Universidad Nacional Autnoma de Mxico

Facultad de Estudios Superiores Zaragoza

LABORATORIO DE INMUNOLOGIA CLNICA

Reacciones de Precipitacin.

Profesores: QFB Mara de las Mercedes Zamudio Duran

QFB Francisco Javier Parada Garca
Mtra. Yolanda Flores Cabrera
Dr. Osvaldo Daniel Casteln Martnez

Integrantes del equipo:

Grupo: 1802
Equipo: 3
Integrantes.
Nombre:

Firma

Herrera Lpez Ema Elvira.

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Villa Reyes Odra Berenisse.

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Valle Medina Antonio.

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Practica 7. Reacciones de Precipitacin.

Introduccin.
La inmunoqumica cobra un gran impulso en las primeras dcadas del siglo XX
con los trabajos de Karl Landsteiner (1868-1943). Su primera contribucin de
importancia haba sido la descripcin, mediante reacciones de aglutinacin, del
sistema de antgenos naturales (ABC0) de los eritrocitos humanos (1901-1902),
completada (en colaboracin con Von Dungern y Hirzfeld), con las
subdivisiones del grupo A y el estudio de su transmisin hereditaria. Estos
trabajos sirvieron de estmulo para avanzar en el desentraamiento de la
especificidad qumica de los antgenos que determinan la formacin de
anticuerpos. Landsteiner estudi sistemticamente las caractersticas de
inmunogenicidad y especificidad de reaccin de antgenos con anticuerpos,
valindose de la modificacin qumica de antgenos, denominando haptenos a
aquellos grupos qumicos que por s mismos no desencadenan formacin de
anticuerpos, pero s lo hacen tras ser conjugados a protenas portadoras. La
cuestin de las reacciones antgeno-anticuerpo se convirti en otra polmica
entre escuelas hasta finales de los aos 20. Mientras Ehrlich y sus seguidores
mantenan que estas reacciones tienen una base puramente qumica, Bordet y
sus discpulos las explicaban como fenmenos fsicos de reacciones entre
coloides. La resolucin del debate debi aguardar hasta finales de los aos 30,
al incorporarse avances tcnicos como la electroforesis, la cromatografa en
papel, la ultracentrifugacin y el microscopio electrnico. Heidelberg y Kendall
(1936) purificaron anticuerpos a partir de sueros por disociacin de
precipitados. Tiselius (1939) demostr que los anticuerpos constituyen la
fraccin gamma-globulnica del suero. En 1959, Rodney R. Porter y Gerald M.
Edelman presentan el modelo fundamental de las inmunoglobulinas (dos
cadenas pesadas y dos cadenas ligeras) y su estructura qumica.,
acontecimiento que separ los 200 aos de la historia de la inmunologa en dos
perodos, en los cuales ms de 70 investigadores han hecho su contribucin en
los campos de: la inmunidad, la serologa, la inmunoqumica y la
inmunobiologa. Durante este lapso de tiempo se descubre que la sntesis de
anticuerpos ocurre en las clulas plasmticas, aunque stas no son puestas en
relacin an con los linfocitos; durante muchos aos se sigui creyendo que los
linfocitos eran clulas pasivas, sin funcin inmune. Por aquella poca se
describe, tambin, la diversidad de inmunoglobulinas, llegndose al
establecimiento de una nomenclatura. Enseguida comienza la era de los
mltiples experimentos sobre timectoma en ratones neonatos y sobre
bursectoma en aves, as como los de reconstitucin de animales irradiados,
con timocitos y clulas de la medula sea, y que permiten afirmar el papel
esencial de los linfocitos, encuadrarlos en tipos funcionales T y B, y
relacionarlos con las respuestas inmunes celular y humoral, respectivamente.

Una importante faceta de la inmunologa de la primera mitad del siglo XX fue la

obtencin de vacunas. Se lograron toxoides inmunognicos a partir de toxinas
bacterianas, en muchos casos por tratamiento con formol: toxoide tetnico
(Eisler y Lowenstein, 1915) y toxoide diftrico (Glenny, 1921). En 1922 se
desarrolla la vacuna BCG contra la tuberculosis, haciendo uso de una cepa
atenuada de Mycobacterium tuberculosis, el bacilo de CalmetteGurin. La
utilizacin de coadyuvantes se inicia en 1916, por LeMoignic y Piroy.

