente las ERO son
productos de una reduccin secuencial del oxgeno molecular (Wojtaszek, 1997), es decir, son
especies moleculares que han sufrido la adicin de electrones (Smirnoff, 2005). Entre las ERO que
se encuentran en plantas estn el in superxido (O2.-), el radical hidroperxido (HO2), el perxido
de hidrgeno (H2O2) y el radical hidroxilo (OH) (Agrios, 1997).
La primera reaccin de reduccin del oxgeno molecular lleva a la formacin del in superxido
(O2.-) o a su forma protonada como radicales hidroperxido (HO.2). En un segundo paso, el O2.- es
rpidamente convertido a H2O2 por la enzima superxido dismutasa (SOD) (Hammond-Kosack y
Jones, 1996) (Figura 2).

Figura 2. Especies reactivas de oxgeno derivadas del oxgeno molecular (Hammond-Kosack

y Jones, 1996).

7
 INTRODUCCIN

El poder oxidante convierte a estas ERO en agentes potencialmente dainos para la clula. El O2.-
puede inactivar o alterar la actividad cataltica de enzimas que contengan sitios Fe-S. La forma
protonada, HO2, puede atravesar membranas biolgicas e iniciar oxidacin lipdica mediante la
extraccin de protones de cidos grasos poliinsaturados. En cuanto al H2O2, ste puede inactivar
enzimas mediante la oxidacin de los grupos tiol. El radical hidroxilo .OH, es altamente reactivo,
por lo cual las clulas poseen mecanismos para prevenir su formacin (Gechev et al., 2006).
En altas concentraciones, las ERO pueden provocar una oxidacin no controlada de diversas
estructuras celulares como son: DNA, protenas y lpidos membranales. Sin embargo, debido a
que en las plantas se producen continuamente estas especies como producto normal del
metabolismo aerbico, se cuenta con mecanismos antioxidantes y de detoxificacin para mantener
un balance celular inocuo de xido-reduccin (Smirnoff, 2005). Los diferentes sistemas de
detoxificacin de ERO incluyen: ascorbato peroxidasas, glutatin, superxido dismutasas y
catalasas que mantienen la homeostasis de ERO en diferentes compartimentos de la clula
vegetal (Torres et al., 2006).
Sin embargo, las ERO no slo son metabolitos txicos y agentes de dao celular, sino que tambin
cumplen una importante funcin como molculas sealizadoras que coordinan las respuestas
celulares ante numerosos tipos de estmulos ambientales y durante el desarrollo (Smirnoff, 2005).
La funcin de sealizacin se produce en respuesta a un estmulo que favorece la produccin de
ERO, generando un incremento de estas especies por arriba del nivel basal.
La accin de las ERO en la clula depender de su concentracin, de la rapidez con la que se
forman, de su sitio de produccin, de su accesibilidad a blancos de accin y de su manejo por los
sistemas celulares detoxificadores (Gechev et al., 2006).
Las plantas, as como los animales, producen ERO va enzimas de la clase de las oxidoreductasas
(Smirnoff, 2005).

2.2. Funciones de las ERO en plantas.

Las ERO estn involucradas en una gran variedad de procesos en las plantas, como
diferenciacin, crecimiento celular y respuestas a estrs bitico y abitico. Durante el desarrollo
vegetativo, la produccin de ERO es necesaria en eventos como: la germinacin, el crecimiento
(Korystov y Narimanmov, 1997), la elongacin de las races (Foreman et al., 2003), la formacin de
las hojas (Smirnoff, 2005), el desarrollo del tricoma (Smirnoff, 2005) y en la muerte celular de la
aleurona (Bethke y Jones, 2001). Tambin se sabe que el H2O2 est implicado en el cierre de los
estomas inducido por cido abscsico (Pei et al., 2000).

8
 INTRODUCCIN

En los ltimos aos, se ha encontrado que las ERO desempean una funcin importante durante
las respuestas de defensa de las plantas contra el ataque de patgenos. Se han propuesto
numerosos mecanismos para tratar de elucidar cual es el papel que desempean. Actualmente
existen evidencias de que las ERO tienen un efecto antimicrobiano directo, que ocurre cuando
causan un dao al patgeno e inhabilitan la unin peroxidativa de las protenas de la pared celular
con los polisacridos del patgeno, impidiendo su invasin (Smirnoff, 2005). Asimismo, las ERO
pueden actuar como mensajeros para la activacin de genes de defensa (Thordal-Christensen et
al., 1997) y actan orquestando el establecimiento de la reaccin de defensa a travs del
fortalecimiento de la pared celular va el entrecruzamiento de protenas de la pared (Brisson et al.,
1994).
La doble mutante de Arabidopsis thaliana en los genes AtRBOHF y AtRBOHF, que codifican a
protenas ortlogas de la subunidad cataltica gp91phox de la NADPH oxidasa, produce menos ERO
y disminuye la muerte celular. Estos resultados evidencian la participacin de la NADPH oxidasa
en la respuesta contra patgenos (Torres et al., 2002).
Dependiendo de los diferentes sistemas planta-patgeno, la acumulacin de ERO puede tener
diferentes funciones. Por ejemplo, los patgenos necrtrofos producen ERO para inducir la muerte
celular en la planta y de esta manera facilitar la infeccin (Torres et al., 2006; Wang et al., 2007).

2.3. Fuentes de las ERO en plantas.

Debido a que las plantas son organismos aerbicos, utilizan el oxgeno molecular como aceptor
final de electrones y como resultado de la reduccin del O2 se forman ERO durante el metabolismo
aerobio normal, estrs ambiental, senescencia y en respuesta al ataque de patgenos (Wojtaszek,
1997). Dependiendo de la naturaleza del estmulo que reciben las plantas, la generacin de ERO
se origina en diferentes compartimentos celulares (Parent et al., 2008).
En general, las ERO mantienen un nivel basal en clulas sanas y son normalmente producidas en
bajos niveles en organelos como cloroplasto y mitocondria, principalmente en plantas no-
estresadas. Sin embargo, tambin pueden ser generadas por reacciones enzimticas
citoplsmicas, membranales o exocelulares (Wojtaszek, 1997).
Los cloroplastos son los principales sitios generadores de ERO en las plantas, en donde se
produce O2.- como resultado de una excesiva energetizacin en las cadenas de transporte de
electrones. El O2.- se genera por la fuga de electrones de los centros Fe-S del fotosistema I o
mediante la reaccin de Mehler, por la que se lleva a cabo la reduccin univalente del oxgeno a
nivel del fotosistema I. En esta reaccin, la ferredoxina transfiere un electrn a la molcula de
oxgeno produciendo el radical superxido que posteriormente dismuta a H2O2 (Foyer et al., 1994).

9
 INTRODUCCIN

A nivel del fotosistema II, se produce oxgeno singulete (1O2) como consecuencia del estado
excitado de la clorofila, especialmente debido a elevadas intensidades de luz (Gechev et al., 2006).
Los peroxisomas y glioxisomas son otras fuentes de ERO durante la foto-respiracin y la oxidacin
de cidos grasos, respectivamente (Gechev et al., 2006).
Por otra parte, la mitocondria es una fuente de formacin de O2.- y H2O2 durante la respiracin. Las
principales fuentes de ERO en la mitocondria son la NADH deshidrogenasa, el radical ubiquinona y
el complejo III (Moller, 2001). Aunque hay una menor produccin de ERO en mitocondrias que en
cloroplastos, las especies generadas en las mitocondrias cumplen funciones reguladoras en
mltiples procesos celulares incluyendo la adaptacin y la MCP (Fleury et al. 2002).
Las principales ERO detectadas en respuesta contra patgenos son el anin superxido y el
perxido de hidrgeno. El superxido es producido de manera caracterstica en el apoplasto por la
enzima NADPH oxidasa, localizada en la membrana plasmtica (Torres et al., 2005). La NADPH
oxidasa (NOX) es un complejo de enzimas membranales y citoslicas que cataliza la produccin
del ion superxido a travs de la subunidad enzimtica gp91phox que trasfiere electrones al oxgeno
molecular. En una reaccin subsecuente catalizada por la enzima superxido dismutasa, el in
superxido dismuta a perxido de hidrgeno.
Las peroxidasas asociadas a la pared celular tambin contribuyen a la produccin apoplstica de
ERO durante la interaccin planta-patgeno (Bolwell et al., 1995; Bindschedler, 2006; Choi, 2007).
La xantina oxidasa tambin es una enzima generadora de ERO durante el catabolismo de purinas.

2.4. Perxido de hidrgeno como mediador en las vas de sealizacin.

El H2O2 es una molcula relativamente estable en comparacin con otras ERO, es elctricamente
neutro, por lo cual puede atravesar membranas celulares y llegar a regiones distantes de su sitio
de formacin (Wojtaszek, 1997). Aunque las membranas no son muy permeables a esta molcula,
el transporte se lleva a cabo mediante acuaporinas especiales denominadas peroxoporinas
(Gechev et al., 2006). El H2O2 puede ser generado por varios estmulos ambientales y actuar como
una molcula sealizadora que regula el desarrollo de la planta, su adaptacin al estrs y la MCP
(Gechev y Hille, 2005). Los mecanismos qumicos y enzimticos de generacin del H2O2 y de
detoxificacin estn bien estudiados, sin embargo, poco se sabe de cmo es percibida la seal y
cual es el mecanismo molecular de la accin del H2O2 en la regulacin de los procesos antes
mencionados (Gechev y Hille, 2005).
La detoxificacin enzimtica del H2O2 se da a travs de dos enzimas principales: la catalasa y la
ascorbato peroxidada. Ambas enzimas remueven esta molcula pero catalizan la reaccin de
manera diferente y se encuentran en diferentes compartimentos celulares. La catalasa se localiza

10
 INTRODUCCIN

principalmente en peroxisomas, mientras que la ascorbato peroxidasa en cloroplastos y en el

citosol (Gadjev et al., 2008).

2.5. Caractersticas de la produccin de ERO en defensa contra patgenos.

La rpida generacin de H2O2 y otras ERO en plantas, como respuesta a la estimulacin con
patgenos o evocadores provenientes de patgenos es conocida como explosin oxidativa o bien
oxidative burst (Schroeder et al., 1996) y es uno de los primeros acontecimientos despus de la
evocacin (Wojtaszek et al., 1997). Este evento se ha observado en plantas expuestas a
microorganismos como bacterias y hongos, as como tambin a virus (Levine et al., 1994). En
1983, Doke report la generacin del in superxido al presentarse la interaccin incompatible
entre el patgeno avirulento Phytophthora infestans y plantas de papa. A partir de este reporte, se
ha detectado la produccin de O2- y H2O2 en respuestas de resistencia contra patgenos.

2.6. Cintica de la produccin de ERO en la interaccin planta-patgeno.

En la Figura 3 se muestra la cintica de acumulacin de ERO que ocurre despus de la
inoculacin de clulas en suspensin de soya con el patgeno Pseudomonas syringae pv. glicenea
cepas virulenta y avirulenta (Orlandi et al., 1992). Se pueden distinguir dos fases de acumulacin
de H2O2. En una primera fase, denominada transitoria, se detecta una rpida pero dbil y pasajera
produccin de ERO. Esta fase es observada tras la inoculacin tanto de un patgeno virulento
como de uno no virulento. Esta respuesta se observa cuando existe reconocimiento del patgeno
va la interaccin gen-por-gen, pero tambin cuando se da la interaccin compatible en donde
actan las defensas basales (Torres et al., 2006).

Figura 3. Cintica de la acumulacin de ERO en clulas vegetales despus de la inoculacin con patgenos
bacterianos virulentos y avirulentos (Torres, Biojournal; Adaptado de Orlandi et al., 1992).

11
 INTRODUCCIN

La segunda fase, o fase persistente, es considerada como propia de una interaccin incompatible
(Wojtaszek, 1997), en donde las clulas inoculadas con el patgeno avirulento presentan un
masivo y prolongado pico de acumulacin de ERO que corresponde a la fase II de la explosin
oxidativa. Como se observa en la Figura 3, esta segunda fase no se presenta para el patgeno
virulento, debido a que la fase II depende de la expresin de genes de avirulencia (AVR) (Lamb y
Dixon, 1997). Cabe destacar que los tiempos especficos en que se presentan las dos fases de
produccin de ERO dependen tanto de la planta de estudio como del patgeno.

2.7. Relacin de las ERO con mecanismos de sealizacin como el cido saliclico y las
MAP cinasas en la defensa contra patgenos.
La infeccin por patgenos como hongos y bacterias, provoca la acumulacin de cido benzoico
(AB) y cido saliclico (AS) con sus respectivos glucsidos conjugados (Hammond-Kosack y
Jones, 1996).
El AS es un inductor de resistencia a la enfermedad en diferentes especies y se acumula en tejidos
vegetales, induciendo la Respuesta Sistmica Adquirida (RSA) que permite a las plantas
responder ms rpida, integral y eficientemente al ataque de un patgeno (Hammond-Kosack y
Jones, 1996).
La RSA es un mecanismo de defensa inducida que se presenta en partes distales de la planta que
no fueron expuestas al patgeno (Wojtaszek, 1997) y debido a que las infecciones son eventos
locales, esta respuesta es relevante para establecer un sistema de inmunidad en toda la planta.
Se le atribuyen varios papeles tanto al AS como al AB en las respuestas de defensa de las plantas,
pues ambos compuestos son antimicrobianos y su aplicacin exgena induce la expresin de
genes PR (genes de protenas relacionadas a patgenos) (Uknes et al., 1992; Hammond-Kosack y
Jones, 1996).
Se ha documentado el sinergismo entre ERO y AS en la regulacin de la HR y en el
establecimiento de las respuestas sistmicas (Torres et al., 2006). Altas concentraciones de AS
inhiben la actividad de la catalasa (enzima que cataliza la descomposicin de H2O2 en H2O y O2),
lo que exacerba el estrs oxidativo (Hammond-Kosack y Jones, 1996).
Por otra parte, las MAP cinasas son enzimas citoslicas que participan en la transduccin de
seales en clulas eucariticas (Ichimura et al., 2006). Su funcin consiste en transducir estmulos
externos percibidos por receptores membranales mediante una serie de reacciones de fosforilacin
(Gechev y Hille, 2005).
Las cascadas de MAP cinasas son sistemas comunes de transduccin de seales, que se
conforman de tres elementos: la MAPKKK (cinasa de la cinasa de la MAPK), MAPKK (cinasa de la
MAPK) y la MAPK (MAPK); la secuencia indica el orden en que los componentes se van activando

12
 INTRODUCCIN

consecutivamente mediante las reacciones de fosforilacin (Zhang et al., 2001). Existen mltiples
miembros de cada uno de los tres elementos de estas cinasas en la clula que contribuyen de
manera especfica a la transduccin de seales (Zhang et al., 2001). En el genoma de Arabidopsis
se han identificado aproximadamente 20 MAPKs diferentes (Ichimura et al., 2002).
Adems de la produccin de ERO, durante la interaccin incompatible entre clulas vegetales y
patgenos, se activan las cascadas de MAP cinasas, sin embargo, no se sabe con certeza si la
activacin de MAPKs precede o se da de manera paralela a la produccin de H2O2 (Zhang et al.,
2001).
Se ha reportado la activacin de algunos componentes de cascadas de MAP cinasas en plantas
estimuladas con algunos evocadores fngicos y bacterianos. Asimismo, se sabe que la muerte
celular que se presenta durante la HR inducida tanto por patgenos avirulentos como por
evocadores puede ser bloqueada por la inhibicin de cinasas, lo que sugiere la participacin de
estas enzimas en el proceso. La activacin por patgenos de la cascada de MAPKs en tabaco
SIPK/Ntf4/WIPK, activa la produccin de ERO en cloroplastos en condiciones de iluminacin,
mientras que plantas que se mantienen en oscuridad no acumulan H2O2 despus de la activacin
de MAPK y presentan un fenotipo atenuado de muerte (Liu et al., 2007).
En el trabajo de Romeis et al. (1999), se demostr que la interaccin gen-por-gen activa a dos
MAPKs de Nicotiana tabacum: la SIPK (cinasa de protena inducida por cido saliclico) y la WIPK
(cinasa de protena inducida por herida).

3. ESFINGOLPIDOS EN PLANTAS.
Los esfingolpidos constituyen una clase de lpidos que se encuentra distribuida en membranas
celulares, lipoprotenas (particularmente de baja densidad) y otras estructuras lipdicas de las
clulas eucariticas (Sperling y Heinz, 2003).
Los esfingolpidos en mamferos desempean un papel importante en el desarrollo de los
organismos, ya que estn involucrados en procesos como la proliferacin celular, la diferenciacin
y la apoptosis (Dunn et al., 2004). En mamferos, se encuentran predominantemente esfingolpidos
como la esfingomielina, mientras que en levadura estn en mayor proporcin las
inositolfosforilceramidas. En algunos tejidos vegetales, las glucosilceramidas parecen ser los
esfingolpidos complejos que se encuentran en mayor proporcin (Lynch et al., 1993), aunque los
glicofosfoesfingolpidos tambin son abundantes (Dunn et al., 2004). Sin embargo, las
proporciones de estos dos tipos de esfingolpidos complejos han sido ms precisamente
cuantificados recientemente gracias al desarrollo de nuevos procedimientos de extraccin y
anlisis. De esta manera, en Arabidopsis se determin que las glucosilinositolfosforilceramidas

13
 INTRODUCCIN

(GIPC) son las especies predominantes, siendo su contenido de 64.4 % en hojas, en contraste con
el contenido de glucosilceramidas que representa un 30 % de los esfingolpidos totales (Markham
et al., 2006).
En plantas, el estudio de los esfingolpidos, en particular el de las bases de cadena larga (BCL)
que son las precursoras de los esfingolpidos complejos, ha cobrado mayor importancia debido a
que se han identificado como molculas sealizadoras en la respuesta de las plantas ante la
sequa y como reguladores de la MCP (Ng et.al., 2001; Shi et al., 2007).

3.1. Estructura de esfingolpidos.

Los esfingolpidos son molculas anfipticas que contienen dos cadenas largas hidrofbicas que
integran la porcin de ceramida y una cabeza polar. Las dos cadenas hidrofbicas que forman la
ceramida pertenecen a una BCL y a un cido graso, unidos entre s por un enlace amida entre el
grupo amino de la BCL y el carboxilo del cido graso (Figura 4). El grupo hidroxilo terminal de la
BCL une un grupo polar que puede estar formado por uno o varios residuos de carbohidratos y/o
un grupo fosfato.
La complejidad y diversidad de los esfingolpidos se debe a las numerosas posibilidades
estructurales de cada una de sus tres porciones: los grupos polares, las BCL y los cidos grasos.
Por ejemplo, en estos dos ltimos componentes pueden variar tanto el nmero de carbonos en las
cadenas hidrofbicas como el nmero y la posicin de las insaturaciones, la presencia de
hidroxilaciones o metilaciones (Dunn et al., 2004).

Figura 4. Estructura bsica de un esfingolpido (Adaptado de Sperling y Heinz 2003).

Los precursores metablicos de la sntesis de los esfingolpidos son las BCL o bases esfingoideas,
cuyas estructuras constan de largas cadenas alqulicas de longitud variable (14-22 tomos de
+
carbono) y de una regin polar constituida por substituyentes OH (en el C1 y C3) y NH (en el C2).
3

14
 INTRODUCCIN

Las bases pueden presentar dobles enlaces en los carbonos en posicin 4 u 8 y algunas de ellas
contienen grupos hidroxilo en las posiciones 4 y grupos metilo en las posiciones -1 (iso), -2
(anti-iso) (Karlsson, 1970). Las BCL que predominan en las plantas tienen una cadena
hidrocarbonada de 18 tomos de carbono y difieren en el nmero de hidroxilaciones, y en el
nmero, posicin y configuracin estereoqumica de los dobles enlaces (Figura 5).
Entre las BCL presentes en mayor proporcin en plantas estn la esfinganina (dihidroesfingosina;
d18:0), 4-hidroxiesfinganina (fitoesfingosina; t18:0), (8E/Z)-4-hidroxi-8-esfingeninas (t18:18), (E/Z)-
esfing-8-enina (d18:18), (4E, 8E/Z)-esfinga-4,8-dienina (d18:24,8) (Lynch y Dunn, 2004).
Otras BCL con diferente nmero de carbonos estn presentes, pero en menores proporciones
(Sperling y Heinz, 2003). Para formar la ceramida, ms de 10 diferentes cidos grasos pueden ser
N-acilados a las diferentes BCL mencionadas anteriormente. Estos cidos grasos varan en la
longitud de la cadena de C14 a C26, siendo los cidos grasos saturados de C16, C20 y C24 los ms
abundantes (Sperling y Heinz, 2003). En Arabidopsis, alrededor del 90 % de los esfingolpidos
estn conformados por bases de BCL trihidroxiladas, y la fitoesfingosina (t18:0) representa el 65 %
de los esfingolpidos neutros (Markham et al., 2006).

