Control de calidad del agua destilada

Para la preparación de medios, soluciones y tampones, debe utilizarse agua destilada que haya sido
sometida a controles periódicos que aseguren su calidad.

Controles periódicos:

 Requisitos del agua destilada:

o Conductividad.
o pH
o Contaminación microbiana
o Libre de sustancias bactericidas, inhibidoras o interferentes
o Se debe llevar un registro actualizado de los mismos.

Procedimiento para preparación de medios de cultivo, diluyentes y reactivos

Los medios de cultivo, soluciones y reactivos deben prepararse, almacenarse y utilizarse de acuerdo con un
procedimiento documentado.

 En dicho procedimiento debe haber una descripción del equipamiento necesario.

 El laboratorio debe colocar una etiqueta indicando la identificación y otros datos en los medios de
cultivo y reactivos.
 Debe haber un registro de preparación de medios de cultivo y reactivos.

Almacenamiento de los medios de cultivo y diluyentes preparados

Debe determinarse y verificarse el período de validez de los medios preparados en las condiciones de
conservación especificadas.

En general los medios preparados se guardan:

 En heladera no más de tres meses

 A temperatura ambiente no más de un mes en condiciones que impidan que su composición sea
modificada.

Observar cambio del color, evaporación, la deshidratación o el crecimiento microbiano.

REQUISITOS
Medios preparados por el laboratorio:

Se debe verificar (siempre que sea necesario) que los medios de cultivo y diluyentes preparados por el
laboratorio tengan las características adecuadas con respecto a:

 Recuperación o supervivencia de los microorganismos de interés.(Productividad)

 Inhibición o supresión de los microorganismos no deseados.(Selectividad)
 Propiedades bioquímicas (diferenciales y diagnósticas)
 Propiedades físicas (por ejemplo, pH, volumen)
 Sea estéril.

 
 Medio de cultivo
Parámetros a tener en cuenta para 
obtener un buen resultado.

 Agua: recipientes dónde se almacena el agua debe ser inerte.

 pH: la medida a 25 oC. pH +0.2. ajuste el pH con 1 M NaOH o 1M CLH
 Fundir en el agua hirviente volúmenes <500ml.
 15 ml de espesor agar en placas petri 90 mm.
 Secado de placas estufa 25-55 oC (20 min.) o en flujo laminar.
 Incubación: las pilas de platos < 6.

Medios listos para su uso

Todos los medios y diluyentes que se suministren en una forma directamente utilizable o parcialmente
completa deben ser validados antes de su utilización.

Se evalúa utilizando criterios objetivos del medio respecto a:

 La recuperación o supervivencia de los microorganismos de interés

 La inhibición o supresión de los microorganismos no deseados tiene que ser cuantitativa.
 Los atributos (por ejemplo: Propiedades físicas y bioquímicas).

Parte de esa validación es provista por las especificaciones de calidad del proveedor.

Reactivos

EVALUACIÓN DE LA CALIDAD DE LOS REACTIVOS

El laboratorio debe asegurarse que la calidad de los reactivos utilizados sea apropiada para los ensayos
realizados.

Ejemplo: Reactivos usados para revelar pruebas bioquímicas

Realizo controles positivo y negativo utilizando microorganismos que sean trazables a colecciones de
cultivos nacionales o internacionales reconocidas.

Control de las pérdidas de volumen

durante la esterilización:

Debe verificarse que no haya pérdidas significativas de volumen de los diluyentes durante el proceso de
esterilización en autoclave.

Este punto es especialmente importante en métodos cuantitativos.

El laboratorio debe tener :

Un procedimiento documentado.
Registro de datos obtenidos realizados en forma periódica.
 El laboratorio determina el intervalo en el que se efectúan estos controles.

Control de las pérdidas de volumen

durante la esterilización

Para la evaluación de la pérdida de volumen de los diluyentes:

1. Colocar un volumen fijo de diluyente en tubos de ensayo o frascos de dilución.

2. Medir el peso o volumen antes y después del proceso de esterilización en autoclave.
3. Con los datos obtenidos, se efectúa el cálculo y la inferencia estadística.

 LAVADO DE MATERIAL:

Otro aspecto a tener en cuenta es el correctolavado del material reciclable. El laboratorio de debe contar
con un instructivo para esta tarea.

Pasos:

 Descontaminación material de vidrio.

 Enjuague y se lavado con agua caliente y extran neutro (diluido al 2%)
 Enjuague nº de veces con agua corriente y luego un nº de veces con agua destilada. Eliminar el
detergente
 El material se seca en estufa y se acondiciona para ser esterilizado.

Eliminación de los reactivos:

Si bien la eliminación adecuada de los reactivos no es un problema que afecte directamente a la calidad,

DEBE REALIZARSE DE ACUERDO CON LA NORMATIVA VIGENTE EN MATERIA DE MEDIO AMBIENTE, SALUD
Y SEGURIDAD.