Anticuerpos
Un anticuerpo se define como una inmunoglobulina (Ig) capaz de una
combinacin especifica con el antgeno que ha causado su produccin en un
animal susceptible. Ellos son producidos en respuesta a la invasin de
molculas forneas en el cuerpo. Los anticuerpos existen como una o mas
unidades en forma de Y, compuesta por cuatro cadenas polipeptdicas. Cada Y
contiene dos copias idnticas de una cadena pesada (HC, heavy chain), y dos
copias idnticas entre s de una cadena ligera (LC, light chain), llamadas as por
sus pesos moleculares relativos que son de aproximadamente 50kDa la cadena
pesada y de cerca de 25kDa la cadena ligera. Estas cadenas se mantienen
unidas mediante enlaces disulfuros intercatenarios. Estas cadenas pueden
separarse por reduccin de los enlaces S-S y acidificacin.
Los anticuerpos pueden ser divididos en cinco clases: IgG, IgM, IgA, IgD e IgE,
basado en el nmero de unidades Y y en el tipo de cadena pesada. Las
cadenas pesadas de IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, son conocidas como gamma, mu,
alpha, delta y epsilon (, , , y ), respectivamente. Las cadenas ligeras de
cualquier anticuerpo pueden ser clasificadas como tipo kappa () o lambda (),
basadas en pequeas diferencias estructurales polipeptdicas; sin embargo, las
cadenas pesadas determinan la subclase de cada anticuerpo.
Antgenos
El principio bsico de cualquier tcnica inmunoqumica es el de que un
anticuerpo especfico se unir con un antgeno especfico para dar un complejo
anticuerpo-antgeno exclusivo. La definicin clsica de antgeno es cualquier
sustancia fornea que elicita una respuesta inmune cuando es introducida
dentro de tejidos de animales susceptibles y que son capaces de combinar con
los anticuerpos especficos formados. Los antgenos son generalmente de alto
peso molecular y comnmente son protenas o polisacridos. Polipptidos,
lpidos, cidos nucleicos y otras molculas pueden tambin funcionar como
antgenos. La respuesta inmune puede tambin ser generada contra sustancias
pequeas, llamadas haptenos, si estos esta acoplados a una protena
acarreadora, como la albmina de suero bovino (BSA) u otras matrices
sintticas. Una variedad de molculas como drogas, azucares simples,

aminocidos, pequeos pptidos, fosfolpidos o triglicridos pueden funcionar

como haptenos. As, dndole suficiente tiempo, cualquier sustancia fornea
ser identificada por el sistema inmune y evocara la produccin de un
anticuerpo especfico. Sin embargo, esta respuesta inmune especfica es
altamente variable y depende mucho en parte del tamao, estructura y
composicin de los antgenos. Los antgenos que elicitan una fuerte respuesta
inmune se dice que son altamente inmunognicos. Las partes de las regiones
hipervariables del anticuerpo que contactan con el antgeno se denominan
partopos y la regin de un antgeno que puede especficamente unirse a un
anticuerpo es llamado eptope. Un eptope no tiene una propiedad intrnseca de
alguna estructura particular. Estos son usualmente uno a seis monosacridos o
5-8 residuos de aminocidos sobre la superficie del antgeno. Debido a que la
molcula de antgeno existe en el espacio, el eptope reconocido por un
anticuerpo puede depender de la presencia de una especfica conformacin
tridimensional del antgeno (por ejemplo, un sitio nico formado por la
interaccin de dos loops o subunidades de una protena nativa) o el eptope
puede corresponder a una regin de una secuencia primaria simple, as, los
eptopes son descritos como conformacionales y lineares, respectivamente. El
rango de posibles sitios de unin es enorme, ya que cada sitio de unin tiene
sus propias propiedades estructurales derivadas de enlaces covalentes, inicos
e interacciones hidroflicas e hidrofbicas. Para que exista una eficiente
interaccin entre el antgeno y el anticuerpo, el eptope debe estar fcilmente
disponible para la unin. Si la molcula blanco es desnaturalizada, por ejemplo,
por la fijacin, cambios de pH o durante la preparacin para el gel de
electrofresis, el eptope puede ser alterado y esto puede afectar su habilidad
para interactuar con un anticuerpo. Por ejemplo, algunos anticuerpos son
inefectivos en un Western-blot pero muy bueno en inmunohistoqumica debido
a que en el proceso, un complejo sitio antignico puede ser mantenido en el
tejido, mientras que en el otro procedimiento la preparacin de la muestra
altera la conformacin de la protena lo suficiente para destruir el sitio
antignico y as elimina el sitio de unin con el anticuerpo. 14 Si el producto de
un gene de inters est presente en concentraciones extremadamente bajas,
una opcin puede ser el uso de la informacin de la secuencia conocida de
nucletidos para derivar el correspondiente pptido para generar anticuerpos
especficos para esa secuencia. Caractersticas de un buen antgeno incluyen:
reas de estabilidad estructural dentro de la molcula.
Un peso molecular mnimo de 8000 a 10000 Daltons, aunque los haptenos
con pesos moleculares tan bajos como 200 Da han sido usados en presencia de
protenas acarreadoras.
La habilidad de ser procesado por el sistema inmune.

