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Manual de Microbiologia de Los Alimentos PDF
Manual de Microbiologia de Los Alimentos PDF
Manual de Microbiologia de Los Alimentos PDF
MICROBIOLOGÍA
de los ALIMENTOS
Leonor Carrillo y M. Carina Audisio
con la colaboración de
Noemí V. Bejarano,
Silvia E. Gómez Molina,
E.Gustavo Ancasi y
MarceloR.Benítez Ahrendts.
© Leonor Carrillo
Alberdi 47, 4600 SS Jujuy, Argentina
ISBN 978-987-05-3214-9
Carrillo, Leonor
Manual de microbiología de los alimentos / Leonor Carrillo y
Marcela Carina Audisio ; con colaboración de Noemí del Valle
Bejarano ... [et al.]. - 1a ed. - Jujuy : el autor, 2007.
194 p. : il. ; 21x15 cm.
ISBN 978-987-05-3214-9
SEGURIDAD ALIMENTARIA
El sistema de control retrospectivo o a posteriori consiste
en la toma de muestras en los lugares de comercialización de
los productos y análisis de las mismas para determinar
microorganismos patógenos, deteriorantes o marcadores. Esta
inspección permite medir el efecto pero no puede prevenir los
riesgos. Además para tener datos confiables acerca de un lote,
las muestras deben ser obtenidas rigurosamente al azar y el
número debe ser elegido de acuerdo con los estudios de
distribución de Poisson (1). Por ejemplo en un lote con 0,1% de
unidades defectuosas, estas no serán reconocidas con un nivel
de probabilidad del 95%, a menos que sean examinadas por lo
menos 3.000 muestras (2). También se supone que los
microorganismos buscados están distribuidos homogénea-
mente en el alimento, pero es común la estratificación.
La protección adecuada del consumidor solo se puede
conseguir mediante la intervención durante el procesamiento
de los alimentos. En una planta elaboradora, las buenas
prácticas de manufactura y distribución comprenden los
procedimientos con los cuales se obtienen productos de calidad
microbiológica aceptable, convenientemente controlados
mediante pruebas en la cadena de elaboración y de
laboratorio. Un código de buenas prácticas debe definir los
pormenores del proceso de elaboración que son necesarios para
alcanzar este objetivo, por ejemplo materias primas,
equipamiento, procedimientos, tiempos, temperaturas,
métodos de higiene y desinfección, pruebas de laboratorio (1).
La intervención requiere primero la identificación de las
prácticas críticas en la totalidad de las líneas de producción y
distribución de los alimentos. Las prácticas críticas se definen
como aquéllas que presentan riesgos de contaminación y/o
multiplicación microbiana (1).
Peligro: es el agente biológico, químico o físico presente en
el alimento, o bien la condición en que éste se halla, que puede
causar un efecto adverso para la salud.
Punto crítico: es la fase en la que puede aplicarse un
control y que es esencial para prevenir o eliminar un peligro
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Si No
Si No No es un Pasar al siguiente
punto crítico peligro identificado
No Si No es un Pasar al siguiente
punto crítico peligro identificado
PUNTO CRÍTICO
*Los niveles aceptables o inaceptables deben ser definidos teniendo en cuenta
los objetivos globales.
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pelado,descascarado,
descarozado, etc
separación,clasificación,
remoción de los defectuosos
escurrido
llenado
enfriado
rotulado
al depósito
empaquetado
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Dosis respuesta
o ¿cómo está vinculada la infección o intoxicación con la
cantidad ingerida?
Evaluación de la exposición
o ¿cuántos organismos son ingeridos por el consumidor?
o ¿con qué frecuencia?
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CRITERIOS MICROBIOLÓGICOS
Los criterios, límites, normas o estándares, también
llamados valores, rangos o intervalos de referencia,
constituyen el instrumento de medida para juzgar la seguridad
y la calidad microbiológica de los alimentos procesados y de las
comidas elaboradas en el momento de la comercialización, así
como de los ingredientes y materias primas.
Los criterios no pueden separarse de las líneas de
producción, a lo largo de las cuales deben conseguirse tales
atributos mediante la intervención del sistema HACCP (1).
Entre las características cualitativas obligatorias de los
criterios se encuentra un pequeño número de microorganismos
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PLANES DE MUESTREO
El valor objetivo m para los microorganismos no patógenos
debe estar algo por encima del 95% de los recuentos. El valor
M es el límite de la calidad tolerable bajo ciertas condiciones y
debe estar muy alejado de los niveles de colonización en los que
es inminente la alteración manifiesta o la enfermedad segura
después de la ingestión. En la zona comprendida entre m y M
solo estará comprendida una fracción de las muestras c/n,
donde n es el número de unidades analíticas y c el número de
las mismas que pueden presentar valores entre m y M. Por
tanto esta interpretación de los datos del estudio exploratorio
se denomina plan de tres categorías (5).
En los casos que el análisis del riesgo revela un margen
excesivamente reducido entre los niveles de colonización
observados y los correspondientes a la colonización “inocua”, o
bien que algunos recuentos exceden M, deben ser
reconsideradas las prácticas de fabricación y distribución. En
la estimación de los valores de m y M se incluyen:
95%
m M ufc/g
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Elegir n Elegir n y c
para alcanzar la probabilidad deseada
5% > m 20%> m
Plan de 3 clases 3 clases
muestreo 2 %>M 2 %>M
clases clases
n c 0 5 0 10 20
0 0,77 0,77 0,77 0,33 0,33 0,33 0,33
1 0.98 0.98 0,77 0,74 0,74 0,53 0,33
5
2 1,00 1,00 0,77 0,94 0,94 0,58 0,33
3 1,00 1,00 0,77 0,99 0,99 0,59 0,33
0 0,60 0,60 0,60 0,11 0,11 0,11 0,11
1 0,91 0,91 0,60 0,38 0,38 0,24 0,11
10
2 0,99 0,99 0,60 0,68 0,68 0,32 0,11
3 1,00 1,00 0,60 0,88 0,88 0,34 0,11
Condiciones Condiciones
Condiciones
Grado de peligrosidad que no que
que reducen
relativo a la utilidad cambian la aumentan la
la gravedad
y salud gravedad del gravedad del
del peligro
peligro peligro
No directo para la
3 clases, 3 clases, 3 clases,
salud, afecta a la
n= 5, c =3 n=5, c =2 n=5, c =1
utilidad
Bajo e 3 clases, 3 clases, 3 clases,
indirecto n=5, c =3 n=5, c =2 n=5, c =1
Moderado,
3 clases, 3 clases, 3 clases,
directo y
n=5, c =2 n=5, c =1 n=10, c =1
limitado
Peligro
Moderado,
para la
directo y
salud 2 clases, 2 clases, 2 clases,
potencial-
n=5, c =0 n=10, c =0 n=20, c =0
mente
extenso
Grave y 2 clases, 2 clases, 2 clases,
directo n=15, c =0 n=30, c =0 n=60, c =0
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MARCADORES
Índice. Microorganismo o grupo de microorganismos
marcadores, cuya presencia y nivel en un alimento permite
deducir la suerte de otro microbio o grupo de microbios de
Peligro moderado,
difusión Peligro moderado,
Peligro grave
potencialmente limitado
extensa
Clostridium
Listeria
botulinum tipos A, B, Bacillus cereus
monocytogenes
E, F y G
Campylobacter
Shigella dysenteriae Shigella spp.
jejuni
Salmonella typhi, S.
Clostridium
parathyphi serotipos Salmonella spp.
perfringens
AyB
Otros Escherichia
Escherichia coli Staphylococcus
coli
enterohemorrágico aureus
enterovirulentos
Virus de la hepatitis Streptococcus Vibrio cholerae no
AyE pyogenes O1
Brucella melitensis, Vibrio
Rotavirus
Brucella abortus parahaemolyticus
Grupo del virus Yersinia
Vibrio cholerae O1
Norwalk enterocolitica
Vibrio vulnificus
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TRAZABILIDAD
La trazabilidad es un conjunto de medidas, acciones y
procedimientos que permiten registrar e identificar cada
producto alimenticio desde su origen hasta su destino final,
considerando el origen y calidad de sus componentes, los
procesos aplicados y la distribución del mismo.
Comenzó como un sistema para identificar el momento en
que un organismo genéticamente modificado se introduce en la
cadena de producción y distribución, y se ha generalizado para
otros alimentos, por ejemplo carnes y miel (9).
CRECIMIENTO
EJEMPLOS
MICROBIANO
carne, aves y alimentos marinos, frescos y
ilimitado
refrigerados
leche pasterizada, frutas y hortalizas
amplio
refrigeradas no dañadas
embutidos cocidos en envoltura intacta,
limitado
refrigerados
alimentos fermentados y conservados en
restringido
vinagre, productos con aw < 0,90
prácticamente alimentos con esterilización comercial,
ausente alimentos desecados hasta aw < 0,60
REFERENCIAS
1. Mossel DAA et al. 2003. Microbiología de los Alimentos. 2° ed.
Acribia, Zaragoza, p 341, 375.
2. Downes FP, Ito K. 2001. Compendium of Methods for the
Microbiological Examination of Foods. 4° ed, APHA, Washington, p
13, 267.
3. Codex Alimentarius. 1999. Higiene de los Alimentos. Textos Básicos.
FAO, Roma, p 45.
4. Goulg WA. 1997. Fundamentals of Food Processing and Technology.
CTI Publications, Maryland, p. 60.
5. ICMSF. 2002. Microorganisms in Foods. Vol. 7. Kluwer Academic/
Plenum, New York, cap. 7, 8.
Carrillo L
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BACTERIAS
Los alimentos son alterados por diferentes géneros
bacterianos y a su vez, pueden servir como vehículo de
patógenos o sus toxinas. Se conoce como microbiota dominante
a los microorganismos que causan la descomposición bajo las
condiciones normales de almacenamiento. Identificar al
organismo que ha producido una infección o intoxicación
alimentaria o generado el deterioro del alimento, es una tarea
laboriosa y compleja (1).
Alimentos Microorganismos
Acinetobacter, Aeromonas, Alcaligenes,
Campylobacter, Corynebacterium,
Enterobacteriaceae, Flavobacterium, Kocuria,
Carnes rojas y aves
Listeria, Micrococcus, Moraxella,
Pseudomonas, Psychrobacter, Shewanella,
Vagococcus
Acinetobacter, Bacillus, Brochothrix,
Clostridium, Enterococcus, Lactobacillus,
Carnes procesadas
Pseudomonas, Proteus, Staphylococcus,
Weissella
Acinetobacter, Aeromonas, Alcaligenes,
Huevos y Enterobacter, Escherichia, Flavobacterium,
subproductos Micrococcus, Pseudomonas, Proteus,
Salmonella, Serratia, Staphylococcus
Aeromonas, Moraxella, Pseudomonas, Proteus,
Pescados y mariscos
Psychrobacter, Shewanella, Vibrio
Alcaligenes, Bacillus, Clostridium,
Leche Flavobacterium, Lactobacillus, Micrococcus,
Pseudomonas, Staphylococcus, Streptococcus
Bacillus, Corynebacterium, Clostridium,
Frutas y hortalizas Paenibacillus, Pantoea, Pectobacterium,
Pseudomonas, Streptomyces
Zumos de frutas y Acetobacter, Lactobacillus, Pediococcus,
hortalizas Streptococcus
Cereales y harinas Bacillus
Audisio MC
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BACTERIAS GRAM-NEGATIVAS
Los bacilos Gram-negativos, catalasa-positivos, son los
agentes más importantes en el deterioro de los alimentos y al
mismo tiempo los patógenos más relevante de origen entérico
transmitidos por alimentos.
V E
P E N
C E H D G L
A A S L U U E A
R V C E E L T T
BACTERIAS
N E A C V C A A
E S D H O E L D
S O E S S E O
S S S
* **
Bacillus cereus − − − − − − + −
Campylobacter jejuni ± + − + + − − −
Clostridium botulinum ± ± ± − − − + +
Clostridium perfringens + + − − − − − ±
Escherichia coli + + + − − − − −
Listeria monocytogenes + ± + − − − + −
Salmonella spp. + + ± + + + − ±
Staphylococcus aureus + + ± ± ± + − ±
Vibrio spp − − + − − − − −
Yersinia enterocolitica + + ± + − − − −
* hortalizas, granos y harinas, ** hortalizas, carnes, leche en polvo
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BACTERIAS GRAM-POSITIVAS
Bacilos catalasa-negativos, no esporulados, inmóviles
Las especies de Lactobacillus pueden ser anaerobias
facultativos o microaerófilas. Se las divide en homo-
fermentativas si degradan glucosa produciendo sólo ácido
láctico, y hetero-fermentativas si forman una mezcla de ácido
láctico, CO2, etanol y/o acetato. El ácido láctico disminuye el
pH del medio e inhibe el desarrollo de otras bacterias,
favoreciendo adaptabilidad a diferentes hábitats. Son
frecuentes en la leche fresca, ovoproductos, canales de
mamíferos y de aves antes de su almacenamiento (5).
Carnobacterium se encuentra en pescados, canales de aves
y carnes rojas envasadas al vacío (2).
Audisio MC
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Cocos catalasa-negativos
En este grupo se encuentran Enterococcus, Streptococcus,
Leuconostoc, Pediococcus y Aerococcus.
Los Enterococcus son de interés en higiene de alimentos
como organismos marcadores. Son relativamente termodúricos
y pueden sobrevivir en la leche pasteurizada (1).
Weisella tiene la propiedad de sintetizar exopolisacáridos a
partir de los hidratos de carbono presentes en la leche, bebidas
fermentadas o azúcar ocasionando su deterioro por la
aparición de una filancia no deseada.
Cocos catalasa-positivos
Dentro de este grupo se encuentran los géneros
Staphylococcus y Micrococcus. Una diferencia entre estos dos
géneros es que los estafilococos no crecen a temperaturas
inferiores a 7ºC y por lo tanto no causarían problemas en
alimentos adecuadamente refrigerados. Numerosas cepas de
Staphylococcus aureus producen una potente enterotoxina (1).
Micrococcus y Kocuria ocasionan alteraciones en las carnes
curadas y en algunos alimentos con baja actividad de agua, por
ejemplo leche condensada (2).
TINCIÓN DE GRAM
Tomar con un asa una porción de cultivo bacteriano,
depositarlo sobre una gota de agua y hacer un extendido sobre
un portaobjetos. Dejar secar y fijar por calor. Ponerlo sobre un
soporte y cubrirlo con una solución de violeta cristal. Luego de 1
minuto agregar solución de iodo. Después de 1 minuto, lavar con
agua. Decolorar con alcohol 96°. Lavar con agua y cubrir con una
solución de safranina durante 1 minuto. Lavar con agua y secar.
Colocar una gota de aceite para inmersión. Llevar el
portaobjetos a la platina de un microscopio. Mirar a través del
objetivo de bajo aumento (10x) y una vez enfocado el objeto
mover el revólver para colocar el objetivo de inmersión en aceite
(100x). Levantar el condensador acercándolo a la platina. Ajustar
el enfoque mediante el tornillo micrométrico. Regular la cantidad
de luz por medio del diafragma.
Las bacterias Gram-negativas se tiñen de rojo anaranjado y las
Gram-positivas adquieren color violeta.
BACTERIAS TOLERANTES
Algunos microorganismos han desarrollado una fuerte
resistencia a factores abióticos y por ejemplo, son capaces no
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TINCIÓN DE FLAGELOS
Dejar correr una gota del cultivo líquido de 12-18 horas, sobre
un portaobjetos nuevo, limpio y tibio. Secar al aire. Mezclar en el
momento de usar: 2 mL de alumbre de potasio al 12%, 1 mL de
ácido tánico al 20%, 1 mL de agua, 1,5 mL de etanol 96° y 0,3
mL de fucsina básica al 6% en etanol 96°. Volcar de inmediato
sobre el portaobjetos y dejar 10 minutos. Lavar con agua. Las
bacterias y los flagelos se tiñen de color rojo.
Se puede inferir la motilidad de las bacterias al observar su
desplazamiento rápido a través del campo microscópico cuando
se enfoca una gota de cultivo reciente, colocada entre porta y
cubreobjetos (8).
TINCIÓN DE ENDOSPOROS
Cubrir el extendido fijado por calor, con verde de malaquita al
2%. Calentar hasta emisión de vapores, dejar enfriar y volver a
calentar 3 ó 4 veces más. Lavar con agua. Cubrir con safranina al
0,25% durante 1 minuto. Lavar con agua y secar. Los
endosporos se tiñen de verde y las células somáticas de color
rojo anaranjado (8).
PRUEBA DE LA OXIDASA
Tomar parte de una colonia con una fina varilla de vidrio y frotar
un trozo de papel de filtro humedecido previamente con una
solución acuosa de clorhidrato de tetrametil-parafenilen-diamina
al 1% recién preparada. La aparición de un color púrpura intenso
en 5 segundos indica que la prueba es positiva (1).
PRUEBA DE LA CATALASA
Colocar una gota de peróxido de hidrógeno al 3% sobre un
portaobjetos. Tomar con un asa material del cultivo y mezclar. La
formación inmediata de burbujas indica desprendimiento de
oxígeno debido a la enzima (1).
PRUEBA DE OXIDACIÓN-FERMENTACIÓN
Sembrar por picadura profunda dos tubos con medio de cultivo.
Sobre uno de los tubos, verter una capa de 2 cm de agar-agua
estéril fundido y enfriado hasta 45ºC, tomando las precauciones
para evitar la contaminación. Incubar a 30ºC durante 48 hs.
Observar la formación de ácido o gas.
AGAR GLUCOSA DE HUGH Y LEIFSON (para Gram-negativos). Triptona
2 g, extracto de levadura 1 g, glucosa 10 g, cloruro de sodio 5 g, fosfato
dipotásico 0,2 g, azul de bromotimol 0,08 mg, agar 15 g, agua 1 litro, pH
7,1. Disolver los ingredientes y distribuir en tubos formando una columna
de 10 cm. Esterilizar a 120ºC durante 15 minutos y después dejar
solidificar en posición vertical.
