GUÍA DE PRÁCTICA TOXICOLOGÍA Y QUÍMICA LEGAL II

PRÁCTICA N° 1
DETERMINACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA DE SALICILATOS EN
MUESTRAS BIOLÓGICAS (MÉTODO DE TRINDER)

I. INTRODUCCIÓN.

La intoxicación por salicilatos es una de las intoxicaciones medicamentosas más

frecuentes, en especial en la infancia. En la actualidad su frecuencia ha disminuido
radicalmente, quizá por la sustitución de estos fármacos por el paracetamol en la práctica
clínica. Su etiología más habitual es la accidental, ya que con fines suicidas se suele
recurrir a fármacos indicados como más peligrosos. Una vez que ha sido ingerido se
transforma rápidamente en ácido salicílico (causante del efecto), perdiendo una molécula
de ácido acético.
Las determinaciones de estas sustancias son muy útiles tanto para su diagnóstico,
establecer el grado de evolución de la intoxicación.
II. OBJETIVOS.

 Determinar los niveles de salicilemia e interpretar.

 Capacitar al alumno en el manejo del espectrofotómetro para cuantificar salicilatos en
fluidos biológicos.

III. FUNDAMENTO.(Reacción de Trinder)

Formación de un complejo de color azul-violeta por reacción del ion férrico del reactivo
(FeCl3) con el ácido salicílico. El enlace covalente del quelato se formará a nivel del
carboxilato y el de coordinación a nivel del OH fenólicos del salicilato.

IV. MATERIALES Y REACTIVOS.

MATERIALES:
Tubos de ensayo
Pipetas
Vaso de precipitado
Fiolas

REACTIVOS:
Reactivo de Trinder : Disolver con exactitud 4 g de cloruro de mercúrico en 50 mL.
de agua destilada caliente; adicionar 12 mL de HCl 1N, 4 g de nitrato férrico. Completar
a un volumen de 100 mL con agua destilada.
Este reactivo es estable si se guarda en un frasco ámbar a temperatura ambiente.

HgCI2 + 3HCl + Fe(NO3)3 C13Fe + Hg(NO3)2+ H2O

Solución Stock de salicilatos: Pesar 580 mg de salicilato de sodio en un matraz

volumétrico de 100 mL.
Disolver en agua destilada tibia, enfriar y enrasar a 100 mL con agua destilada. Puede
agregarse gotas de cloroformo como conservador (Concentración = 500 mg/100 mL).

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EQUIPO.
Espectrofotómetro.

V. PROCEDIMIENTO.

Construcción de la curva de calibración de salicilatos.

Preparar una solución madre de salicilatos de C= 500 mg%, disolviendo 580 mg de
salicilato de sodio en 100 mL de agua (adicionar una gota de éter) para que la solución sea
estable por seis meses) luego tomar alícuotas de 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0 y un blanco y
diluir con agua destilada a 25 mL para obtener concentraciones de 10, 20, 40, 60 y 80 mg
%.

REACTIVOS TUBOS
I II III IV V M.P B
Patrón de salicilato mg% mL 1 1 1 1 1 - -
Muestra biológica mL - - - - - 1 -
Blanco mL - - - - - - 1
Reactivo de Trinder 4 4 4 4 4 4 4
Homogenizar y leer a 540 nm.
Sangre y líquido cefaloraquídeo: recoger la sangre sobre anticoagulante heparina.
Operar sobre plasma y, en rigor, sobre sangre total. (1 mL de sangre y 5 mL de reactivo
Trinder).
Agitar unos minutos y centrifugar, extraer el líquido sobrenadante y leer a 540 nm.

Para elaborar la curva de calibración graficar Absorbancia Vs. Concentración.

Hallar el factor de calibración promedio.
INTERPRETACIÓN: Para el análisis en sangre
1 mg% d ebido a la alimentación.
25-30 mg% salicilemia por tratamiento terapéutico.
30-50 mg% intoxicación moderada.
50-80 mg% intoxicación severa.
Más de 80 mg% riesgo de muerte.
La dosis tóxica de salicilatos es de 3 a 10 g (depende de la idiosincrasia de la
persona) en una sola dosis.
Los salicilatos también se pueden descartar en orina en forma rápida.
M:P: + FeCl3 ------------ Azul : La reacción es positiva cuando los salicilatos están por
encima de los 20 mg%.

VI. RESULTADOS
VII. CONCLUSIONES
VIII. CUESTIONARIO

1. Explique el mecanismo de toxicidad de los salicilatos.

2. Explique los efectos tóxicos de los salicilatos.
3. Señale otros métodos alternativos para determinar salicilatos en muestras biológicas.

IX. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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PRÁCTICA N° 2
DETERMINACIÓN DE PARACETAMOL EN FLUIDOS BIOLÓGICOS

I. INTRODUCCIÓN.

El paracetamol es el metabolito activo de la fenacetina, es un analgésico derivado de la

anilina. El paracetamol es un fármaco eficaz que puede emplearse en vez de la aspirina
como analgésico – antipirético, sin embargo, es poca su actividad antiinflamatoria y por
eso no es útil para combatir trastornos inflamatorios. El paracetamol es bien tolerado y no
genera muchos de los efectos colaterales de la aspirina y puede obtenerse sin receta
médica, razón por la cual ha ocupado un sitio destacado como analgésico casero común.
Sin embargo, la sobredosis aguda ocasiona lesión hepática mortal, y en años recientes ha
crecido en forma alarmante el número de auto intoxicaciones y suicidios con dicho
producto.

II. OBJETIVOS

Determinar la presencia de paracetamol en muestras biológicas por espectrofotometría.

III. FUNDAMENTO

La nitración del paracetamol empleando nitrito de sodio y ácido tricloroacético, origina un

derivado de color amarillo en medio alcalino.

ACETAMINOFÉN + NITRITO DE SODIO 3-NITRO-ACETOMINOFÉN

3-NITRO-ACETOMINOFÉN + NaOH 3-NITRO

ACETOMINOFÉN SÓDICO
ANION (Amarillo)

IV. MATERIALES Y REACTIVOS

MATERIALES.
 Tubos de ensayo
 Pipetas
 Espectrofotómetro

REACTIVOS
 Hidróxido de sodio
 Nitrito de sodio
 Acido tricloroacético
 Paracetamol estándar

V. PROCEDIMIENTO.
Elaboración de la curva de calibración
Pesar 50 mg de estándar de paracetamol y disolver en una fiola de 100 mL con un poco de
agua destilada, luego de su disolución total enrasar
De la solución preparada tomar 5, 2.5, 2, 1 y 0,5 mL y enrasar a una fiola de 25 mL, para
obtener soluciones de concentraciones de 100, 50, 40, 20 y 10 g/mL de paracetamol.

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De cada una de las soluciones anteriores tomar 1 mL y llevar a tubos de ensayo

Agregar 2 ml de ácido tricloroacético (ATC) al 5%, luego agregar 2 mL de nitrito de sodio
al 1% y reposar por 2 a 3 minutos.
Transcurrido el tiempo agregar 2 mL de hidróxido de sodio al 10% y proceder a leer en el
espectrofotómetro a 450 nm contra un blanco de agua destilada.

