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Nombre del Procedimiento: Departamento:

ANALISIS DE SUPERFICIES INERTES. MICROBIOLOGIA

Clave:
MB-P-030

Elaboro: Reviso: Autorizo:


Q.B.P. Teresa G. Castañeda H. Q.F.B. Aurora Ortegón Ávila I.Q.M. José A. Roldán G.

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Junio 2007 – mayo 2009 Junio 2009 Tercera

ANALISIS DE SUPERFICIES INERTES.

1.- OBJETIVO.
 Este procedimiento proporciona las reglas para efectuar monitoreo de superficies inertes por
los métodos del hisopo, esponja, enjuague total y placa por contacto.

2.- ALCANCE.
El presente procedimiento se debe aplicar a las superficies inertes en general.

3.- DEFINICIONES.
Técnica de asepsia.- Toma de muestra bajo condiciones que no provoquen contaminación por
las personas, medio ambiente, herramientas de muestreo, etc.

4.- GENERALIDADES.
La higiene los alimentos implica una variedad de acciones, entre las cuales, el evitar la
contaminación ocupa lugar relevante. Cada fuente de contaminación que puede actuar sobre
los alimentos presenta sus propias peculiaridades y por ello requiere de métodos especiales
para lograr su control. Así ocurre con el agua, los manipuladores, equipo, envases, superficies
de trabajo, etc.
En el caso del equipo, este puede ser un vehículo pasivo de microorganismos, o puede
constituirse en la base material sobre la cual, con un aseo deficiente, entren en actividad y
lleguen a introducirse por millares en el alimento.
La calidad sanitaria de los alimentos, depende de la materia prima utilizada en su preparación y
de las condiciones higiénicas en que han sido elaborados, manejados y conservados,
incluyendo todas las superficies que están en contacto con ellos.
Dinero y esfuerzo invertido en una planta para seleccionar materias primas e instalar equipo
costoso puede perderse si la limpieza y desinfección en general, o específicamente en los
puntos críticos, no se realiza y evalúa su eficiencia correctamente. Existen procesos de lavado
y desinfección, que utilizan sustancias y condiciones de tratamiento propio para cada necesidad
en las distintas ramas de la industria de alimentos. Cuando las normas o recomendaciones
para su aplicación se siguen con acierto, los resultados son claramente satisfactorios. El
establecimiento de sistemas de higiene (lavado y sanitización) adecuados del equipo,
debidamente programados y en manos de personal responsable y adiestrado, debiera ser una
exigencia motivo de supervisión especial dentro de cada industria y por parte de la autoridad
sanitaria competente. El laboratorio proporciona un valioso recurso que permite evaluar
satisfactoriamente la eficiencia de estos procesos.
Para evaluar la eficiencia de la limpieza y saneamiento de las superficies, se han desarrollado
métodos y propuesto normas basadas en el número total de microorganismos por unidad de
superficie.

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Existen muchos métodos para tal efecto, el recuento de microorganismos viables en el equipo
tratado, es sencillo y confiable, aunque necesariamente requiere de tiempo para disponer de los
resultados.
Los métodos pueden aplicarse ya sea para buscar microorganismos indicadores, o un género
especial, cuando se trate de un problema particular.
Existen varios procedimientos, dentro de los cuales describiremos los más usuales:

5.- DESCRIPCION DE LA ACTIVIDAD.

5.1. MÉTODO DEL HISOPO.


Esta técnica se puede utilizar en superficies que sean regulares, lisas, pulidas. Consiste en
frotar un aplicador de madera u otro material de algodón (hisopo) estéril, humedecido con la
solución diluyente que recoge la flora microbiana en un área determinada para finalmente
suspenderla en el diluyente.
Siguiendo las instrucciones del método y contando con un valor normativo, es posible decidir
sobre el nivel de contaminación que prevalece sobre una superficie. Hay que tomar en
consideración la representatividad que ofrece este ensayo para sugerirlo a una planta o a un
proceso particular.
PRUEBA LIMITE PERMITIDO

Mesofílicos aerobios < 400 UFC/cm2 o unidad


Coliformes totales < 200 UFC/cm2 o unidad

Límite como referencia tomado de la norma oficial NOM-093-SSA1-1994. Prácticas de Higiene y Sanidad en la
preparación de alimentos que se ofrecen en establecimientos fijos.

MATERIAL.
• Tubos con tapón de rosca conteniendo 10 ml de solución diluyente.
• Hisopos estériles en sobres de papel manila o tubos de ensayo. Se pueden conseguir en
forma comercial.
• Plantillas de papel aluminio de 12 cm por lado con un cuadro de 5 x 5 cm recontado en el
centro y esterilizadas dentro de papel manila.

TOMA DE LA MUESTRA.
5.1.1. Muestreo de superficies.
Colocar la plantilla o bien imaginariamente delimitar un área aproximada de 5 x 5 cm ó 10 x 10
cm sobre la superficie que se va a muestrear. Sacar el hisopo asépticamente.
Si la superficie está seca humedecer el hisopo en la solución diluyente y presionar contra la
pared del frasco o tubo con un movimiento de rotación para quitar el exceso de líquido, en caso
contrario no es necesario hacer esto.

