Inmunodifusion Radial (IDR)

La formación de complejos antígeno – anticuerpo es fundamental en la respuesta inmune específica para la

remoción de agente infecciosos del cuerpo, debido a que cada anticuerpo puede unir más de un antígeno,
ya que cada antígeno multivalente puede ser unido por más de una molécula de anticuerpo, grandes
complejos macromoleculares pueden formarse producto de esta interacción secundaria. La precipitación de
estos complejos macromoleculares en un medio gel osado es utilizada la técnica de Inmunodifusion radial
para cuantificar diversas proteínas plasmáticas en muestras biológicas.

Fundamento de la técnica

Usaremos como ejemplo el Dosaje de haptoglobina humana en suero para explicar el fundamento de la
técnica, mediante la inyección de haptoglobina humana a animales de otras especies obtendremos un anti-
suero con anticuerpos policlonales específicos dirigidos contra este antígeno.

Estos anticuerpos caprinos específicos anti-haptoglobina humana, son incorporados a agarosa estado
líquido, la cual es luego vertida en un soporte adecuado en el que se le permite solidificar, luego pequeños
agujeros son realizados en la agarosa en los cuales se depositaran 5 microL de calibradores de
concentración de haptoglobina humana con el objetivo de realizar una curva estándar y una cantidad similar
a las muestras incógnitas es depositada en los otros agujeros.

Durante el tiempo de incubación que dependerá entre otras variables del tamaño de la molécula a adosar,
los antígenos en solución difunden radialmente hacia afuera del agujero, la difusión continuara hasta que
antígenos y anticuerpos se encuentren en las proporciones adecuadas, situación que generada la formación
de un anillo estable de precipitación conocido como zona o punto de equivalencia.

La inmuno difusión radial simple se basa en el principio que existe una relación cuantitativa entre la cantidad
de antígeno presente en la muestra evaluada y el diámetro del resultante anillo de precipitación, gracias a
esto se puede construir una curva de calibración graficando el diámetro al cuadrado de los anillos de
precipitación versus la concentración de los calibradores, luego podremos determinar los valores de
haptoglobina de las muestras incógnitas interpolando los diámetros de los agujeros correspondientes en la
curva lineal obtenida.

Parte Práctica

El primer aspecto a considerar es la conservación de las placas, se debe presar atención a dos aspectos
fundamentales, el primero es la temperatura (Las placas de IDR se conservan en heladera de 2 a 8 grados
centígrados, tratándose de agar debe prestarse especial atención a que no se congele por ninguna causa,
ya que si esto sucede el reactivo se malogra y puede ser descartado, por este motivo debemos evitar colocar
las placas en contacto con el fondo de la heladera, ya que ahí se encuentra el tubo por donde circula el
líquido refrigerante) y el otro aspecto a cuidar es que las placas deben estar siempre en posición horizontal
tanto durante su transporte como en su almacenamiento, guardaremos las placas siempre el posición
invertida es decir con la tapa hacia abajo para evitar la condensación de líquidos en los pocillos; si al sacar
la placa encontramos condensación de líquido en la tapa, debemos evitar invertirla para que el líquido no
caiga en los pocillos, una vez retirada la tapa si llegara a haber liquido en el pocillo dejaremos la placa
destapada sobre la mesa durante unos minutos hasta que el líquido se halla evaporado y podamos realizar
la siembre correctamente. Nunca debemos utilizar un pocillo que tenga condensación de líquido dentro.

El volumen de muestra a dispensar en cada pocillo es de 5 microL, para dispensar este volumen podemos
utilizar una pipeta Hamilton o una pipeta automática de volumen fijo de 5 microL o de rango acotado de 0 a
10 microL, el uso de pipetas de rango muy amplio puede generar errores en el dispensado de cantidades.

Si ya tenemos lista con la pipeta con la que trabajaremos, el suero control y las muestras; entonces estamos
listos para comenzar. En este caso trabajaremos con muestra de suero fresco, debemos evitar usar sueros
lipemicos, hemolizados o que presenten partículas en suspensión; debido al pequeño volumen y la
viscosidad de la muestra debemos usar la técnica de pipeteo reverso que es la que nos brinda mayor
seguridad, es aconsejable el uso de micro tips, la técnica de pipeteo reverso consiste en presionar el embolo
hasta el último tope para tomar la muestra y desplazarla hasta dispensarla de esta manera queda algo de
muestra en el tip que descartaremos.