AGAR GLUCOSA PURPURA (para Gram-positivos). Triptona 10 g,
glucosa 5 g, púrpura de bromocresol 0,04 g, agar 15 g, agua 1 litro, pH
7,0. Disolver los ingredientes y distribuir en tubos formando una columna
de 10 cm. Esterilizar a 120ºC durante 15 minutos y después dejar
solidificar en posición vertical (1).
REDUCCION DE NITRATOS
Calentar a ebullición el tubo de caldo nitrato durante 2 minutos.
Enfriar sin agitar y sembrar. Incubar a 35ºC durante 24-48 horas.
Agregar 0,5 mL del reactivo de Griess A y 0,5 mL del B. La
aparición de un color rosado dentro de los 10 minutos indica la
presencia de nitritos.
CALDO NITRATO. Triptona 20 g, fosfato disódico 2 g, glucosa 1 g, agar
1 g, nitrato de potasio 1 g, agua 1 litro. Distribuir en tubos y esterilizar a
120ºC durante 15 minutos.
REACTIVO DE GRIESS. A. Ácido sulfanílico 0,8 g, ácido acético glacial
30 mL, agua 75 mL; B. Alfa-naftilamina 0,5 g, ácido acético glacial 30
mL, agua 75 mL (4).
Audisio MC
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REFERENCIAS
1. Mossel DAA et al. 2003. Microbiología de los Alimentos. 2ª ed.
Acribia, Zaragoza, p 15, 599, 634, 637.
2. Jay MJ et al. 2005. Modern Food Microbiology. 7ª ed. Springer, New
York, p 13. 42, 36.
3. Doyle MP et al. 1997. Food Microbiology. ASM Press, Washington, p
101, 129, 228, 305.
4. Downes FP, Ito K, eds. 2001. Compendium of methods for the
microbiological examination of foods. 4ª ed. APHA, Washington, p.
159, 167, 187, 357.
5. Sharpe ME 1981. En: The Prokaryotes. Vol ll. Starr MP et al., eds.
Springer-Verlag, Berlin, p 1653.
6. ICMSF. 1996. Microorganismos de los Alimentos. Vol. 5:
Características de los Patógenos Microbianos. Acribia, Zaragoza, p
7. ICMSF. 1998. Microorganisms in food. Vol 6: Microbial Ecology of
Food Commodities. Blackie Academic & Professional, London, p 131.
8. Collins CH et al. 1999. Microbiological Methods. 7ª ed. Butterworth-
Heinemann, Oxford, p 102.
9. Madigan MT et al. 2004. Brock - Biology of Microorganisms. 10ª ed.
Pearson - Prentice Hall, p 812.
MOHOS
Los hongos se agrupan en el reino Fungi. Son organismos
heterotróficos y osmotróficos, con quitina o quitosano en la
pared celular. Los oomicetos, cuya pared contiene celulosa, se
encuentran en el reino Straminipila (1).
Si un hongo es filamentoso se llama moho y cuando es una
célula aislada se dice levadura. Los filamentos que constituyen
el micelio reciben el nombre de hifas. Las hifas pueden estar
separadas en secciones generalmente multinucleadas por
medio de septos perforados, o bien carecer de éstos. La pared
celular del micelio de los mohos semeja un extenso sistema
tubular por el que avanza el citoplasma para su dispersión y
búsqueda de nutrientes. Los mohos se reproducen
asexualmente en la mayoría de los casos y las estructuras
sexuales sólo aparecen cuando las circunstancias son
favorables o se encuentran micelios de distinta polaridad.
Los hongos anamórficos
generan esporas asexuales
por mitosis, que tienen
diversa forma y son mono o
corte de pluricelulares. La morfología
de las estructuras que
producen las esporas es muy
variable. El color de la
mayoría de los mohos se debe
a sus esporas asexuales, las
que suelen desarrollarse en el
extremo de unas estructuras
espe-cializadas que se
extienden en el aire a partir
del micelio, conocidas como
esporóforos.
Las esporas pueden estar
encerradas en un esporangio
o ser externas (conidios). Los conidióforos generan esporas
solitarias o en cadena. A veces están agrupados en un haz
(coremio) o sobre un conjunto de hifas entrelazadas (acérvula,
esporodoquio) o dentro de un conidioma (picnidio) (2).
Carrillo L, Bejarano NV
32
esporodoquio
Un esporangio es una
estructura comúnmente
globosa con una membrana
simple que contiene
innumerables esporas,
generalmente en el extremo
de un esporóforo. Cuando
los esporangios tienen pocas esporas se llaman esporangiolos o
merosporangios.
Las estructuras de resistencia son las células de pared
gruesa llamadas clamidosporas y los esclerocios que están
formados por un conjunto macroscópico de hifas apelmazadas
como un tejido.
Los mohos suelen reproducirse también a través de las
esporas sexuales (teleomórficos). Los oomicetos producen
oosporas y los zigomicetos forman zigosporas de paredes
gruesas y obscuras. Ambas son esporas de reposo (2).
Los ascomicetos
producen sus esporas
sexuales (ascosporas)
dentro de ascos,
generalmente ubicados
en un cuerpo fructífero
llamado ascoma. Los
ascomas tienen forma de
copa (apotecio) o son cuerpos cerrados (cleistotecio) o abiertos
por un ostiolo (peritecio), y se encuentran aislados o reunidos
sobre un estroma.
Los basidiomicetos desarrollan sus esporas sexuales
(basidiosporas) sobre los basidios que se hallan en un cuerpo
fructífero denominado basidioma, comúnmente de gran
tamaño y entonces se llaman setas, o bejines si son redondos.
Muchos oomicetos son saprobios del suelo o el agua, pero
algunas especies son parásitas de plantas y peces. Los
zigomicetos son hongos saprobios comunes en el suelo. Ambos
grupos tienen un micelio sin septos.
OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA
Suspender el material depositado sobre un portaobjetos, en
agua, líquido de montar, lactofenol o azul de algodón. Con ayuda
de dos agujas separar los filamentos y colocar un cubreobjetos.
LACTOFENOL. Disolver 20 g de fenol en 20 mL de agua, agregar
20 mL de ácido láctico y 40 mL de glicerol.
AZUL-LACTOFENOL. Disolver 0,1 g de azul de algodón (= azul de
anilina) en 100 mL de lactofenol.
LÍQUIDO DE MONTAR. Mezclar 50 mL de acetato de potasio al 2%
en agua, con 20 mL de glicerina y 30 mL de etanol 96º (1).
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34
Acremonium sp.
Aureobasidium
pullulans
Botrytis sp.
Paecilomyces
variotii
Colletotrichum.
Conidióforos reunidos en
Cladosporium sp.
acérvulas, con cerdas
oscuras, conidios
oblongos, rectos o
falciformes.
Colletotrichum graminicola
Chrysonilia. Micelio
blanco, cadenas
ramificadas de esporas Chrysonilia
unicelulares, color sitophyla
anaranjado.
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36
Fusarium
sporotrichioides
F.equiseti F. verticilloides
F. semitectum
Mucor hiemalis
Phytophthora. Tiene
conidiosporangios limoni-
formes o elipsoidales sobre
esporangióforos cortos o
largos. Produce clamidos-
poras esféricas o subes-
féricas.
Phytophthora sp.
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38
Trichothecium.
Conidios sobre un
esporóforo que crece
al formar cada uno
de ellos.
Thamnidium elegans
Trichothecium roseum
MICROCULTIVO
Colocar sobre un portaobjetos, previamente flameado y
enfriado, un trozo de medio gelificado de 1 cm de lado y 2 mm de
espesor, tomado de una placa estéril. Sembrar el hongo en los
bordes del trozo de agar. Colocar un cubreobjetos, también
flameado y enfriado.
REFERENCIAS
1. Mueller GM et al. 2004. Biodiversity of Fungi. Elsevier, Amsterdam,
apéndice.
2. Kendrick B. 2000. The Fifth Kingdom. 3ª ed. Focus Publishing,
Newburyport, cap 2, 3.
3. Barnett H, Hunter B. 1998. Ilustrated genera of imperfect fungi. 4ª
ed. APS Press. St. Paul Minnesota.
4. Pitt JI, Hocking AD. 1997. Fungi and Food Spoilage. 2ª ed. Blackie
Academic & Professional, London, cap 2, apéndice.
Carrillo L, Bejarano NV
40
LEVADURAS
Las levaduras son hongos que forman sobre los medios de
cultivo colonias pastosas, constituídas en su mayor parte por
células aisladas que suelen ser esféricas, ovoideas, elipsoideas
o alargadas. Unas pocas presentan hifas. Las dimensiones
pueden oscilar de 1 a 9 µm de ancho y 2 a más de 20 µm de
longitud según la especie, nutrición, edad y otros factores.
Algunos hongos fitopatógenos forman colonias levaduriformes
en cultivos axénicos y varios patógenos de animales se
presentan como levaduras en los materiales clínicos (1).
En general, las células de las levaduras son conidios
formados según diferentes tipos de conidiogénesis. En
Saccharomyces una célula madre da lugar a la formación de
yemas en diferentes puntos de la superficie produciendo en
cada uno sólo una célula hija (blastoconidio o blastospora),
pero en Rhodotorula o Cryptococcus todos los brotes surgen
desde un solo punto. La célula apiculada de Saccharomycodes
brota repetidamente de cada extremo, extendiéndose un poco
con cada conidio formado. En el caso de Schizosaccharomyces
la célula es casi cilíndrica y los conidios tienen una base muy
ancha. Las levaduras hifales, como Trichosporon o Geotrichum
producen artroconidios (o artrosporas) por formación de septos
dobles en las hifas, que luego se escinden (2).
Las levaduras pertenecen a dos clases de hongos:
ascomicetos o basidiomicetos, aunque muchas de ellas se
presentan comúnmente en la forma imperfecta. Las levaduras
ascomicéticas forman ascas libres, con 1 a 8 ascosporas, y en
las especies hifales las ascas están desnudas. Las ascoporas de
las levaduras son algo más resistentes al calor y la desecación
que las células vegetativas, si bien tienen mucha menor
resistencia térmica que las esporas bacterianas, por lo que
mantienen la viabilidad de la especie durante los cambios
adversos del medio ambiente (1).
El modo de diploidización en las levaduras ascomicéticas
se efectúa entre una célula y su brote, como es el caso de
Schwanniomyces, Debaryomyces y otras, o puede efectuarse
entre dos células independientes, por fusión directa
(Schizosaccharomyces) o por medio de un tubo de conjugación
Ancasi EG
42
AMBIENTE
Las levaduras se encuentran con frecuencia en las hojas y
las flores, aunque en número muy pequeño, siendo los insectos
un importante vector de diseminación de las mismas. Están
sobre la epidermis de frutas y pueden penetrar a los tejidos
subyacentes como resultado de un daño mecánico. El suelo es
un importante reservorio, desde el cual pueden llegar a los
alimentos, pero también suelen hallarse en el agua de lagos y
IDENTIFICACIÓN
La forma no es un indicio para la identificación de las
especies, ni la variedad morfológica en un mismo cultivo es
una prueba de la contaminación del mismo. El comportamiento
fisiológico es muy importante para la identificación. Mientras
que las caracterísiticas morfológicas y sexuales permiten
generalmente identificar el género, las características
bioquímicas definen la especie de la levadura, por ejemplo la
utilización de compuestos carbonados (almidón, L-arabinosa,
cadaverina, celobiosa, 2-cetogluconato, citrato, eritritol,
galactosa, inositol, lactosa, lisina, maltosa, manitol, melibiosa,
α-metilglucósido, rafinosa, ramnosa, sacarosa, trehalosa,
xilosa) y nitrogenados (nitratos), el crecimiento a 37 °C, la
fermentación de glucosa y sacarosa, la necesidad de vitaminas,
la resistencia a la cicloheximida, la hidrólisis de urea o el
desarrollo en presencia de algunos inhibidores (acetato de
sodio 1%, cloruro de sodio 16%, glucosa 60%) (4).
La identificación sólo puede llevarse a cabo sobre una cepa
en cultivo puro, previamente aislada en una placa de medio
gelificado. Se comienza examinando el aspecto de los cultivos
tras incubación a 28°C durante 3 días o más. Se observa el
Ancasi EG
44
PRODUCCIÓN DE ASCOSPORAS
A partir de un cultivo de 24-36 hs en agar-malta-levadura
sembrar abundante cantidad en la cara superior de un bloc de
yeso (2 x 2 x 0,5 cm) colocado en una caja de Petri con agua
estéril, también hacer estrías sobre el agar de Gorodkowa y agar-
papa-zanahoria. Incubar a temperatura ambiente entre 7 y 20
días.
Examinar periódicamente los preparados en fresco con azul-
lactofenol, observar si hay producción de ascas, la forma y
facilidad de ruptura, el número y la forma de las ascosporas y su
posición en el asca.
REFERENCIAS
1. Carlile MJ et al. 2001. The Fungi. 2ª ed. Academic Press, San Diego,
p 70.
2. Kendrick B. 2000. The Fifth Kingdom. 3º ed. Focus Publishing,
Newburyport, p 112.
3. Salle AJ. 1965. Bacteriología. Gustavo Gili, Barcelona, cap 5.
Ancasi EG
46
VIRUS y PARÁSITOS
VIRUS
Los virus son elementos genéticos que pueden replicarse
independientemente de los cromosomas de una célula, pero
sólo dentro de la misma. Poseen una forma infecciosa
extracelular, que les permite ser transmitidos con facilidad de
un hospedante a otro y replicarse por sí mismo mediante una
vía destructiva para la célula que lo aloja.
En el estado extracelular, un virus es una partícula
diminuta metabólicamente inerte que contiene ácido nucleico
rodeado de proteína y ocasionalmente, según el virus, otros
compuestos macromoleculares. Una vez que el ácido nucleico
viral es introducido en una célula, se inicia el estado
intracelular y ocurre la replicación del virus mediante la
producción de nuevas copias del genoma y la síntesis de los
componentes de la cubierta.
El genoma viral es muy pequeño y codifica aquellas
funciones que no puede adaptar del hospedante. Redirige la
maquinaria preexistente en el hospedante para permitir la
replicación y ensamblaje de las nuevas partículas virales.
Los virus pueden tener ADN o ARN, mono o bicatenario.
Unos pocos virus tienen ambos tipos de ácido nucleico, pero en
diferentes estadios de su ciclo reproductivo, por ejemplo el de
la hepatitis que contiene ADN en la partícula extracelular y un
ARN intermediario en la célula (1).
Los virus semejantes al Norwalk, pequeños y de estructura
redonda, son los agentes más conocidos de los brotes de
gastroenteritis transmitida por el agua y los alimentos,
enfermedad caracterizada por nauseas, vómitos, diarrea y una
duración de 1 a 3 días.
El modo común de transmisión es el consumo de alimentos
contaminados, por ejemplo mariscos crudos y cocidos, hielo,
agua, productos de panadería congelados, varios tipos de
ensaladas y alimentos fríos. También pueden ser transmitidos
por los manipuladores infectados, asintomáticos o enfermos.
El virus de la hepatitis A es transmitido por el agua y los
alimentos, a través de la ruta fecal-oral. El período de
incubación dura 2 a 6 semanas y la enfermedad comienza con
Carrillo L, Audisio MC
48
PARASITOS
Son los organismos que pasan toda o parte de su existencia
a expensas del hospedante, causándole o no daño, y con quien
tienen una dependencia obligada y unilateral. Entre los
parásitos que el hombre puede adquirir a través de la
ingestión de la comida y/o el agua, se encuentran los protozoos
y helmintos.
En el ciclo directo, no es necesaria la presencia de un
hospedante intermediario. Puede ser corto si la forma emitida
es la infectante, por ejemplo Giardia lamblia, o largo cuando la
forma emitida necesita pasar un cierto tiempo en el medio
para transformarse en infectante, por ejemplo Ascaris
lumbricoides.
Los parásitos con un ciclo indirecto requieren un
hospedante intermediario y la presencia del mismo en el medio
determina la parasitosis, por ejemplo Taenia saginata.
Los protozoos son organismos unicelulares que con
frecuencia forman quistes o esporos de elevada resistencia. Los
protozoos de importancia en los alimentos pertenecen
principalmente a las divisiones Sarcomastigophora
(Entamoeba histolytica, Giardia lamblia y dinoflagelados) y
Sporozoa (Toxoplasma gondii, Cryptosporidium parvum,
Sarcocystis spp). Éstos últimos con un ciclo de vida
relativamente complejo y fases alternadas de reproducción
sexual y asexual.
La infección se puede producir por: a) ingestión de los
protozoos que se encuentran dentro de los tejidos del alimento
a consecuencia natural de su ciclo biológico como los quistes en
Carrillo L, Audisio MC
50
Carrillo L, Audisio MC
52
REFERENCIAS
1. Madigan MT et al. 2005. Brock-Biology of microorganisms. 10º ed.
Prentice Hall, Upper Saddle River, p 231.
2. ICMSF. 1996. Microorganismos de los Alimentos. Características de
los Patógenos Microbianos. Acribia, Zaragoza, p 517.
3. Euzéby J. 2001. Los parásitos de las carnes. Acribia, Zaragoza.
4. Mossel DAA et al. 2003. Microbiología de los Alimentos. 2ª ed.
Acribia, Zaragoza, p 61.
5. Downes FP, Ito K, eds. 2001. Compendium of Methods for the
Microbiological Examination of Foods. 4º ed, APHA, Washington, p
429, 447.
6. Doyle MP et al., eds. 1997. Food Microbiology - Fundamentals and
Frontiers. ASM Press, Washington, p 435,447.
CALIDAD ANALÍTICA
El principal objetivo de un laboratorio es producir datos
analíticos de precisión y confiabilidad suficientes en un plazo
aceptable y a un costo admisible. La garantía de calidad es el
proceso total que asegura la confiabilidad de los resultados de
laboratorio.