Técnica para la muestra

A la persona previamente administrar 500 mg de paracetamol y extraer sangre, centrifugar

la muestra con anticoagulante para obtener el plasma sanguíneo, del cual tomar 1 mL y
conservar en refrigeración hasta el momento del análisis.
A la muestra de plasma adicionar 2 ml de ATC 5% y centrifugar a 3000 RPM por 5
minutos. Trasvasar el líquido sobrenadante.
Al sobrenadante adicionar 2 mL de nitrito de sodio al 1%, Mezclar y reposar por 2 a 3
minutos en medio ambiente, Luego adicionar 2 mL de NaOH al 10%, remover las
burbujas y proceder a medir la absorbancia a 450 nm contra un blanco de plasma.

VI. RESULTADOS.
VII. INTERPRETACIÓN
VIII. CUESTIONARIO

1. Explique el mecanismo y efecto tóxico del paracetamol

2. Señale el tratamiento en una intoxicación por paracetamol
3. Desarrolle un método para cuantificar paracetamol en fluidos biológicos

IX. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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PRÁCTICA N° 3
DETERMINACIÓN DE BENZODIAZEPINAS Y BARBITÚRICOS POR
CCF

I. INTRODUCCIÓN

Las benzodiacepinas o tranquilizantes menores, anticonvulsivantes, algunos hipnóticos

como el diazepam, flurazepam, nitrazepam, flunitrazepam. Son poco tóxicos, aún dosis 10
veces de las usuales sólo producen sueño profundo.
Los neurolépticos o tranquilizantes mayores como las fenotiazinas tienen un núcleo
heterocíclico formado por 3 anillos, que resulta de la unión de dos anillos bencénicos a
través de un puente de hidrógeno y otro de azufre.
Los barbitúricos son depresores no selectivos del SNC, según la dosis puede producir
desde sedación hasta anestesia general o parálisis del centro respiratorio.
Existen numerosos depresores del SNC, la mayoría de los cuales actúan sobre el cerebro
afectando el neurotransmisor ácido gammaaminobutírico (GABA). Los neurotransmisores
son sustancias químicas cerebrales que facilitan la comunicación entre las células
cerebrales. El GABA funciona disminuyendo la actividad cerebral. Las benzodiacepinas
desarrollan su efecto en el complejo supramolecular GABA ionóforo del cloro,
interactuando en un lugar específico localizado en este complejo. Allí potencian el efecto
del GABA (ácido gamma-aminobutírico) facilitando la apertura del canal del cloro, lo que
ocasiona un mayor flujo de iones hacia la célula, produciendo una hiperpolarización que
eleva el nivel de estimulación. Aunque las diferentes clases de depresores del SNC trabajan
en maneras únicas, en definitiva es a través de su habilidad de aumentar la actividad del
GABA que los depresores producen un efecto somnoliento o calmante que es beneficioso
para aquellos que sufren de ansiedad o de trastornos del sueño.

ESTRUCTURA QUIMICA

R3 R(N1)
R

Diazepan -H -H -CH3
Oxazepan -H -OH -H
Lorazepa
-Cl -OH -H
n

II. OBJETIVOS.
 Extraer e identificar las benzodiazepinas y barbitúricos por cromatografía en capa fina.
 Conocer la importancia toxicológica de las benzodiacepinas y barbitúricos.

III. MATERIALES Y REACTIVOS.

MATERIALES:
Pera de bromo

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Vaso de precipitado
Pipetas
Cuba cromatográfica
Placa cromatográfica
REACTIVOS
Silicagel G
Acetona
Cloroformo
Bicarbonato de sodio
Hidróxido de amonio
Ácido sulfúrico
Fast blue

IV. PROCEDIMIENTO.

1. BENZODIAZEPINAS.
Extracción : Alcalina
Sistema de solventes : Cloroformo-acetona-amoníaco (90:10:01)
Cloroformo-metanol : (90:10)
Revelador : Dragendorff + H2SO4 al 10%
Rx. Positiva : Anaranjado que empalidece con H2SO4 al 10%

2. BARBITÚRICOS.
Extracción : Ácida
Sistema de solvente : Cloroformo-acetona (90:30)
Revelador : Reactivo de Zwicker
Rx. Positiva : Rosado = Barbitúricos
Verde = Tiobarbitúricos
Cuando se va a trabajar con sangre u homogenato de vísceras previamente se debe
desproteinizar de la siguiente manera: A l0 mL de sangre (u homogenato de vísceras)
agregar 20 mL de agua destilada y 3 g aproximadamente de desproteinizante (sulfato de
amonio, Tunsgtato de sodio o ácido tricloro acético). Llevar a ebullición por 15 a 20
minutos hasta notar 2 fases. Filtrar en caliente y trabajar con el filtrado.
Se debe tener en cuenta que una mala desproteinización conduce a una emulsión por
presencia de ácidos grasos y oligopéptidos que impiden una buena extracción. La
desproteinización permite, además, romper la unión de los tóxicos orgánicos fijos con las
macromoléculas sean estas proteínas o lípidos (fracción inactiva).
ENSAYOS CROMÁTICOS:
Diazocopulación: Tomar 2-3 mL del extracto clorofórmico, agregar 0,5 mL de HCl
concentrado. Calentar en baño de agua a ebullición durante 5 minutos y enfriar.
Agregar 1 mL de NaNO2 0,1%, sobre baño de hielo y agitar. Dejar reposar 5 minutos.
Finalmente agregar 1 mL de sulfamato de amonio 0,5%, agitar y nuevamente dejar en
reposo 5 minutos. Agregar 1 mL de clorhidrato de naftiletilendiamina al 0,5%. Agitar.
Color rojo o púrpura indica la presencia de benzodiacepinas.
V. RESULTADOS.
VI. CUESTIONARIO.
 Explique el mecanismo de acción, el efecto farmacológico y toxicológico de las
drogas analizadas.
 ¿Cuál es la importancia toxicológica de las muestras analizadas?

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 Desarrolle la reacción de Zwicker.

VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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PRÁCTICA N° 4
IDENTIFICACIÓN DE FENOTIAZINAS EN MUESTRAS BIOLÓGICAS

I. INTRODUCCIÓN

Farmacológicamente corresponden al grupo de los Neurolépticos o Tranquilizantes

Mayores.
La fenotiazina es un núcleo heterocíclico formado por tres anillos, que resulta de la unión
de dos anillos bencénicos a través de un puente de nitrógeno y otro de azufre. Sus
derivados todos de origen sintético, corresponden a un grupo farmacológico muy amplio,
con acciones tranquilizantes mayores.
Las fenotiazinas:
– Originan Síndrome de neurolepsia
• Disminución de la actividad psicomotora
• Originan un estado de indiferencia afectiva
– No tienen acción hipnótica
– Apenas causan depresión respiratoria
– No originan dependencia
– Carecen de acción anticonvulsivante

Principales fenotiazinas
Clorpromazina.
Flufenazina.
Levomepromazina.
Perfenazina.
Pipotiazina.
Tioproperazina.
Tioridazina.
Trifluoperazina`

II. OBJETIVOS
Determinar la presencia de fenotiazinas en muestra biológica.

III. MATERIALES Y REACTIVOS

Reactivos:

FPN (fenotiazinas)
a. Solución de FeCl3 al 5%
b. Solución de HClO4 al 20%
c. Solución de HNO3 al 50%
Procedimiento
Mezclar a, b, c (5.45:50)
Comentario
Para diferenciar las fenotiazinas (rojo-violeta) de las fenotiazinas sulfóxidos (no dan color),
usar la solución de FeCl3 al 2%.