En primer lugar sembraremos 5 microL de suero control y a continuación las muestras, tendremos especial
cuidado de no tocar los borden de los pocillos; una vez realizada la siembre del suero control y las muestras,
colocaremos un pequeño trozo de algodón humedecido en el centro de la placa y la cerraremos cuidando el
correcto ajuste de la tapa, incubaremos la placa en forma invertida a temperatura ambiente y en cámara
húmeda.

Es importante evitar los cambios bruscos de temperatura durante la incubación, en particular el descenso
de la misma durante la noche, ya que si leyésemos los halos al tiempo no adecuada, es posible que midamos
diámetros inferiores a los esperados, ya que estos aún no han llegado a su máxima extensión, en estos
casos de debe realizar una nueva medición dejando difundir las muestras 12 o 24 horas más, cumplido el
tiempo de incubación procederemos a leer los resultados donde hay dos formas de hacerlo por medio de la
regla de lectura o mediante una lupa graduada.

Una vez que tenemos los diámetros de los halos, utilizaremos la tabla diámetro vs concentración que viene
provista junto con la placa para encontrar las concentración correspondientes a las muestras, primero
verificaremos que el control dio el resultados esperado y una vez revisado esto encontraremos los valores
de las muestras incógnitas. Luego las placas se vuelven a guardar en la heladera con el algodón humedecido
en su centro de forma invertida.

Durante los segundos seis meses de la vida útil de la placa, osea que el control no arrojara el resultado
esperado deberemos construir nuestra propia curva de calibración, eliminando de esta manera las fuentes
de errores sistemáticos, como por ejemplo los generados por la pipeta mal calibrada, tiempos o temperaturas
de incubación diferentes a los indicados.

Para poder hacer los puntos de nuestra curva, lo obtendremos realizando una dilución al 1/4 del suero control
para el primer punto, luego una dilución 1/1 el control puro para el segundo punto y el tercer punto de la
curva lo obtendremos sembrando tres veces el suero control en el mismo pocillo esperando que este difunda
totalmente entre siembra y siembra. Es importante recordar que si la curva se realiza manualmente la
ordenada de origen de la curva debe estar comprendida entre 10 y 12 milímetros cuadrados, una vez
graficada la curva diámetro cuadrado vs concentración, podremos obtener las concentraciones de la
muestras incógnitas ingresando el valor del halo de cada una de ellas.

Inmunodifusion doble

 Conceptos previos:
o Anticuerpo: se definen como una inmunoglobulina capaz de una combinación especifica con
el antígeno que ha causado su producción en un animal susceptible, ellos son producidos en
respuesta a la invasión de moléculas foráneas en el cuerpo, los anticuerpos existen como
una o más unidades en forma de “Y” compuesto por 4 cadenas, dos de ellas son pesadas y
dos ligeras, esto se divide en cinco clases de inmunoglobulina IgG, IgM, IgA, IgD e IgE.
o Antígeno: Sustancia foránea que elicita una respuesta inmune cuando es introducida dentro
de tejidos de animales susceptibles y que son capaces de combinar con los anticuerpos
específicos formados. Generalmente poseen un alto peso molecular y comúnmente son
proteínas o polisacáridos pero también existen sustancias pequeñas llamadas Atenos, los
antígenos que elicita una fuerte respuesta inmune se dice que son altamente inmunogénicas
 Características:
 Áreas de estabilidad estructural dentro de la molécula
 Un peso molecular mínimo de 8000 a 10000 daltons, aunque los haptenos con
pesos moleculares tan bajos como 200 Da han sido usados en presencia de
proteínas acarreadoras.
 La habilidad de ser procesado por el sistema inmune.
 Regiones inmunogénicas accesibles al mecanismo formado por el anticuerpo.
 Elementos estructurales que sean suficientemente diferentes al huésped.
 Para péptidos antígenos, regiones que contengan por lo menos 30% de
aminoácidos inmunogenicos: K, R, E, D, Q, N.
 Para péptidos antígenos, significante hidrofobicidad o residuos cargados.