Esfinganina d18:0
(dihidroesfingosina)

(E)-4-esfingenina d18:1(4E)
(esfingosina)

(E)-8-esfingenina d18:1(8E)

(Z)-8-esfingenina d18:1Z

(4E,8Z)-4,8-esfingadienina d18:24E,8Z

4-hidroxiesfinganina t18:0
(fitoesfingosina)

Figura 5. Estructuras de bases de cadena larga presentes en plantas (Sperling y Heinz, 2003).

15
 INTRODUCCIN

3.2. Funciones de los esfingolpidos en plantas.

Las funciones de esfingolpidos estn muy documentadas en levaduras y clulas animales. Entre
ellas destacan la formacin de la estructura membranal, la modulacin de la actividad de
receptores membranales, la unin a sitios especficos de protenas extracelulares, a
microorganismos, a toxinas y a virus (Lynch y Dunn, 2004).
Asimismo, en estos eucariontes los esfingolpidos estn involucrados en la regulacin del
crecimiento celular, la diferenciacin y la transformacin neoplsica a travs de la participacin en
la comunicacin clula-clula, interacciones clula-sustrato, posibles interacciones con receptores
celulares y sistemas de sealizacin (Huwiler et al., 2000).
En plantas, poco se sabe de las funciones de esfingolpidos; sin embargo, estudios recientes han
proporcionado informacin sobre la naturaleza esencial de estas molculas en diferentes aspectos
celulares como la estabilidad membranal, la sealizacin, la patognesis y la MCP (Sperling y
Heinz, 2003). Por ejemplo, existen evidencias que confirman la funcin de las BCL (esfingosina y
fitoesfingosina fosforiladas) como mediadores en una va de transduccin que conduce al cierre de
estomas (Ng et al., 2001) y se sabe que las ceramidas participan en la sealizacin celular
(Hannun, 1996).
La participacin de la ceramida como inductor de MCP se he evidenciado en la mutante de
Arabidopsis accelerated cell death 5 (acd5), la cual muestra muerte celular espontnea y un
fenotipo de muerte exacerbado tras la infeccin con un patgeno. Esta mutante acumula ceramida,
ya que presenta actividad disminuida de la ceramida cinasa (CERK) que fosforila la ceramida para
dar ceramida-1-fosfato. Por lo tanto, se demuestra la importancia del balance entre la ceramida y
su derivado fosforilado en la modulacin la muerte celular en plantas (Liang et al., 2003).
Por otro lado, en levaduras, protozoarios y plantas la inositolfosforil ceramida sintasa (IPCS)
cataliza la transferencia de un grupo inositolfosfato del fosfatidilinositol a la ceramida produciendo
inositolfosfatidilceramida (Nagiec et al., 1997). La mutante erh1 acumula ceramida debido a la
reduccin en actividad de la IPCS y muestra acumulacin de cido saliclico, aumento en la
transcripcin del gen de defensa RPW8, espontnea muerte celular tipo HR y reduccin en la
estatura (Wang et al., 2008). De nueva cuenta se demuestra la importancia del balance entre la
ceramida y un derivado, la inositolfosfatidilceramida, en la modulacin de la MCP asociada con
defensa.
En clulas vegetales, se ha evidenciado la participacin de los esfingolpidos como componentes
de balsas lipdicas. La asociacin de esfingolpidos-protenas en estos microdominios
membranales resulta importante para la distribucin lateral de protenas, el trfico celular y la
transduccin de seales (Mongrand et al., 2004; Borner et al., 2005).

16
 INTRODUCCIN

Por otro lado, se ha demostrado la importancia de los esfingolpidos en las etapas de crecimiento
de plantas, ya que se ha probado que la supresin parcial de gen AtLCB1 por RNAi da como
resultado reduccin de tamao en las plantas y alteraciones en la morfologa (Chen et al., 2006).
En la doble mutante sbh1-1 sbh2-1 que no expresa los genes que codifican para las hidroxilasas
de BCL, la ausencia de BCL trihidroxiladas provoca una reduccin de tamao debida a defectos en
la divisin celular (Chen et al., 2008).

3.3. Biosntesis de novo de los esfingolpidos.

La biosntesis de los esfingolpidos comienza en el retculo endoplsmico con la condensacin de
la palmitoil-CoA con la L-serina para producir 3-cetoesfinganina; esta reaccin es catalizada por la
enzima serina palmitoiltransferasa (SPT), que es un heterodmero formado por las subunidades
LCB1 y LCB2. En un segundo paso, la 3-cetoesfinganina es reducida con NADPH va una
oxidoreductasa (3-cetoesfinganina reductasa) para dar esfinganina (Lynch y Dunn, 2004). En una
subsecuente reaccin alterna a la formacin de la ceramida, la esfinganina puede ser fosforilada
por la esfinganina cinasa para formar la esfinganina-1-fosfato. Para la formacin de ceramida el
grupo amino de la esfinganina es acilado mediante un enlace amida, este paso es catalizado por la
enzima esfinganina N-aciltransferasa tambin llamada ceramida sintasa. Posteriormente, las
ceramidas son el sustrato de otras enzimas para la insercin de grupos polares y as formar
esfingolpidos complejos, por ejemplo, mediante la adicin de un residuo de glucosa se forma la
glucosilceramida (CluCer) (Figura 6).
Palmitoil-CoA + Serina
Serina Palmitoiltransferasa (SPT)

3-cetoesfinganina
NADPH
3-cetoesfinganina reductasa

Esfinganina cinasa
Esfinganina Esfinganina-1-fosfato
Acil-CoA
Esfinganina-N-aciltransferasa
(Ceramida sintasa)

Ceramida
Glucosilceramida sintasa
Inositolfosforilceramida sintasa

Glucosilceramida (GluCer) Inositolfosforilceramida (IPC)

Figura 6. Biosntesis de novo de los esfingolpidos (Sperling y Heinz, 2003).

17
 INTRODUCCIN

3.4. Fumonisina B1 como inhibidor de la sntesis de esfingolpidos.

Las fumonisinas son una familia de micotoxinas producidas por Fusarium verticillioides que
frecuentemente contaminan el maz y otros granos. La toxina predominante de este grupo y la ms
potente por su toxicidad es la fumonisina B1 (FB1) (Figura 7) (Desai et al., 2002). La fumonisina B1
es un aminopentol con dos cidos tricarballicos unidos mediante un enlace ster a la cadena
hidrocarbonada.
Esta fumonisina es un potente inhibidor competitivo de la ceramida sintasa, la enzima que cataliza
la acilacin de esfinganina en la biosntesis de novo de los esfingolpidos (Figura 6). Por lo tanto,
la inhibicin de esta enzima altera la sntesis de esfingolpidos produciendo una acumulacin de
BCL (Merrill et al., 1996). Esta inhibicin se debe a las similitudes estructurales que presentan las
BCL y esta micotoxina. De acuerdo al modelo de inhibicin, el aminopentol compite con el sustrato
(las BCL), al mismo tiempo que los cidos tricarballicos interfieren con el enlace del cido graso
acil-CoA (Desai et al., 2002).

Figura 7. Estructura de la fumonisina B1 (Merrill et al., 1996).

Existen evidencias que sostienen este modelo, la primera se refiere a que la potencia con la cual la
FB1 inhibe a la ceramida sintasa es sensible a las concentraciones tanto de las bases esfingoideas
como del cido graso acil-CoA (Merrill et al., 1993). La segunda evidencia se refiere a que la
remocin de los cidos tricarballicos disminuye la potencia de la inhibicin (Humpf et al., 1998).
La tercera contempla que con la remocin de los cidos tricarballicos, la FB1 no es slo un
inhibidor, sino que tambin es sustrato para la acilacin por la ceramida sintasa (Humpf et al.,
1998).

3.5. Relacin de ERO con esfingolpidos.

El grupo de Ausubel report la susceptibilidad de Arabidopsis thaliana a la fumonisina B1 en donde
la exposicin a esta micotoxina produce un fenotipo de muerte celular (Stone et al., 2000). En este
reporte tambin se sugiri que la FB1 estaba funcionando como un evocador de respuestas de

18
 INTRODUCCIN

defensa, ya que se detectaron en las plantas eventos como deposicin de callosa, produccin de
ERO, acumulacin de fitoalexinas y la expresin del gen de defensa PR-1.
En particular, se estableci que la MCP inducida por la FB1 dependa de mltiples vas de
sealizacin como la del cido saliclico, el jasmonato y el etileno (Asai et al., 2000).
Independientemente, se saba que la FB1 al inhibir la ceramida sintasa de la va de sntesis de
novo de esfingolpidos provocaba una acumulacin de BCL (Abbas et al., 1994). Con todos estos
resultados se fue conociendo que la toxina poda estar activando respuestas de defensa. Por lo
tanto, resultaba interesante analizar si exista una relacin entre la acumulacin de BCL y un
parmetro de defensa particular como son las ERO.

En el 2007, se report que al ser expuesta la mutante Atfbr11-1 a la FB1 no se producan ERO y
no se presentaba una MCP (Shi et al., 2007). FBR11-1 codifica para la subunidad LCB1 de la SPT
de la va de sntesis de novo de esfingolpidos, por lo tanto, con la mutacin de este gen la planta
presentaba una atenuada formacin de BCL en respuesta a la exposicin a la toxina. En este
reporte se sugiri que la alteracin en la sntesis de BCL llevaba a la disminucin de produccin de
ERO y finalmente a evitar la muerte celular en la mutante fbr11-1 despus de la exposicin a la
FB1. Hasta este punto las observaciones indicaban que la acumulacin de BCL desencadenaba la
MCP. Adems, en este reporte tambin se dilucid la importancia del balance entre BCL
fosforiladas y no fosforiladas en el proceso de MCP. Los resultados apuntaron a que la
dihidroesfingosina-1-fosfato (dh-S1P) bloquea la generacin de ERO y la muerte celular inducida
por la forma no fosforilada de la BCL (dihidroesfingosina).

19
 ANTECEDENTES INMEDIATOS

III. ANTECEDENTES INMEDIATOS

Existen evidencias experimentales por parte de nuestro grupo de trabajo que demuestran la
relacin entre los esfingolpidos y las respuestas de defensa contra patgenos en tres especies de
plantas.
Sabemos que la exposicin in vivo de los embriones de maz a la fumonisina B1 y a la BCL
esfinganina es capaz de estimular la formacin del radical superxido en las condiciones
experimentales en las que los embriones de maz expresan respuestas de defensa contra
patgenos (Rodrguez, 2006). Tambin se sabe que cuando se presenta la Respuesta de
Hipersensibilidad en frijol, sta se acompaa de la acumulacin de la base de cadena larga
fitoesfingosina y concomitantemente a sta, la aparicin de inmunidad contra un patgeno
(Palacios, 2008). Paralelamente, los resultados en maz y frijol sugieren que las MAP cinasas que
se activan por BCL son las mismas inducidas por patgenos en otras especies vegetales
(Saucedo, 2007). Estos resultados junto con los obtenidos por el grupo del Dr. Plasencia que
muestran que la fumonisina B1 desencadena eventos de defensa contra patgenos como son la
prdida de la integridad del DNA genmico, la activacin de nucleasas especficas (de la Torre,
datos no publicados) y la elevacin de los niveles de cido saliclico (Rivas, 2004), son relevantes
para el entendimiento de los procesos de defensa contra patgenos que se presentan en las
plantas.

20
 JUSTIFICACIN

IV. JUSTIFICACIN

Las evidencias tanto en la literatura como en nuestro grupo sealan una relacin entre los
esfingolpidos y las respuestas de defensa contra patgenos en plantas y adems postulan a las
especies reactivas de oxgeno como un intermediario entre estos dos parmetros. Por ello, es
necesario obtener ms informacin sobre la generacin de estas especies en el contexto de
defensa mediado por compuestos esfingoideos y as contribuir al entendimiento de cmo los
procesos de defensa contra patgenos pueden ser exitosos a travs de la utilizacin de lpidos
sealizadores que involucran la participacin de especies reactivas de oxgeno.
En este estudio se caracteriz con ms detalle la relacin entre la acumulacin de bases de
cadena larga, la formacin de especies reactivas de oxgeno y la muerte celular programada
involucrada en la respuesta de defensa contra patgenos.

21
 JUSTIFICACIN

V. HIPTESIS
La acumulacin de BCL induce la produccin temprana de H2O2 tanto en una respuesta de
inmunidad producida ante un patgeno no-hospedero como en la de interaccin gen por gen.

VI. OBJETIVOS
Objetivo general
Evaluar el papel de las BCL en la produccin in situ de H2O2 en especies de plantas en las que la
muerte celular programada se presenta como mecanismo de defensa contra patgenos.

Objetivos particulares

Evaluar la produccin temporal in situ de H2O2 de las plantas de Phaseolus vulgaris (frijol)
tras la exposicin a fumonisina B1 (FB1) y al patgeno no hospedero Pseudomonas
syringae DC3000 avrRPM1.

Evaluar la produccin in situ de H2O2 en lneas de Arabidopsis thaliana modificadas
genticamente que expresan menores niveles de BCL, tras la exposicin a la cepas
virulenta y avirulenta de Pseudomonas syringae.

Evaluar la produccin in situ de H2O2, tras la exposicin a la cepas virulenta y avirulenta de
Pseudomonas syringae, en la mutante nula de A. thaliana Atmpk6.

Determinar los niveles de BCL en plntulas de A. thaliana (genotipo silvestre Col-0 y
Atlcb2a-1) con y sin tratamiento con FB1 por HPLC/ESI-MS/MS.

Evaluar la produccin in situ de H2O2 en plntulas de A. thaliana (genotipo silvestre Col-0 y
Atlcb2a-1) con y sin tratamiento con FB1.

Determinar la localizacin subcelular del H2O2 en algunas de las condiciones estudiadas

22
 MATERIALES Y MTODOS

I. MATERIALES Y MTODOS

1. Material biolgico.
Diferentes tejidos de dos especies vegetales fueron utilizadas en este estudio: hojas adultas de
Phaseolus vulgaris var. Canario y hojas adultas y plntulas de Arabidopsis thaliana (Figura 8).

A B C

Figura 8. Especies vegetales usadas en este estudio. A, Hoja adulta de Phaseolus vulgaris var.
Canario. B, Hojas de Arabidopsis thaliana de 10 semanas de edad. C, Plntulas de Arabidopsis
thaliana de 3 semanas de edad.

De la especie Arabidopsis thaliana, se emplearon cuatro lneas: una que es la lnea silvestre
(ecotipo Col-0), y otras tres lneas genticamente modificadas de la silvestre: lneas Atlcb2a-1,
Atlcb2b-hp/Atlcb2a y Atmpk6. Estas lneas de Arabidopsis thaliana expresan defectos en la va de
sntesis de esfingolpidos y en la expresin de MAP cinasas (Tabla 1). En el caso de la lnea
Atlcb2a-1, se trata de una mutante en el gen LCB2A, que codifica para la subunidad LCB2A de la
serina palmitoiltransferasa (SPT). La SPT es la enzima que cataliza la primera reaccin de la va
de sntesis de esfingolpidos en plantas (Tamura et al., 2001). En esta lnea, el gen LCB2A ha
sufrido una interrupcin a partir de la insercin de un transposn, dando un gen inactivo que no se
transcribe y que por lo tanto no produce la protena. Sin embargo, en esta lnea, la SPT es an
activa, ya que las funciones de la subunidad LCB2A, que ya no est producida a partir del gen
LCB2A, son suplidas por la subunidad LCB2B, cuyo gen est intacto. La lnea Atlcb2b-hp/Atlcb2a,
se gener a partir de la lnea Atlcb2a, slo que esta lnea adicionalmente tiene la construccin de
una horquilla inducible de RNA para que se aparee con el transcrito del gen LCB2B, anulando as
su funcin de ser traducido a la protena correspondiente. La expresin de esta horquilla
corresponde a un diseo molecular que es inducible por exposicin a la metoxifenozida (MTF).
Este compuesto es el principio activo del insecticida Intrepid, mismo que se aplica por aspersin a
las plantas para que as se induzca la formacin de la horquilla de RNA y con ello, quede tambin

23
 MATERIALES Y MTODOS

suprimida la expresin del gen de la subunidad LCB2B (Dietrich, et al., 2008). En el caso de la
lnea Atmpk6, el gen correspondiente a la protena MAP cinasa 6 se ha silenciado por un RNA de
interferencia, de manera que esta lnea no expresa a esta protena (Tabla 1).

Tabla 1. Lneas de Arabidopsis thaliana utilizadas en este proyecto.

Gen
Nombre Clasificacin Fenotipo
alterado

Niveles normales de BCL y

WT Col-0 Silvestre Ninguno
de esfingolpidos complejos

Homciga de la lnea de
Niveles normales de
Atlcb2a-1 insercin de T-DNA Salk- LCB2A
esfingolpidos complejos
061472

Homciga de la mutante
Atlcb2b-hp/Atlcb2a Atlcb2a transformada con la
construccin lcb2b-hairpin
Atmpk6 SALK-127507-35.X
- Metoxifenozida
LCB2A Niveles normales de
esfingolpidos complejos
+ Metoxifenozida
Disminucin en la sntesis
LCB2A de esfingolpidos. (A los 7
LCB2B post-induccin las BCL se
reducen 36 %)
(Dietrich et al., 2008)
Niveles normales de BCL
MPK6
Niveles nulos de AtMPK6

Las lneas de Arabidopsis thaliana Atlcb2a-1 y Atlcb2b-hp/Atlcb2a fueron generadas y

generosamente proporcionadas por el Dr. Edgar B. Cahoon, del Donald Danforth Plant Science
Center, St. Louis Missouri, EE.UU. La lnea Atmpk6 fue generada y amablemente proporcionada
por el Dr. Arturo Guevara del Instituto de Biotecnologa de la UNAM.

24
 MATERIALES Y MTODOS

2. Cultivo de lneas de Arabidopsis thaliana.

1.- Las semillas se colocaron en un tubo eppendorf y se les agreg 1 mL de una solucin
comercial de NaHClO4 (Cloralex) 20 % (estril) y 1 L de Tween 20 (cf 0.1 %). Se agitaron
vigorosamente por 20 min.
2.- Posteriormente, las semillas se lavaron con la solucin de NaHClO4 al 20 % por 10 min con
agitacin suave.
3.- El tubo con las semillas se centrifug por aproximadamente 10 s en una minifuga y se elimin
el sobrenadante con una micropipeta utilizando puntas estriles.
4.- Las semillas se enjuagaron varias veces (mnimo 5 veces) cada vez con 1 mL de agua estril y
con agitacin por 30 s hasta eliminar completamente el NaHClO4 y el Tween 20. Cada vez se
centrifug en una minifuga por 10 s y se elimin el sobrenadante con una micropipeta. Despus
del ltimo lavado se agreg agar 0.1 % en agua (solucin estril) procurando que la solucin
cubriera totalmente a las semillas, para que stas quedaran suspendidas y pudieran depositarse,
con ayuda de la punta de una micropipeta, sobre el agar slido de las cajas de petri.
5.- Las semillas desinfectadas se sembraron en cajas de Petri conteniendo medio estril
Gamborgs B-5, Agar 1 % y sacarosa 1 %.
El medio de Gamborg se prepar de la manera siguiente:
Para 1 L de medio
- Gamborg 3.2 g/L. Se us el preparado comercial de Gamborg B-5 (Basal Medium with
minimal organics) de SIGMA, No. de catlogo G5893
- Agar 1 %
- Sacarosa 1 %
6. Las cajas con las semillas sembradas se cubrieron con aluminio y se mantuvieron por 48 h a 4
C, posteriormente, se pasaron a una cmara de incubacin a 22 C con un fotoperodo de 16 h
oscuridad/ 8 h de luz.
7. A las 2 o 3 semanas se utilizaron las plntulas para realizar los experimentos.
8.- En el caso de las plantas de Arabidopsis thaliana despus de 2 semanas, las plntulas se
trasplantaron a macetas con una mezcla de sustratos hidratados con agua estril.
Mezcla de sustratos: 3 partes de Sunshine Mix 4,1 parte de vermiculita y 1 parte de agrolita.

3. Cultivo de Frijol (Phaseolus vulgaris variedad Canario 60).

1. Las semillas de frijol se desinfectaron con una solucin de etanol al 70 % agitando a
temperatura ambiente por 1 min, despus se enjuagaron con agua destilada varias veces.

