AÑO DE LA UNIVERSALIZACION DE LA SALUD”

Facultad:
FARMACIA Y BIOQUÍMICA
Escuela:
FARMACIA Y BIOQUÍMICA

Docente : Dr. Bertha Estela Ramos Huamán

TEMA: ESQUEMATICE TOMANDO LOS DATOS DE COPROCULTIVO

MENCIONADO EN CLASE .MENCIONAR LAS PRUEBAS BIOQUÍMICAS
PARA LA IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTERIAS Y ESQUEMATICE
CADA UNA DE ELLAS CUANDO ES POSITIVA O NEGATIVA LA PRUEBA.

Alumno : Quispe Mantari Reyna

Curso: ABC

Ciclo : X

ICA – PERU

2020
Cultivo de Materia Fecal: Coprocultivo
1. Muestra ----sembrar en :
2. Caldo de enriquecimiento
3. Placas con agar SS, VB, Mac Konkey , MS
4. Llevar las placas y el tubo con medio líquido de enriquecimiento a incubación a 37 °C
por 24- 48 horas.
5. Resembrar la muestra del medio líquido en las placas con agar SS, VB, Mac Konkey e
incubar por 24 – 48 horas, hacer el control.
6. Las colonias que crecieron y son sospechosas, s e les hace pruebas de diferenciación
bioquímica para la identificación del del o los microorganismos patógenos,
seguidamente el antibiograma.

PRUEBAS BIOQUÍMICAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTERIAS

 Citrato
 Ureasa
 Voges-Proskauer
 Rojo de metilo
 Sulfuro Indol Movilidad (SIM)
 Movilidad, Indol, Ornitina (MIO)
 Triple azúcar Hierro (TSI)
 Agar Lisina Hierro (LIA)

PRUEBA DE CITRATO

COLOR: VERDE INDICADOR: AZUL DE BROMOCRESOL

SUSTRATO PRINCIPAL: CITRATO DE SODIO

PRINCIPIO

Es una sal del ácido cítrico. Algunas bacterias pueden obtener energía de fuentes distintas de
la fermentación de los hidratos de carbono, con el citrato como única fuente de carbono. La
medición de esta característica es importante para identificar muchos miembros de la familia
Enterobacteriaceae.

La utilización del citrato por la bacteria que se va a probar se detecta en el medio de citrato
por la producción de subproductos alcalinos.

El medio contiene citrato de sodio, que es un anión, como única fuente de carbono, y fosfato
de amonio como única fuente de nitrógeno. Las bacterias que pueden utilizar el citrato
también pueden extraer nitrógeno de la sal de amonio, con producción de amoniaco (NH+), lo
que produce la alcalinización del medio por conversión del NH a hidróxido de amonio
(NH4OH)El indicador es el azul de bromotimol, que es amarillo por debajo de pH 6 y azul por
encima de pH 7,6.

MEDIO DE CULTIVO

El medio para citrato utilizado con mayor frecuencia es la fórmula de

Simmons. El medio se coloca en tubos inclinados (agar en pico de
flauta).
PROCEDIMIENTO Se toma una colonia bien aislada de la superficie de un medio de
aislamiento primario y se siembra en forma de estría única en el pico de flauta (agar
inclinado) del tubo de agar citrato. El tubo se incuba a 35 °C durante 24 a 48 horas.

RESULTADOS

La prueba positiva está representada por la producción de color azul oscuro en el

término de 24 a 48 horas, que indica que el microorganismo en prueba ha sido capaz
de utilizar el citrato contenido en el medio, con formación de productos alcalinos.

La prueba también puede considerarse positiva sin que haya color azul, si hay
desarrollo visible en la estría de siembra. Esto es válido porque para que el desarrollo sea
visible, el microorganismo debió haber ingresado en la fase logarítmica de crecimiento, lo que
solo es posible si ha asimilado carbono y nitrógeno

Microorganismos Positivos

• Salmonella • Arizona • Citrobacter • Enterobacter • Klebsiella • Serratia licuefaciensis

• Pseudomonas cepacia

Microorganismos Negativos

• Edwarsiella • Yersinia enterocolítica • Escherichia coli • Shigella

• Yersinia pseudotuberculosis • Otras especies de Moraxella • Proteus morgaño

PRUEBA DE UREASA
COLOR: ROSADO
INDICADOR: ROJO FENOL
SUSTRATO PRINCIPAL: UREA

PRINCIPIO

Es una diamida del ácido carbónico Todas las amidas se hidrolizan fácilmente, con
liberación de amoniaco y dióxido de carbono. El amoniaco reacciona en solución para
formar carbonato de amonio, lo que produce alcalinización y aumento de pH del
medio.