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IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Ensayo en animales
Droga : clorpromacina
Animales: ratones
Dosis : 25 mg/kg
Vía : oral

Observar los efectos tóxicos por 60 minutos

Enayo cromatográfico
Muestra: vísceras, sangre u orina.

Técnica de extracción: remitirse a las técnicas descritas para la extracción de drogas

básicas y su respectivo fraccionamiento.

Fase estacionaria: Silicagel G

Fase móvil :
Cloroformo: metanol: amoniaco (80:20:1)
Reactivo revelador: FPN

Resultados: Las fenotiazinas dan manchas o puntos naranja, rojo o azul.

V. CUESTIONARIO
1. Explique el mecanismo de toxicidad y efectos tóxicos de las fenotiazinas.
2. Indique el cuadro clínico de la intoxicación por fenotiazinas.
3. Describa la estructura química de las principales fenotizinas.
VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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PRÁCTICA N° 5
IDENTIFICACIÓN DE ANTIDEPRESIVOS
TRICÍCLICOS

I. INTRODUCCIÓN
Los estados depresivos se consideran como un desequilibrio entre los sistemas neuronales,
más específicamente se ha demostrado que los mismos vienen dados por una disminución
de la cantidad de monoaminas en las hendiduras sinápticas. Los fármacos utilizados para el
tratamiento de la depresión aumentan la disponibilidad de aminas biógenas en las
hendiduras.
Los medicamentos más utilizados para contrarrestar estos trastornos son los llamados
antidepresivos tricíclicos o también conocidos como timolépticos. Dentro de este grupo de
fármacos tenemos a la imipramina, amitriptilina, desipramina, nortriptilina, doxepina y
otros.
Todos estos compuestos antes mencionados son estimulantes del SNC, los cuales bloquean
el consumo activo del NT en el terminal presináptica.
En general, todos ellos se absorben bien por vía oral, pero su absorción es máxima a nivel
intestinal por sus características de liposolubilidad y valor de pKa (son bases débiles), son
además considerados agentes anticolinérgicos fuertes y es por esa razón que los mismos
actúan disminuyendo el tono de la musculatura lisa y, por ende, retrasan el vaciamiento
gástrico con absorción más lenta e irregular de éstas y otras drogas tomadas
simultáneamente.
Las concentraciones plasmáticas llegan al máximo típicamente en 2 a 8 horas, pero puede
demorarse hasta más de 12 horas. Después de ser absorbidas, se difunden ampliamente y se
ligan fuertemente a proteínas plasmáticas y a los constituyentes de los tejidos; sólo el 10 %
queda libre en sangre, ejerciendo su acción farmacológica.
Los tricíclicos se oxidan por acción de enzimas microsomales hepáticas y luego se
conjugan con el ácido glucurónico.
La eliminación de éstos se produce durante varios días después de terminar el tratamiento
(siete días), por la bilis y heces, el resto no metabolizado se excreta por la orina. En
general, su tiempo de vida media es de 10 a 20 horas.
Casi todas las reacciones tóxicas y secundarias implican efectos antimuscarínicos,
toxicidad cerebral y cardíaca.
En intoxicaciones agudas por tricíclicos el paciente debe colocarse en una unidad de
cuidados intensivos para vigilarles continuamente la actividad cardíaca, la realización de
desfibrilación y reanimación en caso necesario.
Aunque existen diversas posibilidades de intervención farmacológica para contrarrestar las
intoxicaciones por tricíclicos, éstas no están totalmente aclaradas.

II. OBJETIVOS
Determinar la presencia de antidepresivos tricíclicos en muestra biológica

III. MATERIALES Y REACTIVOS

Ácido clorhídrico concentrado

Ácido sulfúrico concentrado
Ácido nítrico concentrado
Amoníaco
Cloroformo

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Amitriptilina
Metanol
Contenido gástrico
Silica gel
R. Dragendorff
Otros: Embudo separador

IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Ensayo en animales
Droga : amitriptilina
Animales: ratones
Dosis : 25 mg/kg
Vía : oral
Observar los efectos tóxicos por 60 minutos

Cromatografía:
Placa delgada (silica gel)
Extracción : Alcalina
Sistema de solventes : Metanol-amoníaco (100:1.5)
Revelador : Dragendorff
Rx. Positiva : Anaranjado rojizo

A 10 mL de muestra llevar a pH 8-8,5 con hidróxido amonio diluido, luego extraer con 10
mL de cloroformo en la pera de bromo con agitaciones suaves. Separar la fase orgánica y
concentra hasta aproximadamente 1 ml con el cual realizar el sembrado en la placa
cromatográfica.

Test de color

REACTIVO AMITRIPTILINA IMIPRAMINA

H2SO4C Anaranjado Azul-verde
HCl -- --
HNO3 Amarillo-claro Azul-prusia

En la placa se puntea la muestra concentrada con 2 patrones correspondientes:

imipramina y amitriptilina (10 µl de c/u).
-Calcular el RF y comparar contra los RF de los patrones.
Resultados y conclusiones:
- Una vez realizado el test de color se debe observar el desarrollo de los diferentes colores
para cada reactivo utilizado y con ello concluir qué antidepresivos tricíclicos están
presentes en la muestra procesada.
- Por el método cromatográfico también podremos saber a través de los valores de los RF
para la muestra y los patrones y comparándolos, cuál era el tricíclico que aparecía en
contenido gástrico.
V. RESULTADOS
VI. CONCLUSIONES
VII. CUESTIONARIO
1. Explique el mecanismo de toxicidad de los antidepresivos, indicando el cuadro clínico.
2. Clasifique los principales antidepresivos.
VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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PRÁCTICA N° 6
EVALUACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA DEL
MALONILDIALDEHIDO (MDA) EN PLASMA