25
 MATERIALES Y MTODOS

2. Posteriormente, se adicion a las semillas una solucin de hipoclorito de sodio comercial

(Cloralex) NaHClO4 1 %, se agitaron y se dej reposar a temperatura ambiente por 10 min. Se
enjuagaron las semillas con agua destilada hasta que desaparece el olor a cloro.
3. Las semillas se colocaron en agua destilada y se dejaron reposar 2 h a temperatura ambiente.
4. Se colocaron las semillas, sin enterrarlas, en una charola con agrolita humedecida, procurando
que el hilio quedara en contacto con el sustrato.
5. Se tap la charola con papel aluminio haciendo unos pequeos agujeros en el papel. Se incub
a una temperatura de 25-29 C hasta que las semillas germinaron (aproximadamente 5 das).
Durante el tiempo transcurrido se reg diariamente con agua destilada cada 24 h.
6. Una vez que germinaron las semillas, cada una de las plntulas se transfiri a un vaso de
plstico lleno de agrolita hmeda y se regaron diariamente alternando con H2O y medio de
Hoagland-Arnon (Ver Apndice), hasta que alcanzaron una edad de 4 a 5 semanas.

4. Exposicin de tejidos a condiciones en las que se expresan modificaciones en los

niveles endgenos de BCL.
Se realiz la deteccin in situ de H2O2 en condiciones experimentales en las que los niveles
endgenos de bases de cadena larga se modifican y hay una repercusin sobre la manifestacin
de la muerte celular. Estas condiciones fueron: la exposicin a fumonisina B1, la exposicin al
patgeno avirulento Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 avrRPM1 (Pst DC3000 avrRPM1),
exposicin al patgeno virulento Pseudomonas syringae DC3000 (PSt DC3000 vir) y el empleo de
lneas de Arabidopsis con niveles de BCL disminuidos (Atlcb2a-1 y Atlcb2b-hp/Atlcb2a) y el empleo
de una lnea que no presenta a la MPK6 (Atmpk6).

4.1. Infiltracin de las hojas de Frijol con MgCl2, FB1 y el patgeno no hospedero (Pst
DC3000 avrRPM1).
Se tomaron plantas de frijol (Phaseolus vulgaris) de 4 a 5 semanas de edad que tuvieran de 3 a 4
trifolios totalmente extendidos con un color verde homogneo y apariencia sana. Para cada
condicin de estudio se seleccionaron dos trifolios provenientes de diferentes plantas y se
realizaron cuatro infiltraciones por hoja.
Reactivos
Solucin de MgCl2 10 mM estril
Solucin de FB1 (Sigma Chemical Co, St Louis, MO) 10 M disuelta en agua estril.
Suspensin de bacterias. Pseudomonas syringae pv. Tomato DC3000 avrRPM1 (Pst DC3000
avrRPM1) 1 x 108 UFC/mL.

26
 MATERIALES Y MTODOS

Procedimiento
1. Se limpi la superficie de las hojas a infiltrar.
2. Se realizaron las infiltraciones con jeringas de plstico de 1 mL sin aguja. Para ello se aplic
presin con la jeringa sobre la hoja en la superficie abaxial infiltrando aproximadamente 20 L de
la solucin de estudio en los intersticios celulares del tejido. Se procur realizar las infiltraciones en
la parte central de la hoja evitando tocar las nervaduras principales. Para cada tratamiento se
realizaron cuatro infiltraciones por hoja, en cada hoja de dos trifolios de plantas independientes.
3. Se sec la superficie donde se infiltr para eliminar el excedente.

Tabla 2. Tratamientos de infiltracin utilizados en foliolos de Phaseolus sp.

Tratamiento Concentracin

Fumonisina B1 (FB1) 10 M.

Pst DC3000 avrRPM1 1 x 108 UFC/mL

Como control se utiliz MgCl2 10 mM estril.

4. La recoleccin de las hojas de frijol se realiz a los siguientes tiempos post infiltracin: 0+ (justo
despus de la infiltracin), 1, 4, 8, 24, 48 h, 6 y 11 d.
5. Al trmino del tiempo de tratamiento requerido se hicieron los cortes de discos de 1 cm en la
zona de infiltracin. Para cada tratamiento se cortaron entre 16-20 discos y se llev a cabo un
registro fotogrfico para poder evaluar el fenotipo.
6. Posteriormente se realiz la deteccin de perxido de hidrgeno in situ con DAB en los 16-20
discos.

4.2. Infiltracin de las hojas adultas de Arabidopsis thaliana con MgCl2, FB1, el patgeno
avirulento (Pst DC3000 avrRPM1) y el patgeno virulento (Pst DC3000 vir).
1. Se seleccionaron plantas de A. thaliana de 10 semanas de edad con apariencia sana. Se
utilizaron diferentes lneas con y sin tratamiento con el inductor MTF, como se puede
apreciar en la Tabla 3. La induccin con la MTF se realiz asperjando el Intrepid disuelto
en agua estril (1/5000, v/v) en la superficie de todas las hojas. Cuatro das despus de la
induccin se realiz la infiltracin.

27
 MATERIALES Y MTODOS

Tabla 3. Das post-induccin con MTF en las tres diferentes lneas de Arabidopsis
thaliana.
Das post-induccin
Lnea de Arabidopsis thaliana
con MTF
WT Col-0 0

Atlcb2a-1 4

Atlcb2b-hp/Atlcb2a 0

Atlcb2b-hp/Atlcb2a 4

Atmpk6 0

2. Se infiltraron las hojas en el envs con 20 L del tratamiento deseado (Tabla 4), utilizando una
jeringa de insulina graduada y sin aguja. Se aplic una ligera presin sobre la hoja de tal manera
que sta no se rompiera y para que la solucin penetrara en los intersticios intercelulares del
tejido. Se realiz un punto de infiltracin en la parte lateral de cada una de las hojas.

Tabla 4. Tratamientos de infiltracin utilizados en hojas de A. thaliana

Tratamiento Concentracin
Control (H2O) --
FB1 10 M

Tratamiento Concentracin

Control (MgCl2) 10 mM

Pst DC3000 avrRPM1 1 x 108 UFC/mL

Pst DC3000 vir 1 x 108 UFC/mL

3. Por tratamiento se recolectaron 3 hojas (cada una de una planta independiente) a los siguientes
tiempos post infiltracin: 0+ (justo despus de la infiltracin), 4, 12, 24, 48, 72, 96 h y 7 das.
4. Posteriormente se realiz la deteccin de perxido de hidrgeno in situ con DAB.

28
 MATERIALES Y MTODOS

4.3. Exposicin de las plntulas de Arabidopsis thaliana silvestres y mutantes Atlcb2a-1

a FB1.
1. Se germinaron, en cajas de Petri de 4 cm de dimetro, semillas de plantas silvestres y mutantes
Atlcb2a-1 de Arabidopsis thaliana en mallas (63 micras de abertura de poro) sobre medio slido de
Gamborg. Durante el crecimiento de las plntulas el fotoperodo fue de 16 h.
2. Las plntulas de tres semanas de edad se transfirieron, en la malla donde fueron crecidas, a
medio de Gamborg lquido con FB110 M y a medio sin la toxina como control. La exposicin a la
FB1 se llev a cabo durante 0, 4, 12, 24, 48 y 72 h con fotoperodo continuo.
3. Una vez concluido el tiempo de tratamiento, se realiz la deteccin del perxido de hidrgeno in
situ con DAB.

5. Deteccin in situ de perxido de hidrgeno.

El ensayo seleccionado para la deteccin in situ de perxido de hidrgeno fue el descrito por
Thordal-Christensen H. et al., (1997) y fue modificado para adecuarlo a nuestros tres modelos de
estudio.
La tcnica de tincin con 3,3-diaminobencidina (DAB) se basa en la formacin de un precipitado
caf rojizo al contacto del H2O2 con el reactivo DAB. Para poder detectar el precipitado formado es
necesario decolorar el tejido vegetal.

Reactivos
Solucin 3,3-diaminobencidina DAB 1 mg/mL (Sigma-Aldrich D5637-1G) pH 3.8. Ajustar el pH con
NaOH (utilizar este reactivo fresco).
Etanol grado industrial.
Medio de hidratacin Glicerol/H2O/cido actico (70/20/10 v/v/v).

Procedimiento
1. Se seleccionaron hojas o plntulas de A. thaliana o P. vulgaris que fueron tratadas de acuerdo a
las condiciones que se describieron anteriormente. Posteriormente:
a) Las hojas adultas de A. thaliana se cortaron e inmediatamente se introdujeron cada una en un
tubo eppendorf de 2 mL con la solucin de DAB, procurando que toda la hoja quedara inmersa en
la solucin. Se realiz este tratamiento durante 2 h.
b) Las plntulas de A. thaliana se transfirieron a una caja de Petri de 4 cm de dimetro y se
sumergieron totalmente en la solucin de DAB por 2 h.

29
 MATERIALES Y MTODOS

HIPERTINCIN. Despus del tratamiento con DAB durante 2 h, las plntulas se transfirieron a un
vaso de precipitados con 20 mL de etanol + 1 mL de DAB. Se mantuvieron en estas condiciones
durante 48 h.
c) Los discos de P. vulgaris fueron sumergidos completamente en la solucin de DAB por 2 h.
2. Al terminar el tratamiento con DAB, los tejidos vegetales se sumergieron en etanol al 96 % en
ebullicin (74 C), hasta que quedaran completamente decolorados. Las plntulas se decoloraron
en aprox. 10 min, las hojas de Arabidopsis en 10 min y los discos de frijol en 20 min.
3. Una vez que los tejidos fueron decolorados completamente se sacaron del etanol y se colocaron
en una caja de petri con el medio de hidratacin. En la Figura 9 se observan los controles
negativos de los tejidos utilizados en este estudio, es decir, los tejidos que no tuvieron tratamiento
de infiltracin con los patgenos o la FB1 antes de la deteccin de H2O2 con DAB.
4. En todos los casos de exposicin a las diferentes condiciones experimentales, se llev un
registro fotogrfico de los tejidos tratados. Este registro de imgenes se realiz con una cmara
Moticam 352 acoplada a un microscopio de diseccin Zeigen. El procesamiento de las imgenes
se realiz con el programa Motic Images Plus 2.0 ML, Image J y iPhoto Plus.

A B C D E

Figura 9. Controles negativos de los tejidos vegetales utilizados en este trabajo. Se muestran los tejidos
vegetales utilizados en este trabajo despus del tratamiento de deteccin de H2O2 con DAB sin
infiltracin previa. (A) Disco de P. vulgaris, (B) Hoja silvestre Arabidopsis, (C) Hoja Atlcb2a-1, (D) Hoja
Atmpk6, (E) Hoja Atlbc2b-hp/Atlcb2a.

6. Localizacin subcelular del H2O2 formado en respuesta a la FB1 y el patgeno P.

syringae DC3000 avrRPM1 en P. vulgaris y A. thaliana.
Tejidos vegetales, tanto de Arabidopsis como de P. vulgaris, de algunas de las condiciones
analizadas que haban sido mantenidos en el medio de hidratacin fueron examinados con un
fotomicroscopio Olympus Provis Modelo AX70.

30
 MATERIALES Y MTODOS

7. Deteccin y cuantificacin de bases de cadena larga por HPLC fase reversa acoplada a
espectrometra de masas con ionizacin por electroaspersin.

7.1. Crecimiento de plntulas de A. thaliana genotipo silvestre y mutante Atlcb2a-1.

1. Se germinaron semillas de A. thaliana genotipo silvestre y mutante Atlcb2a-1 sobre una malla
(63 m de abertura de poro) en cajas de petri de 14 cm de dimetro en medio de crecimiento
slido Gamborg, con fotoperodo de 16 h durante 2 semanas.
2. Se expusieron las plntulas silvestres y Atlcb2a-1 de 2 semanas de edad a la fumonisina B1,
transfiriendo la malla donde se crecieron las plntulas a un medio de crecimiento slido de
Gamborg con o sin FB1 10 M. Los tiempos de exposicin fueron de 0, 1, 4, 8, 12 y 72 h con
fotoperiodo continuo.
3. Una vez concluido el tiempo de exposicin a la FB1, las plntulas se congelaron con nitrgeno
lquido y se liofilizaron hasta que el tejido quedara completamente seco y se guardaron a -70
C en la medida de lo posible, si bien en el envo a EE.UU., parte de las muestras estuvieron a
temperatura ambiente de 24 a 48 h.

7.2. Extraccin de lpidos de plntulas de Arabidopsis thaliana.

La extraccin de muestras obtenidas con los siguientes tratamientos se realiz por
quintuplicado y de acuerdo al protocolo descrito por Markham y Jaworsky (2007).

Arabidopsis thaliana genotipo Silvestre Col-0.

Tratamiento Tiempos
Sin FB1 0, 1, 4, 8, 12, 72 h
FB1 10 M 0, 1, 4, 8, 12, 72 h

Arabidopsis thaliana genotipo mutante Atlcb2a-1

Tratamiento Tiempos
Sin FB1 0, 1, 4, 8, 12, 72 h
FB1 10 M 0, 1, 4, 8, 12, 72 h

Aproximadamente 30 mg del tejido seco se colocaron en un mortero de vidrio DUAL de 3 mL

(Kontes 885450-0021) y se aadieron 3 mL de la mezcla de solventes isopropanol-agua-hexano
(55/25/20 v/v/v) y se agregaron exactamente 10 L del estndar interno de esfingolpidos (BCL &
BCL-P). Se moli manualmente con el mortero hasta homogeneizar completamente.

31
 MATERIALES Y MTODOS

Posteriormente, la muestra se transfiri a un tubo de 10 mL enjuagando el mortero con 3 mL de la

mezcla de solventes de extraccin para transferir el total de la muestra. Se incub la muestra
durante 15 min a 60 C seguida de una centrifugacin a 500 x g durante 10 min. Despus de la
centrifugacin, el sobrenadante se transfiri a un segundo tubo y se volvi a realizar la extraccin
aadiendo 3 mL de la mezcla de solventes al pellet obtenido, de nuevo se enjuag el tubo con 3
mL de la mezcla de solventes y se incub a 60 C por 15 min y se centrifug por 10 min a 500 x g.
Se junt al sobrenadante con el obtenido anteriormente para despus secar la muestra bajo un
flujo de nitrgeno y a 50 C. Una vez que se obtuvo el extracto seco se agreg 1.4 mL de la
mezcla 70 % monometilamina/ 30 % agua y 0.6 mL de agua. La muestra se incub a 50 C
durante 1 h y posteriormente se sec bajo un flujo de nitrgeno y a 50 C. Se aadi 1 mL de la
mezcla tetrahidrofurano/metanol/agua (50/20/30 v/v/v) + 0.1 % cido frmico y se disolvi
perfectamente en vortex y sonicando. Finalmente se centrifug a 500 x g durante 10 min y se
tomaron aproximadamente 500 L para transferirlos a un vial y realizar el anlisis.

La deteccin y cuantificacin de bases de cadena larga por HPLC fase reversa acoplada a
espectrometra de masas con ionizacin por electroaspersin fue llevada a cabo en el Donald
Danforth Plant Science Center por el Dr. J. Markham segn el procedimiento descrito en Markham
et al. (2006) y Markham y Jaworsky (2007).

32
 RESULTADOS

I. RESULTADOS

1. Deteccin in situ de H2O2 en hojas de Phaseolus vulgaris expuestas a la fumonisina B1 y

al patgeno no hospedero Pseudomonas syringae DC3000 avrRPM1.
Para evaluar la temporalidad de la produccin de H2O2 y relacionarla con el fenotipo de HR, se
realiz una cintica de exposicin de hojas de P. vulgaris a la fumonisina B1 y a la bacteria Pst
DC3000 avrRPM1. Es conveniente hacer notar que el diseo experimental seguido incluy para
cada condicin el procesamiento de muestras provenientes de por lo menos 2 plantas, en las que
se trataron 6 hojas de 2 trifolios independientes y exponiendo 4 zonas de cada hoja al tratamiento
correspondiente. De esa manera se llegaron a tener entre 16 y 20 discos para cada tratamiento
por experimento. Los discos que se muestran en la Figura 10, son representativos de cada una de
las condiciones experimentales probadas. Es importante sealar que en todos los casos, se
present el mismo patrn de produccin de H2O2 en el total de los discos utilizados para la
deteccin in situ en cada tratamiento.
Como se observa en la Figura 10, en el caso de la hojas infiltradas con MgCl2, en el tiempo de
0+hpi (horas post infiltracin), que corresponde a la muestra tomada inmediatamente despus del
momento de la infiltracin de la solucin, se observ la formacin del precipitado caf-rojizo
especficamente en el sitio de la infiltracin. Esta coloracin puede interpretarse como una
produccin de H2O2 localizada en el sitio de la herida. Una hora despus de la infiltracin, se
observ una disminucin en la tincin en la zona de la herida. A partir del siguiente tiempo de
muestreo, que fue el de 4 hpi, el precipitado rojizo ya no se detect prcticamente y esto se
observ an hasta los 11 das posteriores a la infiltracin. La progresin de la formacin del H2O2
tras la infiltracin con el MgCl2 se puede comparar con las imgenes fotogrficas respectivas de
las hojas originales antes de ser tratadas para revelar la formacin de H2O2. Puede observarse que
a las 0+h el tejido mostr una clara lesin en el sitio de infiltracin y que es la zona que se ti
claramente. Despus de este tiempo, el rea no mostr dao en el tejido, excepto hasta los 6 y 11
dpi, en los que las imgenes respectivas muestran una marca en la superficie de la hoja con una
forma que semeja la huella de la jeringa en el sitio de infiltracin. En estos casos, no hubo
formacin de H2O2 en ese sitio.
En el caso del tratamiento con la fumonisina B1, al tiempo de 0+ hpi se detect la formacin de
H2O2 exclusivamente en la zona de la herida ocasionada al momento de la infiltracin. Despus de
1 h de tratamiento se redujo la tincin en el rea de la herida. En los discos que corresponden a
los tiempos de 4 y 8 hpi se present una ligera tincin que se intensific a las 24 hpi. En los
tiempos de 48 hpi, 6 y 11 dpi fue clara la tincin positiva al DAB en la zona de infiltracin.

33
 RESULTADOS

0+ h 1h 4h 8h 24 h 48 h 6d 11 d

MgCl2
FB1
DC3000 avrRPM1
Figura 10. Efecto de la FB1 y del patgeno Pst DC3000 avrRPM1 en la produccin de H2O2 en hojas de P. vulgaris. Para cada condicin se infiltraron
dos trifolios provenientes de plantas independientes y se realiz la infiltracin en cuatro puntos por hoja con MgCl2 10 mM como control, FB1 10 M y Pst
8
DC3000 avrRpm1 1 x 10 UFC/mL. En los tiempos indicados se realiz la deteccin in situ de H2O2 con DAB en discos cortados de las hojas expuestas
a los tratamientos. Se muestra un resultado representativo de 16 discos analizados en 2 experimentos independientes. Todas las imgenes de los
discos decolorados fueron contrastadas por igual al 0.05 % con el programa Image J.

34
 RESULTADOS

En las fotografas que corresponden al fenotipo de cada condicin se puede observar que al tiempo
de 0+hpi la zona del tejido recin infiltrado con la FB1 se present translcida y posteriormente el
tejido no mostr dao evidente hasta las 48 hpi, cuando se observ muerte celular en el contorno de
la zona infiltrada. En los tiempos de 6 y 11 dpi se observ una zona necrtica localizada y restringida
al sitio de infiltracin con la FB1 y que coincidi con el rea de tincin positiva al DAB.
Con respecto a lo ocurrido con la infiltracin del patgeno no hospedero P. syringae DC3000
avrRPM1, en la Figura 10 se muestra la presencia de H2O2 en el rea del tejido que fue daada al
momento de la infiltracin con la jeringa. Al tiempo de 1 hpi, la formacin del precipitado en la zona de
infiltracin se redujo, mientras que en los tiempos de 4, 8 y 24 hpi se detect la formacin del
precipitado, que corresponde a la presencia de H2O2 en la zona que fue infiltrada con el patgeno. De
manera ms evidente, a tiempos largos de 48 hpi, 6 y 11 dpi se detect la tincin positiva al DAB
justamente en la zona que corresponda a la lesin. En las fotografas que presentan el fenotipo a los
diferentes tiempos de tratamiento con la bacteria se puede observar que inicialmente la zona del
disco recin infiltrada se present translcida y que despus de 1 hpi el tejido se recuper y no
mostr seal de dao en los tiempos posteriores de 4 y 8 hpi. A las 24 hpi con el patgeno, se
observ una lesin en el tejido y la tincin correspondiente a la formacin de H2O2 en la zona daada.
A los tiempos largos de 48 hpi, 6 y 11 dpi, donde la tincin con DAB fue muy intensa, se observ
muerte celular localizada en los sitios de infiltracin en los discos de las hojas.
Al comparar el fenotipo con ambos tratamientos se encontraron similitudes hasta las 8 h, pues a las
24 h se observ una lesin causada por la inoculacin del patgeno y no por la FB1. Al tiempo de 48
h aunque la lesin fue evidente con el tratamiento de FB1, la que present el disco inoculado con el
patgeno fue una muerte ms avanzada que persiste en los tiempos posteriores. A los 6 y 11 d la
progresin de la lesin fue similar para ambos tratamientos.
En cuanto a la generacin de H2O2, tambin se encontraron comportamientos semejantes. En los
tiempos iniciales de 0+ y 1 hpi, los discos infiltrados con ambos tratamientos se comportaron igual
que el control (MgCl2). Posteriormente, en los tiempos de 4, 8 y 24 hpi la generacin de H2O2 en los
discos expuestos a la FB1 fue menor que con la infeccin bacteriana a estos mismos tiempos Sin
embargo, a partir de las 48 hpi la magnitud de la tincin fue semejante y la zona teida se present
consistentemente en el rea afectada por los tratamientos.