Un programa de garantía de calidad proporciona un
registro de seguimiento que asegura la integridad de la
muestra, con documentación para verificar que los
instrumentos de laboratorio funcionan adecuadamente y que
los datos del laboratorio se produjeron según procedimientos
normalizados. Esta garantía abarca tanto el control como la
evaluación de la calidad (1).
Un programa de garantía de la calidad contiene tres
elementos esenciales:
o Prevención. Comprende una planificación ordenada y
una serie de medidas positivas antes y durante los
análisis, para asegurar que todos los sistemas
analíticos funcionan adecuadamente, por ejemplo la
utilización de medios de cultivo estandarizados, la
calibración y el mantenimiento de los instrumentos, la
formación contínua de los analistas.
o Evaluación. Consiste en comprobaciones periódicas del
rendimiento mediante el análisis de muestras
seleccionadas, usando una metodología validada.
o Corrección. Abarca las medidas adoptadas para
determinar las causas de los defectos de calidad y
restablecer el funcionamiento adecuado de las
operaciones analíticas, por ejemplo la reparación de los
equipos averiados, la revisión de la metodología, la
capacitación del personal (2).
La acreditación es un componente de la garantía de calidad
y consiste en la auditoría por un agente externo para procurar
que el laboratorio se ajuste a ciertos cánones definidos. Un
esquema de acreditación debe ser completo, cubriendo todos
los aspectos del laboratorio, incluídos organización y
administración, formación y actualización del personal,
equipamiento y comodidades, procedimientos y criterios (1).
Carrillo L
54
LABORATORIO
Aunque el diseño lo hacen los arquitectos o ingenieros, los
analistas deben participar en las decisiones que afectarán,
finalmente, a su medio de trabajo y las condiciones en que éste
se desarrollará.
El laboratorio de microbiología no debe ocupar una sola
sala polivalente, sino más bien dos o más locales dedicados al
almacenamiento del instrumental de vidrio y de los medios
deshidratados, la preparación y esterilización de los medios, la
descontaminación del material peligroso, la zona de trabajo
analítico y el almacenamiento de las muestras a analizar y las
ya analizadas que pasan a la reserva.
Si los medios, reactivos y los materiales de vidrio se deben
almacenar en la misma habitación en que se llevan a cabo los
análisis microbiológicos, se guardan en envases herméticos
dentro de armarios limpios de polvo, preferentemente con
puertas corredizas que permanecen cerradas cuando no es
necesario acceder a los mismos. En las paredes pueden
colocarse, con el mismo fin, estanterías protegidas por puertas
corredizas.
Es conveniente utilizar dos autoclaves ubicados a bastante
distancia uno de otro, para la esterilización de los medios y la
descontaminación del material peligroso, a fin de reducir al
mínimo las posibilidades de contaminación mutua. El material
de vidrio puede lavarse en el mismo local donde se encuentran
los autoclaves.
Debe preverse en cada local dos puertas, para facilitar una
rápida evacuación en caso de incendio o cualquier otra
emergencia. También es conveniente una habitación propia
para el personal, por pequeña que sea.
Los muros deben pintarse con una pintura impermeable y
a prueba de moho, que proporcione una superficie lisa de fácil
limpieza. Los suelos deben ser de baldosas resistentes, lisas y
que puedan fregarse rápidamente (2).
El laboratorio de microbiología debe estar alejado de
cualquier lugar en que haya emanaciones de gases o humos.
Conviene que esté equipado con aire acondicionado filtrado,
porque los ventiladores levantan polvo y pueden ser una causa
importante de contaminación. Las ventanas cerradas reducen
al mínimo las corrientes de aire que pueden causar
Carrillo L
56
VIGILANCIA DE SUPERFICIES
Cortar esponjas de celulosa en piezas de 1 x 5 x 5 cm, ponerlas
en bolsas individuales de papel y esterilizarlas en autoclave.
Humedecer una pieza con 10 mL de diluyente y frotar
vigorosamente 1 m2 de la zona seleccionada, sujetándola con
una pinza o un guante esterilizado. Colocarla en una bolsa
plástica esterilizada, agregar 100 mL de diluyente, aplicar un
masaje vigoroso a la esponja durante 1 minuto y dejar 20-30
minutos.
Transferir dos alícuotas de 1 mL a sendas cajas de Petri y
volcar 15 mL de agar para recuento fundido y enfriado a 45-50ºC.
Incubar las placas a 30 y 35ºC durante 48 hs.
Calcular el número de microorganismos en el área frotada (2).
CONTROL DEL AIRE
Exponer dos placas de agar para recuento al ambiente del
laboratorio durante 15 minutos. Colocar las tapas e incubar a
30ºC. Contar el número de colonias. Más de 15 colonias por
placa indica que la calidad del aire es inapropiada (2).
PERSONAL
En un laboratorio típico hay dos clases de personal:
analistas y auxiliares, estos últimos preparan medios y
soluciones, y limpian el material. Los auxiliares deben ser
conscientes de la importancia de su cometido y de la necesidad
de informar cualquier circunstancia que exceda a sus
posibilidades o conocimientos, ya que la capacitación y
supervisión de los mismos depende de los analistas (2).
Las formación contínua de los analistas se determina en
función de los objetivos definidos para el laboratorio y es un
medio que permite producir resultados de calidad aceptable.
Deberán organizarse actividades de capacitación en la
metodología analítica específica, a veces en el mismo
laboratorio, bajo la responsabilidad del director.
Un programa de verificación de muestras es un ensayo
efectuado entre diversos laboratorios para determinar la
eficiencia analítica de los participantes. Un laboratorio de
referencia prepara las muestras homogéneas con niveles
teóricamente iguales de microorganismos. Los resultados cuali
o cuantitativos se envían al laboratorio de procedencia para su
evaluación estadística. La presencia de resultados
discrepantes, como los positivos falsos o negativos falsos, es
causa de preocupación.
Otro tipo de programa de ensayos entre laboratorios es el
estudio en colaboración, con el que se miden los resultados de
un método. Trabajando independientemente, los participantes
analizan las muestras de ensayo con el método que debe
validarse y envían los resultados al laboratorio de procedencia.
Los datos se analizan estadísticamente y los resultados del
método se expresan en términos de exactitud, capacidad de
reproducción y repetición (3).
Carrillo L
58
MUESTRAS
La información y el estado de las muestras que van a ser
analizadas influye de modo muy importante en su validez y
por tanto en la calidad de los resultados obtenidos. Por
consiguiente, la toma de muestras debe realizarse con tanto
cuidado como el propio análisis. La operación de muestreo debe
ser organizada de antemano con todos los instrumentos y
envases estériles a mano (3).
Siempre que sea posible, se eligen cinco o diez unidades del
mismo producto según el plan de muestreo. Se mezclan y
toman muestras de cada una de estas unidades con cucharas o
cuchillos estériles. Todas las fases (acuosa, grasa, granular,
etc.) deben estar representadas. Se registra la temperatura, el
estado y las características especiales de las muestras. Las
muestras de un lote de alimento preparado a escala industrial
se eligen aleatoriamente y se obtienen al menos diez, siempre
que sea posible (4).
Cuando el muestreo no es realizado por el analista, es
esencial disponer de un registro escrito que responda de la
integridad de la muestra entre el momento de recolección y la
utilización definitiva.
En cada ficha debe constar el número de subunidades de la
muestra, el nombre del producto, el nombre del recolector, la
fecha y hora de muestreo y recepción en el laboratorio, el
método y lugar de almacenamiento, el nombre del analista, la
fecha de análisis, el método y lugar de almacenamiento de
reserva en los casos de muestras oficiales, el método y fecha de
eliminación o destino final de la muestra (2).
Las muestras perecederas deben transportarse al
laboratorio refrigeradas y entre el momento de la llegada al
mismo y el inicio del análisis deben mantenerse a una
temperatura de 0 a 4ºC. Los alimentos congelados se
mantienen en ese estado. El análisis debe realizarse entre las
6 y 24 hs de la toma de la muestra, según el tipo de alimento.
Se emplea hielo seco o “hielo-gel” comercial/hielo normal
para mantener las muestras congeladas o refrigeradas,
respectivamente, durante el transporte al laboratorio, evitando
el contacto del producto con el hielo fundido. La integridad de
la muestra entre el momento de recolección y el de la entrega
EQUIPAMIENTO
Cámaras de cultivo
Se coloca un rótulo en el exterior, indicando la
temperatura a la que deben mantenerse. Algunos modelos
suelen ser muy sensibles a las variaciones diarias de la
temperatura ambiente y se deben adoptar las precauciones
necesarias, especialmente en verano.
La temperatura interior se debe observar con uno o más
termómetros, según el tamaño de la estufa. Las cámaras
grandes sufren menos fluctuaciones de temperatura que las
pequeñas (1). El margen de tolerancia es de + 1 a 2ºC. El
termómetro de inmersión parcial, con un intervalo de
graduación de 0,1ºC, debe estar inserto en un tubo con agua
cuya boca estará sellada con masilla para evitar la
evaporación. Todos los termómetros deben calibrarse una vez
al año .
Para cultivos a 15-20ºC se requiere más bien un
refrigerador antes que una estufa, pero algunas cámaras
tienen ambas cualidades con controles de calentamiento y
enfriamiento (2).
Los recipientes con los cultivos deben estar claramente
etiquetados con el nombre del analista y la fecha y hora en que
se introdujo. Los cultivos que deben incubarse durante 3 a 7
días se colocan dentro de bolsas plásticas junto a un vaso con
agua para mantener la humedad.
Carrillo L
60
Baño de agua
Se emplea toda vez que se deba mantener la temperatura
dentro de un margen de tolerancia de + 0,2ºC. Se carga con
agua destilada para evitar depósitos calcáreos, excepto los que
están conectados al grifo de agua corriente porque tienen un
dispositivo que mantiene el nivel constante. La tapa tiene que
estar bien ajustada para impedir una excesiva evaporación (1).
Si no se utilizará en dos semanas, se drena el agua, se lava
y seca el interior. Se debe inspeccionar con frecuencia para
impedir o retrasar los daños causados por la corrosión.
La temperatura se suele controlar después de un período
de estabilización de 3 horas, con un termómetro de inmersión
total cuyo intervalo de graduación es de 0,1ºC. Generalmente
se utiliza a 44,5 - 45,5ºC, rango en el cual un cultivo de
Escherichia coli incubado durante 24 hs produce gas y el de
Enterobacter aerogenes no lo forma en el medio EC (triptona 20
g, lactosa 5 g, sales biliares 1,5 g, fosfato dipotásico 4 g, fosfato
monopotásico 1,5 g, cloruro de sodio 5 g) (2)
Refrigerador y congeladora
El refrigerador se debe mantener a una temperatura de
menor a 5ºC. El exterior se limpia por lo menos una vez al mes
y el interior del equipo desconectado cada tres meses. Se vigila
con termómetros de inmersión para baja temperatura cuyo
intervalo de graduación es de 1ºC.
La congeladora se mantiene a una temperatura de -20ºC y
se debe desconectar y limpiar cada seis meses. Todos los
recipientes tienen que llevar rótulos con el tipo de material, el
nombre del responsable y la fecha de depósito.
Todo funcionamiento defectuoso de los aparatos del
laboratorio y las reparaciones realizadas deben ser
documentadas (2).
Autoclave
Es preferible el modelo de carga horizontal. Conviene que
posea un termómetro calibrado para medir una temperatura
Carrillo L
62
Balanza
El laboratorio debe estar equipado con una balanza de 200-
300 g de capacidad y una sensibilidad de 0,1 g, y otra con una
capacidad de 100-150 g y una sensibilidad de 1 mg. Cada vez
que se usan se debe limpiar los platillos de pesada. La
exactitud de las balanzas debe verificarse cada tres meses con
pesas calibradas. Conviene que anualmente un representante
del fabricante haga una limpieza y calibración de la balanza
analítica de alta precisión (2).
pHmetro
Es preferible usar un medidor de pH antes que las tiras
indicadoras para los medios rehidratados, las soluciones y
otros materiales, pero para productos con pH <4,0 es aceptable
el empleo de los papeles indicadores (3).
Si el aparato es nuevo se deben seguir las instrucciones del
fabricante para su puesta en marcha. Los electrodos necesitan
cuidados especiales. Cuando se transfieren de una solución a
otra, se deben enjuagar con la segunda solución y con agua
desmineralizada al terminar el trabajo. El procedimiento de
almacenamiento depende del tipo de electrodo, los de vidrio
deben colocarse en una solución reguladora neutra, para los de
referencia se usa una solución de cloruro de potasio 0,1 M.
Los pHmetros se controlan antes de cada uso con
soluciones reguladoras de pH 4,0, 7,0 y 10,0. Hay que dejar
que las muestras y soluciones alcancen la misma temperatura
antes de de efectuar las mediciones.
Con el uso o el tiempo la eficiencia de un electrodo se
reduce. Deberá limpiarse la punta con ácido clorhídrico 0,1 M,
luego con solución de EDTA, terminando con acetona o
metanol. Si las lecturas erráticas persisten se debe a otras
causas y probablemente haya que sustituirlo (2).
Carrillo L
64
Microscopio
Es preferible un microscopio estándar binocular, con
objetivos y oculares que proporcionen aumentos de 40x, 100x,
400x y 1000x aproximadamente, un condensador con una
abertura numérica de 1,25, un diafragma iris y el sistema de
iluminación montado en la base. En los laboratorio que lleven
a cabo procedimientos con colorantes fluorescentes, es
imprescindible un microscopio de fluorescencia (2).
Una lupa binocular es conveniente para el examen de la
morfología del cultivo y facilita el repique en una placa
atestada de colonias (4).
Deben colocarse en una superficie exenta de vibraciones y
no es conveniente cambiarlos de emplazamiento. Cuando no se
utilicen se cubren con una funda para evitar el polvo.
Los lentes se deben limpiar, después de usarlos, con papel
para lentes o algodón muy suave. El objetivo de inmersión se
Material de vidrio
Conviene el fabricado con vidrio borosilicato de bajo
contenido alcalino. Todos los materiales volumétricos deben
estar acompañados de la certificación de calibración. Después
de cada uso se revisan y descartan los que tienen bordes
mellados o la superficie interna corroída. La punta mellada de
una pipeta hará que los volúmenes vertidos sean inexactos. El
gollete de los matraces se debe inspeccionar para detectar
fisuras que puedan causar derrames y los tapones de plástico
si son nuevos se lavarán con una solución detergente caliente
para eliminar residuos tóxicos.
Carrillo L
66
Material de plástico
Hay dos categorías, descartable y esterilizable.
El material descartable, tal como cajas de Petri,
recipientes para muestras, puntas de pipetas automáticas, etc.
reduce el tiempo empleado en las tareas de limpieza, pero
complica la eliminación una vez usado.
El material recuperable, por ejemplo cajas de Petri de
policarbonato, puede ser esterilizado en autoclave (4).
Carrillo L
68
METODOLOGÍA
Abundan los métodos microbiológicos. El empleo de
métodos diferentes para analizar un determinado alimento
suele conducir a resultados diferentes. Los microbiólogos
deben conocer la finalidad y las aplicaciones de los principales
manuales de análisis microbiológico de los alimentos, entre
ellos están:
o AOAC International. 1998. Official Methods of Analysis, 16ª
ed, 4ª rev. Gaithersburg.
o APHA. 2001. Compendium of Methods for the
Microbiological Examination of Foods, 4ª ed. Downes FP, Ito
K, editores. Washington.
o ICMSF. 1982. Microorganismos de los Alimentos, vol I.
Acribia, Zaragoza.
o Mossel DAA et al. 2003. Microbiología de los Alimentos. 2ª
ed. Acribia, Zaragoza, cap. 9: Procedimientos normalizados y
validados.
Todas las técnicas analíticas presuponen que el analista ha
sido instruído adecuadamente en las prácticas microbiológicas
de laboratorio y se ha familiarizado con las técnicas de
seguridad empleadas cuando se manipulan microorganismos
patógenos (1).
Antes que un método sea utilizado corrientemente en un
laboratorio, debe ser convalidado. El método ha de facilitar
datos con un grado predecible de precisión y exactitud cuando
lo empleen analistas calificados. La precisión da la medida de
DOCUMENTACIÓN
Se debe proceder a un registro sistemático y documentado
de toda la información que tenga alguna relevancia práctica
para los análisis realizados, y permita reconstruir una
situación analítica mucho después de que se haya efectuado el
trabajo.
La documentación es un mecanismo que colabora con la
localización de una muestra de laboratorio desde que se recoge
hasta que se elimina. La secuencia de registros deben
constituir un cuerpo contínuo que proporcione un historial
claro, exacto e indiscutible de la muestra, sin discrepancias.
Los datos de la garantía de calidad (calibración,
mantenimiento o reparación de un equipo; preparación de
medios y reactivos; control microbiológico del aire; etc) deben
registrarse en el cuaderno de notas y no en las fichas de
análisis de las muestras (3).
El manual de procedimientos operativos normalizados es el
documento más importante para el mejoramiento y
mantenimiento de la calidad del servicio, y es esencial para la
acreditación del laboratorio microbiológico de alimentos.
Debe cumplir con los siguientes criterios:
Carrillo L
70
REFERENCIAS
1. Collins CH et al. 1999. Microbiological Methods. 7ª ed. Butterworth-
Heinemann, Oxford, pp 11, 19, 39.
2. Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la
Alimentación. 1992. La Garantía de la Calidad en el Laboratorio
Microbiológico de Control de los Alimentos. Roma.
3. Downes FP, Ito K, editores. 2001. Compendium of Methods for the
Microbiological Examination of Foods. 4º ed. American Public Health
Association, Washington, pp 1, 13, 25.
4. Mossel DAA et al. 2003. Microbiología de los Alimentos. 2ª ed,
Acribia, Zaragoza, p 585.
5. Carrillo L. 2005. Manual de Microbiología Agrícola. Ediunju, Jujuy,
p 51.