I. INTRODUCCIÓN.
La acción tóxica de los xenobióticos sobre la
arquitectura celular está mediada por tres tipos de reacciones:
Reacciones de causticación, alquilación y reacciones radicalarias.
Se ha demostrado que los radicales libres son, en su mayoría, especies reactivas que dañan
las células vivas, por lo que – debido a la gran cantidad de xenobióticos a los cuales se ve
expuesto el organismo- no es sorprendente que algunos produzcan radicales libres,
responsables de la toxicidad de dichos compuestos.
Como ejemplo, podemos mencionar: el tetracloruro de carbono (CCl 4), paraquat,
adriamicina, amiodarona, etc.
Recordemos que, en la respiración celular, el oxígeno no oxida directamente a los sustratos,
sino que de ellos, por acción de las enzimas deshidrogenasas (situadas en la cara interna
mitocondrial), separan electrones, en forma de hidrógenos, que reducen el oxígeno
molecular. En el proceso intervienen las coenzimas transportadoras de electrones.
En la reducción completa de una molécula de oxígeno, hasta la formación de agua, se
requieren cuatro electrones. Cuando no se dispone de ellos en su totalidad, se pueden
formar derivados del oxígeno de gran reactividad y toxicidad sobre moléculas biológicas.
La reducción del oxígeno por un electrón forma el radical superóxido (0 2-). Por dos
electrones, el peróxido de hidrógeno (H202) y con la participación de 3 electrones el radical
hidroxilo (OH-). Estas especies intermedias del oxígeno pueden formarse a nivel celular de
modo enzimático o por vía no enzimática.
En la mayoría de los casos, sin embargo, las células vivas poseen poderosos mecanismos
enzimáticos y no enzimáticos, mediante los cuales pueden eliminar o prevenir la formación
de especies reactivas del oxígeno, que resultan altamente tóxicas al organismo.
La enzima superóxidodismutasa (SOD), que se encuentra localizada en las mitocondrias y
el citosol, generalmente se conoce como la enzima responsable de la eliminación del
radical superóxido (02-).
La catalasa, varias peroxidasas y la glutatión reductasa son las encargadas de eliminar el
peróxido de hidrógeno (H202).
La glutatión reductasa también reacciona con los peróxidos orgánicos. La misma se
encuentra situada en el mismo compartimento celular que la SOD.
Los diferentes sistemas enzimáticos de defensa endógena, cuando se han empleado dosis
tóxicas de diferentes xenobióticos, sufren saturación.
Estos agentes exógenos incorporados al organismo por cualquier vía pueden, como
consecuencia de su metabolismo endógeno, formar radicales libres del producto primitivo
que – a su vez - puede seguir dos caminos:
a- Reacciones de alquilación: alquilando diferentes componentes de la membrana tisular
(membrana celular, R.E., etc.), produciendo con esto necrosis o déficit metabólico o de
defensa o trastornos en la reproducción celular (cáncer).
b- Reacciones de peroxidación lipídica: las formas de oxígeno activo actúan oxidando,
preferentemente, a los lípidos de las membranas (lípidos insaturados), pues son más
reactivos, y estos compuestos peroxidados forman los hidroperóxidos lipídicos que pueden
seguir 2 vías:

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1- Forman radicales libres lipídicos, que peroxiden a su vez a otros lípidos, entre ellos los
constituyentes de la membrana celular. Como resultado de esta reacción se produce lesión
de la membrana y liberación de MDA.
2- Ser reducido, por el sistema enzimático del glutatión, a alcoholes grasos:
Sistema enzimático del glutatión:
- Glutatión peroxidasa (Se).
- Glutatión reductasa (NADP).
- Glucosa 6 fosfatodeshidrogenasa.

Lipoperoxidación y liberación de MDA.

Así, sobre el ácido linoleico (9,12 octadecanoico) el grupo hidroperóxido se puede unir al
azar a cualquier carbono, del 8 al 14, originando desplazamiento de los dobles enlaces y
producción de un puente de peróxido y posterior ruptura de la molécula con liberación de
MDA (producto de degradación de la peroxidación lipídica) el cual puede ser detectado por
la reacción del ácido tiobarbitúrico, aunque exista otro método más actual que permite
detectar de forma directa los RL, mediante resonancia paramagnética electrónica y métodos
fluorométricos, en esta práctica de laboratorio lo determinaremos de forma indirecta,
determinando la concentración de MDA en cada muestra ensayada.

II. MATERIALES Y REACTIVOS

 Ácido tricloroacético al 20%

 Ácido tiobarbitúrico al 0,67% en HCl 0,25 N
 Cloruro de sodio al 0,85 %

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 Agua destilada
 Plasma sanguíneo
Otros:
 Tubos de centrífuga de vidrio con tapa.
 Pipetas de 1 mL y 2 mL.
 Gradillas.
 Pinzas.
 Equipos:
 Baño de agua termostatado.
 Centrífuga.

III. PROCEDIMIENTO

 Obtener sangre anticoagulada con citrato de sodio (9:1 v/v) y centrifugar a 2500 rpm,
durante 15 min para obtener un plasma pobre en plaquetas (PPP).
 Tomar 0,5 mL de plasma y 1 mL de ATC al 20%.
 Llevar a baño maría hirviente por 10 minutos, luego proceder a enfriar la muestra en
agua a chorro con la finalidad de detener la reacción.
 Añadir 1,5 mL de ácido tiobarbitúrico al 0,67% en HCl 0,25 N
 Volver a llevar a baño maría por 30 minutos y luego enfriar en agua helada
 Centrifugar la muestra a 4000 rpm durante diez minutos
 Extraer el sobrenadante y leer en el espectrofotómetro a 535 nm.

Cálculos:
DO = a.C
C = DO
a

C = concentración
DO = densidad óptica
a = absortividad = 1,56x10-5 nmol-1xcm-1

IV. CUESTIONARIO
1. Señale los efectos de los radicales libres en el organismo.
2. Indique el origen y formación de radicales libres.
3. ¿Cuál es la importancia de conocer los radicales libres?.

V. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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PRÁCTICA N° 7
BIOENSAYO DE TOXICIDAD EN ARTEMIA SALINA

I. INTRODUCCIÓN

El bioensayo con Artemia salina es un método que permite determinar citotoxicidad en la

larva de este crustáceo que es altamente sensible a una gran variedad de sustancias
químicas. La toxicidad se expresa como CL50 (concentración letal 50).

TOXICIDAD Esta fase es importante para determinar los efectos adversos o nocivos de las
drogas, se realiza en varias especies de animales.

Toxicidad aguda: La droga se administra por un periodo corto, esta directamente

relacionado con la (DL50) dosis que mata al 50% de animales estudiados.

Toxicidad subaguda y crónica: Se administra el producto en dosis tóxicas por un tiempo

prolongado. Se realiza para observar las alteraciones funcionales y anatómicas,
mutagénicos, carcinogénicos, etc.

II. OBJETIVOS
Determinar la concentración letal 50 de la cocaína en larvas de Artemia salina.
Determinar la dosis letal 50 de la cocaína en animales de experimentación.
Conocer la importancia de determinar la CL50 y DL50 de las sustancias químicas.

III. MATERIALES Y REACTIVOS

MATERIALES:
Vaso de precipitado.
Pipetas.
Matraz de Erlenmeyer.
Placa Petri.
Foco.
MATERIAL BIOLÓGICO

Larvas de Artemia salina

REACTIVOS:
Agua de mar o (sal azul).
Solución de cocaína.

IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

BIOENSAYO DE TOXICIDAD EN ARTEMIA SALINA

Día 1:
A. Se prepara agua de mar según las instrucciones del envase (3,8 g de sal de mar
comercial en 100 mL de agua destilada o 2,5 g de sal azul adecuadamente filtrado.
B. Se colocan aproximadamente 50 mg de huevos de Artemia salina en un Erlenmeyer con
350 mL de agua de mar. Se coloca en un lugar con luz (artificial o natural). Se coloca
una bomba de oxígeno con burbujeo lento.

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Día 2:

A. Se transfiere la mayor cantidad de nauplios vivos a un Erlenmeyer con agua de mar

fresca.
B. Se pesa 20 mg de muestra.

Día 3:
A. Se disuelven 20 mg de la muestra en 2 mL del disolvente de la siguiente forma: las
muestras polares se disuelven en 2 mL de agua destilada y las muestras apolares se
disuelven en 0,5 mL de dimetilsulfoxido (DMSO) y 1,5 mL de agua destilada (lo que
hace un total de 2 mL).
A partir de esta solución, se preparan diluciones de 1000, 100 y 10 ppm, transfiriendo
a cada vial 500, 50 y 5 µL respectivamente, Son 3 viales por cada concentración (9 en
total). Se hace un control por muestra. Si la muestra es apolar debe agregarse al
control 50 µL de DMSO.
B. Los nauplios están listos para el ensayo
A cada vial se le agregan 10 nauplios y la muestra. Luego agregar agua de mar hasta
completar 5 mL por vial. A cada vial se le agrega además una gota de suspensión de
levadura (3 mg de levadura seca se disuelven en 5 mL de agua de mar) como
alimento.

Nota: Los nauplios pueden ser utilizados entre 48 y 72 horas después que se ha
iniciado la incubación. Sin embargo, luego de 72 horas deber ser descartados.

Día 4:

A. Después de las 24 horas, se cuenta y anota el número de sobrevivientes en cada

dilución
B. Se analiza los datos con el programa de computadora Finney (DOS) para determinar
valores CL50. Los valores de CL50 menores de 1000 ppm son considerados activos.

V. RESULTADOS
VI. CONCLUSIONES
VII. CUESTIONARIO
1. Determine gráficamente la CL50 de la muestra analizada.
2. Indique la dosis letal 50 de 20 sustancias químicas.
3. ¿Cuál es la importancia de determinar la CL50 y DL50 de las sustancias químicas?

VIII. REFERNCIAS BILIOGRÁFICAS

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GUÍA DE PRÁCTICA TOXICOLOGÍA Y QUÍMICA LEGAL II

PRÁCTICA N° 8
ESTUDIOS DE TOXICIDAD AGUDA Y A DOSIS REPETIDA

I. INTRODUCCIÓN

La necesidad del control en el uso de sustancias químicas requiere que se determine el

potencial tóxico de las mismas, para lo cual se han establecido legislaciones metodológicas
y reglamentaciones en todos los países; surgiendo una rama moderna de la toxicología
conocida como toxicología regulatoria, que estudia las reglamentaciones científicas y
técnicas de las pruebas toxicológicas necesarias para llevar a cabo la evaluación preclínica
de cualquier sustancia química o biomaterial.
Organizaciones Internacionales como por ejemplo la OMS, FAO y la OECD han
desarrollado protocolos toxicológicos con el objetivo de auxiliar el trabajo de los
investigadores y evaluadores y así armonizar el trabajo en este campo a nivel internacional.
La naturaleza y la extensión de las investigaciones toxicológicas necesarias para obtener
una satisfactoria garantía de seguridad pueden variar de una sustancia a otra. La
determinación de cuales serán los ensayos toxicológicos apropiados requiere de la
asistencia de un personal especializado y experimentado.
Reconocidas organizaciones han desarrollado directrices en este sentido, las más
importantes son: la Food and Drug Administration” (FDA), la Envirumental Protetion
Agency (EPA), la Comission of the European Communities” (CEC), la World Health
Organizacion (International Programme on chemical Safety-IPCS) y la Organization for
Economic Cooperation and Development (OECD). Aunque cada una de estas directrices
tenga sus particularidades todas tienen en común los elementos fundamentales que hay que
cumplir en la Evaluación Preclínica, que son las que veremos a continuación.
El planteamiento de un protocolo de toxicología experimental requiere resolver cuatro
cuestiones elementales: especie animal, número total y grupos de animales, vías de
administración y tiempo de duración del estudio.
Los estudios de toxicidad pueden desarrollarse con una sola administración (toxicidad
aguda) o con administración continuada durante periodos cortos (toxicidad subcrónica),
medios o largos (toxicidad crónica); para lo cual se establecen las siguientes categorías de
ensayos toxicológicos:

1- Estudios de toxicidad aguda (a corto plazo): Administración única.

Objetivo: Valoración de la DL50 u otro efecto tóxico.
Observación: Muertes a las 24 h, 7 días y 15 días.
Animales: ratas o ratones.
Vías de administración: vía oral.

2- Estudios de toxicidad crónica: Administración continuada.

Medio plazo (subcrónica) 21 a 90 días.
Largo plazo (crónica) 1 a 2 años.
Varias organizaciones y agencias regulatorias han comenzado a reconsiderar su posición
respecto a la necesidad de la determinación de la DL50 y los métodos utilizados para ello.
En años recientes la OECD aceptó el método del ensayo en la dosis límite que se basa en
los principios de la toxicología alternativa o sea la reducción, remplazamiento y
refinamiento de los métodos que emplean animales de laboratorio.
La reducción esta basada en la clasificación toxicológica propuesta por la Unión Europea
como se indica a continuación:

20
GUÍA DE PRÁCTICA TOXICOLOGÍA Y QUÍMICA LEGAL II

Clases de toxicidad Rango de DL50 (mg/kg).

Muy tóxica
DL50 ≤ 25
Tóxica 25 ≤ DL50 ≤ 200
Dañino 200 ≤ DL50≤ 2000
Sin clasificar 2000 ≤ DL50.

El método de la dosis fija (aceptado por la OECD y la U. E), plantea que si a dosis de 2000
mg/kg no ocurren muertes, no es necesario realizar estudios a dosis mayores, reduciendo el
número de animales y el sufrimiento de los mismos.

II. OBJETIVOS
- Evaluar la toxicidad aguda en animales de experimentación

III. MATRIALES Y REACTIVOS

- Ratas albinas

IV. PROCEDIMIENTO
EVALUACIÓN DE LA TOXICIDAD AGUDA (Método dosis límite)
Cuando se emplean roedores se puede utilizar solo un nivel: 2000
mg/kg (3 hembras y 3 machos). Si no hay muertes no se necesitan estudios a dosis
superiores.
Si hay muertes se debe administrar dosis de 25 mg/kg, 200 mg/kg y 2000 mg/kg
1. Animales en ayuna antes de la administración.
- Ratas: 12 horas antes.
- Ratones: 3-4 horas antes.
2. Pesar la dosificación de acuerdo al peso.
3. Se administra una sola dosis o varias dosis en 24 h. (divididas en dosis iguales
separadas de 3 a 4 horas).
4. La administración es por gavage utilizando una cánula de intubación gástrica.
5. Terminada la dosificación la comida se vuelve a colocar de 3 a 4 horas después (1dosis)
y cuando son varias, en dependencias de la longitud del período.
6. Para las sustancias acuosas 2 mL/100 g.
7. Para las sustancias no acuosas 1mL/100 g.
8. La administración puede ser a concentración constante o a volumen constante.