35
 RESULTADOS

2. Deteccin in situ de H2O2 en hojas de tres lneas de Arabidopsis thaliana expuestas a un

patgeno avirulento o virulento.
En el sistema de hojas de plantas adultas de A. thaliana , el objetivo fue evaluar la temporalidad de
produccin de H2O2 en una relacin incompatible y una compatible en lneas modificadas
genticamente para expresar variaciones en el contenido de los niveles endgenos de BCL o evitar la
expresin de la MPK6.
As como se utiliz la FB1 como una estrategia experimental para acumular BCL, se recurri a una
lnea de A. thaliana que es una mutante silenciable en LCB2B (lnea Atlcb2b-hp/Atlcb2a) (Dietrich et
al., 2008), la cual al ser expuesta a la MTF disminuye su contenido tanto de esfingolpidos complejos
como de sus precursores. En este sistema se evalu el perfil de la produccin de H2O2 en
condiciones en las que se tienen disminuidas las BCL. Las plantas controles de la lnea mutante
silenciable de A. thaliana fueron las del genotipo Col-0 silvestre y las de la lneas Atlcb2a-1 (con MTF)
y Atlcb2b-hp/Atlcb2a (sin MTF).
Para ello se infiltraron las hojas adultas de las plantas antes referidas as como las de la lnea Atmpk6
con MgCl2 (tratamiento control), el patgeno avirulento Pst DC3000 avrRPM1 o el patgeno virulento
Pst DC3000 vir. Despus de transcurridos los tiempos de tratamiento a partir de la infiltracin (0+, 4,
12, 24, 48, 72, 96 h y 7d) se recolectaron 3 hojas infiltradas provenientes de 3 plantas diferentes para
cada condicin y se realiz la deteccin de H2O2 con DAB. En el caso de la lnea Atlcb2b-hp/Atlcb2a
en la que se indujo el silenciamiento con MTF y de la lnea Atlcb2a-1, la infiltracin del MgCl2 o de los
patgenos siempre se hizo a los 4 d de haber sido aplicada la MTF. A las plantas de la lnea Atlcb2b-
hp/Atlcb2a que fungieron como controles se les aplic agua en el mismo tiempo que el de adicin de
la MTF.
En la Figura 11 se presentan los resultados de los tratamientos de infiltracin con los patgenos en
las hojas de plantas silvestres de A. thaliana que fueron la referencia de comparacin con respecto a
las mutantes con las que se trabaj. Al tiempo inicial de 0+hpi, justo despus de la inoculacin
bacteriana, las hojas se observaron sanas y al ser tratadas segn el procedimiento de deteccin de
H2O2 no se encontr el precipitado caf rojizo en ninguno de los tres tratamientos.
A las 4 y 12 hpi se observaron resultados similares; a estos tiempos no se detect lesin fsica en las
hojas control ni en las hojas infiltradas con ambos patgenos; sin embargo, se observ una clara
produccin de H2O2 exclusivamente con el patgeno avirulento, en la zona donde fue infiltrado.
Despus de 24 h de la infiltracin, no se observ lesin fsica en las hojas tratadas con el MgCl2 y en
las inoculadas con el patgeno virulento; sin embargo, fue perceptible una ligera lesin que se
observ como una zona ms oscura en la hoja infiltrada con el patgeno avirulento. En cuanto a la
presencia del H2O2, se sigui detectando slo la tincin correspondiente a la generacin de H2O2 en la
zona afectada por el patgeno avirulento.

36
 RESULTADOS
MgCl2 DC3000 avrRpm1 DC3000 vir MgCl2 DC3000 avrRpm1 DC3000 vir

48 h
0h+

72 h
4h

12 h 96 h

7d

24 h
Figura 11. Efecto del patgeno avirulento (Pst DC3000 avrRPM1) y del patgeno
virulento (Pst DC3000 vir) en la produccin de H2O2 en hojas de A. thaliana
silvestres (Col-0). Todas las imgenes de la tincin con DAB fueron contrastadas
por igual al 0.05 % con el programa Image J. 37
 RESULTADOS

En los tiempos de 48, 72 y 96 hpi las hojas con el tratamiento control mostraron una apariencia fsica
sana, en contraste, se apreci una lesin en el rea afectada tanto por el patgeno avirulento como
con el virulento. Esta lesin se intensific gradualmente en transcurso de estos tiempos largos
analizados hasta llegar al tiempo final estudiado de 7 dpi, cuando se observ un rea de muerte del
tejido vegetal en el tratamiento con ambos patgenos. En los tiempos de 48, 72 y 96 hpi, una intensa
tincin en presencia de DAB se detect consistentemente en la zona que present muerte. En el
tiempo correspondiente a los 7dpi ya no se realiz la tincin con DAB porque nuestro inters era ver
la evolucin de la lesin causada por los patgenos.
Los mismos tratamientos (MgCl2, el patgeno avirulento Pst DC3000 avrRPM1 o el patgeno virulento
Pst DC3000 vir) fueron aplicados en hojas de las mutantes Atlcb2a-1 y Atlcb2b-hp/Atlcb2a con y sin
exposicin a la MTF, mostrndose los resultados en la Figura 12. No se muestran los resultados
obtenidos con la lnea Atlcb2a-hp/Atlcb2a sin MTF, debido a que se observ el mismo
comportamiento que en la otra lnea control, la Atlcb2a-1 con MTF. Ambas condiciones fueron los
controles del tratamiento de la lnea Atlcb2a-hp/Atlcb2a con MTF.
En todos los tratamientos explorados al tiempo inicial de 0+hpi, se observ que todas las hojas de la
mutante Atlcb2a-1 y Atlcb2b-hp/Atlcb2a a las que se les aadi el inductor del silenciamiento del gen
LCB2B, presentaban una apariencia sana y sin acumulacin de H2O2, a excepcin de una ligera
tincin en la hoja infiltrada con el patgeno avirulento en la mutante Atlcb2b-hp/Atlcb2a +MTF.
En un tiempo posterior de 4 hpi, en las lneas control Atlcb2a-1 +MTF y Atlcb2a-hp/Atlcb2 -MTF no se
detect ninguna lesin en las hojas control ni en las expuestas a los patgenos. Sin embargo, la
tincin del H2O2 en la zona de infiltracin slo fue evidente en la condicin de infiltracin con el
patgeno avirulento a este tiempo.
En cuanto a la mutante Atlcb2a-hp/Atlcb2 inducida con MTF, a las 4 hpi las hojas infiltradas con el
patgeno avirulento presentaron una notable prdida de turgencia en contraste con las hojas control y
las infectadas con el patgeno virulento. Para este tiempo no se present la formacin del precipitado
del H2O2 en el tratamiento control y con la exposicin al patgeno virulento; sin embargo, despus de
la exposicin al DAB, la hoja tratada con el patgeno avirulento mostr tincin en una zona ms
extensa al de la infiltracin.
A las 12 hpi, la mutante Atlcb2a-1 continu mostrando produccin de H2O2 tras la infiltracin del
patgeno avirulento an y cuando no se observaba una lesin fsica en la hoja ni con este patgeno
ni con MgCl2 o el patgeno virulento. En contraste, la lnea Atlcb2a-hp/Atlcb2 inducida, a las 12 hpi
present lesiones generalizadas en toda la hoja despus del tratamiento con el patgeno avirulento.
En esta condicin se observ una produccin de H2O2 en algunas zonas a lo largo de la nervadura
central. A este tiempo (12 hpi) la hoja infiltrada con el patgeno virulento mostr una lesin lejana a la
zona de infiltracin acompaada de tincin. Posteriormente, al tiempo de 24 hpi, en la lnea Atlcb2a-1

38
 RESULTADOS
Atlcb2a-1 Atlcb2b hp/Atlcb2a+MTF
MgCl2 DC3000 avrRPM1 DC3000 vir
MgCl2 DC3000avrRPM1 DC3000vir

0+ h
0+ h

4h
4h

12 h
12 h

24 h

24 h

39
 RESULTADOS

Atlcb2a-1 Atlcb2b hp/Atlcb2a + MTF

MgCl2 DC 3000 avrRPM1 DC3000 vir
MgCl2 DC3000avrRPM1 DC3000 vir

48 h
48 h

72 h
72 h

Figura 12. Efecto del patgeno avirulento (Pst DC3000 avrRPM1) y del
patgeno virulento (Pst DC3000 vir) en la produccin de H2O2 de hojas
mutantes Atlcb2a-1 y Atlcb2b-hp/Atlcb2a. Despus de 4 das de
exposicin a la MTF las lneas Atlcb2a-1 y Atlcb2b hp/Atlcb2a fueron
infiltradas con MgCl2 como control, Pst DC3000 avr RPM1 y Pst
DC3000 vir. En los tiempos indicados se realiz la deteccin de H2O2
con DAB. Todas las imgenes de la tincin con DAB fueron
contrastadas por igual con un 0.05 % con el programa Image J.
96 h

7d

40
 RESULTADOS

el tratamiento con el patgeno avirulento provoc una lesin y esta misma zona present tincin
despus del tratamiento con DAB.
La mutante inducida Atlcb2a-hp/Atlcb2 que fue infiltrada con el patgeno avirulento mostr, a las 24
hpi, prdida de turgencia y muerte celular en la zona superior de la hoja y despus de la reaccin con
DAB, se present tincin en el rea que fenotpicamente mostr ms dao.
Las hojas de Atlcb2a-1 tratadas con MTF como control y las de Atlcb2a-hp/Atlcb2 sin MTF que
fueron infiltradas con los patgenos avirulento y virulento presentaron un comportamiento similar en
los tiempos de 48, 72 y 96 hpi, cuando se pudo observar la progresin de la muerte del tejido debido
a los tratamientos con los patgenos (se muestran slo los resultados para la lnea Atlcb2a-1). A
estos tiempos, la tincin con DAB revel que hubo presencia de H2O2 en la zona que corresponde a
la muerte del tejido. En las fotografas del tiempo de 7 dpi se muestran solamente los fenotipos de las
hojas infiltradas para ver el avance de la lesin causada tanto por el patgeno avirulento como por el
virulento. En todos estos tiempos, las hojas de las mismas lneas pero infiltradas con MgCl2
permanecieron ntegras fenotpicamente. Por otra parte, en cuanto a la lnea Atlcb2b-hp/Atlcb2
inducida, a las 48 hpi, el control infiltrado con MgCl2 s mostr lesiones, la hoja tratada con el
patgeno avirulento manifest una prdida clara de turgencia y el tratamiento con el patgeno
virulento desencaden clorosis generalizada en prcticamente toda la hoja. A este tiempo, despus
de la tincin con DAB, la hoja con el tratamiento de MgCl2 present tincin en algunas zonas. En
contraste, las hojas tratadas con los patgenos se observaron totalmente teidas. El ltimo tiempo
registrado fenotpicamente para esta mutante fue el de 72 hpi, ya que a este tiempo fue evidente la
muerte del tejido despus del tratamiento con los patgenos, y no se realiz la deteccin de perxido
a este tiempo porque las hojas presentaron un dao muy avanzado.
La Figura 13 se presentan los resultados de los experimentos realizados en la lnea Atmpk6. Es
posible observar que el estado inicial de las hojas justo despus de la infiltracin (0+h) de MgCl2, o de
los patgenos avirulento o virulento fue muy similar, ya que no hubo signos de lesin o de tincin con
DAB. A las 4 hpi, no se detect lesin en ninguna de las hojas con los tratamientos. Sin embargo, en
la hoja expuesta al patgeno avirulento se desencaden la produccin de H2O2, que se observ como
una tincin justo en la zona de infiltracin. A las 12 hpi fue evidente una ligera lesin en la hoja
infiltrada con el patgeno avirulento, y esta misma zona present el precipitado caf-rojizo. A las 24
hpi la hoja tratada con el patgeno avirulento mostr una lesin acompaada de tincin de H2O2. A
este tiempo, se detect una ligera coloracin despus de la tincin con DAB, en la hoja tratada con el
patgeno virulento sin que sta presentara lesin fenotpica. En un siguiente tiempo de 48 hpi fue
muy clara la zona de clorosis en el tejido infiltrado con el patgeno avirulento y esta misma zona
present una intensa coloracin despus del tratamiento de deteccin de H2O2. A este tiempo el

41
 RESULTADOS
MgC l2 DC3000 avrRPM1 DC3000 vir MgCl2 DC3000 avrRPM1 DC3000 vir

0h
48 h

4h
72 h

12 h
96 h

7d

24 h
Figura 13. Efecto del patgeno avirulento (Pst DC3000 avrRPM1) y del
patgeno virulento (Pst DC3000 vir) en la produccin de H2O2 de hojas de la
mutante Atmpk6. Todas las imgenes de la tincin con DAB fueron
contrastadas por igual con un 0.05 % con el programa Image J. 42
 RESULTADOS

patgeno virulento desencaden una tincin positiva al DAB en la zona que fenotpicamente
present prdida de turgencia y una coloracin ms oscura.
A las 72 hpi con ambos patgenos por separado, se hizo evidente en la regin foliar la clorosis y
presencia de tincin positiva de DAB. A las 96 hpi, el fenotipo de la hoja infectada con el patgeno
avirulento se observ con clorosis en la zona de infiltracin mientas que la hoja infiltrada con el
patgeno virulento present una extensa y progresiva zona de muerte celular. De nueva cuenta,
las zonas que se presentaron afectadas fueron teidas con el DAB.
En el tiempo final de 7 dpi solo se presentan las imgenes correspondientes al fenotipo ya que se
observ una muerte celular muy avanzada en los tratamientos con los patgenos.

43
 RESULTADOS

3. Efecto de la FB1 en la produccin de H2O2 en hojas de plantas silvestres y mutantes

Atlcb2a-1 de A. thaliana.
Para evaluar la produccin del H2O2 en respuesta a la acumulacin de BCL, se infiltraron hojas de
plantas adultas silvestres y de la mutante Atlcb2a-1 con FB1. Se realiz la tincin con DAB en
hojas expuestas a la toxina o al H2O como control a tiempos de 0+, 1, 4, 12, 24, 48, 72 h y 6 d, los
resultados se muestran en la Figura 14. A tiempos cortos de exposicin a la FB1 (0+ a 48 h), no se
detect presencia del precipitado caf. A las 72 h, la hoja infiltrada con el H2O no present lesin
en la zona de infiltracin y no se detect H2O2, la hoja expuesta a la FB1 present una clorosis
ligera en la zona de infiltracin y despus de la tincin con DAB se detect precipitado en la zona
correspondiente a la lesin observada.
Se realiz el seguimiento de estos tratamientos hasta 6 d en donde se observ claramente un rea
de tejido muerto en la zona de infiltracin en la hoja que fue tratada con la toxina.

WT Atlcb2a-1

72 h

6d

C FB1 C FB1

Figura 14. Efecto de la FB1 en la produccin de H2O2 en hojas de A. thaliana (silvestres y Atlcb2a-1). Hojas
de plantas silvestres y Atlcb2a-1 fueron infiltradas con H2O como control y FB1 10 M. La infiltracin se
realiz en la parte lateral izquierda de la hoja. Al tiempo de 72 h se realiz la deteccin de H2O2 mediante la
tincin con DAB. Se muestran tambin los fenotipos a los tiempos sealados. Las imgenes de la tincin con
DAB fueron contrastadas por igual al 0.05 % con el programa Image J.

A las 72 h de tratamiento con la FB1, en la mutante Atlcb2a-1 se observ que no hubo lesin en la
zona de infiltracin ni deteccin de H2O2. En esta mutante, despus de 6 d de tratamiento con la
FB1 la hoja mostr algunas zonas de muerte en el rea del tejido que fue infiltrado.

44
 RESULTADOS

4. Deteccin y cuantificacin de bases de cadena larga por HPLC fase reversa acoplada a
espectrometra de masas con ionizacin por electroaspersin.
Con el objeto de asociar los niveles de BCL con la formacin in situ de H2O2 en un sistema en el
que se facilitara la identificacin y cuantificacin de las BCL, se estableci un sistema de plntulas
de A. thaliana expuestas a la FB1. Las plntulas utilizadas en este estudio fueron las silvestres
(ecotipo Col-0) y las de la lnea Atlcb2a-1, una mutante en el gen LCB2A, que codifica para una
subunidad de la SPT. La cuantificacin de BCL libres se realiz en extractos obtenidos de 5 lotes
independientes de plntulas de A. thaliana silvestres (Col-0) y mutantes Atlcb2a-1 con y sin
exposicin a FB110 M a diferentes tiempos. En el anlisis por HPLC/ESI-MS/MS se cuantificaron
en total diez BCL: esfinganina (d18:0), esfingosina (d18:1), esfingadienina (d18:2), fitoesfingosina
(hidroxiesfinganina) (t18:0), hidroxiesfingenina (t18:1) y sus derivados fosforilados respectivos
(d18:0-P; d18:1-P; d18:2-P; t18:0-P; t18:1-P). En la Figura 15 se muestran solamente los perfiles
de acumulacin de las BCL d18:0, t18:0 y sus derivados fosforilados (d18:0-P y t18.0-P), ya que
estas especies presentaron las acumulaciones ms significativas tras la exposicin a la FB1.
De acuerdo a lo que se presenta en la Figura 15A y en la Tabla 4, la acumulacin de la d18:0 se
detect desde la primera hora de tratamiento de las plntulas con la FB1 en las dos lneas
analizadas (2.1 veces en la silvestre y 1.5 veces en la lnea Atlcb2a-1) y continu con un patrn
creciente, mostrando la mxima acumulacin en el ltimo tiempo analizado (72 h).