FRUTAS y HORTALIZAS
Una vez que el producto es cosechado, comienza de
inmediato la senescencia, haciéndolo más sensible al deterioro
microbiano. El grado y la velocidad del incremento de la
población de microorganismos depende del producto y las
condiciones de almacenamiento. El deterioro es realmente
causado por solo una pequeña proporción de la microbiota
inicialmente presente y un tipo específico de alteración se
desarrolla bajo las condiciones normales de almacenamiento a
temperaturas apropiadas. Los factores que influyen sobre la
microbiota dominante y determinan la clase de deterioro, son
la contaminación inicial, las propiedades del sustrato, las
condiciones ambientales y las características de los microbios.
Todos los vegetales poseen una microbiota residente que
subsiste con pequeñísimas cantidades de carbohidratos,
proteínas y sales inorgánicas disueltas en el agua exudada o
condensada sobre la superficie del hospedante. Otros factores
importantes son la contaminación a partir del suelo, el agua,
los animales domésticos y salvajes, y la extensión del contacto
durante la cosecha con las superficies sucias de las
cosechadoras y contenedores (1).
DETERIORO
La microbiota dominante sobre las hortalizas recién
cosechadas es muy variable. Está constituída por bacterias
gramnegativas como Enterobacter, Pantoea y Pseudomonas (2),
pero las partes que crecen cerca o dentro del suelo contienen
bacterias grampositivas, por ejemplo Bacillus, Paenibacillus,
Clostridium (3) y organismos corineformes. Sobre la superficie
de algunas verduras se propagan los Leuconostoc y
Lactobacillus (4). Muchos de estos organismos son pectinolíticos
o celulolíticos y originan el reblandecimiento característico de
las podredumbres blandas, por ejemplo Pectobacterium
carotovorum (5).
Los hongos filamentosos aislados de las hortalizas con más
frecuencia son Aureobasidium, Fusarium, Alternaria,
Epicoccum, Mucor, Rhizopus, Phoma, Chaetomium y en menor
proporción Aspergillus, Acremonium, Botrytis, Cladosporium,
ALMACENAMIENTO
La refrigeración reduce el metabolismo y mantiene el sabor
y el valor nutritivo, y puede disminuir la incidencia de las
podredumbres. Sin embargo las plantas tropicales y
subtropicales sufren lesiones debido al frío con la consiguiente
pérdida de calidad.
El aire debe circular dentro de la cámara refrigeradora y se
requiere una humedad entre 90 y 95% para evitar el secado de
las frutas y hortalizas, pero si se mantiene una humedad más
alta aumentará el número y tipo de microbios a pesar de la
baja temperatura. El ajuste de la humedad relativa permite
equilibrar la disminución del crecimiento microbiano y la
pérdida de humedad del producto (17).
Por otra parte el almacenamiento en una atmósfera
modificada extiende la vida útil del producto mientras se
mantenga la temperatura baja, por ejemplo las manzanas,
pues bajo ciertos niveles de dióxido de carbono se restringe el
crecimiento de organismos aerobios como los mohos (1).
En el caso de las papas, se almacenan los tubérculos
limpios y secos bajo ventilación, con una humedad relativa
elevada y una temperatura entre 4 y 10°C (18). Otros productos
como alcaucil, apio, arveja, cebolla, coliflor, espárrago,
espinaca, lechuga, nabo, perejil, repollo y zanahoria se
almacenan alrededor de los 2°C, mientras que ají, berenjena,
chaucha y pepino se colocan a 7°C, tomate a 10°C, calabaza y
zapallo a 10 - 13°C y batata a 13 - 15°C.
La mayoría de las frutas se almacenan a 2°C, pero limón,
lima, mango, papaya, banana, ananá y otras requieren mayor
temperatura. El deterioro durante la comercialización es
variable pudiendo llegar hasta el 50% de las hortalizas y
algunas frutas.
Además de la refrigeración, las siguientes medidas antes
del almacenamiento ayudan a controlar el deterioro:
PATÓGENOS
Las hortalizas crudas sólo participan de un modo
secundario en las infecciones transmitidas por alimentos.
Cuando aparecen estas infecciones, son debidas a la
contaminación por estiércol (21) o aguas residuales (22), por
ejemplo huevos de vermes, quistes de protozoos, bacterias y
virus entéricos como el de la hepatitis A.
Las bacterias patógenas y amebas pueden sobrevivir por
un tiempo en el suelo y contaminar las hortalizas que serán
consumidas crudas. El lavado y desinfección de estos alimentos
puede reducir algo del problema, pero no eliminarlo (1).
Con el fin de controlar estos peligros son necesarias las
siguientes precauciones:
o evitar el uso de aguas fecales y de estiércol animal no
compostado como abono,
o evitar el riego con agua contaminada,
o lavar previamente todas las materias primas con agua
potable,
o higienizar con un agente desinfectante,
o limpiar y desinfectar adecuadamente las instalaciones y
enjuagar con agua potable (18).
Las hortalizas son alimentos cuya durabilidad se suele
prolongar mediante refrigeración, especialmente las cocidas.
La presencia de Clostridium botulinum no proteolíticos (tipos
B, E y F) constituye un peligro pues puede formarse la toxina
en 10 días a 8ºC si hay microambientes anaeróbicos en el
producto almacenado (23). Por otra parte, las hortalizas y
frutas frescas tratadas con bioinsecticidas que contienen
CONSERVACIÓN
Los métodos más importantes para conservar las frutas y
hortalizas son desecación, congelación, apertización, fermenta-
ción láctica y colocación en vinagre o salmuera, pero ninguno
mejora la calidad de la materia prima. La selección previa
ayuda a eliminar los materiales crudos deteriorados y la
limpieza en seco quita el suelo del producto antes del lavado
con agua clorada (2 a 5 ppm de cloro residual) (2).
El blanqueo es un paso crítico en el procesamiento de las
hortalizas congeladas pues elimina la mayoría de los
organismos contaminantes, y las dificultades en el control de
la contaminación post-blanqueo depende del tipo de producto.
La microbiota predominante en los vegetales congelados
depende de la región geográfica y de la hortaliza. Suelen
encontrarse bacilos gram-negativos, enterococos, especies de
Lactococcus y Leuconostoc, y un bajo número de mohos (1).
Como las frutas comúnmente no son blanqueadas
mantienen la microbiota adquirida en el campo, a la se suma
la incorporada durante el procesamiento. Predominan las
levaduras y los mohos, especialmente Geotrichum pues suele
acumularse en las superficies del equipamiento. También se
encuentran bacterias lácticas y especies de Acetobacter,
Gluconobacter y Zymomonas (2). Las frutas a desecar deben
cosecharse cuando hayan alcanzado su madurez.
Las hortalizas son blanqueadas antes de la deshidratación
a una temperatura y por un tiempo que dependen de la
madurez del producto. De esta manera se eliminan microbios e
inactivan enzimas. El dióxido de azufre a un nivel de 1.000-
3.000 ppm, previene el oscurecimiento y reduce el número de
microorganismos.
El secado al sol está limitado a un clima favorable y a
ciertos frutos y hortalizas. Es posible el deterioro durante el
proceso de secado, el producto está también expuesto a la
contaminación ulterior por polvo, suciedad, insectos y roedores,
que añaden microorganismos al producto desecado (2).
En las cabinas de secado los factores que influyen son la
temperatura, la humedad relativa del aire, la velocidad del
ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO
Se toman las muestras llevando a cabo las técnicas
apropiadas para evitar cualquier contaminación durante su
obtención y la posibilidad de crecimiento o muerte de los
microbios durante el transporte al laboratorio. La muestra es
el material obtenido y la unidad de análisis el material
realmente utilizado. Ambos pueden ser lo mismo, pero en
general el tamaño de la muestra suele ser más del doble de la
unidad analizada para permitir otro ensayo posterior.
Se usan recipientes limpios, secos, esterilizados y cerrados,
de capacidad adecuada para el escandallo deseado, como
frascos de boca ancha con tapa a rosca o bolsas plásticas
desechables. Los instrumentos de muestreo requeridos
también son esterilizados. Las etiquetas deben tener un
tamaño adecuado para registrar todos los datos necesarios.
Las muestras refrigeradas o congeladas se colocan en un
recipiente aislante. En el caso de productos envasados cada
paquete es la muestra (27).
GRANOS y HARINAS
La microbiota de los granos de cereales y leguminosas es la
proveniente del suelo y el ambiente del depósito, además de la
adquirida durante el procesamiento. Aunque tienen alta
concentración de carbohidratos y proteínas, su baja actividad
de agua restringe el crecimiento microbiano si se almacenan
adecuadamente (1).
Las condiciones de almacenamiento, tales como el
contenido de humedad de los granos, la temperatura y el
tiempo de almacenamiento, son factores críticos en el control
de los microorganismos.
Las distintas variedades de granos no presentan grandes
diferencias entre sí, respecto a las poblaciones microbianas.
Los mohos, las levaduras y la mayoría de las bacterias
mesofílicas presentes, son indígenas de las plantas. Algunos
tipos de granos están constantemente contaminados con mohos
tales como Cladosporium, mientras que otros contienen
Aspergillus, Fusarium, Alternaria y otros.
Los contaminantes bacterianos (coliformes, enterococos, E.
coli) son aportados por los pájaros, insectos y roedores, los
cuales están ecológicamente asociados a los granos (2).
Para prevenir el crecimiento de mohos, el contenido de
humedad de los cereales debe ser tan bajo como sea posible.
Un aumento de 0,5% en el rango de 14,2 a 15,5% eleva la
cantidad del desarrollo de Aspergillus amstelodami, A. repens
y otros en un período de un mes.
El ataque fúngico de los granos comienza en el campo
antes que el grano esté maduro. La contaminación con
micotoxinas puede ocurrir en el campo o durante el
almacenamiento y no está limitada a una región geográfica o
climática particular (3).
La población bacteriana en los granos es alta, pero el
número de patógenos es bajo y suele incluir B. cereus, C.
perfringens, C. botulinum y en algunos casos Salmonella spp.
Los niveles de mohos y levaduras también son elevados, y si
los granos están secos mueren lentamente. La baja actividad
agua de los granos de cereales evita el desarrollo de las
ANALISIS MICROBIOLOGICO
La microbiota normal de los granos de cereales comprende
mohos (102 - 104 /g), levaduras y hongos levaduriformes (102 -
104 /g), bacterias aerobias (102 - 106 /g), coliformes (102 - 104 /g),
E. coli (<102 - 103 /g), actinomicetos (103 - 106 /g).
Carrillo L
86
Carrillo L
88
REFERENCIAS
1. Jay MJ et al. 2005. Modern Food Microbiology. 7ª ed. Springer, New
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Zaragoza, p.109.
7. Código Alimentario Argentino. http//:www.anmat.gov.ar/codigoa
/caa1.htm cap 9.
MICOTOXINAS
Los mohos crecen sobre los materiales vegetales
produciendo el deterioro de los mismos. Forman metabolitos
secundarios que actúan como antibióticos favoreciendo la
prevalencia del moho frente a otros microorganismos, muchos
de los cuales son tóxicos para plantas y/o animales. Estos
metabolitos que enferman o matan a los animales que los
consumen se conocen como micotoxinas y la afección se llama
micotoxicosis. Las micotoxinas en la mesa del consumidor
constituyen un problema que comienza en el campo y continúa
durante el acopio y la comercialización, cuya única solución es
prevenir el crecimiento fúngico. Se ha comprobado la acción de
unas pocas toxinas en brotes de intoxicación humana y animal,
las otras han sido ensayadas en animales de experimentación.
La presencia de las micotoxinas en los vegetales puede
deberse:
o a la infección de la planta en el campo por el hongo
patógeno o a la colonización por los saprobios,
o al crecimiento de los mohos saprobios o patógenos post-
cosecha sobre los frutos y granos almacenados,
o al desarrollo fúngico saprobio durante el
almacenamiento de los productos ya procesados (1).
Las micotoxinas son compuestos ubicuos que difieren en
sus propiedades químicas, biológicas y toxicológicas. Una
micotoxicosis primaria se produce al consumir vegetales
contaminados, y secundaria al ingerir carne o leche de
animales que comieron forrajes con micotoxinas (2). La
presencia de aflatoxina M1 en la leche materna es
consecuencia de la ingestión de aflatoxina B1 con los alimentos
y provoca una micotoxicosis en el bebé (3).
Las características de una micotoxicosis son las siguientes:
o no es una enfermedad transmisible,
o el tratamiento con drogas o antibióticos tiene poco o
ningún efecto,
o en los brotes observados en el campo, el problema es
estacional debido a que las condiciones climáticas
afectan al desarrollo del hongo,
MOHOS
Los hongos adquiridos en el campo son Alternaria, algunos
Aspergillus, Cladosporium, Epicoccum, Fusarium,
Verticillium, además de otros fitopatógenos, y las especies
difieren según el vegetal, el clima y la región geográfica (5, 6).
Para crecer requieren generalmente una humedad relativa
entre el 90 y 100% y un contenido de agua en los granos de 22
a 23%, con un amplio rango de temperatura entre 0 y 30°C,
aunque algunos pueden desarrollarse a 35°C o más (7).
La colonización de las partes aéreas de las plantas por los
microorganismos comienza tan pronto como son expuestas al
aire. Las bacterias suelen aparecer primero, luego las
levaduras y finalmente los hongos filamentosos saprobios y
patógenos. Los mohos continúan desarrollándose a lo largo de
todo el crecimiento de la planta, lo que se acentúa cuando
envejece y las semillas maduran. La cosecha perturba el
ecosistema y las condiciones relativamente estables del
almacenamiento entrañan un profundo cambio en la
composición de la microbiota (5).
Los restos vegetales abandonados en el campo suelen
albergar esclerocios, como en el caso de A. flavus, que serán la
fuente de contaminación del cultivo en la temporada siguiente
(6). El crecimiento fúngico continua en los productos frescos
después de la cosecha y causa lesiones que desfiguran el
aspecto de frutas y hortalizas. Los hongos toxigénicos persisten
PRODUCCIÓN DE MICOTOXINAS
La microbiota sobre y dentro de los vegetales afecta la
calidad y el comportamiento durante el acopio y el
procesamiento de varios productos hortícolas. La competencia
entre las poblaciones microbianas mixtas que se encuentran
naturalmente suele constituir una desventaja para la
producción de las micotoxinas (1).
Se conocen algunas especies fúngicas, por ej. Trichoderma
viride, que inhiben la producción de aflatoxinas. A su vez A.
flavus impide la formación de toxinas en un cultivo mixto con
Aspergillus ochraceus o Aspergillus versicolor (2). También A.
flavus y A. ochraceus inhiben la formación de toxinas de
Myrothecium. roridum en un cultivo mixto (8). En cambio la
rubratoxina B, un metabolito de Penicillium purpurogenum,
aumenta la producción de aflatoxinas por Aspergillus
parasiticus, y el ácido ciclopiazónico producido por A. flavus
potencia la acción de la aflatoxina B1 (2).
El metabolismo primario de los mohos es similar al de la
mayoría de los organismos eucarióticos. Los metabolitos
secundarios son formados a partir de unos pocos
intermediarios del metabolismo primario, bajo condiciones
sub-óptimas y de estrés (1). Durante la biosíntesis de estos
metabolitos, la cantidad producida depende no sólo de los
parámetros nutricionales y ambientales, sino también de la
historia del desarrollo del moho. La formación de las
micotoxinas refleja que el hongo ha alcanzado cierto grado de
MICOTOXINAS AFECCIONES
inducción de cáncer hepático, se excreta por
aflatoxina B1 leche como aflatoxina M1, pasa al feto (3, 11,
12, 13)
inducción de cáncer hepático, excretada en
aflatoxina M1
leche materna, pasa al feto (3)
alcaloides del ergotismo convulsivo; ergotismo gangrenoso
ergot necrótico (9)
citroviridina beriberi cardíaco agudo (2)
diarrea, nauseas, vómitos, cefalalgia, dolor
desoxinivalenol abdominal, anorexia, escalofríos,
convulsiones, vértigo; inmunotoxicidad (9)
fumonisinas lesiones precancerosas en esófago (9, 14)
moniliformina cardiopatía endémica en China (15)
nefropatía endémica de los Balcanes, Túnez
ocratoxina A y Escandinavia; excreción por leche materna,
pasa al feto; tumores en tracto urinario (3, 16,
17, 18, 19)
MICOTOXINAS MOHOS
Aspergillus flavus, A. nomius, A.
aflatoxinas
parasiticus
alcaloides del Claviceps purpurea, Neotyphodium
ergot coenophialum
Aspergillus terreus, Eupenicillium
citroviridina
ochrosalmoneum, Penicillium citreonigrum
Fusarium culmorum, F. graminearum, F.
desoxinivalenol
pseudograminearum
Alternaria arborescens, Fusarium nygamai,
fumonisinas
F. proliferatum, F. verticilloides
Fusarium acuminatum, F. avenaceum, F.
moniliformina fujikuroi, F. proliferatum, F. subglutinans,
F. thapsinum
Aspergillus alliaceus, A. carbonarius, A.
melleus, A. niger, A. ochraceus, A.
ocratoxina A
sclerotiorum, A. sulphureus, Penicillium
verrucosum
psoralenos Sclerotinia sclerotiorum
Fusarium armeniacum, F. equiseti, F.
toxina T-2
musarum, F. poae, F. sporotrichioides
Fusarium crookwellense, F. culmorum, F.
zearalenona
equiseti, F. graminearum, F. semitectum
INCIDENCIA Y LÍMITES
La contaminación con micotoxinas de los productos
hortícolas y animales no es grande, mientras que la de los
granos es variable. Algunos mohos toxigénicos no producen
micotoxinas sobre todos los substratos, pero tampoco fueron
PREVENCIÓN
El manejo correcto de los cultivos y cosechas, y el control
de la calidad de los alimentos para los animales de la granja
constituyen los únicos medios de prevención. La presencia de
cualquier alteración organoléptica de frutas u hortalizas es
causa suficiente para rechazar el producto por la potencial
formación de toxinas debida al deterioro fúngico, las que se
distribuyen con facilidad por todo el substrato, por ejemplo en
los tomates. Por otra parte, es difícil prever la presencia de
micotoxinas al adquirir carnes, huevos y quesos ‘caseros’, sin
REFERENCIAS
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CARNES ROJAS
La carne roja de vacunos, búfalos, cerdos, ovejas, cabras,
llamas y otras especies, es un medio de cultivo excepcional
para el desarrollo de la mayoría de los microorganismos. Tiene
un alto contenido de proteínas, baja proporción de carbo-
hidratos y sustancias solubles de menor peso molecular, y una
aw = 0,99. La humedad disponible para el crecimiento
microbiano se expresa en términos de actividad agua (aw) cuyo
valor es 1 para el agua pura y por ejemplo, 0,990 para una
solución 0,30 molal de cloruro de sodio. El contenido en
vitaminas del músculo es muy elevado (unos 60 µg/g) y
comprende a tiamina, riboflavina, niacina, ácido fólico, ácido
pantoténico, B6, B12 y biotina (1).