PERIODO DE OBSERVACIÓN
Al menos 14 días, pero no rígidos.
En este se determinará:
 Reacciones tóxicas.
 Inicio y Término periodo de recobrado.
 El tiempo en que los signos aparecen y desaparecen y cuando mueren (esto es
importante).
V. RESULTADOS
VI. CUESTINARIO
1. Indique la importancia de evaluar la toxicidad aguda de las sustancias químicas.
2. Explique el método para evaluar la toxicidad a dosis repetida.

VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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FORMATO DE REPORTE PARA DOSIS LETAL MEDIA (DL50)

Nombre de la Muestra: Lote:

Código: Presentación:
Cantidad Recibida: Concentración:
Fecha: Cantidad de muestra a emplear:

CANTIDAD DEL ANIMAL EXPERIMENTAL:

Animal: ratón  rata  pollo  otro __________

Procedencia: Número total a emplear:

Cepa: Edad: Sexo: Macho  Hembra  Ambos 
Rango de peso: ___________ g Peso Promedio: _________ g

DATOS DE REFERENCIA PARA ESTABLECER LOS RANGOS A EVALUAR:

______________________________________________________________________________

Rango de Dosis a evaluar: u ____________/kg de animal

DATOS DE LAS DILUCIONES DE LA MUESTRA:

Muestra recibida: ________ Concentración: __________ (Fecha de la prueba: / / )

 Sólida  Líquida Concentración: ________ Cantidad: ________ mL

Fecha de dilución de la muestra a evaluar: ___/___/___

Concentración de la muestra a partir de la cual se realizará la prueba:
(Mezcla de ___________________________ + _____________________________ de solvente)
Solvente empleado: (Concentración: ____________________)

DOSIS, NUMERO DE ANIMALES Y MORTALIDAD:

Fecha de la prueba: ___/___/___ Vía de Administración:

Volumen de Inyección:
D O S I S DILUCIONES MORTALIDAD
Número
Grupo Muestra (mL) Solvente 24 48 72
animales
u__/g u__/ratón (x dosis) mL

Control Solvente

Observaciones:

_________________
Analizado por

22
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PRÁCTICA N° 9
EVALUACIÓN DE IRRITABILIDAD DÉRMICA

I. INTRODUCCIÓN
Las formulaciones de uso cosmético pueden causar reacciones cutáneas irritativas o
alérgicas, debido a algunos agentes que forman parte de estos compuestos; la severidad
de estos efectos dependerá de la concentración y tiempo de contacto. Es así que los
productos que permanezcan mayor tiempo en contacto con la piel ejercen mayor
influencia sobre esta y por lo tanto requieren de mayor cuidado en su preparación, este es
el caso de las cremas, a diferencia de los polvos, lápices de labios y otros productos
cosméticos que sólo enmascaran el rostro en forma pasajera. Por ejemplo se considera
que una crema no debe ser irritante mientras que una loción que contiene alcohol o un
jabón que es un agente tensoactivo puede causar algún grado de irritación.

El método establece el potencial del material que se desea ensayar para producir la
irritabilidad dérmica.
1. Aquellas sustancias irritantes ó corrosivos se excluyen del ensayo.
2. Solo se realiza el ensayo a sustancias con 2<pH<11,5.
3. T A D > 2000 mg/kg. no es necesario realizar la Irritabilidad Dérmica
 Se utilizan para este ensayo o se pueden utilizar varias especies de mamíferos, pero el
conejo albino es el que se prefiere.
 En general el peso de los animales deberá no ser menor de 2 kg.

EDEMA: Acumulación excesiva de líquidos corporales, este puede ser local como el
que se observa en una inflamación o ser mas generalizado.
ERITEMA: Enrojecimiento anormal de la piel, ya sea difuso o localizado provocado por
la dilatación de los capilares sanguíneos próximos a la superficie de la piel, con la
consiguiente hiperemia. El enrojecimiento es transitorio y palidece momentáneamente
bajo la presión del dedo y constituye la primera y más frecuente manifestación de la
reacción de la piel ante la acción de un irritante interno o externo.
PAPULA: Pequeña elevación sólida superficial que suele formar parte de un exantema o
rash, sin líquido visible, puede tener color blanco (milio), rojo (eccema), amarillento
(xantoma), consistencia blanda o firme y superficie lisa o rugosa.
PUSTULA: Pequeñas elevaciones de la piel que contienen pus; por su forma son
semejantes a las vesículas y pueden tener asimismo una areola inflamatoria.
VESICULA: Elevaciones epidérmicas circunscritas, de 1 a 10 mm de tamaño, que
habitualmente contienen un liquido claro. Pueden ser pálidas o amarillentas por su
contenido seropurulento, rojizas si en ellas hay suero mezclado con sangre y
ocasionalmente tienen una areola intensamente rojiza. Pueden brotar directamente o a
partir de una mácula o pápula perdiendo su identidad al formar una ampolla o una
pústula. La diferencia entre vesícula y ampolla es el tamaño, siendo esta última de más de
1 cm.

II. MATERIALES Y REACTIVOS

Material biológico: conejos albinos Nueva Zelandia o F1, machos o hembras.

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GUÍA DE PRÁCTICA TOXICOLOGÍA Y QUÍMICA LEGAL II

III. PROCEDIMIENTO

La irritación producida por una sustancia se mide por una técnica de prueba de parche
sobre la piel escoriada e intacta del conejo albino.
El dorso del conejo es rasurado adecuadamente 3,0 x 3,0 cm. Aproximadamente, introducir
bajo un parche cuadrado de gasa quirúrgica que mida 2,5 x 2,5 cm. y con un grosor de dos
mono capas, 0,5 g. de la forma farmacéutica semisólida (crema) a ensayar.
Los animales se inmovilizan con los parches asegurados en su lugar con tela adhesiva.
Todo el tronco del animal se envuelve con un material impermeable, por un período de 24
horas.
A las 24 horas de exposición se quitan los parches, y se evalúan las reacciones resultantes
mediante la escala de valores descrita por Draize para la evaluación de las lesiones de la
piel
Hacer lecturas nuevamente al final de un total de 72 horas (48 horas después de la primera
lectura).
Realizar un número igual de exposiciones sobre áreas de piel que han sido previamente
escoriadas, las escoriaciones son incisiones menores a través del estrato córneo, pero no lo
suficientemente profundas para interesar la dermis o producir sangrado.
Evaluar las reacciones de la piel escoriada a las 24 y 72 horas, como se describió
anteriormente. Sumar los valores del eritema y la formación de escaras, de la piel intacta a
la piel escoriada a la s 24 y 72 horas cada uno (cinco valores). De manera semejante, sumar
los valores para la formación de edema, de la piel intacta a la piel escoriada a las 24 y 72
horas cada uno (cinco valores). El total de los diez valores se divide entre cinco para dar el
valor de irritación primaria.