MEDIOS DE CULTIVO

Los dos medios utilizados con mayor frecuencia son el caldo urea de Stuart y el agar urea de
Christensen. CALDO UREA DE STUART AGAR UREA DE CHRISTENSEN Extracto de levadura 0,1 g
Peptona 1 9 Fosfato monopotasico 9,1 g Glucosa 1 g Fosfato disodico 9,5 g Cloruro de sodio 5
g Urea 20 g Fosfato monopotasico 2 g Rojo fenol 0,01 g Urea 20 g Agua destilada 1 L Rojo fenol
0 ,012 g Agar 15 g Agua destilada 1 L pH final = 6,8 pH final = 6,8

PROCEDIMIENTO El medio liquido se siembra con un ansa de cultivo puro del microorganismo
por probar. La superficie inclinada del agar (pico de flauta) se siembra en estría con el
microorganismo por probar. Ambos medios se incuban a 35 °C durante 18 a 24 horas.
RESULTADOS

Los microorganismos que hidrolizan la urea rápidamente pueden producir reacciones positivas
en l o 2 horas; las especies menos activas pueden requerir 3 días o más. Las reacciones son las
siguientes:

Caldo de Stuart: Un color rojo en todo el medio indica alcalinización e hidrolisis de la urea.

Agar de Christensen: Degradadores rápidos de la urea (especies de Proteus): color rojo en

todo el medio. Degradadores lentos de la urea (especies de Klebsiella): inicialmente color rojo
solo en el pico de flauta, que gradualmente se extiende a todo el tubo.

Ausencia de hidrolisis de la urea: el medio conserva su color amarillo original.

Microorganismos positivos • Klebsiella • Proteus (rápido)

Microorganismos negativos • Escherichia coli • Providencia

VOGES- PROSKAUER

PRINCIPIO Voges-Proskauer es un epónimo doble, en honor de dos microbiólogos que

trabajaron a principios del siglo xx. Estos investigadores fueron los primeros en observar la

reacción de color rojo producida en medios de cultivo adecuados después del

tratamiento con hidróxido de potasio. Luego se descubrió que el producto activo del
medio, formado por el metabolismo bacteriano, es el acetil metil carbinol, producto
de la vía del butilenglicol.
• El acido pirúvico, se metaboliza da como resultado la producción de acetoina (acetil metil
carbinol).
• Los microorganismos del grupo Klebsiella- Enterobacter-Hafnia-Serratia producen acetoina
como producto metabólico final principal del metabolismo de la glucosa y forman cantidades
pequeñas de ácidos mixtos.
• En presencia de oxigeno atmosférico e hidróxido de potasio al 40%, la acetoina se convierte
a diacetilo y el a-naftol sirve de catalizador para producir un complejo de color rojo.

MEDIOS DE CULTIVO

A. Caldo VP/RM
• Polipeptona 7g
• Glucosa 5 g
• Fosfato dipotasico 5 g
• Agua destilada 1 L
• pH final = 6,9 B.
Reactivos
• oc-naftol al 5%. intensificador de color
• a-naftol 5 g
• Alcohol etilico absoluto 100 mL
• Hidroxido de potasio al 40%,
agente oxidante
• Hidroxido de potasio 40 g
• Agua destilada 100 mL El medio utilizado con mayor frecuencia es el caldo de rojo de metilo-
Voges-Proskauer (MR/VP) segun la formula de Clark y Lubs.

PROCEDIMIENTO

Sembrar un tubo de caldo MR/VP con un cultivo puro del microorganismo por probar. Incubar
24 horas a 35 °C. Finalizada la incubación, transferir 1 ml del caldo a un tubo de ensayo limpio.
Agregar 0,6 ml de a-naftol al 5%, seguidos de 0,2 ml de KOH al 40%. Es esencial que los
reactivos sean agregados en ese orden. Agitar suavemente el tubo para exponer el medio al
oxigeno atmosférico y dejar el tubo en reposo durante 10 a 15 minutos.

RESULTADOS Positivo: desarrollo de color rojo 15 minutos o mas después del agregado de los
reactivos, que indica la presencia de diacetilo, el producto de oxidación de la acetoina. La
prueba no debe leerse mas allá de una hora después de dejar los tubos en reposo, porque los
cultivos Voges-Proskauer negativos pueden producir un color cobrizo, que se puede
interpretar como un positivo falso.

Microorganismos positivos • Klebsiella pneuminiae • Yersinia enterocolítica

Microorganismos negativos • Escherichia coli • K. ozaenae
ROJO DE METILO

PRINCIPIO
El rojo de metilo es un indicador de pH con un rango entre 6 (amarillo) y 4,4
(rojo). El pH al cual el rojo de metilo detecta los ácidos es mucho mas bajo que
el pH correspondiente a otros indicadores utilizados en medios de cultivo
bacteriológicos. Por lo tanto, para provocar un cambio de color, el
microorganismo en estudio debe producir grandes cantidades de acido del
sustrato de hidratos de carbono que se utilice. La prueba del rojo de metilo es una prueba
cuantitativa de la producción de acido, que requiere que los microorganismos positivos
produzcan ácidos fuertes (lactico, acetico, formico) de la glucosa.