El tejido muscular está recubierto por sus fascias
protectoras y las miofibrillas contenidas dentro del sarcolema.
Una vez que han sido descuartizadas las reses, gran parte de
su protección inicial se destruye y durante el picado
desaparece por completo. Los alimentos de origen animal
poseen sustancias inhibidoras como las inmunoproteínas, muy
específicas en su acción pero con un reducido espectro de
actividad antimicrobiana, que no proveen protección práctica
alguna (2).
Todos los animales transportan grandes cantidades de
microorganismos. Numerosas bacterias, además de mohos y
levaduras, están presentes en el cuero, los pelos y las pezuñas
de los vacunos, y son transmitidos a la carcasa luego del
sacrificio. Los restos de estiércol en la pelambre suelen acceder
al músculo, así como el contenido intestinal si la evisceración
no se hace cuidadosamente. Por otra parte, las bacterias
también pueden proceder de los pisos, paredes, mesadas,
cuchillos y manos de los operadores en la planta de faena (1).
Los bacterias psicrotróficas de la superficie de las carnes
no provienen del intestino e incluyen especies de
Pseudomonas, Moraxella, Flavobacterium, Acinetobacter,
Brochothrix thermosphacta, y algunas Enterobacteriaceae y
Lactobacillaceae (2).
En la superficie de la carne bovina suelen encontrarse
varios tipos de Escherichia coli, algunas especies de
DETERIORO
Las carnes son fácilmente alterables, sobre todo si están
procesadas, pues tienen un pH entre 5,1 y 5,6, adecuado para
el desarrollo de la mayoría de los microorganismos, y un
potencial de reducción que permite el crecimiento de los
anaerobios en profundidad y los aerobios en la superficie (1).
Las bacterias están confinadas a la superfice de las carnes
durante la fase de crecimiento logarítmico, e interviene en la
adhesión al sustrato la carga superficial de los microbios y su
hidrofobicidad (10). Las enzimas extracelulares, secretadas por
los gérmenes proteolíticos cuando alcanzan su densidad
máxima, les permite penetrar en la carne (11).
Audisio MC
104
Audisio MC
106
MICROORGANISMOS PATÓGENOS
La carne vacuna está considerada como el origen de la
diseminación de ciertos tipos virulentos de E. coli. Las
bacterias Staphylococcus aureus, C. perfringens, Campylo-
bacter spp., Listeria monocytogenes y Salmonella spp., se
encuentran en un bajo número sobre las superficies de las
carnes crudas sin embargo pero puede aumentar por una
manipulación inadecuada (4).
Los patógenos más comunes transmitidos por la carne
vacuna son Salmonella spp., Staphylococcus aureus y C.
perfringens. La carne de cerdo es un vector importante en la
transmisión de Campylobacter jejuni y Y. enterocolitica (7).
Por otra parte Listeria puede sobrevivir, a temperatura
reducida, en la carne procesada porque es osmóticamente
tolerante y acumula solutos compatibles en el citosol (20).
La presencia de patógenos en la carne cruda es un
problema imposible de solucionar. Ninguno de los proce-
dimientos disponibles actualmente pueden proporcionar una
carne roja, cruda, libre de patógenos. A pesar de este riesgo, la
carne y las hamburguesas se suelen consumir crudas o mal
cocidas. Esto ha producido en los últimos años brotes de
infección humana por E. coli O157:H7, que podrían haberse
evitado si la temperatura interna de cocción hubiera alcanzado
los 65ºC (16).
Existen varios tipos de E. coli patógenos, entre ellos se
encuentran el enterohemorrágico (ECEH O157:H7) que
coloniza el tracto gastrointestinal y sintetiza verotoxinas, el
enteropatógeno (ECEP) que provoca la destrucción de las
microvellosidades de la pared intestinal, el enterotoxigénico
(ECET) que es la principal causa de la diarrea del viajero y las
infantiles, y el enteroinvasor (ECEI) que origina una enferme-
dad similar a Shigella (21). En el 36,5% de las reses bovinas y
54,5% de las carnes molidas faenadas en el noreste del país se
aislaron cepas de ECEH, el cual es un patógeno emergente
asociado a casos esporádicos de diarrea, colitis hemorrágica.
síndrome urémico-hemolítico o púrpura trombocitopénica en
seres humanos (22).
Audisio MC
108
ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO
Se suele emplear el recuento de bacterias aeróbicas totales,
el recuento de anaerobios totales, y la determinación de una o
más de las clases de microorganismos a diferentes
temperaturas (2).
CARNE PICADA
ANALISIS FIAMBRES
CHACINADOS
Recuento de aerobios n=5 c=3
−
mesófilos/g m=106 M=107
n=5 c=2
Recuento de E.coli/g <10 ufc/g
m=100 M=500
Recuento S. aureus n=5 c=1
<100 ufc/g
coagulasa positivo/g m=100 M=1000
n=5 c=0
E. coli O157:H7/NM ausencia en 25 g
ausencia en 65 g*
N=5 c=0
Samonella spp. ausencia en 25 g
ausencia en 10 g*
Listeria monocytogenes − ausencia en 25 g
Coliformes totales − <100 ufc/g
Clostridios sulfito-
− <100 ufc/g
reductores
Mohos y levaduras − <1000 ufc/g
*criterios obligatorios
Audisio MC
110
Muestras Muestras
Rango del % positvo para
dentro del positivas para
NMP E. coli /g Salmonella
rango Salmonella
<3 270 2 0,7
3 – 51 406 20 4,9
51 – 100 54 3 5,6
101 – 240 96 4 4,1
241 – 1.100 65 3 4,6
1.101 – 11.000 56 9 16,1
< 11.000 25 5 20,0
Audisio MC
112
RECUENTO DE E. coli
Preparar las diluciones de la muestra (10-1 y 10-2) por alguno de
los procedimientos descriptos más atrás. Sembrar 0,1 mL de
cada dilución en sendas placas de medio de cultivo. Incubar a
35ºC durante 24 - 48 hs.
Incubar a 35ºC durante 24 - 48 hs. Contar las colonias oscuras
con brillo verde metálico en agar-eosina-azul de metileno o las de
color púrpura con halo del mismo color y fluorescentes en agar
McConkey-MUG.
AGAR EOSINA-AZUL DE METILENO. Peptona 10 g, lactosa 10 g, fosfato
dipotásico 2 g, eosina Y (solución acuosa al 2%) 20 mL, azul de metileno
(solución acuosa al 0,25%) 25 mL, agar 15 g, agua 1 litro, pH 7,1.
Esterilizar a 120ºC durante 15 minutos.
AGAR MC CONKEY-MUG. Peptona 20 g, lactosa 10 g, sales biliares 1,5
g, cloruro de sodio 5 g, rojo neutro (sol. hidroalcohólica al 1%) 3 mL,
violeta cristal (sol. acuosa al 0,1%) 1 mL, metil-umberiferil-β-glucurónido
0,05 g, agar 15 g, agua estéril 1 litro, pH 7,1. Calentar a ebullición hasta
disolución completa (2, 23).
IDENTIFICACION DE E. coli
Tomar material de varias colonias y suspenderlas en 1 mL de
diluyente. Hacer una tinción de Gram y la reacción de catalasa.
Sembrar por punción con aguja en el medio SIM, y con asa en
caldo glucosa y agar citrato. Incubar a 35ºC durante 48 hs.
Observar el color del agar citrato si tiene color azul hubo
asimilación del citrato.
En el medio SIM el crecimiento de E. coli se aleja de la punción
de siembra debido a la movilidad y no colorea el medio de negro
(H2S negativo). Añadir 1 mL del reactivo de Kovac y agitar, al
cabo de 10 minutos aparece color rojo en capa superior si hubo
formación de indol.
Dividir en dos tubos el cultivo en caldo glucosa.
Tubo 1: agregar unas gotas de rojo de metilo, se verá color rojo
si hubo una fermentación ácida mixta.
Tubo 2: añadir 1 mL de α-naftol y 0,5 mL de creatina alcalina,
dejar en reposo hasta 3 hs. Si hubo formación de acetoína, un
intermediario de la fermentación butilén-glicólica, aparecerá un
color rojo (reacción de Voges-Proskauer).
AGAR CITRATO DE SIMMONS. Sulfato de magnesio heptahidrato 0,2 g,
fosfato monoamónico 1 g, fosfato dipotásico 1 g, citrato de sodio
dihidrato 2 g, cloruro de sodio 5 g, azul de bromotimol (solución al 0,2%)
40 mL, agar 15 g, agua 1 litro, pH 6,8-7. Esterilizar a 120ºC durante 15
minutos.
MEDIO SIM. Triptona 20 g, peptona de soja 6 g, sulfato ferroso amónico
0,2 g, tiosulfato de sodio 0,2 g, cloruro de sodio 5 g, agar 3,5 g, agua 1
litro, pH 7,3. Esterilizar a 120ºC durante 15 minutos.
CALDO GLUCOSA. Proteosa-peptona 5 g, glucosa 5 g, fosfato
dipotásico 5 g, agua 1 litro. Esterilizar a 120 ºC durante 15 minutos.
α-NAFTOL. Disolver 1 g en 20 mL de etanol y usar.
CREATINA ALCALINA. Disolver 0,3 g de creatina y 40 g de hidróxido de
potasio, en 100 mL de agua destilada.
ROJO DE METILO. Disolver 10 mg en 30 mL de etanol 96º y añadir 20
mL de agua, esta solución es roja a pH 4,4 y amarilla a pH 6,2.
REACTIVO DE KOVAC. Disolver 1 g de p-dimetil-amino-benzaldehído en
15 mL de alcohol isoamílico y añadir 20 mL de ácido clorhídrico
concentrado (2, 25).
Audisio MC
114
REFERENCIAS
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AVES
La carne de ave comprende el tejido muscular, la piel
adherida, el tejido conectivo y los órganos que se consumen
(hígado, molleja y corazón). El contenido de agua de las
porciones comestibles de las canales de aves es
aproximadamente 70% para pollo parrillero mientras que el
contenido de proteínas y lípidos es 20,5% y 2,7%,
respectivamente (1). A diferencia de las carnes rojas (vaca,
cerdo) la grasa en el pollo se encuentra justo por debajo de la
piel y en la cavidad abdominal lo que facilita su remoción. El
contenido de grasa varía con la edad, sexo, anatomía y especie
aviar.
El sistema intensivo de cría, que limita el libre
desplazamiento de las aves, constituye una de las principales
causas de estrés y aumenta la difusión de los microorganismos
de animal a animal. Además, el traslado de las aves a la
planta de faena implica un período de ayuno y el hacinamiento
de las aves en jaulas de pequeñas dimensiones que favorecen
la infección por Salmonella (2). El ayuno es una práctica común
al final del período de crianza y se lo realiza para reducir el
contenido del tracto gastrointestinal, previo al procesamiento
de las aves.
La infección del ave por parásitos del género Eimeria
alteran la mucosa intestinal, barrera protectora natural del
lumen intestinal, que favorece la proliferación de bacterias
patógenas y la oportunidad que éstas alcancen otros órganos
concluyendo en una septicemia (3,4).
Algunas bacterias de los géneros Bacillus, Paenibacillus y
Clostridium se encuentran presentes en todo tipo de carnes,
rojas y blancas, por otro lado, Arcobacter y Campylobacter se
encuentran principalmente en las carnes de aves (5).
La contaminación interna del huevo puede provenir de
infecciones en el ovario u oviducto de la gallina ponedora. Si el
huevo es destinado para el consumo crudo y lleva el agente en
la yema, puede desencadenar una infección alimentaria. Si es
un huevo fértil, el pollito nacerá infectado. Entre las bacterias
que pueden habitar el sistema reproductor de la gallina se
Audisio MC
118
DETERIORO
En el matadero la contaminación tiende a propagarse por:
la contaminación cruzada entre aves vivas y canales, una
temperatura insuficiente en el tanque de escaldado, los dedos
de goma de la máquina desplumadora, la forma de
evisceración, la conservación de la piel y un inadecuado
enfriamiento final (7).
La población microbiana de las carcasas de las aves está
constituída por la microbiota natural de la piel y las plumas, la
microbiota transitoria durante la faena y los contaminantes
que se adquieren durante el procesamiento (1). Las aves
enteras suelen dar recuentos microbianos más bajos que las
troceadas.
Los estudios de la microbiota bacteriana de la carne fresca
de aves demostraron la presencia de unos 25 géneros
diferentes. Sin embargo, cuando las canales se refrigeran para
detener o reducir la contaminación, el principal agente causal
de deterioro lo constituyen las especies de Pseudomonas (5).
También se suelen encontrar Acinetobacter, Flavobacterium,
Corynebacterium, Alcaligenes, y algunas microbacterias y
lactobacilos.
El deterioro de las aves está limitado a la superficie porque
las partes internas de los tejidos generalmente son estériles o
contienen microorganismos que no suelen crecer a bajas
temperaturas. La mayor parte de los organismos están en la
superficie y los recuentos superficiales por cm2 ofrecen mayor
información que los recuentos de muestras que incluyen tejidos
profundos.
Las canales de aves frescas y almacenadas en un ambiente
muy húmedo son muy susceptibles al ataque por Pseudomonas
MICROORGANISMOS PATÓGENOS
La producción en gran escala de carne de aves ha generado
una serie de problemas sanitarios. Se ha observado y publicado
que porcentajes elevados de canales (de pollos y de pavos)
contienen Salmonella spp., Campylobacter jejuni y Listeria
monocytogenes (7). Con frecuencia se han detectado aves
contaminadas con Yersinia enterocolitica, en un estudio hecho
en el país, el 10% de los pollos faenados contenían especies de
Yersinia, y el 4,3% Y. enterocolitica (8).
Campylobacter jejuni, es una bacteria gram-negativa,
microaerófila, móvil, con forma de bacilos o espirilos.
Campylobacter es transmitido al hombre a través de alimentos
contaminados (aves, cerdos, leche), de aguas superficiales sin
Audisio MC
120
RECUENTO DE Enterobacteriaceae
a. Hacer la suspensión de la muestra obtenida por extracción
de una capa superficial de 100 cm2, por hisopado de igual área o
por macerado de 25 g en 225 mL de diluyente. Preparar
diluciones decimales (10-2 - 10-6) y dejarlas a temperatura
ambiente durante 1 hora para revitalizar las células.
b. Transferir 1 mL de cada una a sendas cajas de Petri. Volcar
en las mismas unos 15 mL de agar VRGB fundido y enfriado a
50ºC. Mezclar suavemente, girando las placas sobre la mesada,
tres veces a la derecha y otro tanto a la izquierda.
c. Una vez que ha gelificado, verter unos 10 mL del mismo
medio a 50ºC y dejar enfriar. Incubar a 30 ó 42ºC durante 24
horas.
d. Calcular el número de ufc por g ó cm2, multiplicando el
número promedio de las colonias de color púrpura por el factor
de dilución correspondiente.
AGAR VRBG. Extracto de levadura 3 g, peptona 7 g, cloruro de sodio 5
g. sales biliares 1,5 g, glucosa 10 g, rojo neutro 0,03 g, cristal violeta
0,002 g, agar 15 g, agua 1 litro, pH 7,4. Calentar hasta ebullición para
disolver los ingredientes y mantener en baño de agua a 50ºC (7).
Audisio MC
122
ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO
El recuento de enterobacterias termotróficas a 42ºC,
permite evaluar la contaminación de origen intestinal en el
matadero, siendo el nivel de referencia inferior a 103 – 104
ufc/cm2. Las pruebas directas de presencia-ausencia de
REFERENCIAS
1. ICMSF. 1998. Microorganisms in Foods. Vol 6: Microbial Ecology of
Food Commodities. Blackie Academic & Professional, p 75.
Audisio MC
124
PESCADOS Y MARISCOS
La composición del músculo de pescado es muy variable y
depende de la especie, tamaño y estación del año. En general,
la carne de pescado contiene 20-25% de proteínas de a lto valor
biológico, vitaminas (tiamina, vitamina B12, riboflavina, ácido
pantoténico, ácido fólico, niacina y piridoxina) y minerales
(yodo, sodio, potasio, fósforo, calcio, magnesio, hierro, flúor,
manganeso, cloro, azufre, etc.). El contenido graso varía con la
especie (4 a 8%) y está constituido por triglicéridos y
fosfolípidos. Es pobre en hidratos de carbono.
El pH del pescado inmediatamente después de su captura
es neutro, luego desciende a 6,2-6,5 para luego subir a 6,6-6,7.
Este parámetro contribuye a la inestabilidad del pescado luego
de su muerte porque estos valores de pH favorecen el
desarrollo microbiano.
Las capas internas del músculo se consideran, como en los
casos anteriores, estériles. Las bacterias del pescado fresco se
encuentran en tres puntos principales: limo externo, agallas e
intestinos. La microbiota del pescado es psicrotolerante y en el
caso de los pescados de mar, halofílica (1).
