UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN AGUSTIN

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y NATURALES

ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGIA

ASIGNATURA:

ENZIMOLOGIA
PERTENECE :

Edson Diaz Miranda

DOCENTE:

Georgina Sucasaca Monson

 PRACTICA N°2

EVALUACION DE TABLAS DE PURIFICACION DE ENZIMAS

OBJETIVO

- Evaluar la eficiencia de los métodos de purificación de enzimas

- Capacitarse en el análisis de tablas de purificación de enzimas
INTRODUCCION
Rendimiento:
Porcentaje de la actividad biológica de la proteína de interés en cada paso de la purificación. En
el paso inicial se tiene el 100 %, correspondiente a la actividad total del extracto inicial.

Factor de purificación, grado de pureza.

Incremento de la pureza de la proteína de interés en cada paso de la purificación. Se obtiene con
la relación de la actividad específica de cada paso de purificación y la actividad específica del
paso inicial.

ACTIVIDAD ESPECÍFICA: Unidades de actividad de la proteína de interés por unidad de

masa de proteína total.

RENDIMIENTO: Porcentaje de la cantidad inicial de proteína de interés que queda después de

cada paso de purificación.

VECES DE PURIFICACIÓN: Número de veces que se incrementa la actividad específica

después de cada paso de purificación.

El volumen, la concentración de proteína y la actividad volumétrica son

parámetros calculados experimentalmente.
PROBLEMA N°1

Fracción Vol.ml Actividad. U/ml Unidades Totales Prot.mg/ml Act.esp Rend % Purificación
Extracción crudo(I) 1480 0.34 503.2 10.2 0.033 100.000 1.000
Extracción centrifugado(II) 1390 0.32 444.8 4.3 0.074 88.394 2.233
Extracción en alúmina (III) 69 4.53 312.57 3.9 1.162 62.116 34.846
DEAE celulosa pH 5.52 (IV) 100 3.09 309 1.17 2.641 61.407 79.231
DEAE celulosa pH 7.52 (V) 12 7.02 84.24 0.65 10.800 16.741 324.000

Tabla N°1: El proceso de purificación de fosfatasa acida a partir de hojas de tabaco presentado
presentó varias etapas de purificación, realizándose una extracción por centrifugado (II) el cual
duplica aproximadamente el Rendimiento, pero con la extracción en alúmina la purificación
aumento a 34% junto con el rendimiento y su Act. Esp, lo que indica que esta etapa es muy
importante para la purificación. Finalmente, el procedimiento con DEAE celulosa pH52 (V)
mostro el valor más alto en purificación con 324.000, un rendimiento de 16.741 y una Act. Esp
de 10.800 considerándose así la etapa con mayor eficacia y ser la más determinante.
 Actividad
Act. Rend.
Fracción Vol.(ml) volumétrica. Prot.(mg) Prot.(mg/ml) Act.total(unidades) Purificacion
Esp. %
(U/ml)
Homogenizado 1612 2.680 211000 130.893 4320 0.020 100.000 1
Sobrenadante de PH 5 2881 0.840 21700 7.532 2420 0.112 56.019 5.45
Sulfato de amonio 278 8.259 18500 66.547 2296 0.124 53.148 6.06
Sephadex G-75 98.6 5.071 1860 18.864 500 0.269 11.574 13.13
DEAE-celulosa pico I 38.4 10.521 360 9.375 404 1.122 9.352 54.81
Hidroxiapatita 388 1.026 37 0.095 398 10.757 9.213 525.39
Cristalización I 0.8 162.500 7.3 9.125 130 17.808 3.009 869.80
Cristalización II 0.5 182.400 5.1 10.200 91.2 17.882 2.111 873.42
DEAE-celulosa pico II 242 0.382 140 0.579 92.4 0.660 2.139 32.24
Sephadex G-200 266 0.295 29 0.109 78.4 2.703 1.815 132.04

Tabla N°2: En la tabla se observa que hay varios pasos en los que se obtiene dos picos de
purificación. La precipitación con sulfato de amonio mejora la pureza 6 veces y nos dá un
rendimiento del 53%. Luego se continua en el pico I, la Hidroxiapatita permite incrementar la
pureza y la actividad, luego en el paso de Cristalización II mejora notablemente la pureza pero el
rendimiento disminuye, en esta etapa se recomienda utilizar la técnica de liofilización
enzimática para guardar la enzima. La etapa de DEAE-celulosa pico II, fue malo, porque se
pierde bastante actividad y se obtiene menos pureza de la que se tenía. La Sephadex G-200
representa una mejora con respeto a la proteína obtenida del paso de filtración y permite una
pequeña purificación más para el pico II.
 Act.
V Proteína Proteina Act.total Actividad Act. Rendimie
ETAPA Volumétrica( Purificacion
total(ml) total(mg) (mg/ml) (mKat) total (U) especifica nto. %
U/ml)
Extracto 2140 0.002 36000 16.822 68.3 4.098 0.0001 100 1
pp.sulfato nh4 385 0.012 19600 50.909 79.4 4.764 0.0002 116.25 2.1
Sp-sephadex 42 0.030 1870 44.524 21 1.26 0.0007 30.75 5.9
DEAE-
20 0.055 378 18.900 18.3 1.098 0.0029 26.79 24.5
sephadex
sephacril 20 0.105 30 1.500 35 2.1 0.0700 51.24 614.9
concanavalina 6 0.560 1.47 0.245 5.6 3.36 2.2857 81.99 20079.4

Tabla N°3: En este problema la precipitación con sulfato de amonio incrementa muy poco la
pureza, sin embargo, el rendimiento aumenta. La SP-sephadex duplica la pureza y reduce
notablemente el rendimiento. La etapa de Concanavalina A Sepharosa, es bastante buena,
porque se llega al valor de 20079.481, bastante Actividad específica y un excelente rendimiento
con un 81.991 % con lo cual, en teoría, sería posible obtener una proteína de pureza semejante,
con menos trabajo y con una mejora en el rendimiento final, en conclusión este proceso si es
rentable.