MEDIOS DE CULTIVO A. Caldo VP/RM

• Polipeptona 7g
• Glucosa 5 g
• Fosfato dipotasico 5 g
• Agua destilada 1 L
• pH final = 6,9 B.

Reactivos
• Indicador de pH rojo de metilo.
• Rojo de metilo, 0,1 g en 300 ml de alcohol etílico al 95%.
• Agua destilada, 200 ml. El medio utilizado con mayor frecuencia es el caldo de rojo de
metilo- Voges-Proskauer (MR/VP) según la formula de Clark y Lubs.

PROCEDIMIENTO
1. Sembrar el caldo MR/VP con un cultivo puro del microorganismo en estudio. Incubar el
caldo a 35 °C durante 48 a 72 horas (no menos de 48 horas).
2. Finalizada la incubación, agregar 5 gotas del reactivo de rojo de metilo directamente al
caldo.

RESULTADOS
Positivo: El desarrollo de color rojo estable en la superficie del medio indica la suficiente

producción de acido como para disminuir el pH a 4,4.

Negativo: Como otros microorganismos pueden producir pequeñas cantidades de acido del
sustrato probado, puede observarse un color naranja, intermedio entre amarillo y rojo. Esto
no indica una prueba positiva.

Microorganismos positivos • Escherichia coli • Especies de Yersinia

Microorganismos negativos • Enterobacter aerógenes • Enterobacter cloacae • Klebsiella

PRUEBA DE INDOL

SIM: Sulfuro indol movilidad

MIO: Movilidad indol ornitina Indol

PRINCIPIO
Es uno de los productos de degradación metabólica del aminoácido triptófano. La prueba del
indol se basa en la formación de un complejo de color rojo cuando el indol reacciona con el
grupo aldehído del p- dimetilaminobenzaldehido. En la practica se utilizan medios
combinados, como el medio de sulfuro indol para motilidad (SIM), el medio para
motilidad indol omitina (MIO) o el medio indol nitrato.

SIM: SULFURO INDOL MOVILIDAD

• Determinar si un organismo es móvil o inmóvil, si es capaz de liberar ácido

sulfhídrico por acción enzimática de los aminoácidos que contienen azufre
produciendo una reacción visible de color negro y por último la capacidad de
desdoblar el indol de la molécula de
triptófano.

• Producción de ácido sulfhídrico

• Producción de Indol
• Movilidad

PRODUCCIÓN DE ÁCIDO SULFHÍDRICO La

bacteria reacciona con el tiosulfato de sodio
por medio de una reacción de reducción que da un sulfito y un sulfato. El gas incoloro SH2
reacciona con una sal pesada, citrato férrico de amonio para producir un precipitado negro
insoluble, sulfato ferroso.

PRODUCCIÓN DE INDOL El triptófano es un aminoácido que puede ser oxidado por ciertas
bacterias para formar tres metabolitos principales: indol, escatol e indolacético. La formación
de indol se produce solamente en aquellos organismos capaces de fermentar los hidratos de
carbono.

MEDIOS Y REACTIVOS
Caldo triptofano (triptofano al 1%)
• Peptona o digerido pancreatico de caseina (tripticasa) 2 g
• Cloruro de sodio 0,5 g
• Agua destila da 100 ml
Reactivo de Kovac
• Alcohol amilico o isoamilico puro 150 ml
• p-dimetilaminobenzaldehido 10 g
• HCI concentrado 50 ml
Reactivo de Ehrlich
• p-dimetilaminobenzaldehido 2 g
• Alcohol etílico 190 ml • HCI concentrado 40 ml

PROCEDIMIENTO Sembrar el caldo triptófano con el microorganismo por probar e incubar a

35 °C durante 18 a 24 horas. Una vez transcurrido este tiempo, agregar 15 gotas del reactivo
haciendo que se deslicen por la pared del tubo. Si se utiliza el reactivo de Ehrlich, este paso
debe ser precedido por el agregado de 1 mL de xilol. Esto no es necesario con el reactivo de
Kovac.

RESULTADOS
Ácido sulfhídrico: Positivo: ennegrecimiento del medio
Negativo: Sin ennegrecimiento

Indol:
Positivo: Anillo rojo en la superficie del medio
Negativo: No se produce color /Color naranja en la superficie

del medio indica desarrollo de escatol, un compuesto metilado que puede ser precursor de la
formación de indol. La reacción positiva después de 24 horas indica una prueba
completa. Si el cultivo de 24 hrs es negativo deberá incubarse otras 24 horas y
repetirse la prueba.