La microoorganismos que acompañan al pez vivo depende
del ambiente natural en el que habita y las especies aisladas
del intestino son las mismas que las de las aguas donde es
capturado. Salvo que se pesquen en aguas contaminadas,
raramente son fuente de microorganismos patógenos.
La incidencia de microorganismos en gambas, ostras y
almejas, depende en gran parte de la higiene de las aguas en
las que se capturan. Estos moluscos se alimentan por filtración
y tienden a extraer y acumular los virus y bacterias del agua
en la que viven (2).
DETERIORO
El deterioro de los pescados es debido principalmente a la
autolisis, la oxidación química de lípidos, el crecimiento
bacteriano y el metabolismo resultante en la formación de
compuestos de olor desagradables, siendo estos últimos los
más importante. Sin embargo, no todos los microorganismos
presentes son igualmente causantes de los cambios de calidad.
Audisio MC
126
MICROORGANISMOS PATÓGENOS
Los peces capturados en mar abierto están exentos de
patógenos entéricos, mientras que los de agua dulce están
expuestos a la contaminación procedentes del hombre y otros
animales (2).
Las bacterias productoras de aminas vasopresoras
(escombrotoxina), como histidina y otras, son en su mayor
parte enterobacterias mesófilas, entre ellas Proteus morganii,
Hafnia alvei y Klebsiella pneumoniae. La conservación del
pescado a 0ºC impide la formación de estos compuestos (2).
Clostridium botulinum tipo E puede crecer y sintetizar
toxinas a 3ºC y la prevalencia en pescado crudo varía de 10 a
40% según las especies y en los productos envasados al vacío es
5%, por lo que constituye un riesgo en la industria pesquera (8).
Vibrio parahaemolyticus, V. cholerae y V. vulnificus son
las principales especies de vibrios causantes de las infecciones
relacionadas a los pescados y mariscos (9). También se suelen
aislar Salmonella y Shigella aunque no sean contaminantes
normales del pez (2).
Pseudomonas aeruginosa es un patógeno oportunista que
puede iniciar algunas infecciones en personas con las defensas
bajas y las cepas patógenas tienen una alta resistencia a los
antibióticos debido a un plásmido (2). Las especies de
Aeromonas son patógenos para peces pero A. hydrophila y A.
sobria son enterotoxigénicas para el hombre (10).
Los patógenos humanos son retenidos por las ostras sin o
con mínima inactivación. Como la velocidad de depuración es
muy baja pueden representar un peligro para la salud pública
si son criadas en aguas contaminadas. Las ostras suelen
transmitir ooquistes de Cryptosporidium parvum, quistes de
Giardia lamblia, esporos de microsporidios Encephalitozoon
spp (11).
Audisio MC
128
ANALISIS MICROBIOLOGICO
Los metabolitos producidos por los microorganismos
(trimetilamina y ácidos grasos) se pueden usar como
indicadores de una alteración inminente de los productos de
pesca.
Audisio MC
130
Audisio MC
132
HUEVOS y
OVOPRODUCTOS
El huevo de gallina consiste aproximadamente de un 9,5%
de cáscara, 63% de clara y 27,5% de yema. La cáscara es
bastante porosa, está constituida principalmente por carbonato
de calcio y la recubre una cutícula proteica que constituye la
barrera más importante contra la invasión bacteriana y regula
el intercambio de gases (1). Un par de membranas separan la
clara de la cáscara y otra rodea la yema La cámara de aire
localizada en el polo ancho del huevo, es relativamente
pequeña en el huevo recién puesto y aumenta de profundidad a
medida que pasa el tiempo.
La clara es una solución coloidal con 10,6% de proteínas,
0,9% de carbohidratos, 0,6% de minerales y trazas de lípidos.
Al transcurrir el tiempo después de la postura, va perdiendo su
consistencia y el pH se incrementa de 7,6 a 9,3. Varias
proteínas que constituyen la clara poseen propiedades
inhibitorias: conalbúmina, ovomucoide, lisozima, ovomucina,
avidina, ovoflavoproteína. La lisozima disuelve las paredes
celulares de las bacterias Gram-positivas (2).
DETERIORO
El huevo al momento de la postura generalmente es estéril
o posee pocos microorganismos. La contaminación de la
cáscara ocurre en la cama de las aves y por el contacto con las
heces. Para que un microorganismo produzca alteraciones en
el huevo debe penetrar a través de los poros de la cáscara
hasta a la membrana interna, crecer sobre la membrana y
alcanzar la clara o la yema (3).
El almacenamiento a la temperatura de refrigeración no
evita totalmente la alteración. Las bacterias asociadas con más
frecuencia al deterioro son bacilos Gram-negativos:
Pseudomonas fluorescens y otras especies, Acinetobacter,
Moraxella, Alcaligenes, Proteus, Escherichia y Serratia (3). Los
mohos Penicillium, Cladosporium, Mucor y Alternaria se
Audisio MC
134
MICROORGANISMOS PATÓGENOS
Las bacterias del género Salmonella están asociadas a las
aves y los huevos, siendo éstos los principales vehículos de su
distribución e infección en el hombre. Colonizan el tracto
gastrointestinal, principalmente el buche y el ciego, y se
diseminan entre las aves a través de la ruta fecal-oral. En
particular S. Gallinarum, S. Pullorum, S. Enteritidis y S.
Typhimurium presentan una afinidad por las aves y son
invasoras. Pueden infectar el tracto reproductor de la gallina
ponedora y así se transmiten verticalmente al huevo (6). S.
Enteritidis, S. Typhimurium producen gastroenteritis en el
hombre (1).
S. Enteritidis coloniza los tejidos del ovario y oviducto de la
gallina (7) y cerca del 80% de las gastroenteritis humanas
pueden ser « traced to » los ovoproductos contaminados (8).
La cáscara del huevo a la altura del útero es esponjosa y
muy porosa, y al salir al exterior y como consecuencia del
cambio de presión y de temperatura, permite la succión de
bacterias presentes en la cloaca, región sumamente
contaminada por su continuo contacto con las heces (3). Por
otra parte, algunas bacterias pueden llegar a sobrevir en el
agua de lavado, por ejemplo S. aureus, y contaminar el interior
de los huevos (9).
Pocas células de Salmonella son suficientes para infectar a
un pollito recién nacido y un solo huevo contaminado, por
transmisión vertical, en la incubadora es suficiente para
distribuir ese patógeno hacia todos los huevos e infectar toda
la incubadora por transmisión horizontal.
Audisio MC
136
ANALISIS MICROBIOLOGICO
CONFIRMACIÓN
Tomar con la aguja algunas de las colonias presuntamente de
Salmonella y sembrar por punción los tubos con medio SIM, agar
urea y medio de Hugh y Leifson y por estría el de agar Mac
Conkey. Incubar 10-24 hs a 37ºC.
Audisio MC
138
REFERENCIAS
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Microbiological Examination of Foods. 4ª ed. American Puublic
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Acribia, Zaragoza, p 522, 608.
4. Jay JM. 2005. Modern Food Microbiology. 7ª ed. Springer, New York,
p 198.
5. ICMSF. 1982. Microorganismos de los Alimentos. Vol. 2: Métodos de
muestreo para el análisis microbiológico. Acribia, Zaragoza, p 111,
120.
6. Wigley P et al. 2005. Infect Immun 73: 2986-2990.
7. Keller LH et al. 1995. Infect Immun 63: 2443-2449.
8. Lu S et al. 2003. Infect Immun 71: 6734-6741.
9. Pearson J et al. 1987. Appl Environ Microbiol. 53: 2060-2065.
10. Barbour EK et al. 1982. Avian Diseases 26: 234-244.
11. Doyle MP et al, eds. 1997. Food Microbiology. Fundamentals and
Frontiers. ASM Press, Washington, p 129.
12. ICMSF. 1982. Microorganismos de los Alimentos. Vol. 1: Técnicas de
Análisis Microbiológico. Acribia, Zaragoza, p 163.
13. Ohtsuka K et al. 2005. Appl Environ Microbiol 71: 6730-6735.
14. Eiguer T, Caffer MI. 1988. Rev. Arg. Microbiol. 20: 151-158.
15. Código Alimentario Argentino. Cap 6. http//:www.anmat.gov.ar/
codigoa /caa1.htm
Audisio MC
140
LECHE Y DERIVADOS
Se entiende por leche al producto que surge de la secreción
normal de las glándulas mamarias de los mamíferos. Cualquier
leche que no haya sido calentada a temperaturas de
pasteurización se denomina cruda. Existen varias formas de
tratamiento para aumentar la vida útil del producto: la
pasterización a 63 - 66ºC durante 30 minutos o a 72ºC durante 15
segundos y enfriamiento de inmediato a 10ºC, el tratamiento UHT
a 133ºC durante al menos 1 segundo y envasado en recipientes
estériles, la filtración, clarificación, homogeinización y envasado
seguido de calentamiento a 120ºC durante 10 - 30 minutos (1).
La leche es un buen medio de cultivo para el crecimiento de
varios microorganismos por su contenido en agua, pH casi neutro,
y una amplia variedad de nutrientes como lactosa y diferentes
proteínas. Aún cuando la leche posee un alto contenido de lípidos
son pocos los microorganismos que los utilizan (2).
La leche contiene varios factores antimicrobianos: lisozima,
lactoferrina, proteínas de la leche unidas a vitamina B12 y ácido
fólico, lactoperoxidasa e inmunoglobulinas maternas. La
lactoferrina tiene la capacidad de quelar el hierro. La
lactoperoxidasa cataliza la síntesis de compuestos con efecto
inhibidor sobre bacterias pero no levaduras o mohos (1).
Los microorganismos son importantes en la leche y los
productos derivados porque producen aromas y propiedades
físicas deseables en productos lácteos, pero otros pueden generar
alteraciones y algunos patógenos o sus toxinas pueden tornar
peligrosos a los productos lácteos (2).
La diversidad en los microorganismos presentes es la
responsable de la gran diferencia en las características organo-
lépticas entre los quesos hechos con leche cruda, respecto a los
pasterizados. La microbiota dominante incluye: a) bacterias
lácticas (Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Enterococcus,
Streptococcus, etc), b) Pseudomonas, c) Micrococcaceae
(Micrococcus y Staphylococcus), y d) levaduras. Otros organismos
presentes en la leche cruda son Bacillus, Clostridium, Listeria,
Enterobacteriaceae (Hafnia, Citrobacter, Serratia), Acinetobacter,
BACTERIAS LACTICAS
Son bacilos o cocos, gram-positivos, no esporulados y en
general catalasa-negativos, con una amplia distribución y
adaptabilidad a diferentes ambientes. Pueden producir un pH 4,0
en los alimentos con carbohidratos fermentables, inhibiendo el
desarrollo de otras bacterias. Aunque son mesofílicas pueden
crecer a 5-45ºC (4).
El género Lactobacillus se divide en tres grupos: a) homo-
fermentativos obligados (L. acidophilus, L. delbrueckii subespecie
bulgaricus, etc) son termobacterias que no fermentan pentosas, b)
heterofermentativos facultativos (L. casei, L. plantarum, etc) que
fermentan pentosas, c) heterofermentativos obligados (L. brevis,
L. reuterii, etc) que producen CO2 de glucosa (5).
Los cocos comprenden también a Aerococcus, Carnobacterium,
Pediococcus, Tetragenococcus y Vagococcus, además de los géneros
ya nombrados (6). Hay tres grupos genéticamente diferentes de
estreptococos: a) Streptococcus en la ubre y la cavidad oral, b)
Enterococcus (E. faecalis, E. faecium, etc) propios del intestino y c)
Lactococcus, en la leche (7).
Los enterococos están con frecuencia en los quesos de leche
cruda contribuyendo a las características organolépticas, entre
ellos E. casseliflavus, E. faecalis y E. durans. Pero E. faecium y
Streptococcus bovis, que predominan en el intestino vacuno, no se
suelen encontrar en la leche ni en el queso (8). Aproximadamente
el 10% de la leche cruda contiene diversos fagos de Lactococcus
lactis, algunos de los cuales son sensibles a la pasterización, pero
el 34% de las cepas industriales son resistentes a la infección por
fagos (9).
Las bacterias lácticas poseen propiedades terapéuticas,
mostrando una variedad de efectos beneficiosos. La fermentación
de la leche por los lactobacilos genera una mayor disponibilidad,
digestibilidad y asimilación de sus nutrientes, aumentan la
concentración de vitamina B1, ácido láctico, galactosa, ácidos
grasos y elementos esenciales como Ca, P, Mn, Fe y Zn (10). L.
acidophilus actúa disminuyendo el colesterol en sangre (11). L.
helveticus produce leche fermentada rica en inhibidores de la
enzima convertidora de la angiotensina (12).
Audisio MC
142
DETERIORO
La leche cruda puede ser alterada por bacterias psicrotrófas,
que, en general, son bacilos, no esporulados, gram-negativos,
proteolíticos, con algunas cepas lipolíticas. Los más frecuentes son
Pseudomonas fluorescens y P. putida que provocan cambios en el
aroma y el sabor del producto refrigerado. Otras especies son P.
fragi, P. aeruginosa, P. stutzeri y Burkholderia cepacia. Llegan a
través del suelo, forraje, agua, los otros animales y también por
los utensilios de ordeño y tanques de transporte o
almacenamiento mal lavados.
También la leche pasteurizada puede verse contaminada por
la exposición al aire o equipos contaminados. El tiempo de
generación de estas bacterias en la leche cruda es de 8-12 hs a 3ºC
y se reduce a 5,5-10 hs a 5ºC, y si inicialmente había 1 ufc/mL en
5 días la leche puede estar totalmente alterada (20).
Los bacilos coliformes producen gas a partir de la lactosa
mientras que determinadas especies de Streptococcus, Alcaligenes
y Enterobacter son responsables de la viscosidad y P. aeruginosa y
Serratia marcescens pueden conferir, respectivamente, color azul
y rojo. Es muy difícil producir leche cruda libre de coliformes. No
obstante, los altos recuentos son indicadores de malas prácticas
de producción, transporte o almacenamiento (5).
En la leche pasteurizada la presencia de bacterias coliformes
es inaceptable porque la temperatura de procesamiento las
MICROORGANISMOS PATÓGENOS
La microbiota normal de la ubre, glándula mamaria de la
vaca, está compuesta principalmente por bacterias como
Streptococcus, Staphylococcus y Micrococcus (alrededor del 50%)
seguido por Corynebacterium spp, Escherichia coli y otros.
Audisio MC
144
ANALISIS MICROBIOLOGICO
El Código Alimentario Argentino (CAA) establece límites
microbiológicos para leche pasterizada y en polvo, quesos y otros
productos (cuadros 1, 2 y 3). Los límites para leche cruda
certificada son ausencia de patógenos y E. coli, bacterias
coliformes <10 /mL y bacterias mesófilas < 104/mL en el momento
de la recepción por el consumidor (art 557) (31).
CUADRO 1. Criterios microbiológicos para leche según art. 556, 558, 559
y 567 del CAA (31).
entera
Leche ultrapasterizada entera en polvo
pasterizada
Recuento en placa <5.104 n=5 c=2
n=5 c=2
de bacterias invierno; m=10
m=3.104 M=105
mesófilas /mL <105 verano M=103
Recuento a 30ºC de n=5 c=2 n=5 c=2
<50
coliformes /mL m<3 M=10 m=10 M=100
Recuento a 45ºC de n=5 c=1 n=5 c=2
─
coliformes /mL m<3 M=10 m<3 M=10
S aureus coagulasa n=5 c=1
─ ─
positiva /g m=10 M=100
Salmonella spp
─ ─ n=10 c=0 m=0
/25g
ausencia en
E coli ─ ─
1 mL
Fosfatasa y
negativas negativas ─
peroxidasa
Aflatoxina M1 0,5 µg/L 0,5 µg/L 5,0 µg/L
Audisio MC
146
Audisio MC
148
REFERENCIAS
1. ICMSF. 1998. Microorganisms in foods. 6. Microbial ecology of food
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10. Mc Donough FE et al. 1983. Fed Proc 42: 556.
Audisio MC
150
PRODUCTOS EN
ENVASES HERMÉTICOS
Los alimentos que son colocados en latas, frascos de vidrio
y bolsas con cierre hermético, están protegidos del pasaje de
gases o microorganismos y pueden permanecer inalterados
indefinidamente si han sido sometidos a un tratamiento
térmico adecuado y si el cierre permanece intacto (1).
La calidad de las conservas y su vida de estante dependen
de la materia prima y los aditivos usados. La carga microbiana
del producto final está relacionada con la microbiota presente
en la materia prima y la eficacia del proceso de envasado.
Los alimentos tratados por el calor, estables a temperatura
ambiente, se dividen en dos clases: los que son completamente
estériles (la mayoría de origen animal) y los que contienen un
pequeño número de endosporos bacterianos viables, aunque en
estado latente (muchas de origen vegetal). A esta última clase
se la llama conserva con esterilización comercial (2).
La supervivencia microbiana durante el procesamiento por
calor depende de la temperatura alcanzada, la duración del
tratamiento y la composición del alimento, además del tipo de
organismos presentes en la materia prima (3).
Con respecto a la composición del alimento cabe considerar
el efecto de varios parámetros: a) pH (a medida que descienden
los valores aumenta el poder microbicida del calor), b)
concentración de cloruro de sodio (hasta 4% favorece la
termorresistencia bacteriana y a mayores valores el efecto es
inhibitorio), c) concentración de carbohidratos y grasa (a
medida que aumentan mayor es la termorresistencia de los
microbios), d) contenido de agua (los gérmenes toleran más el
calor seco que el calor húmedo) (1).
Si bien las conservas son los productos alimenticios más
resistentes al deterioro no están exentas de posibles
alteraciones debido a causas físicas, químicas o microbiológi-
cas, siendo la más apreciable el abombamiento o hinchazón de
la tapa y/o la base por la formación de gas en el interior (3).