Método de Irritabilidad Dérmico Primario

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ESCALA DESCRITA POR DRAIZE PARA LA EVALUACIÓN DE LAS

LESIONES EN LA PIEL.

1. ERITEMA Y FORMACIÓN DE ESCARAS VALOR

Sino aparece nada 0
Muy ligero el eritema (Poco perceptible) 1
Eritema bien definido 2
Eritema moderado a severo 3
Eritema severo con formación de úlceras y costras 4
2. FORMACIÓN DE EDEMAS VALOR
Sino hay edema 0
Edema poco perceptible 1
Edema ligero (bordes o áreas bien definidas por elevación de la
2
piel)
Edema moderado (área moderada de aprox. 1 mm.) 3
Edema severo (elevación de más de 1 mm. que se extiende más
4
allá del área de exposición )

ÍNDICE DE IRRITACIÓN PRIMARIA

(J. Officiel de Republique Francaise, 1973).
Índice de Irritación Cutánea Clasificación de la sustancia
Primaria
Menor de 0,5 No irritante
Desde 0,5 hasta 2 Levemente irritante
Desde 2 hasta 5 Moderadamente irritante
Desde 5 hasta 8 Severamente irritante

IV. CUESTIONARIO
1. ¿Cuál es la importancia del estudio de la prueba de irritabilidad primaria
dérmica?
2. ¿En qué consiste el método de la sensibilidad cutánea?. Describa el método.
3. ¿Cómo se evaluaría la irritación vaginal, del pene y rectal?

V. RESULTADOS
VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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PRÁCTICA N° 10
EVALUACIÓN DE IRRITABILIDAD OCULAR
(Para cosméticos, shampoo, colirios y fármacos)

I. INTRODUCCIÓN

La irritación ocular es un cambio inflamatorio reversible que ocurre en la superficie

anterior del ojo después de una exposición directa a una sustancia y este cambio puede
persistir durante un tiempo prolongado.
Las sustancias que presentan efecto irritante al ponerse en contacto con las estructuras
oculares (córnea, iris y conjuntiva), desarrollan manifestaciones como eritema, edema,
secreciones y/o daños en el tejido epitelial. La severidad del daño se relaciona con la
potencia del irritante, y la recuperación depende del grado y la extensión del daño, los
cuales dependen del pH, la unión a proteínas epiteliales y de la penetración en la córnea.
Los parámetros que normalmente se evalúan son: opacidad, ulceración, hemorragias etc.

II. FUNDAMENTO
La prueba mide la capacidad potencial de una sustancia para producir irritación ocular. Se
consideran cuatro parámetros para la interpretación de la prueba:
 Opacidad de la Córnea.
 Iritis.
 Enrojecimiento de la Conjuntiva.
 Quemosis.
Se aplica la sustancia a evaluar en un ojo del animal, mientras que el otro ojo que
permanece sin tratar sirve como control.

III. GENERALIDADES

Conjuntiva: Delicada mucosa que recubre la parte anterior del ojo y tapiza el interior de
los párpados. La conjuntiva que recubre el interior de los párpados contiene vasos
sanguíneos y la que recubre el polo anterior del ojo es transparente.
Córnea: Zona circular transparente del polo anterior del globo ocular. Refracta la luz que
penetra en el ojo hacia el cristalino, que a su vez la proyecta sobre la retina. La córnea no
contiene vasos sanguíneos y es extremadamente sensible al dolor.
Edema: Acumulación excesiva de líquidos corporales, este puede ser local como el que se
observa en una inflación o ser mas generalizado.
Eversión: Observación directa de la conjuntiva que recubre la cara posterior de los
párpados superiores o inferiores.
Inflamación de los Párpados: Inflamaciones palpebrales, las más frecuentes son las que
afectan a las pestañas y los bordes palpebrales (blefaritis).
Iris: parte del ojo que regula la entrada de luz en el mismo. Forma un diagrama muscular
coloreado situado por delante del cristalino; la luz entra a través de la abertura central o
pupila. Un anillo muscular alrededor del margen se contrae con la luz intensa, provocando
la contracción de la pupila. El margen externo del iris está unido al cuerpo ciliar.
Iritis: Inflamación del iris.
Lagrimeo: Mayor cantidad de lagrimas que corresponde a todo proceso irritativo del
segmento anterior o conjuntiva con vías lagrimales permeables.
Opacidades Corneales: Pueden aparecer como resultado de un edema, de una distrofia
endotelial o por las roturas de la membrana de Descemet.

26
GUÍA DE PRÁCTICA TOXICOLOGÍA Y QUÍMICA LEGAL II

Quemosis: Hinchazón (edema) de la conjuntiva. Generalmente se debe a la inflamación,

aunque puede también producirse cuando el drenaje de la sangre y la linfa de alrededor del
ojo están obstruido.
Ulceración de la Córnea: Proceso inflamatorio con curso doloroso y progresivo; cuadro
clínico característico de un defecto epiteleal con un borde muy prominente y
vascularización en la base de la úlcera.

IV. MATERIALES Y REACTIVOS

Material biológico:
Conejos Albinos Nueva Zelandia o F1, machos o hembras, de ojos rojos, peso corporal 2,0
- 2,5 kg mantenidos con ciclos de luz y oscuridad de 12 por 12, comida adlibitum,
temperatura y humedad, según PNT CIEB- IFAL.
Reactivos y equipos:
Solución de cloruro de sodio 0,9 % 2000 mL.
Solución de fluoresceína sódica al 10% 5 ampollas.
Lámpara de luz ultravioleta
Cepos
Lupa de aumento 2x
Micropipetas de 0,1; 1, 5 mL.