Las precauciones a tomar con suplementos conteniendo sustancias tóxicas se especificarán claramente en
cada caso de acuerdo a las instrucciones del fabricante.

Control de esterilidad
de los medios de cultivo y diluyentes:

¿ Fue efectivo el proceso de esterilización de los medios de cultivo y diluyentes?

PRUEBA: se incuban en estufa de cultivo.

 La temperatura y tiempo de incubación para esta prueba se corresponden con las condiciones
usadas durante el ensayo.
 Se realiza este ensayo sobre el 1% de las placas o tubo del comienzo y 1% de las placas o tubos del
final de verter o distribuir los medios o diluyentes.
 Este procedimiento se realiza por cada vez que se esteriliza un lote de medio de cultivo o
diluyente en autoclave o se esteriliza por filtración.

REGISTRO CONTROL DE ESTERILIDAD DE MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS

Datos a registrar:

 Fecha de realización del control

 Medio de cultivo o diluyente
 Indicación del proceso de esterilización (Ejemplo N º correlativo de proceso en autoclave o
filtración)
 Tiempo de incubación (en horas)
 Temperatura de incubación (º C)
 Resultado
 Conforme (SI o NO)
 Firma del personal responsable de la realización del control.

Síntesis parcial

En microbiología se le da especial énfasis a la calidad de los medios de cultivo y reactivos, tal que aquella sea
apropiada para los ensayos realizados.
La preparación y esterilización constituyen pasos críticos en el logro de este objetivo.
El fabricante en el momento de la entrega de medio de cultivo debe proveer información acerca de
las especificaciones de calidad.

El laboratorio debe contar con Procedimientos o Instructivos documentados e implementado para :

 La preparación y esterilización de medios de cultivo y diluyentes

 La preparación de reactivos
 Control de calidad del agua destilada.
 Lavado de material
 Control de las pérdidas de volumen de los diluyentes durante la esterilización en especial para
métodos cuantitativos.

EVALUACIÓN DE LA CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO:

El objetivo es definir la: metodología para evaluar la PRODUCTIVIDAD y SELECTIVIDAD de medios de cultivo
utilizados en el laboratorio de microbiología.

PRODUCTIVIDAD:

Definición: rendimiento, recuperación, crecimiento de un microorganismo que se espera que desarrolle en

el medio de cultivo.

Según el medio de cultivo, se usa una cepa apropiada de referencia target para evaluar la productividad

(ver anexo B de la norma ISO/TS 11133-2:2000)

EJEMPLO: En un medio de cultivo no selectivo como por ejemplo el PCA se evalúa el adecuado
desarrollo de las cepas target o blanco.

En este caso se usan E. coli ATCC 25922,

 S. aureus ATCC 6538 y B. subtilis ATCC 663

Selectividad:

Definición: la supresión del crecimiento de un microorganismo que se espera sea inhibido en el medio de
cultivo.

Según el medio se usa una cepa apropiada de referencia no-target para evaluar la selectividad
(ver anexo B de la norma ISO/TS 11133-2:2000)

En un medio de cultivo selectivo como por ejemplo

Caldo Lauril sulfato (LST)
se evalúa el desarrollo de las cepas target y no target.
En este caso las cepas target que se usan son
E.coli ATCC 25922, C.freundii ATCC 43864
  y las cepas no target Enterococcus faecalis ATCC 29212.
Evalúa reacciones características: gas y turbidez

En medios selectivos y/o diferenciales hay que evaluar:

 El crecimiento de las cepas target

 Hay que prestar atención también a la apariencia, tamaño y morfología de las colonias
(especificidad)
 El crecimiento de las cepas no-target debe estar en parte o completamente inhibido.

PARA EVALUAR CADA LOTE DE MEDIO DE CULTIVO según Norma ISO/TS 11133-2:2000

SE PUEDE EMPLEAR LOS SIGUIENTES MÉTODOS:

 Pruebas cuantitativas
 Pruebas semi-cuantitativas
 Pruebas cualitativas

EVALUACIÓN DE LA CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO:

La elección del empleo de una u otra metodología

será considerada en cada caso en particular
según el medio a evaluar, las capacidades y necesidades del laboratorio
ver ANEXO B norma ISO/TS 11133-2:2000.

MEDIO DE REFERENCIA
 El uso de un medio de referencia específico
  es obligatorio en los métodos de cuantitativos
(ver anexo B de la norma ISO/TS 11133-2:2000)

Para las pruebas semi-cuantitativas o cualitativas, el uso de un medio específico de referencia o

un medio de  cultivo que da una “la reacción positiva"
ayuda al ínterpretar los resultados.
El medio de referencia debe ser de conocida buena calidad  
(por ejemplo ser un medio listo para el uso  de calidad asegurada por el proveedor)

Cultivo de trabajo:
(según Instructivo de cultivos de referencia)

Se prepara un cultivo en fase estacionaria de la cepa a partir de la cepa de reserva almacenadas en el

laboratorio en un caldo no selectivo.
(por ejemplo caldo cerebro corazón)

Productividad:

Para evaluar la productividad de los medios de cultivo sólido, semisólido o líquidos ya preparados
esterilizados, los mismos deben ser inoculados con un microorganismo target apropiado o cultivo de trabajo.