Tabla 4. Acumulacin de bases de cadena larga en plntulas de A. thaliana silvestres (Col-0) y en

la mutante Atlcb2a-1. Se muestra la acumulacin de las BCL d18:0, d18:0-P, t18:0 y t18:0-P,
expresada como el cociente de la relacin del contenido de cada BCL en las plntulas expuestas a
la FB1 entre el contenido de la misma BCL de las plntulas control (que no fueron expuestas a la
toxina).

d18:0-P FB1/ t18:0-P FB1/

d18:0 FB1/ d18:0 t18:0 FB1/ t18:0
d18:0-P t18:0-P
Tiempos
WT Atlcb2a- WT WT WT Atlcb2a-
Atlcb2a-1 Atlcb2a-1
Col-0 1 Col-0 Col-0 Col-0 1

1h 2.08 1.46 2.33 2.02 2.45 1.53 2.33 1.76

4h 12.13 1.14 36.52 13.36 16.99 3.27 41.62 20.21
8h 49.52 4.63 183.96 3.95 31.45 8.88 62.76 34.49
12 h 58.52 3.42 310.26 63.85 30.09 8.59 91.42 50.31
72 h 346.83 56.66 5775.63 214.47 77.10 17.23 687.81 192.13

45
 RESULTADOS

Sin embargo, a partir de las 4 h de tratamiento con la toxina, la acumulacin de esta BCL fue ms
evidente en las plntulas silvestres en comparacin a lo ocurrido en la lnea mutante Atlcb2a-1.
Como se muestra en la Tabla 4, en el tiempo de 4 h, el incremento de la esfinganina en las plantas
silvestres fue de 12.1 veces mientras que para la mutante Atlcb2a-1 fue de 1.1 veces. La
acumulacin fue aumentando claramente pero fue hasta las 72 h, cuando el incremento de
esfinganina detectado fue muy notable, siendo de 346.8 veces con respecto al control en el caso
de las plntulas silvestres, y de 56.7 veces en el caso de la Atlcb2a-1.
En cuanto a la d18:0-P (Figura 15B) la temporalidad de la acumulacin de esta BCL en presencia
de la FB1, que con respecto a sus controles, sigui un patrn similar a lo ocurrido con la d18:0. Sin
embargo, el derivado fosforilado alcanz, a partir de las 4 h, niveles de acumulacin mayores que
para la d18:0 y para las otras especies analizadas, siendo las acumulaciones de 36.5, 184, 310.3
veces para la lnea silvestre a los tiempos de 4, 8 y 12 h, respectivamente. En contraste con los
resultados obtenidos en las plntulas silvestres tratadas con la FB1, las plntulas mutantes que
recibieron el mismo tratamiento, mostraron acumulaciones de d18:0-P menores a las 4, 8 y 12 h
cuando se detectaron incrementos de 13.4, 4 y 63.9 veces con respecto al control. La mxima
acumulacin de d18:0-P se present a las 72 h tanto para la silvestre (5776 veces) cmo para la
mutante Atlcb2a-1 (214 veces). Es importante destacar, como se observa en la Tabla 4, que de
todas las BCL analizadas, la d18:0-P fue la que present los mayores niveles de acumulacin a
partir de las 8 h para las plntulas silvestres y a partir de las 12 h en el caso de la lnea mutante
Atlcb2a-1. De igual manera, al comparar el contenido de t18:0 en las plntulas con y sin exposicin
a la FB1, se encontr que hubo acumulacin de esta BCL tanto en la silvestre como en la lnea
Atlcb2a-1 a partir de 1 h de tratamiento con la toxina. Como se puede observar en el panel C de la
Figura 15, la acumulacin de la t18:0 fue mayor en las plntulas silvestres expuestas a FB1 que en
las mutantes con este mismo tratamiento en todos los tiempos analizados.
Es importante mencionar que, como se observa en la grfica (Figura 15 Panel C), los valores
absolutos de contenido de t18:0 son casi de la misma magnitud a partir de las 4 h de tratamiento
con la toxina en ambos genotipos; a diferencia de lo que ocurre con la d18:0, en donde los
incrementos en el caso de las plantas silvestres son significativamente mayores. Al tomar en
cuenta los datos de la Tabla 4, se observa que los incrementos de t18:0 en las plntulas silvestres
fueron mayores al de las mutantes, ya que se alcanzaron valores de acumulacin de 31.5, 30.1 y
77.1 veces con respecto al control a los tiempos de a las 8, 12 y 72 h, respectivamente, para la
silvestre y en el caso de la mutante a estos mismos tiempos se obtuvieron valores de 8.9, 8.6 y
17.2 veces. El contenido de t18:0-P tanto en las plntulas silvestres como en las mutantes
expuestas a la FB1 fue muy similar desde la primera hora hasta el tiempo de 12 h mientras que a

46
 RESULTADOS
A Esfinganina (d18:0) B Esfinganina fosfato (d18:0-P)
250
250
200 WT
200 WT
WT + FB1 WT + FB 1
150
150 Atlcb2a-1 Atlcb2a-1
Atlcb2a-1 + FB 1 100 Atlcb2a-1 + FB1
100
50
50

10 4

0.20
3 0.16

mmol/ g peso seco

mmol/ g peso seco
0.12

5 2 0.08

0.04

1 0.00
0 1

0 0
0 1 4 8 12 72 0 1 4 8 12 72

mmol/g peso seco

mmol/ g peso seco

Tiempo (h) Tiempo (h)

C Fitoesfingosina (t18:0) D Fitoesfingosina fosfato (t18:0-P)

250 250

200 WT 200
WT + FB 1 WT
150 150 WT + FB1
Atlcb2a-1
Atlcb2a-1
Atlcb2a-1 + FB1 100
100 Atlcb2a-1 +FB 1

50
50

20
1

15

mmol/ g peso seco

mmol/ g peso seco

10 0

0 0

mmol/g peso seco

0 1 4 8 12 72 0 1 4 8 12 72
mmol/ g peso seco

Tiempo (h) Tiempo (h)

Figura 15. Cuantificacin de BCL en plntulas de A. thaliana lneas silvestre y mutante Atlcb2a-1 a diferentes tiempos. Se cuantificaron por HPLC/ ESI-
MS/MS las BCL libres d18:0 (A), d18:0-P (B), t18:0 (C) y t18:0-P (D). La extraccin se realiz a partir de 5 lotes independientes de plntulas silvestres
(Col-0) y Atlcb2a-1 con y sin exposicin a FB1 10 M a los tiempos indicados.

47
 RESULTADOS

las 72 h la acumulacin fue mayor en las silvestres. De nueva cuenta, como se observa en la
Tabla 4, los incrementos referidos al control fueron mayores para el genotipo silvestre llegando a
una acumulacin mxima de 687.8 veces a las 72 h en contraste con 192.1 veces para el caso de
la mutante Atlcb2a-1.

5. Efecto de la FB1 en la produccin de H2O2 en A. thaliana (plntulas silvestres y Atlcb2a-1).

Una vez que se estableci el perfil de acumulacin de las BCL analizadas en las plntulas de las
lneas mencionadas y bajo los tratamientos control o con FB1, se detect el H2O2 mediante la
tincin con DAB, en el sistema de plntulas para poder relacionar ambos eventos. En este
experimento se monitorearon los mismos tiempos que en la cuantificacin de BCL (0, 1, 4, 12, 72
h) y adicionalmente se incluyeron los tiempos de 24 y 48 h para poder evaluar si se registraban
cambios en la produccin de H2O2. En la Figura 16A se muestran los controles (0 h) que no se
expusieron a la toxina y solamente fueron tratados con DAB. Estas plntulas manifestaron
caractersticas saludables y el procesamiento con el DAB no revel formacin de H2O2.

A
WT Atlcb2a-1

0h

Figura 16A. Controles negativos de las plntulas de A. thaliana WT y Atlcb2a-1. Plntulas de 2-3
semanas de edad fueron teidas con DAB sin previa exposicin a la FB1, se muestran fenotipos
de cada condicin.

En los tiempos correspondientes a 1, 4, 12 y 24 h no se observaron diferencias entre las plntulas

expuestas a la FB1 y sus controles; por lo tanto slo se muestra un tiempo representativo, el de 12
h (Figura 16B). En este tiempo, las plntulas de ambos genotipos, se observaron sanas despus
del tratamiento con FB1, al igual que los controles. Con respecto a la deteccin de H2O2 tampoco
se detectaron diferencias en las condiciones probadas, las plntulas se observaron
homogneamente decoloradas y sin presencia de H2O2. A las 48 h, las plntulas silvestres sin FB1
presentaron un fenotipo sano en contraste con las tratadas con la FB1 que mostraron clorosis en
algunas de las hojas. Despus de la tincin con DAB las plntulas control no presentaron
precipitado caf rojizo, en contraste con lo que ocurri en las que fueron expuestas a la FB1, en

48
 RESULTADOS
B
WT Atlcb2a-1

C FB1 C FB1

12 h

48 h

72 h

Figura 16B. Efecto de la FB1 en la produccin de H2O2 en plntulas de A. thaliana (silvestres y Atlcb2a-1).
Plntulas de 2 a 3 semanas de edad, de las lneas WT (Col-0) y Atlcb2a, se transfirieron a un medio con y
sin FB1 10 M. A las 12, 48 y 72 h de exposicin se realiz la deteccin de H2O2 por el mtodo de tincin con
DAB. Se muestra el fenotipo para cada condicin.

49
 RESULTADOS

donde se observ tincin de las hojas. A este mismo tiempo de 48 h, la lnea mutante Atlcb2a-1
present un fenotipo de clorosis en algunas de las hojas de las plntulas tratadas con la FB1, y el
resultado despus de la tincin con DAB fue una ligera formacin de precipitado en algunas de las
hojas. A las 72 h se observ en las plntulas silvestres tratadas con la FB1 un fenotipo de clorosis
en las hojas y generacin de H2O2. Por otra parte, a este mismo tiempo en la mutante Atlcb2a-1
tambin se observ clorosis en algunas hojas y una ligera tincin de las hojas despus del
tratamiento de deteccin de H2O2. Con el afn de observar mejor las diferencias entre las plntulas
silvestres y Atlcb2a-1 tras el tratamiento con FB1, se procedi a realizar la tincin de H2O2
exponiendo las plntulas al reactivo DAB por ms tiempo.

WT Atlcb2a-1

C FB1 C FB1

48 h

72 h

Figura 17. Hipertincin con DAB para detectar el efecto de la FB1 en la produccin de H2O2 en plntulas
de A. thaliana (WT y Atlcb2a-1). Plntulas de 2 a 3 semanas de edad, de las lneas WT (Col-0) y
Atlcb2a, se transfirieron a un medio con y sin FB1 10 M. A las 48 y 72 h de exposicin se realiz la
deteccin de H2O2 por el mtodo de hipertincin con DAB.
50
 RESULTADOS

Se trabaj de nuevo con los mismos tiempos analizados que en las condiciones normales de
tincin y de nueva cuenta no se encontraron diferencias en los tiempos iniciales. Sin embargo, en
los tiempos de 48 y 72 h, se detectaron con ms claridad las diferencias en la tincin con DAB
entre las plntulas silvestres y Atlcb2a-1 (Figura 17).
Con estas nuevas condiciones de tincin a las 48 y 72 h se observ que los controles, tanto de las
plntulas silvestres como las de la lnea Atlcb2a-1, no presentaron tincin en las hojas; sin
embargo, con esta tincin prolongada se tieron las races de estas plntulas. Despus del
tratamiento con FB1 en las plntulas silvestres se detect una coloracin homognea en las hojas
y races de estas plntulas, en ambos tiempos. En contraste, la mutante Atlcb2a-1 present
coloracin pero solamente en algunas de las hojas de las plntulas expuestas a la toxina.

6. Localizacin subcelular del H2O2 formado en respuesta a la FB1 y el patgeno P.

syringae DC3000 avrRPM1 en P. vulgaris y A. thaliana.
Para explorar la localizacin celular de H2O2 en los diferentes tratamientos y sistemas probados en
este estudio, se examinaron al fotomicroscopio algunas de las muestras de frijol y Arabidopsis
teidas con DAB.En la Figura 18 se muestran las fotomicrografas de hojas de plantas silvestres
de A. thaliana que fueron expuestas a MgCl2 (Figura 18A), o al patgeno avirulento (Figura 18B, C,
D) durante 18 h.

A B C

D E F

Figura 18. Localizacin subcelular de H2O2 en hojas de A. thaliana. El H2O2 fue detectado con la tincin
con DAB en hojas de A. thaliana WT despus de los siguientes tratamientos: (A) 18 hpi MgCl2 10 mM,
8
(B) (C) (D) 18 hpi Pst avrRPM1 1 x 10 UFC/mL y (E) (F) 4 dpi FB1 10M.

51
 RESULTADOS

En la Figura 18A se observaron clulas bien delimitadas y estructuras subcelulares refringentes,

que por su tamao y localizacin alrededor de la membrana plasmtica corresponden a
cloroplastos; en este tratamiento no se percibi la tincin con el DAB. Los paneles C y D (Figura
18) corresponden a acercamientos del panel B. En la Figura 18 B, C y D se distinguieron
estructuras teidas con el precipitado de H2O2, que por su morfologa y localizacin son
cloroplastos. Por otra parte, en los paneles E y F de la Figura 18, se muestran las imgenes de
una hoja de Arabidopsis tratada con la FB1 durante 4 d, a este tiempo se observ el precipitado
caf en los espacios intercelulares y una prdida de integridad en las clulas.

En cuanto al frijol, en el panel A de la Figura 19 se puede observar la imagen que corresponde al

tratamiento con MgCl2 despus de 11 d en el cual las clulas se mostraron ntegras y no
presentaron tincin con el DAB. En esta imagen se observan clulas bien definidas que presentan
cloroplastos. En los paneles B y C de la Figura 19 se muestra lo detectado para las muestras
expuestas a la FB1 durante 11 d. Aqu la tincin revela la presencia de las clulas ms por la
coloracin de los espacios intercelulares que por el contorno de la clula misma, en las cuales ya
no se observan claramente los cloroplastos y ms bien los espacios en donde estaban las clulas
parecen estar vacos.

A B C

Figura 19. Localizacin subcelular de H2O2 en hojas de P. vulgaris. El H2O2 fue detectado con la tincin con
DAB en hojas de P. vulgaris despus de los siguientes tratamientos: (A) 11 dpi MgCl2 10 mM, (B) (C) 11 dpi
FB1 10 M.

52
 DISCUSIN

I. DISCUSIN
1. La FB y el patgeno no hospedero Pseudomonas syringae inducen en Phaseolus
vulgaris la produccin in situ de H2O2 con temporalidades semejantes y en ocasiones a
incrementos en BCL endgenas.
La FB1 induce respuestas de defensa contra patgenos que incluyen lesiones similares a las de
HR (Stone et al., 2000; Palacios, 2008). Debido a que la produccin de ERO tambin se presenta
como una de las primeras respuestas de defensa ante el ataque de patgenos (Bolwell and
Wojtaszek, 1997; Lamb and Dixon, 1997; Wojtaszek, 1997), se evalu en hojas de frijol si tanto el
patgeno Pst DC3000 (avrRPM1) como la FB1 inducan la formacin de H2O2 con un patrn
semejante, y si esta cintica estaba relacionada con el perfil de acumulacin temporal de BCL
detectada en presencia de la FB1 o del patgeno en esta misma especie vegetal (Palacios, 2008).

1.1. Generacin in situ de H2O2 tras la infiltracin de FB1.

Los resultados presentados en este trabajo indican que en las hojas de frijol tratadas con la FB1
hay una ligera produccin de H2O2 a las 4 y 8 hpi y una formacin ms tarda y de mayor magnitud
que se presenta a partir de las 24 h. Sin embargo, mientras la tincin positiva al DAB puede
corresponder al precipitado de H2O2 a las 24 y 48 hpi, la coloracin observada a los tiempos de 6 y
11 d pudiera corresponder a una tincin inespecfica entre el DAB y algn compuesto de la hoja.
Adems, no es posible determinar si la coloracin observada despus de las 48 h aument en la
misma proporcin hasta llegar a los 6 d. Comparando este perfil de formacin de H2O2 con el de
acumulacin de la fitoesfingosina en hojas de frijol expuestas a la FB1, se apreciaron incrementos
de la BCL a los tiempos tempranos de 0.5, 1 y 4 h y a tiempos largos de 24 hpi (Palacios, 2008).
Sin embargo, esta BCL no fue la nica que manifest aumentos, pues se detectaron otras dos BCL
putativas (que no fueron identificadas por los estndares de referencia empleados, pero posean
caractersticas de extraccin y polaridad muy parecidas a las de las BCL fitoesfingosina,
esfinganina y esfingosina). Por ejemplo, una de las BCL no identificadas y designada como pico B,
present una acumulacin mxima al tiempo de 1 hpi. Por lo tanto, no se puede descartar que
alguna(s) de las tres incluyendo la fitoesfingosina, contribuya al patrn observado de produccin
de H2O2. La comparacin de los tiempos de generacin de H2O2 y de acumulacin de BCL en P.
vulgaris, sugiere que los aumentos de fitoesfingosina (y/o alguna otra BCL) a las 0.5 y 1 h estaran
sealizando la produccin de H2O2 observada a las 4 y 8 h. Estos resultados estn en
concordancia con el trabajo de Shi et al. (2007), quienes observaron en plntulas silvestres de
Arabidopsis thaliana una acumulacin de BCL 1 h despus del tratamiento con la FB1 y
subsecuentemente, despus de 3-6 h una produccin de ERO, con lo cual estos autores

53
 DISCUSIN

concluyeron que los aumentos tempranos de BCL eran la seal para inducir la produccin de ERO.
La cuantificacin de BCL usada por ese grupo fue mucho ms sensible (ESI-MS/MS) que la que se
utiliz en nuestro laboratorio (HPLC), por lo cual pudieron detectar incrementos ms grandes a
tiempos tempranos, identificando algunas BCL acumuladas a las 6 h despus del tratamiento con
FB1 como esfinganina, fitoesfingosina, esfinganina fosfato y fitoesfingosina fosfato, que
presentaron acumulaciones respecto al control de 162, 144, 77 y 12 veces, respectivamente.
Mientras que en el caso de frijol, los incrementos determinados fueron de 1.9 veces con respecto a
l control a las 0.5 y 1 hpi y 2.18 veces a las 4 hpi. Adems de diferencias en la sensibilidad de la
cuantificacin de BCL es posible que la magnitud de la acumulacin de BCL y su temporalidad
difieran ligeramente entre frijol y Arabidopsis por ser especies diferentes y diferentes estados de
desarrollo.
En reportes recientes en los que se ha puesto de manifiesto la asociacin BCL-defensa-MCP (HR),
las bases que se han visto acumuladas son varias especies libres que incluyen tanto a las formas
fosforiladas como a las no fosforiladas (Shi et al., 2007). A este respecto, es importante sealar
que se ha reportado que existen varias BCL que pueden actuar como sealizadores. Un ejemplo
es la participacin de la esfingosina-1-fosfato y la fitoesfingosina-1-fosfato en la regulacin de la
apertura de los estomas demostrado en Commelina communis y Arabidopsis thaliana (Ng et al.,
2001; Cursol et al., 2005).
Con respecto a la temporalidad entre la acumulacin de BCL y la generacin de ERO a tiempos
intermedios post-infiltracin, se determin la mxima acumulacin de fitoesfingosina (2.7 veces
con respecto al control) en el tiempo de 24 hpi, seguida de una disminucin a las 48 h.
Concomitantemente, se observ una intensa tincin positiva al DAB a las 24 y 48 hpi. El gran
aumento de las BCL podra llevar a una elevacin significativa de estas especies en membranas
intracelulares como las del cloroplasto y la mitocondria, perturbando en estas organelas funciones
membranales que generan ERO (Siskind, 2005; Siskind et al., 2005; Elrick et al., 2006). En este
caso, las BCL estaran participando ms que como sealizadoras, con una funcin de
desestructuracin membranal que ya sera propia de la fase ejecutora de muerte celular (Siskind,
2005; Siskind et al., 2005; Elrick et al., 2006). En apoyo a la propuesta anterior estn las
determinaciones del ndice Fotosinttico que revelaron una disminucin progresiva desde las 4
hasta las 48 hpi con la FB1 y el patgeno avirulento (Gavilanes y Zavaleta, no publicado). El
reporte de Shi et al. (2007) no da informacin sobre estos tiempos, ya que aunque determin BCL
a los tiempos de 1, 6, 12 y 24 h solamente detect ERO al tiempo de 6 h de exposicin a la FB1,
por lo cual no es posible comparar nuestros efectos con su trabajo. Sin embargo, es posible que a

54
 DISCUSIN

estos tiempos intermedios aquellas pocas clulas que ya estn colapsadas puedan presentar una
tincin inespecfica (no reportada hasta nuestro conocimiento) dando una reaccin positiva al DAB.

1.2. Generacin in situ de H2O2 tras la infiltracin de P. syringae DC3000 (avrRPM1).

Al infiltrar la bacteria Pst DC3000 (avrRPM1) en hojas de frijol se explor la cintica de produccin
de H2O2 en un sistema en el que a) se presenta resistencia no hospedera, pues Pst DC3000
(avrRPM1) no causa enfermedad en Phaseolus vulgaris y b) se haba detectado previamente un
aumento en los niveles de fitoesfingosina en presencia de este patgeno (Palacios, 2008). En este
caso, los resultados de deteccin in situ de H2O2 mostraron que el patgeno indujo una
acumulacin de H2O2 en las hojas de frijol a partir de 4 hpi, lo cual podra corresponder a la
acumulacin del compuesto B, la BCL putativa, la cual fue mxima despus de 1 hpi de la bacteria,
ya que la acumulacin de la fitoesfingosina se detect hasta las 5 y 24 h. Nuevamente, a
semejanza de lo que se observ con la FB1, la cintica de formacin de H202 mostr un claro
aumento a las 24 y a las 48 hpi, que en consonancia con el patrn producido por la FB1 podra
corresponder o bien a la formacin de ERO como consecuencia del aumento masivo de BCL en
endomembranas o bien a una tincin inespecfica del DAB en algunas clulas que ya alcanzaron la
muerte.
Adems de plantear la secuencia entre la acumulacin temprana de BCL y la produccin de ERO,
Shi et al. (2007) reportaron que ambos eventos conducan a la expresin fenotpica de muerte
celular que se presenta en Arabidopsis a las 22-24 h despus del tratamiento con la FB1. Si bien
en este sistema la deteccin de la muerte celular se realiz mediante la tincin con azul de Evans,
en nuestro sistema de frijol, el fenotipo de muerte celular empez a ser evidente visualmente en
las plantas a las 24 h de la infiltracin de la bacteria y a las 48 h despus del tratamiento con la
fumonisina. Esta expresin fenotpica de la muerte localizada en la regin de infiltracin es
congruente con la produccin temprana (4-8 h) de H2O2, misma que en las plantas tratadas con el
patgeno fue claramente perceptible y sostenida desde tiempos cortos, en comparacin con lo que
ocurri con las plantas tratadas con la FB1 en donde la produccin de esta ERO fue en menor
intensidad. Lo anterior sugiere que una mayor produccin de H2O2 conduce a una muerte celular
ms exacerbada.
En el contexto de la muerte celular relacionada con la inmunidad, el trabajo de Takahashi et al.
(2009) demostr que la biosntesis de novo de esfingolpidos juega un papel importante en la
resistencia ante un patgeno no hospedero. Este estudio se enfoc en la participacin de la serina
palmitoiltransferasa (SPT) en hojas de Nicotiana benthamiana en donde se estableci que la
sobreexpresin del gen LCB2, que codifica para una de las subunidades de la enzima SPT,

55
 DISCUSIN

provocaba la muerte celular. En dicho trabajo tambin se observ que la expresin de NbLCB2 se
induca tras la infeccin con el patgeno no hospedero Pseudomonas cichorii. Basndose en esta
evidencia y en las del trabajo presente, resulta razonable proponer que la biosntesis de
esfingolpidos es necesaria para desencadenar respuestas de defensa contra patgenos no
hospederos; y si bien el trabajo de Takahashi et al. (2009) no pudo correlacionar la manifestacin
de muerte con los niveles de BCL, pues no pudieron determinar estos compuestos, el trabajo de
Palacios (2008) logr establecer su cintica de acumulacin y los resultados de la determinacin
de H202 de esta tesis complementan la participacin de BCL en la defensa contra patgenos no
especficos de hospederos. Adems, estudios previos de nuestro laboratorio han evidenciado la
participacin de las BCL en respuestas de defensa y que han consistido en que a) plantas de frijol
infiltradas con FB1 presentaron resistencia al ataque de un patgeno (Palacios, 2008), b) cultivos
celulares de Arabidopsis thaliana mostraron una estimulacin en la formacin de 02.- y H2O2 ante la
exposicin a FB1 o a patgenos (Rodrguez, 2007) y c) una MAPK que participa en rutas de
sealizacin inducidas por patgenos es activada en presencia de FB1 (Saucedo, 2007). Los
resultados de las determinaciones de BCL y ERO que fueron realizadas por nuestro grupo de
trabajo, revelan eventos temporales secuenciales en cuanto a la acumulacin de BCL, la
produccin de H2O2 y la manifestacin de una muerte celular similar a la HR. En conjunto los
resultados apoyan la hiptesis de que la acumulacin de BCL induce la produccin de H2O2 y esta
conduce a una muerte celular manifestada en un contexto de inmunidad contra patgenos.