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Con el hisopo inclinado, frotar la superficie delimitada por la plantilla en 3 sentidos diferentes
(horizontal, vertical y oblicuo). Regresar el hisopo al tubo o frasco y romper la parte que estuvo
en contacto con los dedos.
Este método también puede utilizarse para buscar patógenos, substituyendo la solución
diluyente por el caldo de cultivo adecuado.

5.1.2. Muestreo de utensilios de comedor.


Utilizar tubos con l0 ml. Tomar un hisopo, mojarlo en la solución diluyente y exprimir el exceso
de líquido sobre la pared del tubo. Tomar la muestra del utensilio con el hisopo tratando de
tomar de la superficie que está en contacto con el alimento o con la boca. Regresar el hisopo al
tubo y romper la parte que estuvo en contacto con los dedos.

CÁLCULO Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS.


5.1.1 Superficies.
Contar todas las colonias que se desarrollen en las cajas, hacer el cálculo de las colonias por
ml, multiplicar por el volumen de diluyente empleado y dividirlo entre cm 2 de la superficie. Los
resultados se expresan como UFC/cm2.

5.1.2. Utensilios de comedor.


Hacer el cálculo del número de colonias por ml, multiplicar el volumen total de la solución
diluyente de muestreo. Informar UFC/utensilio.

5.2. MÉTODO DE LA ESPONJA.


Esta técnica se puede aplicar eficientemente para tomar muestras de superficies en áreas
grandes. Se utilizan esponjas estériles de espuma de poliuretano generalmente de 13 x 7.5 x 4
cm (o de dimensiones requeridas) y bolsas de plástico transparentes estériles de las
dimensiones necesarias.
Consiste en pasar la esponja sobre toda la superficie del equipo o utensilio que se va a
muestrear pudiendo estimar de esta manera el contenido microbiano de toda la superficie y no
únicamente de dimensiones limitadas.
La bolsa de plástico se invierte a modo de guante sobre la mano del muestreado, haciendo que
la parte interna pase a ser la externa y con la mano así protegida, se toma una esponja
retirándola de la envoltura de papel manila.
Se humedece la esponja con un poco de la solución diluyente estéril y se frota completamente
toda la superficie que se va a muestrear. Terminando el muestreo, se vuelve la bolsa a su
posición original quedando la esponja en su interior y se adiciona el resto del volumen de la
solución diluyente a la bolsa que plástico que contiene la esponja y se homogeniza exprimiendo
repetidamente la esponja. Esta suspensión será considerada como la muestra directa y a partir
de ella se harán las diluciones necesarias.
Las superficies y utensilios a muestrear pueden ser de forma y tamaño muy diverso, tales como,
mesas, tablas de picar (tratando de llegar a las hendiduras y esquinas), utensilios de comedor

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(tomar muestra de la superficie del utensilio con excepción del mango, prestando atención a la
parte interna como es el caso de los tenedores entre diente y diente), vasos, platos (tomar la
superficie expuesta a los alimentos, incluyendo el borde que está en contacto con los labios del
usuario), manos (la palma de la mano y parte interna y externa de cada uno de los dedos), etc.

MATERIAL.
• Esponjas de poliuretano o de celulosa de dimensiones apropiadas a la superficie que se va a
muestrear. Envueltas individualmente en papel manila y esterilizadas en autoclave a 121ºC
por 30 min. Se pueden conseguir en forma comercial estériles.
• Frascos con tapa de rosca con 50 ml o 100 ml (o el volumen necesario).de solución diluyente
estéril.
• Bolsas de plástico estériles de la dimensión necesaria.

TOMA DE LA MUESTRA.
Sacar la esponja utilizando la bolsa invertida a manera de guante, humedecerla con la solución
diluyente y frotar vigorosamente con la esponja el área que se va a muestrear.
Regresar la esponja a la bolsa de plástico y verter el resto del líquido diluyente. Cerrar la bolsa y
homogenizar exprimiendo repetidamente la esponja.

CÁLCULO Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS.


Contar las colonias y calcular el número de UFC/ml multiplicar por el volumen del diluyente y
reportar por unidad de superficie (cm2) o por utensilio.

5.3. MÉTODO DE PLACA POR CONTACTO, RODAC (Replicate Organism Detection and
Counting).
Este método se recomienda para obtener datos cuantitativos en superficies planas e
impermeables. Idealmente la placa se debe utilizar sobre superficies que han sido previamente
saneadas y desinfectadas. En lugares con un alto grado de contaminación, resultará un
crecimiento masivo en las placas que dificultará los recuentos.
En el caso de muestreo de superficies previamente tratadas con desinfectante, es necesario
que se agregue al medio de cultivo un agente neutralizante adecuado, p. ej. lecitina para
neutralizar compuestos cuaternarios de amonio y polisorbato 80 para neutralizar desinfectantes
fenólicos.
En superficies en las que se sospeche que se encuentran un poco más contaminadas se deben
tomar suficientes muestras para obtener datos representativos. La selección del sitio al azar
permitirá comparaciones adicionales y eliminará posibles interferencias.