DETERIORO
Las conservas alteradas por el desarrollo microbiano
suelen presentar ablandamiento del producto enlatado,
descomposición, olor repugnante, sabor amargo, líquido turbio
o decoloración. En las conservas de frutas o verduras que por
su termosensibilidad deben someterse a tratamientos térmicos
suaves, comúnmente el deterioro se debe a una microbiota
heterogénea entre la que se destacan Lactobacillus spp,
Leuconostoc spp y Streptococcus thermophilus. Cuando las
bacterias lácticas son heterofermentativas, producen
abombamiento por la formación de CO2.
La asociación microbiana alterante de los pescados
enlatados, conservados mediante adición de cloruro de sodio,
reducción de pH y con frecuencia conservantes autorizados,
está constituída principalmente por especies de lactobacilos y
Pediococcus. Un ejemplo de este tipo de alimentos son los
filetes de anchoas en aceite o salmuera (2).
En los alimentos con poca acidez, como las hortalizas, los
agentes de deterioro son de origen bacteriano, pero algunas
bacterias lácticas pueden desarrollar en ambientes tan ácidos
como una conserva de tomates. En las conservas de productos
con mucha acidez, como las frutas, los agentes de alteración
predominantes son los mohos y levaduras. Ambos suelen ser
sensibles al calor, sin embargo algunas especies de mohos
tienen ascosporas resistentes, por ejemplo Byssochlamys fulva
presenta un valor D entre 1 y 12 minutos a 90ºC según el
sustrato (4).
Por otra parte, los contaminantes que pueden aparecer
luego del tratamiento térmico, debido a los defectos en los
cierres y/o la contaminación del agua de enfriamiento o las
cintas transportadoras, son S. aureus y enterobacterias (2)
Entre las bacterias forman endosporos muy resistentes al
calor están los productores de gas Paenibacillus polymyxa y P.
macerans que suelen estar asociados con el deterioro de las
conservas de arvejas, espinacas, chauchas, espárragos y
tomates. Las especies que no sintetizan gas, como Bacillus
subtilis y P. megaterium, son responsables de la alteración de
las conservas neutras o poco ácidas (3).
Las especies de Clostridium se desarrollan sin problemas
en ambientes anaerobios, tales como los recipientes cerrados al
Audisio MC
152
ANALISIS MICROBIOLÓGICO
Las conservas deben estar libres de células somáticas
bacterianas, mohos y levaduras viables, así como de toxinas,
sin deterioro de sus propiedades organolépticas.
El número de envases tomados al azar durante el
muestreo depende del tamaño del lote, comúnmente 200. Se
examinan para detectar defectos en el cierre y abombamiento.
Si se encuentran tres o más envases defectuosos se rechaza el
lote, pero si se detectan uno o dos se vuelve a muestrear el lote
para examinar los envases.
Audisio MC
154
PRUEBA DE INCUBACION
Incubar a 30ºC un número de envases, tomados rigurosamente
al azar, colocando cada uno sobre una caja de Petri provista de
una hoja circular de papel de filtro para absorber cualquier
material expulsado durante la prueba.
Observar diariamente y las latas hinchadas o las que pierden
contenido se examinan sin demora.
Lavar las superficies con agua jabonosa, enjuagar y desinfectar
con etanol 70%. Colocar sobre el envase un largo clavo que pasa
a través del vástago de un embudo invertido, para evitar
salpicaduras hacia el operador quien llevará un protector de los
ojos. Golpear el clavo con un solo golpe vertical y luego abrir las
latas bajo condiciones de asepsia.
Inspeccionar la consistencia del contenido, sentir el olor y tomar
el pH, comparándolo con el de un envase idéntico al no
incubado, como testigo.
Tomar 10 g y agregar 90 mL de diluyente en un frasco con
perlas de vidrio o en una bolsa para ‘stomacher’. Homogeneizar y
dejar sedimentar. Tomar 10 µL y extenderlo sobre un área de 1
cm2. Secar, fijar y colorear según Gram. Sobre otro extendido
hacer la coloración de endosporos.
Diferenciar y contar los principales tipos morfológicos de los
organismos observados en diez o más campos microscópicos
separados.
Conociendo la superficie del campo microscópico, calcular el
número aproximado de células de cada uno de los grupos de
bacterias presentes en 1 g de la muestra.
Repetir las mismas operaciones con las muestras incubadas a
55ºC (2).
REFERENCIAS
1. Downes FP, Ito K, eds. 2001. Compendium of Methods for the
Microbiological Examination of Foods. 4º ed, APHA, Washington, p
577, 583.
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Acribia, Zaragoza, p 644.
3. Jay JM et al.2005. Modern Food Microbiology. 7ª ed, Springer, New
York, p 435.
4. Pitt JI, Hocking AD. 1997. Fungi and Food Spoilage. 2º ed. Blackie
Academic & Professional, London, p 206.
5. Sharma SK et al. 2006. Appl Environ Microbiol 72: 1231.
6. Sharma SK et al. 2005. Appl Environ Microbiol 71: 3935.
7. Código Alimentario Argentino. Cap 6, 11 y 17. http//:www.anmat.
gov.ar/codigoa /caa1.htm
8. ICMSF. 1981. Microorganismos de los Alimentos. Vol. 2. Acribia,
Zaragoza, p 149.
Audisio MC
156
ANALISIS MICROBIOLOGICO
El desarrollo de coliformes no fecales que están
naturalmente en el suelo, el agua dulce y la vegetación,
significa que hubo contaminación con los organismos
Carrillo L
158
ANALISIS DE AGUA
a. Dejar que el agua caiga gota a gota del grifo. Flamear la
boca del mismo hasta que las gotas se evaporen. Dejar que el
agua corra libremente durante 2 minutos y luego recoger la
muestra en un recipiente estéril.
b. Tomar un envase original sellado
c. Recoger la muestra desde los llenadores en una botella pre-
esterilizada.
Mezclar 100 mL de muestra con 100 mL de caldo TGSB y dejar
1 hora a la temperatura ambiente. Agregar 20 mL del suplemento
e incubar a 30ºC durante 24 horas. Si no se observa desarrollo
dejar otras 24 horas.
Sembrar 0,1 mL del cultivo en la superficie de cada placa de
medio extendiendo con una varilla de vidrio en L. Incubar una
placa de agar VRBL a 30ºC y la otra, junto con las de agar KEA y
agar NC, a 42ºC durante 24-48 hs.
Si no hay crecimiento se considera que el agua es apropiada
para el consumo.
CALDO TGSB. Triptona 17 g, peptona de soja 3 g, cloruro de sodio 10 g,
fosfato de potasio 2,5 g, glucosa 10 g, agua 1 litro, pH 7,3. Esterilizar en
autoclave a 120ºC durante 20 minutos.
SUPLEMENTO. Sales biliares 50 g, cloruro de sodio 10 g, púrpura de
bromocresol 0,1 g, agua 1 litro, pH 7,4. Esterilizar a 120ºC durante 20
minutos.
AGAR VRBL (para coliformes). Peptona 20 g, lactosa 10 g, sales biliares
1,5 g, cloruro de sodio 5 g, rojo neutro (sol. hidroalcohólica al 1%) 3 mL,
violeta cristal (sol. acuosa al 0,1%) 1 mL, agar 15 g, agua estéril 1 litro,
pH 7,1. Calentar a ebullición hasta disolución completa, enfriar a 50ºC y
volcar en cajas de Petri.
AGAR KEA (para Enterococcus spp). Triptona 20 g, extracto de levadura 5
g, cloruro de sodio 5 g, esculina 1 g, citrato de sodio 1 g, citrato férrico
amónico 0,5 g, azida de sodio 0,15 g, sulfato de kanamicina 0,02 g, agar
15 g, agua 1 litro, pH 7,0. Esterilizar a 120ºC durante 15 minutos. Enfriar
a 50ºC y volcar en cajas de Petri.
AGAR NC (para P. aeruginosa). Triptona 20 g, sulfato de potasio 10 g,
cloruro de magnesio 1,4 g, cetrimida 0,2 g, ácido nalidíxico 15 mg, agar
15 g, agua 1 litro, pH 7,2. Calentar a ebullición hasta disolución
completa, enfriar a 50ºC y volcar en cajas de Petri (11).
NMP DE COLIFORMES
Sembrar 10 mL de muestra en 5 tubos con 10 mL de medio
doble concentración, 1 mL en c/u de 5 tubos con medio simple y
0,1 mL en c/u de otros 5 tubos con medio simple. Incubar a 35ºC
durante 48 horas.
CALDO MAC CONKEY. Peptona 5 g, extracto de carne 3 g, lactosa 5 g,
púrpura de bromocresol (al 0,5%) 4 mL, agua 1 litro (simple) ó 500 mL
(doble concentración), pH 7,2 (12).
CONFIRMACIÓN. Confirmar al menos el 10% de los tubos positivos (2)
en agar VRBL donde los coliformes dan colonias de color púrpura.
Carrillo L
160
DETERIORO
Las levaduras constituyen el grupo más importante en el
deterioro de la bebidas sin alcohol, pues toleran la acidez y
pueden multiplicarse bajo condiciones anaeróbicas, llegando a
producir suficiente dióxido de carbono para reventar la botella
o lata. La estabilidad de las bebidas a base de jugo, o
concentrado, de frutas también depende del tipo de fruta usado
en su formulación.
Las bebidas con jugos de frutas son, además, susceptibles
al deterioro por bacterias lácticas, principalmente especies de
Lactobacillus y Leuconostoc, las que en general son resistentes
a los ácidos benzoico y sórbico.
Los jugos de fruta, debido a sus propiedades intrínsecas,
en particular el pH ácido y los bajos contenidos de nitrógeno y
oxígeno, imponen un ambiente adverso para muchos
microorganismos, pero son excelentes sustratos para las
levaduras y en menor medida para los hongos y las bacterias
lácticas (14).
La mayoría de las especies de levaduras pueden fermentar
los azúcares a etanol pero solamente unas pocas crecen en
completa ausencia de oxígeno. A pH 3,0 Saccharomyces
cerevisiae y Zygosaccharomyces bailii muestran fermentación
alcohólica aeróbica, pero en condiciones anaeróbicas Z. bailii
crece muy lento (15).
Otras especies de levaduras, como Pichia anomala,
también son capaces de tolerar altas concentraciones de
conservantes, así como una carbonatación alta, y suelen a
desarrollar en bebidas a base de frutas (16).
Las soluciones concentradas de saborizantes, endulzantes
y otros ingredientes de las bebidas sin alcohol no suelen ser la
fuente de levaduras y bacterias lácticas que causan alteración,
pues son procesadas para que sean comercialmente estériles(2).
Las especies predominantes en jugos de naranjas
contaminados después de la pasterización son Candida
intermedia y Candida parapsilosis. En los jugos no
pasterizados la mayoría corresponde a especies de
Hanseniaspora, aunque suelen observarse otras levaduras
como Geotrichum citri-aurantii y Pichia fermentans (17).
Paecylomyces fulvus y Penicillium glabrum han sido
aislados de agua mineralizada (18) y bebidas carbonatadas (19).
Carrillo L
162
CONTROL
La conservación depende del control de la contaminación y
la aplicación de varios factores sinérgicos que previenen el
crecimiento microbiano. Las fuentes específicas de
contaminación incluyen las materias primas, los contenedores
y el equipamiento de procesamiento o transporte, así como los
operarios, particularmente cuando no son seguidas las buenas
prácticas de manufactura.
La limpieza cuidadosa durante las horas de cierre evita la
contaminación excesiva. Todas las áreas corrientes debajo de
las de operaciones de mezclado son especialmente vulnerables
a la acumulación microbiana.
El método tradicional es usar cloro para desinfectar
después de la limpieza, pero resulta más efectiva la circulación
de agua caliente (alrededor de 85ºC) a través de las líneas
durante al menos 20 minutos. Este procedimiento debe ser
hecho dentro de las 24 horas previas al inicio de las
operaciones.
El pH bajo y los altos niveles de carbonatación de las colas
las hace resistentes al crecimiento de microorganismos del
deterioro. Las otras bebidas carbonatadas con frecuencia
contienen ácido benzoico, ácido sórbico o una combinación de
ambos, para evitar las levaduras (2).
Debido al pH bajo, una pasteurización a 66ºC durante 10
segundos, suele ser suficiente para inactivar muchos
microorganismos en el jugo de naranja.
El enfriamiento es el procedimiento comúnmente usado
para extender la durabilidad de algunos jugos de frutas pero
también pueden ser congelados, concentrados y/o irradiados
para prevenir el deterioro. La conservación del jugo de
naranjas concentrado puede ser realizado con la adición de
dióxido de sulfuro (230 mg/L) o con ácido sórbico (800 mg/L) (8).
ANALISIS MICROBIOLOGICO
El muestreo debe ser diseñado para identificar los lugares
específicos de contaminación en una planta embotelladora.
Cuando se analiza el llenador, el tamaño de la muestra debería
ser una vuelta completa a causa de que, con frecuencia, sólo
una de las válvulas contribuye a la contaminación.
Carrillo L
164
Coliformes fecales
Colocar la membrana sobre el medio TSM e incubar 4-5 hs a
35ºC a 35ºC, transferir al medio TB e incubar 24 horas a 44,5ºC
en un recipiente cerrado.
Mezclar volúmenes iguales de las soluciones a y b del reactivo
de indol. Con 1 mL mojar un papel de filtro en una caja. Depositar
la membrana sobre el papel sin dejar atrapado aire y dejar 10-15
minutos.
Regresar la membrana al medio TB. Contar las colonias
rosadas o sea que las dan una prueba de indol positiva.
TSM. Triptona 15 g, peptona de soja 5 g, cloruro de sodio 5 g, sulfato
de magnesio 1,5 g, agua 1 litro, pH final 7,3. Esterilizar a 120ºC durante
15 minutos. Colocar la membrana e incubar 4-5 horas a 35ºC y luego
transferir a m-FC e incubar 24 hs a 44,5 ± 0,5ºC en recipiente cerrado.
TB. Triptona 20 g, sales biliares nº 3 1,5 g, agua 1 litro, pH 7,2.
Esterilizar a 120ºC durante 15 minutos.
REACTIVO DE INDOL PARA MEMBRANAS. a. 4-dimetilamino-
benzaldehído 2,5 g, etanol (95%) 90 mL, ácido clorhídrico concentrado
10 mL. b. Persulfato de potasio 1 g, agua destilada 100 mL. Ambas se
mantienen a 4ºC durante unas pocas semanas (13).
ANALISIS DE ENVASES
Volcar 100 mL de diluyente estéril y mover el envase para que
tome contacto con toda la superficie interna.
Colocar 1 mL en una caja de Petri, volcar 15 mL de agar para
recuento fundido y a 50ºC, mezclar por rotación sobre la mesada.
Repetir la operación usando agar McConkey.
Incubar a 35ºC durante 24-48 horas. Multiplicar por 100 los
números de colonias para obtener las ufc de bacterias
heterótrofas y de coliformes /envase (2).
ANALISIS DE TAPAS
Humedecer un hisopo con diluyente estéril y pasar dos veces
por la superficie interna del cierre. Insertar el hisopo en un tubo
con 10 mL de diluyente. Mezclar bien.
Colocar 1 mL en una caja de Petri, volcar 15 mL de agar para
recuento fundido y a 50ºC, mezclar por rotación sobre la mesada.
Repetir la operación usando agar McConkey.
Incubar a 35ºC durante 24-48 horas. Multiplicar por 10 los
números de colonias, para obtener las ufc de bacterias
heterótrofas y de coliformes /tapa
Carrillo L
166
REFERENCIAS
1. Reasoner DJ et al. 1989. Appl Environ Microbiol 55: 912.
2. Downes FP, Ito K, eds. 2001. Compendium of Methods for the
Microbiological Examination of Foods. 4º ed, APHA, Washington, p
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4. Loy A et al. 2005. Appl Environ Microbiol 71: 3624.
5. Moore JE et al. 2002. Appl Environ Microbiol 68: 4130.
6. States SJ et al. 1987. Appl Environ Microbiol 53: 979.
7. Kuhn I et al. 1997. Appl Environ Microbiol 63: 2708.
8. Le Chevalier MW et al. 1991. Appl Environ Microbiol 57: 2617.
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10. Payment P, Franco E. 1993. Appl Environ Microbiol 59: 2418.
11. Mossel DAA et al. 2003. Microbiología de los Alimentos. 2ª ed,
Acribia, Zaragoza, p 650.
12. Guinea J et al. 1979. Análisis Microbiológico de Aguas. Omega,
Barcelona, p 21.
13. Andrews WH, ed. 1996. Microbiological Methods. Subcap 17.2 en:
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14. ICMSF. 1998. Microorganisms in Foods. Vol 6. Blackie Academica &
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15. Rodrigues F et al. 2001. Appl Environ Microbiol 67: 2123.
16. Déak T, Beuchat LR. 1996. Handbook of Food Spoilage Yeasts. CRC
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17. Arias CR et al. 2002. Appl Environ Microbiol 68: 1955.
18. Ancasi EG et al. 2006. Rev Arg Microbiol 38: 93.
19. Pitt JI, Hocking AD. 1997. Fungi and Food Spoilage. Blakie
Academic & Professional, London, p 205, 242.
HONGOS COMESTIBLES
Las setas que se comercializan frescas o conservadas en
nuestra zona son las especies cultivadas conocidas como
champiñones (Agaricus bisporus o A. bitorquis) y gírgola
(Pleurotus ostreatus). Esta última, junto con especies silvestres
del género Suillus se expenden secas.
En el capítulo XVI del Código Alimentario Argentino se
consideran los géneros Agaricus, Boletus, Lactarius, Psalliota
y Tuber. Las setas y trufas conservadas deben ser acidificadas
con ácidos orgánicos y sometidas a esterilización comercial (art
1250). La fase líquida de las encurtidas, saladas o fermentadas
y con vinagre, debe tener un pH < 3,5 (art 1251) (1).