2. La reduccin en la produccin de H2O2 est asociada a la disminucin en la sntesis de

BCL en la respuesta de defensa contra patgenos mediada por la interaccin gen por gen.
En el sistema de Arabidopsis se tiene un ejemplo de la interaccin gen por gen, ya que con el
patgeno avirulento el mecanismo molecular de reconocimiento se basa en la interaccin de la
protena RPM1, codificada por el gen de resistencia Rpm1 presente en la planta, con la
correspondiente protena codificada por el gen de avirulencia avrRPM1 del patgeno (Kim et.al.,
2008). Una de las respuestas de defensa que se desencadenan durante esta interaccin es la
produccin de ERO, que se presenta con una cintica bifsica: una primera fase transitoria y una
segunda sostenida y de mayor amplitud (Orlandi et al., 1992; Lamb y Dixon, 1997). En hojas
silvestres de Arabidopsis se detect la produccin de H2O2 desde las 4 hpi, que junto con lo que se
observa a las 12 hpi, puede corresponder a la fase sostenida de produccin de ERO en la
respuesta incompatible, ya que a estos tiempos la infeccin con el patgeno virulento no
desencaden la produccin de esta ERO. Es posible que la fase inicial, que se presenta a tiempos

56
 DISCUSIN

muy tempranos, casi inmediatos a la aparicin del estmulo, no pudo ser detectada debido a que
su intensidad es baja y la sensibilidad de la tcnica de formacin in situ de H2O2 no es alta.
A tiempos largos, iguales o posteriores a las 24 h, cuando fue evidente la muerte celular en el
tejido vegetal con el tratamiento tanto con el patgeno avirulento como el virulento, hubo una
generacin exacerbada de H2O2. En este caso, el H2O2 que se detect localizadamente con la
tincin puede estar relacionado con un fenmeno de estrs oxidativo que se desencadena para o
por la muerte celular que estn experimentando las clulas de la regin en colapso, misma de la
que pudieran ser responsables BCL endgenas acumuladas que perturban la estructura y la
funcin de organelas generadoras de ERO (mitocondrial, cloroplasto, peroxisomas). Otro de los
procesos que podra explicar esta aparicin de ERO sera la actividad de peroxidasas productoras
de H2O2 involucradas en la lignificacin de la pared celular, misma que puede preceder a la muerte
celular (Smirnoff, 2005). En este contexto, se puede afirmar que lo que se observ sobre la
formacin de H2O2 a los tiempos de 4 a 12 h en la lnea silvestre de Arabidopsis ilustra lo que se ha
reportado que ocurre tpicamente en la interaccin compatible y en la incompatible y que por lo
tanto, el modelo elegido de planta y patgenos es adecuado para recrear las interacciones entre
estos dos organismos y que constituye un sistema de referencia para comparar y analizar los
resultados con lneas mutantes en genes que inciden en los niveles celulares de BCL.

De acuerdo al resultado de Carmona (2008, no publicado), la mutante Atlcb2b-hp/ Atlcb2a tratada

con la MTF reduce los niveles de transcrito del gen LCB2B en un 35 a 40 % desde 1.5 d post
induccin hasta el ltimo tiempo analizado (4 das post-induccin). Asimismo, se ha reportado en
esta mutante la reduccin del 36 % en el contenido de BCL totales despus de 7 das de induccin
(Dietrich et al., 2008). En este escenario, al realizarse la infeccin bacteriana en esta mutante, a
los 4 das post-induccin con la MTF, se puede asumir que las plantas ya presentaban una
reduccin en los niveles de transcrito del gen LCB2B, por consiguiente, una reduccin en la
formacin de BCL y consecuentemente, una disminucin en la sntesis de novo de esfingolpidos.
Para evaluar la formacin in situ de H2O2 en esta lnea silenciada (Atlcb2b-hp/Atlcb2a), era
imperiosa la comparacin con las plantas silvestres y las de la lnea mutante Atlcb2a-1, mismas
que fungieron como controles de la lnea mutante silenciable, pues ambas constituyen los fondos
genticos sucesivos sobre los cuales se fue generando la mutante. Se observ que a tiempos
cortos de 4 y 12 hpi, la lnea silenciada no present la produccin de H2O2 en la zona infiltrada con
el patgeno avirulento, misma que s se present en las plantas controles mencionadas. Este
resultado es muy importante, pues hasta el momento no hay reportes que sugieran que las BCL
tambin estn involucradas en la MCP-HR que se presenta en la respuesta de inmunidad gen por

57
 DISCUSIN

gen, por lo que estos resultados indican la implicacin de las BCL en la produccin de ERO
durante este tipo de interaccin.
Otro aspecto interesante es que en esta mutante Atlcb2b-hp/Atlcb2a, bajo condiciones de
silenciamiento se observ una aceleracin de la muerte celular, especialmente en las hojas que
fueron inoculadas con el patgeno avirulento, detectndose desde las 4 hpi la prdida de turgencia
en toda la hoja y un desarrollo rpido de la lesin hasta que a las 72 hpi se present la muerte en
toda la hoja. Estos son signos de que hay prdida de integridad membranal y prdida de solutos
intracelulares (Pike et al., 1998; 2005). El fenotipo temprano de muerte se hizo evidente en
comparacin con los controles infiltrados con MgCl2, o con el patgeno avirulento en las lneas
silvestre, Atlcb2a-1 o Atlcb2b-hp/ Atlcb2a sin induccin. Por esta razn, incluso en algunas de las
hojas infiltradas con el tratamiento control o a tiempos muy tempranos se present tincin con el
DAB en las zonas donde se observ fenotpicamente la muerte del tejido. Sin embargo, esta
tincin se present en toda la hoja y no coincidi con el sitio de infiltracin. Es presumible que en la
mutante silenciada las clulas estn experimentando un deterioro que las conduce a la muerte
celular debido a la progresiva deplecin de esfingolpidos complejos (Dietrich et al., 2008). La
seal del DAB en este caso puede deberse a un estrs oxidativo que se produce en el proceso de
muerte o bien a la generacin en estas circunstancias, de un compuesto que reaccione
inespecficamente con el DAB. Comparativamente a este resultado, la mutante acd11, que tiene
mutado el gen ACD11 codificante de una protena que transfiere esfingosina, presenta una
aceleracin de la MCP en respuesta al tratamiento con patgenos avirulentos (Brodersen et al.,
2002).

Algunos de los mecanismos de defensa que se desencadenan en la interaccin no hospedera

pueden ser iguales o similares a los que se presentan en una interaccin gen por gen (Kim et al.,
2008). Un ejemplo de ello es el desarrollo de una MCP tipo HR en ambos, sin embargo, no se
debe perder de vista que, a diferencia de lo que ocurre en la resistencia a un patgeno no
hospedero, durante la interaccin incompatible la resistencia de la planta al ataque de un patgeno
en particular es muy especfica porque involucra la interaccin de genes R de la planta y genes avr
del patgeno (Mishina y Zeier, 2007). Los resultados obtenidos sugieren que los mecanismos de
defensa inducidos por BCL y en los que participan ERO, son muy generales y han sido
seleccionados por su eficiencia para formar parte de un esquema de inmunidad ante el ataque
tanto de patgenos no especficos como de muy especficos del hospedero, ya que ambas formas
de generar inmunidad utilizan a la MCP.

58
 DISCUSIN

3. La ausencia de la MPK6 no interrumpe la produccin de ERO en la respuesta a

patgenos mediada por la interaccin gen por gen.
Se sabe que la activacin de MAPKs est relacionada con la promocin de la HR en la interaccin
incompatible (Zhang et al., 2001; Menke et al., 2004). En particular, la MPK6 es una MAP cinasa
implicada en las respuestas de defensa contra patgenos (Zhang y Klessig, 1997; Romeis et al.,
1999). Saucedo (2008, no publicado) ha encontrado que la MPK6 se activa por FB1, en
condiciones en las que hay acumulacin de BCL. La informacin anterior, en conjuncin con el
hallazgo de Shi et al. (2007), que estableci que el incremento de BCL conduca a la formacin de
ERO y con ello a la muerte celular, llevaba a una pregunta que poda explorarse con la mutante
Atmpk6, y que era si la muerte celular mediada por acumulacin de BCL que se presenta en la HR
(Stone et al., 2000; Palacios, 2008; Resultados con Arabidopsis thaliana de este trabajo ) y
mediada por la MPK6, involucraba la produccin de ERO, y si sta se encontraba corriente arriba o
corriente abajo de la activacin de la MPK6. Los resultados indicaron que la generacin de H2O2
persista en la mutante con prdida de funcin en la MPK6 cuando fue infiltrada con el patgeno
avirulento. Este resultado implicara que la generacin del H2O2 en la interaccin gen por gen no
depende de la mediacin de esta enzima, o bien, que la produccin de ERO est corriente arriba
de la activacin de esta MAP cinasa. Una tercera posibilidad es que la produccin de ERO que
observamos est mediada por otra MAP cinasa que tiene redundancia funcional con la MPK6. En
este sentido se ha reportado que la sobreexpresin de las MAPKK de Arabidopsis, AtMEK4 y
AtMEK5, est involucrada en la formacin corriente debajo de ERO en una respuesta de defensa
(Ren et al., 2002).
Otro aspecto que resulta interesante de la mutante Atmpk6, es que present una muerte acelerada
en comparacin de la silvestre en el curso de la infeccin con los patgenos, estos resultados son
congruentes con los obtenidos por Menke et al. (2004), quienes encontraron en Arabidopsis que el
silenciamiento del gen que codifica para la MPK6 provocaba un ligero aumento en la
susceptibilidad al ataque del patgeno avirulento (Pst DC3000 avrRPM1) y en mayor grado al
patgeno virulento (Pst DC3000 vir).

4. El aumento de BCL especficas que conduce a la MCP involucra la generacin de H2O2

en plntulas de A. thaliana.
Para evaluar la relacin entre la acumulacin de BCL y la produccin de H2O2 se recurri a la FB1
como estrategia experimental ya que, como se mencion anteriormente, esta toxina promueve la
acumulacin de las BCL (Abbas, 1994; Wang, 1991). Sin embargo, resultaba indispensable
realizar la identificacin y cuantificacin de estas especies en nuestro sistema de trabajo para

59
 DISCUSIN

establecer cules son las BCL que se acumulaban y monitorear la cintica respectiva, ya que
como se mencion anteriormente, los resultados con frijol slo detectaban un nmero limitado de
BCL y slo cuando se incrementaban a muy altos niveles.
Debido a la complejidad estructural de los esfingolpidos, su deteccin requiere una extraccin
selectiva, una eficiente separacin cromatogrfica y un sistema sensible de deteccin, adems de
una forma confiable y poderosa de identificacin de los compuestos esfingoideos. De ah que en
este trabajo se recurri a la tcnica de HPLC en fase reversa acoplada a espectrometra de masas
con ionizacin por electroaspersin. Esta tcnica resulta muy sensible y especfica para la
medicin de estas especies lipdicas y con ella se han podido detectar y cuantificar 168
esfingolpidos de una muestra cruda de Arabidopsis thaliana (Markham y Jaworsky, 2007).
Asimismo, en nuestro sistema experimental resultaba indispensable identificar las especies
endgenas de BCL libres o fosforiladas que se acumulaban por efecto del tratamiento con la FB1
para poder evaluar su papel como molculas sealizadoras en la MCP. De ah que se hiciera un
diseo experimental que inclua el anlisis de los niveles de BCL tanto libres como fosforiladas en
plntulas de A. thaliana silvestres y mutantes en la subunidad LCB2A de la SPT (Atlcb2a-1). Estas
plntulas se expusieron a la FB1 y se incluyeron los controles respectivos.
Congruente con lo reportado por Shi et al. (2007) encontramos que desde la primera hora de
tratamiento con la toxina, se presentaban alteraciones en los niveles de la esfinganina,
fitoesfingosina y sus derivados fosforilados en las dos lneas analizadas. Si bien a este tiempo
inicial los cambios fueron menores que a tiempos posteriores, este resultado sugiere que a partir
de tiempos cortos se puede detectar la alteracin en la va de sntesis de esfingolpidos, traducida
como una acumulacin de BCL, y que estos compuestos esfingoideos tienen efectos
sealizadores para inducir reacciones posteriores como la generacin de ERO.
Considerando que la SPT es una enzima que consiste de dos subunidades: LCB1 y LCB2
(Hanada, 2003), la mutacin en el gen LCB2A altera la sntesis de esfingolpidos, sin embargo, en
la mutante an persiste la actividad de la protena gracias a la subunidad codificada por el gene
LCB2B, por lo tanto la va no se ve afectada totalmente y eso se refleja en los resultados
encontrados. Por ejemplo, al cuantificar la esfinganina y esfinganina fosfato en la mutante Atlcb2a-
1 encontramos una notable menor acumulacin en comparacin con lo que ocurri en la lnea
silvestre. Por ejemplo, en el caso particular de la esfinganina fosfato, que present la mayor
acumulacin en comparacin con las otras BCL, a las 72 horas de exposicin a la FB1, la
acumulacin para la lnea silvestre fue de 5775.6 veces con respecto al control, en contraste con
las 214.4 veces en la mutante Atlcb2a-1. A este respecto, trabajos publicados recientemente
colocan a las BCL fosforiladas como importantes molculas sealizadoras tanto en mamferos

60
 DISCUSIN

como en plantas (Ng et al., 2001; Spiegel y Milstein, 2002; Coursol et al., 2005), por lo cual
resultaba interesante considerar que el aumento de las especies fosforiladas de BCL con respecto
a sus correspondientes no fosforiladas desde las 4 h de tratamiento con la toxina fueran en
particular las responsables de la sealizacin para la formacin de ERO y consecuentemente de la
muerte del tejido vegetal. Sin embargo, Shi et. al. (2007) proponen que las especies fosforiladas
son indispensables para mantener una homeostasis y para contener el efecto de las BCL no
fosforiladas, ya que a estas ltimas se les atribuye el efecto sealizador que desencadena la
progresin de la MCP. La explicacin que se ha dado ante la citotoxicidad de las BCL libres a altas
concentraciones, es que su exceso requiere que sean degradadas. Para ello, las BCL tienen que
ser fosforiladas por sus respectivas cinasas y posteriormente son descompuestas por accin de
una liasa que produce hexadecenal y fosfoetanolamina (Tsegaye et al., 2007). De esta manera, el
aumento en los niveles de las BCL fosforiladas contribuira, ms que a una sealizacin, a su
desvo hacia una ruta que las conduzca a su degradacin. La cintica de acumulacin de las BCL
obtenida en este sistema nos permiti relacionar su temporalidad con la produccin de H2O2.

Contrario a lo que Shi et al. (2007) reportaron, aunque muy escuetamente, en nuestro sistema de
plntulas no se pudo detectar el H2O2 que funciona como sealizador y que tendra que
presentarse a tiempos cortos (6 h segn Shi et al., 2007). Esto puede deberse a la tcnica
utilizada, ya que no tiene la sensibilidad necesaria para teir concentraciones pequeas de esta
ERO. Sin embargo, podemos decir que en este sistema de plntulas, la sealizacin va
acumulacin de BCL est activa, debido a que las plntulas tratadas con FB1 y que presentan la
mayor acumulacin determinada de BCL son las que tambin presentan ms indicios de muerte
celular y una mayor tincin positiva al DAB. Esta deteccin de H2O2 es congruente a lo que se
present en los otros dos sistemas de estudio, en donde lo que tenemos es una tincin en las
zonas en donde est en progreso el proceso de muerte celular. Relacionando estos resultados con
la cuantificacin de BCL podemos decir que el aumento masivo (12 y 72 h) de estas especies
esfingoideas est relacionado con la produccin de ERO en las clulas que quizs como parte de
del progreso de la muerte celular sufren un estrs oxidativo. No puede descartarse en este caso
tampoco, que las clulas en este estado crtico con las funciones vitales comprometidas, se
generen compuestos que no son H2O2 y que tienen una reaccin positiva con el DAB.

61
 DISCUSIN

5. La FB1 desencadena MCP en hojas adultas de plantas silvestres de A. thaliana y una

MCP retardada en la mutante Atlbc2a-1.
Para relacionar lo que ocurre con los patgenos con el aumento en BCL y la produccin de ERO,
se realiz el experimento infiltrando FB1 en las hojas de plantas silvestres y en las mutantes
Atlcb2a-1. Se detect H2O2 hasta las 72 hpi en las plantas silvestres tratadas con FB1 a diferencia
de lo que ocurri en la mutante tambin tratada con la toxina en la que no se detect esta ERO.
Previamente a este tiempo no se registr formacin de H2O2 (Resultados no mostrados). Este
resultado indica que este sistema experimental, el de plantas adultas de Arabidopsis, es menos
eficiente en la acumulacin de BCL inducidas por FB1 comparado con la acumulacin inducida por
el patgeno, pero que la acumulacin de BCL fue tambin capaz de inducir muerte celular. Lo
anterior se confirma con el resultado del tiempo de 6 d, cuando la MCP que se desencaden por la
infiltracin de la toxina fue ms evidente en las plantas silvestres que en la mutante.
Este resultado se puede comparar con el descrito por Shi et al., 2007 en el que una mutante
resistente a la FB1 (fbr11-1) presenta menor acumulacin de BCL en comparacin con la silvestre
y no produce ERO. El gen FBR11 codifica para la subunidad LCB1 de la SPT, en el caso de la
Atlcb2a-1 tambin se presenta menor acumulacin de BCL tras la infiltracin de la FB1, pero en
este caso la mutacin est en el gen LCB2a que tambin codifica para una subunidad de la SPT.
Es posible tambin que la aparicin ms temprana de ERO en tras la infiltracin del patgeno se
deba a que ste activa vas de defensa adicionales que conducen a la formacin de ERO sin
implicar a las BCL (Gechev et al., 2006).

6. El H2O2 formado a tiempos intermedios por el tratamiento con el patgeno Pst DC3000
avrRPM1 se localiza en el cloroplasto.

Cuatro posibles fuentes celulares de generacin de H2O2 se han postulado principalmente como
parte de las respuestas de defensa contra patgenos relacionadas con la MCP en plantas: la
mitocondria (Moller, 2001), el cloroplasto (Moreno et al., 2005; Liu et al., 2007), la NADPH oxidasa
de la membrana plasmtica (Torres et al., 2002; Torres et al., 2005; Lherminier et al., 2009) y una
peroxidasa de la pared celular (Bolwell et al., 1999; Bindschedler et al., 2006; Choi et al., 2007). En
algunos casos, las evidencias experimentales que asocian alguna de estas fuentes con la MCP-
HR en defensa son muy claras, lo cual sugiere que hay ms de una fuente celular que genera
ERO y que su participacin en la MCP puede estar definida especficamente a ciertos tiempos y
adscrita a ciertos compartimentos subcelulares dependiendo del progreso de la infeccin y de los
mecanismos de transduccin inducidos por las seales producidas por el patgeno.