El principio básico de cualquier técnica inmunoquimica es el de que un anticuerpo específico

se una con un antígeno específico, para dar lugar a un complejo anticuerpo antígeno
exclusivo, las partes de las regiones hipervariables del anticuerpo que contactan con el
antígeno se denomina paratopos y la región del antígeno que puede específicamente unirse
a un anticuerpo se denomina epitope

o Definición de Inmunodifusion
El método de Ouchterlony, es un método de estudio basado en la difusión del antígeno y un
anticuerpo en un gel, generalmente es agar con la subsiguiente formación de un inmuno
precipitado en el caso de que el anticuerpo sea específico para el antígeno que se está
estudiando, la técnica empleada es la difusión doble.
La técnica de Ouchterlony se realiza en placas de agar, en donde se practican pocillos, en
uno de estos pozos se coloca el suero o muestras a investigar y el resto se coloca el
anticuerpo preparado frente a la sustancia que se quiere identificar; el objetivo y finalidad es
 detectar de manera cuantitativa y cualitativa la presencia de anticuerpos de conejo frente a
antígenos (anticuerpos) humanos.
 Procedimiento para la Inmunodifusion
Inicia con la obtención del suero humano, se extrae 8ml de sangre, luego incubar o enfriar de 20 a
30 minutos, luego centrifugar de 2000 a 2500 rpm por 15 minutos.
Luego pasaremos a la primera inoculación, que es la inoculación del suero humano al conejo con 2.5
mL de suero humano en la zona peritoneal del conejo, luego de los 15 días se realiza la extracción
sanguínea para obtener el suero de humano, luego incubar o enfriar de 20 a 30 minutos, luego
centrifugar de 2000 a 2500 rpm por 15 minutos y obtendremos el suero.
En la segunda inoculación, sería la inoculación del suero al conejo con 2.5 mL de suero humano en
la zona peritoneal del conejo, luego de 12 días se procede a la obtención del suero de conejo con
anti-anticuerpo humano, para eso se realiza una tercera expresión de sangre para obtener el suero
humano de igual forma se lleva a refrigerar el tubo de sangre obtenida durante 20 a 30 minutos para
que se forme el coagulo y luego se lleva a centrifugar de 2000 a 2500 rpm por 15 minutos.
Ahora con ayuda de una jeringa hipodérmica o con una pipeta Pasteur de vidrio se retira el suero y
se coloca en un VIAL para su posterior refrigeración.
 Punción cardiaca
Previamente se rasura el conejo en la zona pectoral y luego se sujeta al conejo tomando una posición
cubito dorsal y se realiza la punción, la sangre obtenida se refrigera durante 20 a 30 minutos y se
centrifuga de 2000 a 2500 rpm por 15 minutos, se separa el suero y se reserva en refrigeración.
 Verificación de la respuesta inmune mediante el método de Inmunodifusion doble
Primero se prepara 0.75 g de agar agar en 50 ml de agua destilada y se homogeniza, luego en una
lámina portaobjetos se extiende con un hisopo una fina capa de agar y se deja secar, luego en la
lámina preparada anteriormente, con una pipeta de 5 ml, se extiende una capa gruesa de agar liquido
en toda la superficie de la lámina y se deja solidificar, luego se cortan y extraen dos círculos de 4 mm
de diámetro con una separación de 2 mm en la lámina con la capa de agar para obtener 2 pocillos y
sellamos la base del pocillo con agar, luego con una pipeta Pasteur de vidrio, se coloca en cada
pocillo una muestra de suero humano(ANTIGENO) y el suero del conejo (ANTICUERPO) con anti-
anticuerpo humano; se deja en una cámara húmeda durante 24 h y 48 h, luego la observación de
bandas nos confirma el desarrollo de anti-anticuerpo humano en el conejo.
Cuando difunden, ambos sistemas se encontraran y se formaran en la zona de equivalencia del
complejo antígeno anticuerpo correspondiente que se hace visible en forma de una línea de
precipitación, esta técnica de Ouchterlony permite identificar sustancias según la forma de unirse las
líneas de precipitación de dos o varios sistemas.
El diámetro de las difusiones nos puede indicar el nivel de concentración del anticuerpo frente a la
concentración del antígeno “grado de titulación”.
Como resultado la concentración de los anticuerpos anti-anticuerpo humano que genero el conejo es
menor a las concentraciones de anticuerpos en el suero humano; ya que la línea de precipitación se
encontró más cercana al anticuerpo que al antígeno.