Las especies silvestres con valor gastronómico del
Mercosur son: Agaricus campestris, Boletus loyo, Lactarius
deliciosus, Lepista nuda, Morchella intermedia, Morchella
elata, Phlebopus bruchii, Ramaria flava var. subtilis, Suillus
granulatus y Suillus luteus. Las especies cultivadas son
Agaricus bisporus, Agaricus bitorquis, Lentinula edodes y
Pleurotus ostreatus.
A. campestris y L. nuda crecen sobre suelos ricos en
residuos orgánicos. Morchella está asociada con Austrocedrus
chilensis y Lomatia hirsuta. P. bruchii es simbionte de Fagara
coco, mientras que Lactarius y Suillus lo son de varias especies
de Pinus. Ramaria y B. loyo micorrizan con especies de
Nothofagus (2). Cabe señalar que las especies silvestres deben
ser recolectadas por especialistas, debido a que entre los
géneros señalados se encuentran especies tóxicas o se parecen
a otros hongos tóxicos.
DESCRIPCIONES (3-5)
9 Agaricus bisporus (J.Lange) Imbach = champiñón
El sombrero de forma globosa que evoluciona con el tiempo
a convexo o extendido. Sus dimensiones varían entre los 3 y los
13 cm de diámetro. Tiene una cutícula de color blanco,
pulverulenta al tacto, en la que aparecen manchas crema con
la edad y escamas casi inapreciables. El margen está
incurvado y evoluciona a plano o elevado con el desarrollo. El
Benítez Ahrendts MR
168
Benítez Ahrendts MR
170
Benítez Ahrendts MR
172
REFERENCIAS
1. Código Alimentario Argentino. Cap 16. http//:www.anmat.gov.ar/
codigoa /caa1.htm
Benítez Ahrendts MR
174
Benítez Ahrendts MR
176
OTROS PRODUCTOS
AZÚCAR
Durante el proceso de fabricación, los jugos de la caña de
azúcar se van concentrando paulatinamente hasta que se separa
el azúcar en estado cristalino de las melazas residuales. Cuanto
más puro sea el producto, más pobre será como medio de cultivo.
La sacarosa puede alterarse por inversión, fermentación ácida u
oxidación por bacterias, levaduras y mohos.
Entre los microorganismos presentes en la caña de azúcar se
encuentran Leuconostoc, Enterobacteriaceae, Lactobacillus,
Flavobacterium, Xanthomonas, Pseudomonas, Micrococcus,
Bacillus y Corynebacterium. Uno de las bacterias más molestas
en la refinería de azúcar es Leuconostoc mesenteroides que
hidroliza la sacarosa y sintetiza dextrano, pues esta sustancia
viscosa puede llegar a taponar cañerías (1).
Las levaduras hallados en el azúcar crudo son osmófilas. La
más importante es Zygosaccharomyces rouxii, pero suelen
hallarse también Pichia, Torulopsis, Candida y otras (2).
El refinado del azucar destruye los microorganismos
patógenos, si estuvieran presentes. Sobreviven los endosporos de
bacilos aerobios o anaerobios, tales como Bacillus coagulans, B.
stearothermophilus, Clostridium thermosaccharolyticum y C.
nigrificans.
JARABES
Son soluciones acuosas azucaradas concentradas, con una
actividad de agua entre 0,65-0,70, tales como: a) jarabes
concentrados de sacarosa (66,5-68% p/v), b) jarabes de sacarosa
parcial o totalmente hidrolizados para producir una mezcla de
glucosa y fructosa, c) jarabes de glucosa obtenidos por hidrólisis
química o enzimática de almidones, d) jarabes de fructosa
producidos por isomerización enzimática de la glucosa (1).
Los microorganismos que pueden deteriorar los jarabes son
aquellos que toleran altas presiones osmóticas como las levaduras
osmófilas Zygosaccharomyces rouxii, Z. bailii, Torulaspora
delbrueckii, Candida lusitanae y Schizosaccharomyces sp. que
crecen lentamente (2). Éstas llegan a los mismos por prácticas
poco higiénicas y pueden multiplicarse por la formación de
condensados, en las paredes y tapa de los tanques, que originan
gradientes de concentración (1).
La industria de las bebidas especifica para jarabes: menos
que 100 ufc organismos mesófilos, 10 ufc levaduras y 10 ufc
mohos en el equivalente a 10 g de azúcar seca (3).
El Código Alimentario Argentino (CAA) establece en los art
1020 a 1038, que los jarabes para refrescos deben tener un
densidad no menor de 1,30 a 15ºC (4).
MIEL
El tipo de miel depende del follaje y de las flores disponibles
para las abejas. En un 70-80% son azúcares simples (fructuosa y
glucosa), predigeridos por el aporte enzimático de la abeja y
contiene minerales, aminoácidos, ácidos orgánicos, aminas,
enzimas y vitaminas (5). Además posee sustancias
antimicrobianas capaces de inhibir a las enterobacterias (6).
La mezcla de néctar-enzimas se almacena en la celdas
hexagonales de los panales hasta que el contenido de agua se
haya reducido aproximadamente al 17%. Cuando se alcanza ese
nivel, las celdas se sellan con una delgada capa de cera y puede
permanecer inalterada indefinidamente.
Las mieles suelen ser pasteurizadas con el objetivo de
mantenerla líquida todo el año, dado que en estado natural
cristaliza la glucosa a 14ºC, pero a más de 40ºC se inactivan la
muchas de las sustancias importantes de la miel.
Las principales fuentes de microorganismos de la miel, en la
colmena, son las abejas y el néctar que recolectan de diferentes
flores. Entre las levaduras osmófilas se destaca Z. rouxii. Estas
pueden producir el deterioro de la miel por fermentación cuando
la actividad agua es mayor que 0,65.
POLEN
El CAA indica en el art. 785 que no debe contener gérmenes
patógenos y admite un máximo 150.103 ufc de organismos
aerobios no patógenos /g y 102 ufc de hongos /g (4).
CHOCOLATE
Los productos con cacao tiene una actividad de agua menor
que 0,50 lo que impide el desarrollo de microorganismos, sin
ALIMENTOS DESHIDRATADOS
La mayoría tienen una actividad de agua entre 0,20 y 0,40,
siendo totalmente resistentes a la colonización microbiana. Sin
embargo, esto no significa que estén exentos de microorganismos
patógenos pues algunas bacterias sobreviven con escasa o
ninguna reducción de las ufc durante tiempos prolongados. Por
tal motivo ocasionalmente aparece Salmonella.
Los riesgos debido a los microorganismos transportados por
los alimentos secos son: a) que se multipliquen después que el
alimento ha sido reconstituído, b) que sirvan de fuente de
contaminación al entorno del alimento.
Los problemas provienen de un procesamiento no adecuado.
En el secado es importante el control higiénico constante del
equipo y el ambiente de la fábrica, con énfasis especial en el
suministro del aire, además del transporte y el envasado
adecuado, y el cuidado personal de los operarios (3).
Los límites de referencia correspondientes a los alimentos
secos para consumidores debilitados son ausencia de Salmonella,
Campylobacter y Shigella en 25 g, ausencia de E. coli y S. aureus
en 10 g, B. cereus 102 ufc/g, Clostridium spp. 10 ufc/g,
Enterobacteriaceae 1 ufc/g, esporas de mohos 102 ufc/g. En casos
especiales se agrega recuento de colonias (a 30ºC) 104 ufc/g,
ALIMENTOS CONGELADOS
No plantean problemas de alteración si se almacenan y
distribuyen a −10ºC. Pero el tratamiento, antes y durante la
congelación, requiere prácticas correctas de elaboración y
distribución, así como una descongelación apropiada en los casos
que así lo requieran.
Los valores de referencia en los productos cocinados y
congelados, en ufc/g, son: recuento de colonias (a 30ºC y 7ºC) 103,
Enterobacteriaceae (a 30ºC) 1, S. aureus 10, Clostridium spp. (a
30ºC) 10, recuento microscópico de células microbianas 105, y
ausencia de L. monocytogenes en 25 g (5).
En algunos alimentos las cifras bajas de enterococos indican
la eliminación real de los patógenos más resistentes, suponiendo
que hubieran estado presentes (3).
La ICMSF estableció los siguientes límites microbiológicos
para platos precocinados y verduras en salsa que se expenden
congelados: recuento de bacterias totales n=5, c=2, m=105 y
M=106; coliformes n=5,c=2, m=102 y M=104; E. coli (NMP) n=5,
c=2, m= <3 y M= 102 (8).
MARGARINA, MANTECA
La margarina es una emulsión de agua en grasa, lo mismo
que la manteca, con una actividad agua de 0,92 y un pH inferior a
4,5. Dado que el agua está dispersa en la fase lipídica continua, la
movilidad de los microorganismos contaminantes está limitada
por la separación de la gotas y la escasez de nutrientes en las
mismas (1).
El deterioro de la margarina es producido principalmente por
mohos de los géneros Penicillium, Geotrichum, Cladosporium y
otros, secundado por bacterias y levaduras lipolíticas como
Candida parapsilosis, por lo que se suele adicionar ácido benzoico
o sórbico (2).
Los valores de referencia para margarina recien elaborada,
expresados como ufc/mL de suero son: Enterobacteriaceae 1,
esporas de mohos 1, levaduras no lipolíticas 100, levaduras y
bacterias lipolíticas 5, bacterias no Lactobacillaceae 104,
Salmonella 10-1 (5).
La margarina, según el art 551 del CAA, no debe contener E.
coli en 1 g, pero se admite los siguientes valores máximos por g en
recuentos de: bacterias lipolíticas 50 ufc, bacterias proteolíticas 50
ufc, coliformes 10 ufc, mohos y levaduras 50 ufc (4).
La alteración de la manteca se debe, sobre todo, a la oxidación
y enranciamiento por hidrólisis de la grasa, pues la pasterización
de la crema de leche, a 85ºC durante 15 segundos, destruye a la
MAYONESA
El pH de este producto está entre 3,6 y 4,0, principalmente
debido al agregado de 0,5-1,2% de ácido acético y, ocasionalmente
otros ácidos orgánicos. El contenido de aceite varía de 65 a 80%, el
de sal entre 9 y 11%, y el azúcar representa 7 a 10%. La actividad
de agua se aproxima a 0,92, y suele incluir benzoato de sodio y
sorbato de potasio.
Los agentes comunes de deterioro son Lactobacillus,
Zygosaccharomyces y Moniliella (9), acompañados de especies de
Bacillus y Micrococcus (3). Si están presentes microorganismos
REFERENCIAS
1. ICMSF. 1998. Microorganisms in food. Vol 6: Microbial Ecology of Food
Commodities. Blackie Academic & Professional, London, p. 418.
2. Pitt JI, Hocking AD. 1997. Fungi and Food Spoilage. 2ª ed. Blackie
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Microbiological Examination of Foods. 4º ed. APHA, Washington, p 250,
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10. Collins CH et al. 1999. Microbiological Methods. Butterworth-
Heinemann, Oxford, p 86.
Indice de técnicas
Aeromonas, presencia 131 Agar
Aflatoxinas, presencia 98 papa sacarosa 39
Agar papa zanahoria 45
AD 131 PCS 122
agua 87 recuento 56
Baird Parker 147 sulfito 87
base con C 44 TCBS 129
N 44 TGSB 158
base resistencia 45 tributirina 183
CIN 123 triptona glucosa 88
CFC 130 TSGY 112
citrato Simmons 113 TSI 137
Czapek 39 urea 137
glicerol 39 VRBG 120
dicloran cloranfenicol 81 VRBL 158
dicloran glicerol 81 XLDN 136
eosina azul metileno 112 Agua, idoneidad 67
estreptomicina talio 112 análisis 158
glucosa 60% 178 Agua peptona alcalina 129
glucosa, purpura 27 Aire, control 56
triptona levadura 81 Alfa-naftol, solución 113
Gorodkowa 45 Ascosporas, producción 45
Hugh y Leifson 27 Azúcares, asimilación 44
KEA 158 Azul láctico 80
leche 185 lactofenol 33
LIA 137 Bacillus cereus, recuento 86
Mac Conkey 137 Bacillus del limo 88
- MUG 112 Bacterias aerobias
- sorbitol-TC 114 esporuladas del agriado153
malta 39 esporuladas del limo 88
malta levadura 45 mesófilas, recuento 111
malta glucosa sal 81 psicrótrofas, recuento 127
malta acético 81 recuento membrana 160
MRS 148 recuento microscópico 154
MSS 148 Bacterias anaerobias
MYP 86 esporuladas
NC 158 sulfito-reductoras 155
nutritivo 63 termófilas 176
PALCAM 121 Bacteriostáticos, residuos 63
papa glucosa 39 Brochothrix thermosphacta,
Indice de técnicas
189
Levaduras Mohos
asimilación fuentes N 44 observación 33
fermentacion 45 productos ácidos 81
identificación 44 salados 81
observación 33 secos 81
osmófilas 178 recuento 81
productos ácidos 81 en membrana 165
salados 81 recuento microscópico 80
secos 81 Mordiente con fucsina 26
psicrotrofas 127 Muestras, preparación 111
recuento 81 Nitratos, reducción 27
en membrana 165 Nitrogenados, compuestos
resistencia asimilación 44
acidez 45 NMP, coliformes 159
aw baja 45 tabla 159
cicloheximida 45 Oxidasa, prueba 26
vitaminas, necesidad 44 Oxidación-fermentación,
ureasa 45 prueba 27
Líquido de montar 33 Pseudomonas, recuento 130
Listeria monocytogenes, aeruginosa, presencia 158
presencia 121 Preparación muestras 111
Mac Farland, escala 63 Productos envasados
Medio prueba incubación 154
enriquecimiento Prueba de incubación 153
concentrado 114 Reactivo de Kovac 113
M-Endo 164 Indol para membranas 164
mínimo concentrado 67 Recuento microscópico80,154
MRS 147 Residuos bacteriostáticos 65
MSS 147 Resistencia
PE-2 176 acidez 45
Sierra modificado 183 actividad agua baja 45
SIM 113 cicloheximida 45
TB 164 Rojo metilo, solución 113
TSF 160 Safranina, colorante 25
TSM 164 Salmonella,
YM-11 165 presencia 136
Microaerofilia 122 confirmación 137
Microcultivo 38 reacciones 138
Microorganismos, recuento Sangre lisada 122
lipolíticos 183 Shigella, presencia 131
proteolíticos 185 Solución α-naftol 113
psicrotrofos 128 alcalina creatina 113
Mohos, identificación 39 rojo metilo 113
microcultivo 38 Superficies, vigilancia 56
Indice de técnicas
191
Indice
Aeromonas, presencia 131 Brochothrix thermosphacta
Aflatoxinas 98 recuento 112
Agua envasada 158 Calidad analítica 53
análisis microbiológico 156 Campylobacter jejuni
envases y tapas 165 presencia 122
valores de referencia 157 Carnes rojas 102
Alimentos análisis microbiológico 108
congelados 182 deterioro 103
deshidratados 180 patógenos 107
Aves 117 valores de referencia 108
análisis microbiológico 122 Chocolate 179
deterioro 118 Clostridium perfringens
patógenos 119 recuento 87
valores de referencia 122 Coliformes
Azúcar 176 NMP coliformes 159
Bacterias 19 recuento por filtración 164
esporuladas Compotas 179
anaerobias 176 Control
del agriado 153 aire 56
sulfito-reductoras 155 idoneidad del agua 67
termófilas 155, 176 lámpara UV 53
Gram-negativas 21 residuo bacterostático 65
Gram-positivas 23 superficies 56
identificación 28 Criterios microbiológicos 9
lácticas 141 Desoxinivalenol 97
patógenas 21 Diagrama de flujo 4
pruebas 26 Enterobacteriaceae
recuento mesófilas 111 recuento 120
recuento por filtración 160 Enterococcus, recuento148,156
recuento psicrótrofas 128 Envasados herméticos 150
tinciones 25 análisis microbiológico 153
Bacillus deterioro 151
cereus, recuento 86 prueba de incubación 154
formadores de limo 88 Escherichia coli
Bebidas sin alcohol 160 identificación 113
análisis microbiológico 163 presencia 114
envases y tapas 165 recuento 112
control 162 Frutas 71
deterioro 161 almacenamiento 74
Frutas Leche
análisis microbiológico 79 patógenos 143
conservación 76 valores de referencia 145
deterioro 71 Levaduras 40
patógenos 75 acidófilas 186
valores de referencia 80 ambiente 42
Fumonisinas 99 géneros comunes 41
Garantía de calidad 53 identificación 43
documentación 69 osmófilas, recuento 178
equipamiento 59 recuento 80
laboratorio 54 recuento por filtración 165
metodología 68 Listeria monocytogenes
muestras 58 presencia 121
personal 57 Manteca 184
productos químicos 66 Marcadores 14
Granos 84 Margarina 184
análisis microbiológico 85 Mariscos 125
valores de referencia 85 análisis microbiológico 128
Harinas 85 deterioro 125
análisis microbiológico 85 patógenos 127
valores de referencia 86 valores de referencia 129
Helados 182 Mayonesa 185
postres 182 Mermeladas 179
Hongos comestibles 167 Micotoxinas 89
Hortalizas 71 afecciones humanos 94
almacenamiento 74 incidencia 95
análisis microbiológico 79 límites 96
conservación 76 mohos toxigénicos 90, 95
deterioro 71 prevención 99
patógenos 75 producción 91
valores de referencia 79 Microorganismos
Huevos 133 lipolíticos 183
análisis microbiológico 136 proteolíticos 185
deterioro 133 Miel 178
patógenos 134 Mohos, estructuras 31
valores de referencia 135 géneros comunes 34
Indicador 15 identificación 39
Índice 14 microcultivo 38
Jaleas 179 observación 33
Jarabes 177 recuento 80
Lactobacillus, recuento 148 recuento por filtración 165
Leche 140 Ovoproductos 133
análisis microbiológico 145 análisis microbiológico 136
deterioro 142 deterioro 133
Indice
193