62
 DISCUSIN

Los estudios de Torres et al. (2002) colocan a la NADPH oxidasa como una importante fuente de
ERO durante la interaccin incompatible. En cuanto a la temporalidad de este evento
recientemente se encontr a la NADPH oxidasa como principal enzima productora de ERO en los
primeros minutos despus de la elicitacin con criptogena en clulas de tabaco (Lherminier et al.,
2009).
En cuanto a la generacin de H2O2 inducida por BCL en la ruta conducente a la MCP, las fuentes
de ERO estn poco estudiadas. Las nicas evidencias que hay en la literatura de esta relacin son
el trabajo de Stone et al. (2000) y el de Shi et al. (2007). En el primero se sugiri la participacin de
la FB1 como evocador de respuestas de defensa, entre ellas la produccin de ERO, que fue
detectada como O2.- con la tincin con azul de tetrazolio; sin embargo, en este trabajo no se
atribuy a las BCL la produccin de ERO y tampoco se estudi la fuente de produccin de estas
especies. Por otra parte, el trabajo de Shi et al. (2007) en donde se detect tanto el O2.- como el
H2O2 despus de la exposicin de plntulas de Arabidopsis a la FB1 (atribuyendo este efecto a la
acumulacin de BCL), no present ninguna evidencia experimental sobre la posible fuente de
estas ERO.
En el anlisis microscpico de las regiones que presentaron la formacin del H202 precipitado con
DAB, identificamos que en Arabidopsis el H2O2 formado durante la interaccin incompatible se
sitaba en los cloroplastos a tiempos intermedios de la infeccin bacteriana (18 hpi). Estos
resultados concuerdan con los reportados por Liu et al. (2007) en donde encontraron que la
activacin de una MAPKK de Nicotiana tabacum, que a su vez activa a la SIPK y a la WIPK,
promueve la generacin de ERO en el cloroplasto. La SIPK es un ortlogo de la AtMPK6 que se
activa por FB1 (Saucedo, no publicado).
Este mismo anlisis, realizado tanto en el sistema de Arabidopsis como en el de frijol nos permiti
observar que el H2O2 que se detect a tiempos largos (48 h a 11 d) de exposicin a la FB1, se
localizaba en los espacios intercelulares, resultando plausible la explicacin de que a tiempos ms
largos donde es evidente una muerte celular avanzada en el tejido, la presencia del complejo
insoluble del DAB es debida a una reaccin inespecfica con componentes de la pared celular.

63
 DISCUSIN

FB1 Patgeno Peroxidasa

MAMPs H2O2

NADPH ox

SOD
O2.- H2O2

Cloroplasto
H2O2
PI, PII
BCL
O2.- Fotorrespiracin
CS

ERO
MAPK
MCP/HR
Defensa

Figura 20. Modelo de la relacin entre la acumulacin de BCL y la produccin de ERO en las respuestas de
inmunidad de las plantas. Se propone que el aumento de BCL inducido tanto por el patgeno no hospedero
(va MAMPs), por el patgeno avirulento (va interaccin gen por gen) y por la FB1 (por inhibicin de la
ceramida sintasa) desencadenan la produccin de ERO que conduce a la MCP que se presenta como HR
en la defensa contra patgenos. Entre las posibles fuentes de estas ERO se encuentran: la peroxidasa de la
pared celular, la NADPH oxidasa, y el cloroplasto. Sin embargo, otros sitios generadores posibles de ERO
son la mitocondria y el peroxisoma. (AvrRPM1, producto del gen de avirulencia del patgeno; BCL, bases de
cadena larga; CS, ceramida sintasa; ERO, especies reactivas de oxgeno; FB1, fumonisina B1; HR, respuesta
de hipersensibilidad; MAMPs, patrones moleculares asociados a microbios; MAPK, cinasa activada por
.-
mitgeno; MCP, muerte celular programada; NADPH ox, NADPH oxidasa; O2 , ion superoxido; PI,
fotosistema I; PII, fotosistema II; RPM1, producto del gen de resistencia de la plata; SOD, superxido
dismutasa).

64
 CONCLUSIONES

I. CONCLUSIONES

La acumulacin de BCL a tiempos muy tempranos (1 h) en Phaseolus vulgaris precede a la

formacin de H2O2 en la regin infiltrada con un patgeno no hospedero o con FB1 y en
donde se desarrolla progresivamente la muerte celular tipo HR.

Adems, hay una segunda etapa de formacin in situ de H2O2 a tiempos intermedios (24,
48 h) que est asociada a la elevacin masiva de BCL y que podra estar relacionada con
la perturbacin estructural de membranas de organelas productoras de ERO, como parte
del desarrollo de la muerte celular.

La lnea mutante de Arabidopsis thaliana con el gen LCB2B silenciado (Atlcb2b-hp/Atlcb2a)

fue incapaz de producir H2O2 ( 4 y 12 h) en el sitio de infiltracin del patgeno avirulento a
diferencia de los controles, indicando que la formacin de H2O2 depende de BCL en la HR
que se presenta en la inmunidad mediada por genes R. El tiempo de formacin de H2O2 en
los controles es consistente con los tiempos de formacin sostenida de ERO reportados en
interacciones gen por gen.

La segunda etapa detectada de formacin in situ de H2O2 se present alrededor de las 24 h

en condiciones en las que se estaba iniciando la manifestacin de la HR, sugiriendo que
esta H2O2 es parte de un estrs oxidativo en organelas productoras de ERO. Lo anterior
esta apoyado por la deteccin de H2O2 en los cloroplastos durante esta etapa.

La magnitud en el incremento de las BCL es consistente con el fenotipo de H2O2-

DAB/muerte celular en plntulas de Arabidopsis thaliana.

Conclusin General

La acumulacin de BCL induce la produccin de H2O2 en una respuesta de inmunidad producida

ante un patgeno no-hospedero y en una basada en la interaccin gen por gen.

65
 PERSPECTIVAS

II. PERSPECTIVAS
Las siguientes perspectivas estn planteadas en funcin de conocer aspectos que no fueron
totalmente resueltos en el presente trabajo.

Corroborar la temporalidad de la formacin de ERO por BCL cuantificando las BCL (d18:0,
d18:0-P, t18:0, t18:0-P) en la mutante Atlcb2b-hp/Atlcb2a en ausencia y presencia de
inductor en un amplio curso de tiempo que incluya los posibles tiempos de formacin de
H2O2.

Establecer los perfiles de acumulacin de BCL tras la infiltracin del patgeno avirulento y
del virulento y relacionarlos con los tiempos en los que se detect el H2O2 en las hojas de
Arabidopsis silvestre y de las mutantes.

Determinar la formacin de H2O2 a tiempos cortos con una tcnica cuantitativa y sensible
en las plntulas silvestres y mutantes Altcb2a-1 expuestas a FB1.

Determinar la localizacin subcelular del H2O2 a todos los tiempos probados tanto con los
patgenos como con la FB1 en los modelos de frijol y de plantas adultas de Arabidopsis por
medio de anlisis microscpico de las regiones teidas con DAB.

66
 BIBLIOGRAFA

I. BIBLIOGRAFIA

Abbas H.K., Tanaka T., Duke S.O., Porter J.K., Wray E.M., Hodges L., Sessions A.E., Wang E.,
Merrill A.H. Jr, Riley R.T. Fumonisin and AAL toxin induced disruption of sphingolipid
metabolism with accumulation of free sphingoid bases. Plant Physiology (1994)106, 1085-
1093.
Agrios G. Plant Pathology. 4 Ed. Academic Press (1997) New York, EU. pp.103.
Alvarez M., Pennell, R., Meijer, P., Ishikawa, A., Dixon, R., Lamb, C. Reactive oxygen
intermediates mediate a systemic signal network in the establishment of plant immunity. Cell
(1998) 92, 773-784.
Andrews J., Adams S.R., Burton K.S., Evered C.E. Subcellular localization of peroxidase in tomato
fruit skin and the possible implications for the regulation of fruit growth. Journal of
Experimental Botany (2002) 53, 2185-2191.
Asai T., Stone JM., Heard, JE., Kovtun, Y., Yorgey, P., Sheen, J., Ausubel, FM. Fumonisin B1-
induced cell death in Arabidopsis protoplasts requires jasmonate, ethylene and salicylate
dependent signaling pathways. The Plant Cell (2000) 12, 1823-1835.
Baker C..J., Orlandi E.W., Mock N.M. Harpin, an elicitor of the hypersensitive response in tobacco
caused by Erwinia amylovora, elicits active oxygen production in suspension cells. Plant
Physiology (1993) 102,134144.
Balk, J., Chew, S. K., Leaver, C. J., and McCabe, P. F. The intermembrane space of plant
mitochondria contains a DNase activity that may be involved in programmed cell death. The
Plant Journal (2003) 34, 573583.
Bartosz G. Reactive oxygen species: Destroyers or messengers? Biochemical Pharmacology
(2009) 77, 1303-1315.
Bent A.F. Plant disease resistance genes: function meets structure. The Plant Cell (1996) 8, 1757-
1771.
Benton J. Hydroponics: its history and use in plant nutrition studies. Journal of Plant Nutrition
(1982) 5, 1003-1030.
Bethke P.C., y Jones R.L. Cell death of barley aleurone protoplasts is mediated by reactive oxygen
species. The Plant Journal (2001) 25, 19-29.
Bindschedler LV., Dewdney J., Blee K.A., Stone J.M., Asai T., Plotnikov J., Denoux C., Hayes T.,
Gerrish C., Davies DR., Ausubel F.M., Bolwell G.P. Peroxidase dependent apoplastic
oxidative burst in Arabidopsis required for pathogen resistance. The Plant Journal (2006) 47,
851-863.

67
 BIBLIOGRAFA

Bittel P., Robatzek S. Microbe-associated molecular patterns (MAMPs) probe plant immunity.
Current Opinion in Plant Biology (2007) 10, 335-341.
Bleicher RJ. Cabot M. Glucosylceramide synthase and apoptosis. Biochimica et Biophysica Acta
(2002) 1585, 172-178.
Bolwell G.P., Blee K.A., Butt V.S., Davies D.R., Gardner S.L., Gerrish C., Minibayeva F., Rowntree
E.G., Wojtaszek P. Recent advances in understanding the origin of the cell wall oxidative
burst in plant cells. Free Radical Research (1999) 31, S137-S145.
Bolwell G.P., Butt V.S., Davies D.R., Zimmerlin A. The origin of the oxidative burst in plants. Free
Radical Research (1995) 23, 517-532.
Bolwell G.P., Wojtaszek, P. Mechanisms for the generation of reactive oxygen species in plant
defense- a broad perspective. Physiological and Molecular Plant Pathology (1997) 51, 347-
366.
Boller T., He S.Y. Innate immunity in plants: an arms race between pattern recognition receptors in
plants and effectors in microbial pathogens. Science (2009) 324, 742-744.
Bonfig K.B., Schreiber U., Gabler A., Roitsch T., Berger S. Infection with virulent and avirulent P.
syringae strains differential affects photosynthesis and sink metabolism in Arabidopsis leaves.
Planta (2006) 225, 1-12.
Borner G.H.H., Sherrier D.J., Weimar T, Michaelson L.V, Hawkins N.D., MacAskill A., Napier
J.A., Beale M.H., Lilley K.S., Dupree P. Analysis of detergent-resistant membranes in
Arabidopsis. Evidence for plasma membrane lipid rafts. Plant Physiology (2005) 137, 104-
116.
Brisson L.F., Tenhaken R., Lamb C.J. Function of oxidative cross-linking of cell wall structural
proteins in plant disease resistance. The Plant Cell (1994) 6, 17031712
Cardinale F., Jonak, C. Ligterink, W., Niehaus, K.,Boller, T., Hirt, H. Differential activation of four
specific MAPK pathways by distinct elicitors. The Journal of Biological Chemistry (2000) 275,
36734-36740.
Chen M., Han G., Dietrich C.R., Dunn T.M., Cahoon E.B. The essential nature of sphingolipids in
plants as revealed by the identification and functional characterization of the Arabidopsis
LCB1 subunit of serine palmitoyltransferase. The Plant Cell (2006) 18, 3576-3593.
Chen M., Markham J.E., Dietrich C.R., Jaworsky J.G., Cahoon E.B. Sphingolipid long-chain base
hydroxylation is important for growth and regulation of sphingolipid content and composition in
Arabidopsis. The Plant Cell (2008) 20, 1862-1878.
Chisholm S.T., Coaker G., Day B. and Staskawicz B.J. Host-microbe interactions: Shaping the
evolution of the plant immune response. Cell (2006)124, 803814.

68
 BIBLIOGRAFA

Choi H.W., Kim Y.J., Lee S.C., Hong J.K., Hwang B.K. Hydrogen peroxide generation by the
pepper extracellular peroxidase CaPO2 activates local and systemic cell death and defense
response to bacterial pathogens. Plant Physiology (2007) 145, 890-904.
Coursol S., Le Stunff H., Lynch D.V., Gilroy S., Assmann S.M., Spiegel S. Arabidopsis sphingosine
kinase and the effects of phytosphingosine-1-phosphate on stomatal aperture. Plant
Physiology (2005) 137, 724-737.
Da Cunha L., McFall A.J., Mackey D. Innate immunity in plants, a continuum of layered defenses.
Microbes and Infection (2006) 8, 1372-1381.
Dangl J.L., Dietrich R.A., Richberg M.H. Death dont have no mercy: cell death programs in plant
microbe interactions. The Plant Cell (1996) 8, 1793-1807.
Dangl J., Jones J.D.G. Plant pathogens and integrated defence responses to infection. Nature
(2001) 411, 826-833.
Desai K., Sulluards M.C., Allegood J. Wang E., Schmelz E.M., Hartl M. Humpf H.U., Liotta D.C.
Peng Q., Merrill A.H. Fumonisins and fumonisin analogs as inhibitors of ceramide synthase
and inducers of apoptosis. Biochimica et Biophysica Acta (2002) 1585, 188-192.
Dietrich CR, Han G, Chen M, Berg RH, Dunn TM, Cahoon EB. Loss-of-function mutations and
inducible RNAi suppression of Arabidopsis LCB2 genes reveal the critical role of sphingolipids
in gametophytic and sporophytic cell viability. The Plant Journal (2008) 54, 284-298.
Doke N. Generation of superoxide anion by potato tuber protoplast during the hypersensitive
response to hyphal cell wallcomponents of Phytophthora infestans and specific inhibition of
the reaction by suppressors of hypersensitivity. Physiological Plant Pathology (1983) 23, 359-
367.
Dunn T.M., Lynch D.V., Michaelson L.V., Napier J.A. A post-genomic approach to understanding
sphingolipid metabolism in Arabidopsis thaliana. Annals of Botany (2004) 93, 483-497.
Elrick J.M., Fluss S., Colombini M. Sphingosine, a product of ceramide hydrolysis, influences the
formation of ceramide channels. Biophysical Journal (2006) 91, 1749-1756
Fleury C., Mignotte, B., Vayssiere, J. Mitochondrial reactive oxygen species in cell death signaling.
Biochimie (2002) 84, 131-141.
Flor H.H., Current status of the gene-for-gene concept. Annual Review of Phytopathology (1971) 9,
275-296.

Foreman J., Demidchik V., Bothwell J.H.F. Reactive oxygen species produced by NADPH oxidase
regulate plant cell growth. Nature (2003) 422, 442-446.

69
 BIBLIOGRAFA

Foyer C.H., Lescure J.C., Lefebvre C., Morot-Gaudry J.F., Vincentz M., Vaucheret H. Adaptations
of Photosynthetic Electron Transport, Carbon Assimilation, and Carbon Partitioning in
Transgenic Nicotiana plumbaginifolia Plants to Changes in Nitrate Reductase Activity. Plant
Physiology (1994) 104, 171-178

Futerman A.H., Riezman H. The ins and outs of sphingolipid synthesis. Trends in Cell Biology
(2005) 15, 312-318.

Gadjev I., Stone J.M., Gechev T.S. Programmed cell death in plants: new insights into redox
regulation and the role of hydrogen peroxide. International Review of Cell and Molecular
Biology (2008) 270, 87-144.
Gechev T.S., Hille J. Hydrogen peroxide as a signal controlling plant programmed cell death.
Journal of Cell Biology (2005) 168, 17-20.
Gechev T.S., VanBreusegem F., Stone J.M, Denev I., Laloi C. Reactive oxygen species as signals
that modulate plant stress responses and programmed cell death. BioEssays (2006) 28,
1091-1101.
Gilchrist D.G. Programmed cell death in plant disease: the purpose and promise of cellular suicide.
Annual Review of Phytopathology (1998) 36, 393-414.
Greenberg J.T. Programmed cell death: A way of life for plants. Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America (1996) 93, 12094-12097.
Geenberg J.T. Programmed cell death in plant-pathogen interactions. Annual Review of Plant
Physiology and Plant Molecular Biology (1997) 48, 525-545.
Greenberg J.T., Yao N. The role and regulation of programmed cell death in plant-pathogen
interactions. Cellular Microbiology (2004) 6, 201-211.
Hammond-Kosack K., Jones J. Resistance gene-dependent plant defense responses. The Plant
Cell (1996) 8, 1773-1791.
Hanada K. Serine palmitotransferase, a key enzyme of sphingolipids metabolism. Biochimica et
Biophysica Acta. (2003) 1632, 16-30.
Hannun Y.A. Functions of ceramide in coordinating cellular responses to stress. Science (1996)
274, 1855-1859.
Holt B.F., Hubert D.A., Dangl J.L. Resistance gene signaling in plants- complex similarities to
animal innate immunity. Current Opinion in Immunology (2003) 15, 20-25.
Humpf H.U., Schmelz E.M., Meredith F.I., Vesper H., Vales T.R., Wang E., Menaldino D.S., Liotta
D.C., Merrill A.H.Jr. Acylation of naturally occurring and synthetic 1-deoxysphinganines by
ceramide synthase. Formation of N-palmitoyl-aminopentol produces a toxic metabolite of

70
 BIBLIOGRAFA

hydrolyzed fumonisin, AP1, and a new category of ceramide synthase inhibitor. The Journal
of Biological Chemistry (1998) 273, 19060-19064.
Huwiler A., Kolter T., Pfeilschifter J., Sandhoff K. Physiology and pathophysiology of sphingolipid
metabolism and signaling. Biochimica et Biophysica Acta (2000) 1485, 63-99.
Ichimura K., Shinozaki K., Tena G., Sheen J., Henry Y., Champion A., Kreis M., Zhang S., Hirt H.,
Wilson C., Heberle-Bors E., Ellis B., Morris P., Innes R., Ecker J., Schell D., Klessig D.,
Machida Y., Mundy J., Ohashi Y., Walker J. Mitogen-activated protein kinase cascades in
plants: a new nomenclature. Trends in Plant Science (2002) 7, 301-308.
Jabs T., Dietrich R., Robert A., Dangl J. Initiation runaway cell death in Arabidopsis mutant by
extracellular superoxide. Science (1996) 273, 1853-1856.
Jones J.D.G., Dangl J.L. The plant immune system. Nature (2006) 444, 323-329.
Karlsson K.A. On the chemistry and occurrence of sphingolipid long chain bases. Chemistry and
Physics of Lipids (1970) 5, 6-43.
Keen N.T. Gene-for-gene complementarity in plant-pathogen interactions. Annual Review of
Genetics (1990), 24, 447-463.
Kerr J.F.R., Wyllie A.H., Currie A.R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging
implications in tissue kinetics. British Journal of Cancer (1972) 26, 239257.
Kim M.G., Kim S.Y., Kim W.Y., Mackey D., Lee S.Y. Responses of Arabidopsis thaliana to
challenge by Pseudomonas syringae. Molecules and Cells (2008) 25, 323-331.
Korystov Y.N., Narimanov A.A. Low doses of ionizing radiation and hydrogen peroxide stimulate
plant growth. Biologia (1997) 52, 121-124.
Kotchoni S.O., Gachomo E.W. The reactive oxygen species network pathways: an essential
prerequisite for perception of pathogen attack and the acquired disease resistance in plants.
Journal of Biosciences (2006) 31, 389-404.
Kuriyama H., Fukuda Hiroo. Developmental programmed cell death in plants. Current Opinion in
Cell Biology (2002) 5, 568-573.
Kuroyanagi M., Yamada K., Hatsugai N., Kondo M., Nishimura M., Hara-Nishimura I.Vacuolar
processing enzyme is essential for mycotoxin-induced cell death in Arabidopsis thaliana. The
Journal of Biological Chemistry (2005) 280, 3291432920.
Lam E. Controlled cell death, plant survival and development. Nature (2004) 5, 305-315.
Lam E., Kato N., Lawton M. Programmed cell death, mitochondria and plant hypersensitive
response. Nature (2001) 411, 848-853.
Lamb C., Dixon R. The oxidative burst in plant disease resistance. Annual Review of Plant
Physiology and Plant Molecular Biology (1997) 48, 251-275.