 Regiones inmunognicas accesibles al mecanismo formado por el

anticuerpo.
Elementos estructurales que sean suficientemente diferentes al husped.
Para pptidos antgenos, regiones que contengan por lo menos 30% de
aminocidos inmunognicos: K, R, E, D, Q, N.
Para pptidos antgenos, significante hidrofobicidad o residuos cargados.

Interaccin antgeno-anticuerpo
Lavar
Los antgenos
y anticuerpos
interactan
por complementariedad
espacial y no
GRC
por
centrifugacion
a
2000 rpm por 5 min son s/n TBS
por uniones covalentes. La asociacin especfica del antgeno y el anticuerpo
es dependiente del los puentes de hidrogeno, las interacciones hidrofbicas,
fuerzas electrostticas y las fuerzas de van der Waals; por lo general solo son
Ajustar
suspension
dedbiles
GRC
al 2% en
efectivas
en distancias
cortas. Todos estos son uniones
no covalentes,
TBS
aunque algunas de las asociaciones entre antgeno y anticuerpo pueden ser
bastante fuertes. Al igual que los anticuerpos, los antgenos pueden ser
multivalentes, ambos a travs de mltiples copias del mismo eptope, o a
leer a 550 nm con ajuste de
travs de la presencia
de mltiples
eptopes que son reconocidos por mltiples
blanco de agua
anticuerpos. Las interacciones que involucran multivalencias pueden producir
mayor estabilidad a los complejos, sin embargo la multivalencia puede tambin
resultar
en dificultades
estricas, por lo tanto reduciendo
la posibilidad
de
En
volumenenes
iguales
adicionar
hemolisina titulada a 2 u 50%
unin. hemoliticas
y suspension de GRC
hemoliticas y suspension de GRC

Incubar 30 minutoa a 37C en

La respuesta
inmune esbao
la actuacin integrada de un gran nmero de
metabolico
mecanismos heterogneos de defensa contra sustancias y agentes
extraos. En general, a las sustancias extraas se las denomina como
antgenos, y son ellos los que desencadenan en el organismo una
Preparar diluciones
serie de eventos celulares
que provocan la produccin de los
mecanismos de defensa.
Mezclaro e incubar 30 minutos a
37C

Objetivos.

Determinar la concentracin de complemento hemoltico en suero, para lisar el 50% de una

suspensin de glbulos rojos de carnero; en una muestra de suero problema.
Retirar los tubos y adicionar 1 mL
Mtodo
de TBS frio, excepto al testigo.

centrifugar a 2000 rpm por 5

minutos

Descartar sobrenadante en un
tubo limpio y leer a 550 nm

Resultados

Imagen 1: Precipitacin en capilar

Se observa que en todos los capilares hay precipitacin
aproximadamente en la misma altura, contrastndose entre s, teniendo
adems que en el control positivo no hay precipitado y tampoco en el
control negativo, todas las diluciones han mostrado precipitado en
menor proporcin en cuanto han ido diluyndose ms.

Imagen 2, precipitacin en sistema de 3 pozos de Ouchterlony

Se logra observar en el sistema de la derecha una reaccin de identidad
dada entre albumina y anticuerpo antialbumina, el sistema izquierdo no
ha mostrado la mnima reaccin.

Anlisis de Resultados

Conclusiones

Bibliografa:
Siachoque MO. Inmunologia: diagnostico e interpretacin de pruebas de
laboratorio. 1 ed. Bogot: Centro editorial Universidad del Rosario; 2006.
Pesntez HX. Diagnstico de Inmunoglobulinas por el Mtodo de
Inmunodifusin Radial [Tesis]. Ecuador: Universidad Catlica De Cuenca; 2011.
Freifelder D. Tecnicas de bioqumica y biologa molecular. 1 ed. Barcelona:
Reverte; 2003