MATERIAL
• Las placas RODAC se pueden obtener en forma comercial.

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• Cuando se preparan en el laboratorio, deben vaciarse de 15-16 ml de agar para cuenta


estándar en cajas de petri desechables. (El agar en la placa debe quedar ligeramente
convexo en la superficie del centro, para poder hacer contacto adecuado con la superficie.
• Se pueden emplear medios de cultivo para determinar indicadores o bien patógenos.

TOMA DE MUESTRA
Quitar la tapa de plástico y presionar cuidadosamente el agar contra la superficie, mediante
movimiento rotatorio uniforme, presionar sobre la parte de atrás de la placa para efectuar el
contacto. Colocar de nuevo la tapa e incubar en posición invertida 24-48 h a 35+/-1ºC.

CÁLCULOS Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS


Efectuar la lectura a las 24 h para prevenir crecimiento incontable, en caso de observar
crecimiento pobre incubar 24 h más.
Se cuentan las colonias y se informa el número por placa o por cm2, dividiendo el número de
colonias, entre la superficie de contacto de la caja.
Debido a que la interpretación es relativa, cada laboratorio o industria, deberá establecer sus
propios valores que constituyen un área limpia. El Comité sobre contaminación microbiana de
superficies de laboratorios de la APHA establece los siguientes límites:

No. COLONIAS POR PLACA RODAC CALIDAD


0-25 BIEN
25-50 REGULAR
50 ó más POBRE

5.4. MÉTODO DE ENJUAGUE TOTAL


Este método se emplea para tomar muestras de objetos pequeños como son cucharas,
tenedores, biberones, etc. o para el muestreo de superficies interiores de envases, botellas y
bolsas de plástico, etc.

MATERIAL
• Frascos de boca ancha con 50 ml de solución diluyente, o con la cantidad necesaria según
el tamaño del objeto que se va a muestrear.
• Bolsas de plástico estériles de tamaño adecuado al objeto que se va a muestrear.

TOMA DE MUESTRA
5.4.1 Utensilios.
Sumergir la superficie de los utensilios que estén en contacto con la boca (cucharas, tenedores,
etc.) en frascos de boca ancha con la solución diluyente o bien, verter la solución dentro de una
bolsa estéril, colocar el objeto que se va a muestrear, enjuagar perfectamente bien el objeto y
regresar el líquido al frasco inicial.

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5.4.2 Superficies interiores.


Introducir en el envase o bolsa que se va a muestrear 10 ml o el volumen adecuado de solución
diluyente.
Enjuagar haciendo correr el líquido por toda la superficie, agitar bien.
Regresar el contenido de los envases al frasco.

CÁLCULO Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS


Contar las colonias y expresar las UFC/utensilio o envase, tomando en cuenta el volumen del
diluyente y si se efectuaron diluciones posteriores.

6. ANÁLISIS DE LAS MUESTRAS PARA LOS CUATRO MÉTODOS ANTERIORES.

Transferir volúmenes de 1 ml y 0.1 ml o diluciones de la muestra a cajas de Petri marcadas con


la clave, fecha, medio de cultivo y dilución inoculada.
Agregar el medio de cultivo seleccionado:
• Agar triptona extracto de levadura para cuenta de mesofílicos aerobios
• Agar bilis rojo violeta para cuenta de organismos coliformes totales. Añadir una doble capa
del mismo medio de cultivo una vez solidificada la primera capa para crear condiciones de
anaerobiosis.
Agar papa dextrosa acidificado para cuenta de hongos y levaduras. Acidificar a un pH de 3.5 +/-
0.1 con ácido tartárico estéril a 10% (aproximadamente 1.4 ml de ácido tartárico por cada 100
ml del medio).

6.1. SUPERFICIES
Contar todas las colonias que se desarrollen en las cajas, hacer el cálculo de las colonias por
ml, multiplicar por el volumen de diluyente empleado y dividirlo entre los cm2 de la superficie.
Los resultados se expresan en UFC/cm2.

EJEMPLO
Si se tomó la muestra de 4 superficies de 25 cm2 c/u en un volumen de 10 ml de diluyente,
multiplicar el número de colonias x 10 y dividir el resultado entre 100 para obtener las UFC/cm2.

6.2. UTENSILIOS DE COMEDOR


Hacer el cálculo del número de colonias por ml, multiplicar el volumen total de la solución
diluyente de muestreo y sacar promedio dividiendo entre el número de utensilios muestreados
para informar UFC/utensilio.

7.- BIBLIOGRAFIA.

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 Manual of Food Quality Control. 12. Quality assurance in the food control microbiological
laboratory. FAO. Rome, 1991.
 Manual de prácticas. Curso: Toma y manejo de muestras para análisis bacteriológico.
Laboratorio Nacional de Salud Pública. México 1992.
 Standard methods for the examination of dairy products. APHA. 16 th. 1992.
 Procedimiento para el examen microbiológico de superficies y utensilios. Secretaría de
Salud. Laboratorio Nacional de Salud Pública. México 1990.

Observaciones:

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