71
 BIBLIOGRAFA

Lambeth J.D. Nox enzymes and the biology of reactive oxygen. Nature (2004) 4, 181-189.
Lee S.C., Hwang B. Induction of some defense-related genes and oxidative burst is required for the
establishment of systemic acquired resistance in Capsicum annuum. Planta. (2005) 221, 790-
800.
Levine A., Tenhaken R., Dixon,R., Lamb C. H2O2 from the oxidative burst orchestrates the plant
hypersensitive disease resistance response. Cell (1994) 79, 583-593.
Lherminier J., Elmayan T., Fromentin J., Elaraqui K.T., Vesa S., Morel J., Verrier J.L., Cailleteau B.,
Blein J.P., Simon-Plas F. NADPH oxidase-mediated reactive oxygen species production:
subcellular localization and reassessment of its role in plant defense. Molecular Plant-Microbe
Interactions (2009) 22, 868-881.
Liang H., Yao N., Song JT., Luo S., Lu H., Greenberg, JT. Ceramides modulate programmed cell
death in plants. Genes and Development (2003) 17, 2636-2641.
Liu Y., Ren D., Pike S., Pallardy S., Grassmann W., Zhang S. Chloroplast-generated reactive
oxygen species are involved in hypersensitive response-like cell death mediated by a
mitogen-activated protein kinase cascade. The Plant Journal (2007) 51, 941-954.
Lynch D., Dunn T. An Introduction to plant sphingolipids and a review of recent advances in
understanding their metabolism and function. New Phytologist (2004) 161, 677-702.
Maceyka M., Payne S.G., Milstien S., Spiegel S. Sphingosine kinase, sphingosine-1-phosphate,
and apoptosis. Biochimica et Biophysica Acta (2002) 193-201.
Markham J., Jaworski J. Rapid measurement of sphingolipids from Arabidopsis thaliana by
reversed-phase high-performance liquid chromatography coupled to electrospray ionization
tandem mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry (2007) 21, 1304-
1314.
Markham J., Li J., Cahoon E., Jaworski J. Separation and identification of major plant sphingolipid
classes from leaves. The Journal of Biological Chemistry (2006) 281, 22684-22694.
McRae D.G., Thompson J.E. Senescence-dependent changes in superoxide anion production by
illuminated chloroplasts from bean leaves. Planta (1983) 158, 185-193.
Menke F.L.H., van Pelt J.A., Pieterse C.M.J., Klessig D.F. Silencing the mitogen activated protein
kinase MPK6 compromises disease resistance in Arabidopsis. The Plant Cell (2004) 16, 897-
907.
Merrill A.H. Jr, Van Echten G., Wang E., Sandhoff K. Fumonisin B1 inhibits sphingosine
(sphinganine) N-acyltransferase and de novo sphingolipid biosynthesis in cultured neurons in
situ. The Journal of Biological Chemistry (1993) 268, 27299-27306.

72
 BIBLIOGRAFA

Merrill A., Liotta D., Riley, R. Fumonisins: fungal toxins that shed light on sphingolipid function.
Trends in Cell Biology (1996) 6, 218-223.
Merrill A. De novo sphingolipid biosynthesis: a necessary but dangerous pathway. The Journal of
Biological Chemistry (2002) 277, 25843-25846.
Meskiene I., Hirt H. MAP Kinase pathways: molecular plug-and-play chips for the cell. Plant
Molecular Biology (2000) 42, 791-806.
Miranda Salgado E. Evaluacin de muerte celular en Arabidopsis thaliana inducida por fumonisina
y por esfingolpidos. Tesis de Licenciatura, Facultad de Qumica, UNAM. (2005).
Mishina T.E., Zeier J. Bacterial non-host resistance: interactions of Arabidopsis with non-adapted
Pseudomonas syringae strains. Physiologia Plantarum (2007) 131, 448-461.
Mittler R., Vanderauwera S., Gollery M., Van Breusegem F. Reactive oxygen gene network of
plants. Trends in Plant Science (2004) 9, 490-498.
Moller, I. M. Plant mitochondria and oxidative stress: Electron transport, NADPH turnover, and
metabolism of reactive oxygen species. Annual Review of Plant Physiology and Plant
Molecular Biology (2001) 52, 561591.
Mongrand, S., Morel, J., Laroche, J., Claverol, S., Carde, J.P., Hartmann, M.A., Bonneu, M.,
Simon-Plas, F., Lessire, R., Bessoule J.J. Lipid rafts in higher plant cells: purification and
characterization of Triton X-100-insoluble microdomains from tobacco plasma membrane.
The Journal of Biological Chemistry (2004) 279, 3627736286.
Morel J.B., Dangl JL. The hypersensitive response and the induction of cell death in plants. Cell
Death and Differentiation (1997) 4, 671-683.
Moreno J.I., Martn R., Castresana C. Arabidopsis SHMT1, a serine hydroxymethyltransferase that
functions in the photorespiratory pathway influences resistance to biotic and abiotic stress.
The Plant Journal (2005) 41, 451-463.
Mullineaux P.M., Karpinski S.W., Baker N.R. Spatial dependence for hydrogen peroxide-directed
signaling in light-stressed plants. Plant Physiology (2006) 141, 346350.
Mur L.A., Kenton P., Lloyd A., Ougham H., Prats E. The hypersensitive response; the centenary is
upon us but how much do we know? Journal of Experimental Botany (2007) 59, 501-520.
Nagiec M.M., Nagiec E.E., Baltisberger J.A., Wells G.B., Lester R.L. Dickson R.C. Shingolipids
synthesis as a target for antifungal drugs. Complementation of the inositol
phosphorylceramide synthase defect in a mutant strain of Saccharomyces cerevisiae by the
AUR1 gene. The Journal of Biological Chemistry (1997) 272, 9809-9817.
Ng C., Carr K., McAinsh M., Powell, B., Hetherington, A. Drought-induced guard cell signal
transduction involves sphingosine-1-phosphate. Nature (2001) 410, 596-599.

73
 BIBLIOGRAFA

Ng C., Hetherington A.M. Sphingolipid-mediated signalling in plants. Annals of Botany (2001) 88,
957-965.
Noodn L. Plant Cell Death Processes. Academic Press, New York (2004) pp 37-38.
Orlandi E.W. Hutcheson S.W., Baker C.J. Early physiological responses associate with race-
specific recognition in soybean leaf tissue and cell suspensions treated with Pseudomonas
syringae pv. glicinea. Phisiological and Molecular Plant Pathology (1992) 40, 173-180.
Orozco-Crdenas M., Ryan C. Hydrogen peroxide is generated systemically in plant leaves by
wounding and systemin via the octadecanoic pathway. Proceedings of the National Academy
of Sciences of the United States of America (1999) 96, 6553-6557.
Palacios Bahena, S. Participacin de esfingolpidos membranales en respuestas de defensa en
plantas. (2008) Tesis de Maestra en Ciencias Bioqumicas. Facultad de Qumica, UNAM.
Parent C., Capell, N., Dat J. Formes reactives de loxygene, stress et mort cellulaire chez les
plantes. Comptes Rendus Biologies (2008) 331, 255-261.
Patel S., Caplan J., Dinesh-Kumar SP. Autophagy in the control of programmed cell death. Current
Opinion in Plant Biology (2006) 9, 391-396.
Pei Z.M., Murata Y., Benning G. Calcium channels activated by hydrogen peroxide mediate
abscisic acid signalling in guard cells. Nature (2000) 406, 731-734.
Pennell R.I., Lamb C. Programmed cell death in plants. The Plant Cell (1997) 9, 1157-1168.
Pettus B.J., Chalfant C.E., Hannun Y.A. Ceramide in apoptosis: an overview and current
perspectives. Biochimica et Biophysica Acta (2002) 1585, 114 125.
Pike S.M., Adam A.L., Pu X.A., Hoyos M.E. Laby R., Beer S.V. Novacky A. Effects of Erwinia
amylovora hairpin on tobacco leaf cell membranes are related to leaf necrosis and electrolyte
leakage and distinct from perturbations caused by inoculated E. amylovora. Physiological and
Molecular Plant Pathology (1998) 53, 3960.
Pike S.M., Zhang X.C., Gassmann, W. Electrophysiological characterization of the Arabidopsis
avrRpt2-specific hypersensitive response in the absence of other bacterial signals. Plant
Physiology (2005)138, 10091017.
Reape T., Molony M., McCabe P. Programmed cell death in plants: distinguishing between different
modes. Journal of Experimental Botany (2008) 59, 435-444.
Ren D., Yang H., Zhang S. Cell death mediated by MAPK is associated with hydrogen peroxide
production in Arabidopsis. The Journal of Biological Chemistry (2002) 277, 559-565.
Rivas SanVicente M. Asociacin del metabolismo de esfingolpidos con la acumulacin de cido
saliclico en tejidos vegetales. (2004) Tesis de Maestra en Ciencias Bioqumicas. Facultad de
Qumica, UNAM.

74
 BIBLIOGRAFA

Romeis T., Piedras P., Zhang S., Klessig D.F., Hirt H., Jones J.D.G. Rapid Avr9- and Cf-9
Dependent Activation of MAP Kinases in Tobacco Cell Cultures and Leaves: Convergence of
Resistance Gene, Elicitor, Wound, and Salicylate Responses. The Plant Cell (1999) 11, 273
287.
Rodrguez Meja P. Relacin entre la actividad de la NADPH oxidasa, compuestos esfingoideos y
respuesta a patgenos en clulas vegetales (2006) Tesis de Licenciatura, Facultad de
Qumica, UNAM.
Saucedo Garca, M. Activacin de MAPKs inducidas por bases de cadena larga en una especie
mono y una dicotilednea. (2007) Tesis de Maestra en Ciencias Bioqumicas. Facultad de
Qumica, UNAM.
Schroeder A., Martin G., Low P. A comparison of methods for the determination of the oxidative
burst in whole plants. En Stacey G., Mullin B. Gresshoff P.M. Biology of Plant-Microbe
Interactions. International Society for Molecular Plant-Microbe Interactions, St. Paul, MN,
(1996) pp 15-20.
Seay M., Patel S., Dinesh-Kumar S.P. Autophagy and plant innate immunity. Cellular Microbiology
(2006) 8, 899-906.
Serrano M., Robatzek S., Torres M., Kombrink E., Somssich I.E., Robinson M.,Schulze-Lefert P.
Chemical interference of pathogen-associated molecular pattern-triggered immune responses
in Arabidopsis reveals a potential role for fatty-acid synthase type II complex-derived lipid
signals. The Journal of Biological Chemistry (2007) 282, 68036811.
Smirnoff N. Antioxidants and reactive oxygen species in plants. Blackwell Publishing (2005) Oxford,
UK. pp.197-200.
Shi L., Bielawski J., Mu J., Dong H., Teng C. Zhang J., Yang X., Tomishige N., Hanada K., Hannun
Y., Zuo J. Involvement of sphingoid bases in mediating reactive oxygen intermediate
production and programmed cell death in Arabidopsis. Cell Research (2007) 17, 1030-1040.
Siskind L. J. Mitochondrial ceramide and the induction of apoptosis. Journal of Bioenergetics and
Biomembranes (2005) 37, 143 153.
Siskind L.J., Fluss S., Bui M., Columbini M. Sphingosine forms channels in membranes that differ
greatly from those formed by ceramide. Journal of Bioenergetics and Biomembranes (2005)
37: 227-236.
Spassieva SD., Markham J. Hille J. The plant disease resistance gene Asc-1 prevents disruption of
sphingolipid metabolism during AAL-toxin-induced programmed cell death. The Plant
Journal (2002) 32, 561-572.

75
 BIBLIOGRAFA

Sperling P., Heinz E. Plant sphingolipids: structural diversity, byosynthesis, first genes and
functions. Biochimica et Biophysica Acta (2003) 1632, 1-15.
Spiegel S. y Milstein S. Sphingosine-1-phosphate, a key cell signaling molecule. The Journal of
Biological Chemistry (2002) 277, 25851-25854.
Spiegel S. y Milstein S. Sphingosine-1-phosphate: an enigmatic signalling lipid. Nature (2003) 4,
397-407.
Stone J., Heard, J., Asai T., Ausubel, F. Stimulation of fungal mediated cell death by fumonisin B1
and selection of fumonisin B1-resistant (fbr) Arabidopsis mutants. The Plant Cell (2000) 12,
1811-1822.
Stryer Berg, Tymoczko. Bioqumica. 5 Edicin. Ed. Revert. Barcelona Espaa 2003. Pg 720.
Snyrychova I., Ayaydin F., Hideg E. Detecting hydrogen peroxide in leaves in vivo- a comparison of
methods. Physiologia Plantarum (2008) 135, 1-18.
Takahashi Y., Berberich T., Kanzani H., Matsumura H., Saitoh H., Kusano T., Terauchi R. Serine
palmitoyltransferase, the first enzyme in sphingolipid biosynthesis, is involved in non-host
resistance. Molecular Plant-Microbe Interactions (2009) 22, 31-38.
Tamura K., Mitsuhashi N., Nishimura I., Imai H. Characterization of an Arabidopsis cDNA encoding
a subunit of serine palmitoyltransferase, the initial enzyme in sphingolipid biosynthesis. Plant
Cell Physiology (2001) 42, 1274-1281.
Thordal-Christensen H., Zhang Z., Wei Y., Collinge D. Subcellular localization of H2O2 in plants.
H2O2 accumulation in papillae and hypersensitive response during barley-powdery mildew
interaction. The Plant Journal (1997) 11, 1187-1194.
Tiedemann A. Evidence for a primary role of active oxygen species in induction of host cell death
during infection of bean leaves with Botrytis cinerea. Physiological and Molecular Plant
Pathology (1997) 50, 151-166.
Toyooka K., Moriyasu Y., Goto Y., Takeuchi M., Fukuda H., Matsuoka K. Protein aggregates are
transported to vacuoles by a macroautophagic mechanism in nutrient-starved plant cells.
Landes Bioscience. (2006) 2, 96-106.
Torres M.A., Dangl J.L., Jones J. Arabidopsis gp91phox homologues AtrbohD and AtrbohF are
required for accumulation of reactive oxygen intermediates in the plant defense response.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (2002) 99,
517-522.
Torres M.A. Especies reactivas de oxgeno en la respuesta contra patgenos en plantas.
Biojournal 5, 1-7.

76
 BIBLIOGRAFA

Torres M.A., Jones J., Dangl J. Pathogen-induced, NADPH oxidase-derived reactive oxygen
intermediates suppress spread of cell death in Arabidopsis thaliana. Nature Genetics (2005)
37, 1130-1134.
Torres M.A., Jones J., Dangl J. Functions of the respiratory burst oxidase in biotic interactions,
abiotic stress and development. Current Opinion in Plant Biology (2005) 8, 397403.
Torres M.A., Jones J., Dangl J. Reactive oxygen species signaling in response to pathogens. Plant
Physiology (2006) 141, 373-378.
Tsegaye Y., Richardson C.G., Bravo J.E., Mulcahy B.J., Lynch D.V., Markham J.E., Jaworski J.G.,
Chen M., Cahoon E.B., Dunn T.M. Arabidopsis mutants lacking long chain base phosphate
lyase are fumonisin-sensitive and accumulate trihydroxy-18:1 long chain base phosphate. The
Journal of Biological Chemistry (2007) 282, 2819528206.
Uknes S., Mauch-Mani B., Moyer M., Potter S, Williams D., Dincher S., Chandler D, Slusarenko A.,
Ward E., Ryals J. Acquired resistance in Arabidopsis. Plant Cell (1992) 4, 645-656.
Van Breusegem F., Vranova E., Dat J., Inze D. The role of active oxygen species in plant signal
transduction. Plant Science (2001) 161, 405-414.
VanDoorn W., Woltering E. Many ways to exit? Cell death categories in plants. Trends in Plant
Science (2005) 10, 117-122.
Wang C.F., Huang L.L., Buchenauer H., Han Q.M., Zhang H.C., Kang Z.S. Histochemical studies
on the accumulation of reactive oxygen species (O-2 and H2O2) in the incompatible and
compatible interaction of wheat- Puccinia striiformis f. sp. tritici. Physiological and Molecular
Plant Pathology (2007) 71, 230-239.
Wang E., Norred W.P., Bacon C.W., Riley R.T., Merril A.H. Inhibition of sphingolipid biosynthesis
by fumonisins. The Journal of Biological Chemistry (1991) 266, 14486-14490.
Wang W., Yang X., Tangchaiburana S., Ndeh R., Markham J.E., Tsegaye Y., Dunn T.M., Wang
G.L., Bellizzi M., Parsons J.F., Morrissey D., Bravo J.E., Lynch D.V., Xiao S. An
inositolphosphorylceramide synthase is involved in regulation of plant programmed cell death
associated with defense in Arabidopsis. The Plant Cell (2008) 20, 3163-3179.
Wit P.J.G.M. How plants recognize pathogens and defend themselves. Cellular and Molecular Life
Sciences (2007) 64, 2726-2732.
Wojtaszek P. Oxidative burst: an early plant response to pathogen infection. Biochemistry Journal
(1997) 322, 681-692.
Worrall D., Ng C., Hetherington A.M. Sphingolipids, new players in plant signaling. Trends in Plant
Science (2003) 8, 317-320.

77
 BIBLIOGRAFA

Zhang S., Klessig D.F. Salicilic acid activates a 48 kDa MAP kinase in tobacco. Plant Cell (1997) 9,
809-824.
Zhang S., Klessig D.F., Activation of the tobacco SIPK kinase by both a cell wall derived
carbohydrate elicitor and purified proteinaceous elicitins from Phytophthora spp. Plant Cell
(1998) 10, 435-449.
Zhang S. y Klessing D.F. MAPK cascades in plant defense signaling. Trends in Plant Science
(2001) 6, 520-526.
Zhang S., Liu Y., Klessig D.F. Multiple levels of tobacco WIPK activation during the induction of
cell death by fungal elicitins. Plant Journal (2000) 23, 339-347.
Zimmerli L., Stein M., Lipka V., Schulze-Lefert P., Somerville S. Host and non-host pathogens elicit
different jasmonate/ethylene responses in Arabidopsis. The Plant Journal. (2004) 40, 633-
646.
Zipfel, C., Robatzek, S., Navarro, L., Oakeley, E.J., Jones, J.D., Felix,G., and Boller, T. Bacterial
disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception. Nature (2004) 428, 764767.

78
 APNDICE

II. APNDICE

1. Composicin del medio Hoagland-Arnon (Benton, 1982)

Macronutrimentos
Reactivo Concentracin final Micronutrimentos

KNO3 6 mM Reactivo Concentracin

Ca(NO3)24H2O 4 mM MnCl24H2O 9 M

NH4H2PO4 1 mM H3BO3 46 M
MgSO47H2O 2 mM ZnSO4 7H2O 0.8 M
KNO3 6 mM CuSO4 5H2O 0.3 M
1mL/L de medio (1g/200 mL) Fe-EDTA* H2M6O4 H2O 0.1 M
pH final 5.2-5.5

Fe-EDTA: cido etilendiamino tetraactico (sal sodio-hierro).

2. Medios de cultivo para crecer Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 avrRPM1 y
Pseudomonas syringae DC3000 vir.
Medio B de King
Proteasa peptona (10 g/L)
K2HPO4 (1.5 g/L)
Glicerol (12 g/L)
Agar (15 g/L)

Para Pst DC3000 avrRPM1 agregar por cada 200 mL de medio B de King
200 L de Rifampicina (50 mg/mL)
200 L de Tetraciclina (20 mg/mL)
2 mL MgCl2 1 M

Para Pst DC3000 vir agregar por cada 200 mL de medio B de King
200 L de Rifampicina (50 mg/mL)
2 mL MgCl2 1 M

79
 APNDICE

3. Preparacin del inculo bacteriano de Pst

1. De la cepa de Pst congelada a -70 C se toma una alcuota y se estra en una placa de agar
King B/Rif/Tet en el caso de la cepa avirulenta y en una placa de agar King B/Rif en el caso de la
cepa virulenta . Se incuba durante 48 h a 29 C
2. Posteriormente, se selecciona una colonia aislada y se estra en la placa de agar
correspondiente y se incuba a 29 C durante 24 h.
3. Se toman asadas de la placa de agar y se prepara una suspensin bacteriana en solucin de
MgCl2 10 mM estril. Se ajusta la densidad ptica a una =600 nm a 0.1 UDO
(0.1 UDO= 1 x 108 UFC/mL).

80