Movilidad
Positiva: los organismos móviles migran de la línea de siembra y se difunden en el
medio provocando turbiedad. Negativa: Crecimiento bacteriano acentuado
siguiendo la línea de siembra.

PRUEBA DE
TSI: Triple azúcar Hierro
MEDIO DE CULTIVO
Agar hierro de klinger (AHK)
Composición:
Extracto de carne
Extracto de levadura
Peptona
Proteasa
Lactosa
Dextrosa
Sulfato ferroso
Cloruro de Na
Tiosulfato de Na
Agar
Agua destilada
Indicador: Rojo fenol
Ácido: amarillo
Alcalino: Rojo
Medio no inoculado: naranja rojizo, pH 7.4
PRINCIPIO

Determina la capacidad de un organismo de atacar un hidrato de carbono específico

incorporado en un medio de crecimiento básico, con producción o no de gases, junto con la
determinación de posible ácido sulfhídrico.

La fermentación es un proceso que se lleva a cabo en condiciones aeróbicas (pico de flauta) y

anaeróbicamente (capa inferior) El medio TSI contiene una cantidad limitante de glucosa y
concentración 10 veces mayor de lactosa. Las enterobacterias y los fermentadores de glucosa
comienzan metabolizando este azúcar. Una vez que se ha reducido toda la glucosa piruvato,
este se metaboliza por el ciclo de Krebs formando productos finales ácidos.

El ácido en el medio hace virar el amarillo del indicador de pH, rojo fenol. A 6 horas de la
incubación, la zona de la estría y el fondo del tubo tendrán un color amarillo (fermentador de
glucosa)

Al agotar la glucosa la bacteria utiliza la lactosa o sacarosa. Después de 18-24 hrs, el medio
permanece amarillo, reacción ácida sobre ácido (A/A). Fermentador de lactosa. La producción
de gas romperá el agar o lo empujará hacia arriba. Reacción A/A más gas.

Si no utiliza la lactosa, hará uso de proteínas o aminoácidos. El metabolismo proteico se

produce en la superficie de la zona inclinada donde el oxígeno es abundante. 18-24 hrs de
incubación: zona inclinada roja fondo del agar amarillo (metabolismo anaerobio de glucosa
inicial). Reacción alcalina sobre ácido K/A.

Las bacterias que fermentan glucosa también pueden formar productos alcalinos a partir de la
utilización de la peptona, sobre la zona inclinada. Reacción K/K.

PROCEDIMIENTO
Inoculación: picadura y estría en pico de flauta.
Tiempo: 18-24 Horas
Temperatura: 35-37°C

RESULTADOS

K/A: fermentación de glucosa solamente (Pico de flauta alcalino/profundidad ácida).

Característico de bacterias no fermentadores de lactosa como Shigella.
A/A: fermentación de glucosa y lactosa (Pico de flauta ácido/ profundidad ácida).
Característicos de E. coli y grupo
Klebsiella-Enterobacter. K/K: No fermentación
de glucosa y lactosa (pico de flauta alcalino/profundidad alcalina). Característico de bacterias
no fermentadoras como Pseudomas aeruginosa

LIA: Agar Lisina Hierro

COLOR: LILA
INDICADOR: PÚRPURA DE BROMOCRESOL
SUSATRATPOS PRINCIPALES: LISINA Y HLUCOSA

MEDIO DE CULTIVO

Base de descarboxilasa de Moller

Composición:

Peptona Extracto de carne

Piridoxal L-lisina
Citrato de amonio Tiosulfato de sodio
Glucosa Agua destilada
Agar
Indicador de pH: Purpura de bromocresol
Ácido: Amarillo pH 5.2
Alcalino: Púrpura pH 6.8
Medio no inoculado: Purpura intenso brillante pH 6.0

PRINCIPIO
Mide la capacidad enzimática de un organismo para descarboxilar un aminoácido (lisina y
arginina) para formar una amina con la consiguiente alcalinidad.

ROCEDIMIENTO
Inoculación: por picadura y estría, inóculo liviano.
Temperatura: 35-37°C
Tiempo 18-24 hora

RESULTADOS

A: ácido
K: alcalino
N: neutra
R: Rojo (desaminación oxidativa

• K/K: Azul de Prusia/azul de Prusia. Desaminación oxidativa/descarboxilación.

• K/A: azul de Prusia/lila. No desaminación.
• Producción de H2S: Ennegrecimiento del medio
• Producción de gas: burbujas o levantamiento del medio de cultivo de las paredes del tubo.