V. PROCEDIMIENTO

 Para cada muestra usar dos conejos de cualquier sexo, de entre 2,0 y 2,5 Kg de peso.
 Se examinan ambos ojos de cada animal que se pretende emplear para la prueba y solo se
escogen aquellos animales sin defectos o irritación ocular.
 Cada animal se sujeta firme pero suavemente para que permanezca quieto.
 Se aplica el material de prueba a un ojo de cada animal jalando suavemente hacia fuera el
párpado inferior del globo ocular, a modo de formar una especie de recipiente en el cual se
deposita la muestra. Mantener los párpados abiertos por un segundo y dejar el animal en
reposo.
 El ojo, que permanece sin tratar, sirve como control.
 Para probar líquidos, instilar 0,1 mL y para muestras sólidas o en pasta se emplea 100 mg.
Las instilaciones de la muestra a analizar se harán una hora antes de la primera lectura y las
consiguientes lecturas a las 24 y 48 horas.
 Examinar los ojos a 1, 24, 48, 72 y 96 horas y a los 7 días siguientes a la instilación inicial
y registrar con valores numéricos según la siguiente tabla:

I. Córnea:
A. Grado de Opacidad:
Opacidad ligera 1
Áreas opacas diseminadas 2
Áreas translúcidas con iris visible 3
Opacidad completa con iris invisible 4

B. Extensión de la Opacidad:
Más de ¼ del área total 1
Más de 1/4 y menos de 1/2 del área 2

27
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Más de 3/4 y más de 1/2 del área 3

Más de 3/4 del área total 4
Total de lesiones corneales A x B x 5 = 80

II. Iris
A. Evaluación de la lesiones:
Con alteraciones pero reaccionando a la luz 1
Lesionados hasta que no reaccionan a la luz 2
Total de lesiones corneales A x 5 = 10

III. Conjuntiva
A. Enrojecimiento
Vasos enrojecidos sobre lo normal 1
Enrojecimiento moderado 2
Enrojecimiento difuso intenso 3

B. Edema
Edema ligero, incluyendo la membrana nictitante 1
Edema con eversión parcial del párpado 2
Edema con párpados cerrados a la mitad 3
Edema con párpados totalmente cerrados 4

C. Secreción
Secreción ligera 1
Secreción moderada en ambos párpados 2
Secreción en ambos párpados y alrededores 3
Total de lesiones en la conjuntiva (A + B + C) x 2 = 20

Cálculos:
Cuando han sido evaluados los ojos durante el tiempo establecido, se halla la sumatoria de
los valores individuales de la córnea, iris y conjuntiva y se dividen por 12, este valor se
compara según el sistema de clasificación siguiente:
Clasificación por puntos: Evaluación
No irritante 0 y 10
Ligeramente irritante 10 y 20
Moderadamente irritante 20 y 30
Irritante severo 30 y 110

EVALUACIÓN E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

Se debe considerar que un animal exhibe una reacción positiva si la sustancia a probar
produce, a cualquiera de las lecturas, ulceración de la córnea (que no sea un punteado
fino), opacidad de la misma (que no sea disminución ligera del lustre normal), iritis (que
no sea una ligera profundización de los dobleces o una leve inyección de los vasos
sanguíneos circuncorneales), o si dicha sustancia produce en la conjuntiva excluyendo la
córnea y el iris una inflamación obvia con eversión parcial de los párpados o un

28
GUÍA DE PRÁCTICA TOXICOLOGÍA Y QUÍMICA LEGAL II

enrojecimiento carmesí difuso, con los vasos individuales no discernibles con facilidad. La
prueba debe considerarse positiva si cuatro o más de los animales en el grupo de prueba
exhiben una reacción positiva. Si solo un animal exhibe una reacción positiva, la prueba
debe considerarse como negativa. Si dos o tres animales muestran una reacción positiva, la
prueba se repite empleando un grupo diferente de seis animales. La segunda se considerará
positiva si tres o más de los animales exhiben una reacción positiva. Si solo uno de dos de
los animales de la segunda prueba exhiben una reacción positiva, la prueba debe repetirse
con un grupo diferente de seis animales.

En caso de que se requiera una tercera prueba, la sustancia se considerará como irritante si
cualquier animal exhibe una respuesta positiva. En cualquier caso se tomará como
referencia el control negativo.

FORMATO REPORTE DE IRRITACIÓN OCULAR EN CONEJOS

MÉTODO DE DRAIZE MODIFICADO PARA COSMÉTICOS

CODIGO: _________________________ Fecha de Recepción: ___________

Muestra N°: ___________________________ Analista: _______________________________

Descripción de la Muestra: ________________
______________________________________
Control N°: ____________________________ Fecha de Reporte: _______________________
Descripción del Control: __________________ Proyecto N°: ____________________________
______________________________________
Método de Análisis: _____________________ Ref. N°: ________________________________
Resumen del Estudio N°: _________________ Peso Conejo: ____________________________

Seis conejos albinos de raza Nueva Zelanda serán empleados; todos previamente evaluados y aprobados para el test
ocular. 0,1 mL de la sustancia a probar instilar dentro de un ojo, el ojo no tratado sirvirá como control. Las
reacciones serán evaluadas de acuerdo con el método de Draize con lecturas a las 1, 24, 48, 72 y 96 horas y a los 7
días siguientes a la instilación inicial. Instilaciones de la sustancia a analizar se hicieron una hora antes de la primera
lectura y las consiguientes lecturas a las 24 y 48 horas. A continuación se indican detalles y resumen de los
resultados hallados en el test.

VALORES DIARIO PROMEDIO *

MUESTRA 1h 24 h 48 h 72 h 96 h 7 días RESULTADO

RESUMEN DE REACCIONES POSITIVAS EN CONEJOS**

TOTAL POSITIVOS TOTAL POSITIVOS

DURANTE EL ANALISIS AL FINALIZAR EL ANALISIS
MUESTRA CONTROL MUESTRA CONTROL
CORNEA

29
GUÍA DE PRÁCTICA TOXICOLOGÍA Y QUÍMICA LEGAL II

IRIS
CONJUNTIVA

COMENTARIOS: _________________________________________________________

 Resultado de Irritación Ocular en cada conejo.

FORMATO REPORTE DE IRRITACIÓN OCULAR EN CONEJOS

MÉTODO DE DRAIZE MODIFICADO PARA COSMÉTICOS

RSD N° TIEMPO DE OBSERVACION

MUESTRA N° 1h 24 h 48 h 72 h 96 h 7 días
Conejo N° Córnea Opacidad
Área
Iris
PESO: Conjuntiva Rojez
Quemosis
Descarga
Conejo N° Córnea Opacidad
Área
Iris
PESO: Conjuntiva Rojez
Quemosis
Descarga

RESUMEN DEL ANÁLISIS*

CORNEA
IRIS
CONJUNTIVA
PROMEDIO DIARIO
* Córnea = Opacidad x Área x 5
Iris = Resultado x 5
Conjuntiva = (Rojez + Quemosis + Descarga) x 2

________________
Analista

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GUÍA DE PRÁCTICA TOXICOLOGÍA Y QUÍMICA LEGAL II

ENSAYO DE IRRITABILIDAD OCULAR MODELO ALTERNATIVO

HET-CAM EN HUEVO (In Ovo)

Evalúa semi cuantitativamente el potencial irritante de un producto (productos solubles,

emulsiones, geles y aceites) sobre la Membrana corioalantoidea del huevo embrionado de
la gallina, en el décimo día de incubación. El ensayo se basa en la observación de los
efectos irritantes (hiperemia, hemorragia y coagulación) tras 5 minutos de la aplicación del
producto, puro o diluido, sobre la membrana corioalantoidea.
Se obtiene una escala que considera los fenómenos observados.

VI. CUESTIONARIO
VII. RESULTADOS
1. Explique la importancia de las pruebas de irritabilidad ocular.
2. Señale otros métodos alternativos de la prueba de irritabilidad.
3. Señale la anatomía y fisiología del ojo.

VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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