Productividad: Pruebas cuantitativas

Para las pruebas cuantitativas la proporción de Productividad PR es definido como sigue: 

PR = Ns /No 

donde 

Ns: es el recuento total de colonias obtenido en el medio de cultivo a probar (obtenido de uno o más
placas) 

No: es el recuento total de colonias obtenido en el medio de cultivo de referencia definido obtenido de uno
o más placas que debe ser › 100 ufc.

Productividad: Pruebas cuantitativas

CRITERIO DE CONFORMIDAD:
Anexo B de la norma ISO/TS 11133-2:2000.

Allí figuran:
  Los microorganismos
 Tiempo y temperatura de incubación
 Criterios
 Medio de referencia que debe usarse según el medio a evaluar.
 PR debe ser mayor o igual a un valor límite para que el medio de cultivo sea conforme.

En general para que los medios no selectivos como el PCA sea conforme, el PR debe ser › a 0,7.

Productividad
Pruebas cuantitativas Ejemplo

Se desea evaluar la productividad del PCA.

El medio de referencia usado es agar tripticasa soya (TSA)

1) Ns ( dil -6):140 ufc

No ( dil -6): :170 ufc
PR = Ns /No
PR= 0,8 esto quiere decir que el medio testeado es conforme

2) Ns ( dil -6):100 ufc

No ( dil -6): 230 ufc
PR = Ns /No
PR= 0,4 esto quiere decir que el medio testeado
no es conforme en cuanto a su productividad.

Productividad: Pruebas semi-cuantitativas en medios de cultivos sólidos

 Se inocula en forma de
estrías diluciones del cultivo
con ansa calibrada de
acuerdo a la figura o modelo.
 Las placas inoculadas se
incuban a temperatura y
tiempo que depende del
medio de cultivo evaluado y
se observa el crecimiento.
 Se evalúa la productividad
del medio teniendo en
cuenta el valor de cada estría
con crecimiento.

 Productividad: Pruebas cualitativas

Se llevarán a cabo visualmente asignando un score de crecimiento.

Score para medios sólidos:

 0 no hubo crecimiento
 1 hubo crecimiento débil
 2 hubo buen crecimiento.

Score para medios líquidos:

 0 no hubo turbidez
 1 hubo turbidez muy tenue
 2 hubo buena turbidez

Selectividad:

Para llevar a cabo la prueba de la selectividad,

el medio de cultivo selectivo a evaluar y un medio de la referencia se inoculan con un microorganismo y

nivel apropiado.

Se emplea una suspensión del microorganismo de no-target que contiene 104cfu a 106cfu por ml se inocula
en la placa o en el tubo de medio.

Certificado de control de calidad de un no selectivo medio de cultivo

Certificado de control de calidad de un selectivo medio de cultivo

REGISTRO EVALUACION DE MEDIOS DE CULTIVO

La información a registrar es:

 Medio de cultivo evaluado.

 Nº ID o Nº lote de medio evaluado.
 Fecha de realización del análisis.
 Cepa usada (Género y especie del microorganismo y tipo y Nº de colección).
 Medio de referencia usado para evaluar la productividad.
 Medio de referencia usado para evaluar la Selectividad.
 Resultado de productividad (unidades).
 Resultado de selectividad (unidades).
 Medio de cultivo conforme (SI/NO)
 Personal responsable. 

Síntesis parcial

Los medios de cultivos sólidos, semisólidos y líquidos empleados para la realizar el ensayo deben ser
evaluados en cuanto a su productividad, selectividad y reacciones características.

Para ello se han desarrollado pruebas cuantitativas, semi-cuantitativas y cualitativas.

Las recomendaciones internacionales de organismos de acreditación se basan en la Norma ISO/TS 11133-
2:2000.

Es importante el uso de cultivos de referencia con adecuada trazabilidad.

Síntesis final

Un punto crítico a tener en cuenta a la hora de implementar y la ISO 17025 y acreditar el laboratorio es la
preparación, esterilización y evaluación de la calidad de los medios de cultivo empleados para realizar el
ensayo.

Las recomendaciones internacionales de organismos de acreditación se basan en la Norma ISO/TS 11133-

1:2000 y ISO/TS 11133-2:2000.

Esto implica una revisión de las prácticas cotidianas realizadas por el laboratorio y a su vez la seguridad que

los medios usados son adecuados a la finalidad prevista.