PRACTICA # 7

DISTRIBUCION INTRACELULAR DE LAS ENZIMAS DE OXIDO –

REDUCCION
I. INTRODUCCION
Los carbohidratos, ácidos grasos, aminoácidos y algunas otras sustancias orgánicas sufren
oxidaciones en el organismo mediante sistemas enzimáticos simples o complejos. Estos sistemas
están constituidos por proteínas, fosfolípidos , grupos prostéticos e iones metálicos. De acuerdo
a su estructura y función las enzima que intervienen en esos procesos se encuentran clasificados
en diversos grupos y tienen denominaciones particulares dentro de la literatura enzimológica.
Las enzima de oxido reducción tienen una distribución característica intracelularmente,
encontrándoseles de modo fundamental en una subestructura celular en donde la energía
derivada de las oxidaciones es capturada en la forma del intermediario macro energético con ATP.
Objetivo: Demostrar la distribución intracelular de las enzimas de óxido reducción usando
indicadores redox, 2, 6-Diclorofenolindofenol y p- fenilendiamina y los componentes celulares de
un homogeneizado de hígado de rata

II. MATERIAL Y METODO

- 2, 6-Diclorofenolindofenol 0.02 %. - Fracción mitocondrial del homogeneizado.
- Buffer fosfato de sodio 0.1 M pH 7.4. - Fracción nuclear del homogeneizado.
- p - fenilendiamina 1 % - Fracción microsomal soluble del homogeneizado.
- Succinato 0.1 M. - Homogeneizado total de hígado de rata en sucrosa
0.25 M.
PROCEDIMIENTO:
A. Sistema usando 2,6 - diclorofenolindofenol:
COMPONENTES / TUBOS I II III IV V
Buffer Fosfato 0.1M pH 7.4 1.0 0.5 0.5 0.5 0.5
2,6-diclorofenolindofenol 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
Succinato 0.1 M 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
Fracción nuclear --- 0.5 --- --- ---
Fracción mitocondrial --- --- 0.5 --- ---
Fracción microsomal soluble --- --- --- 0.5 ---
Homogeneizado total --- --- --- --- 0.5
Mezclar.
Dejar en reposo a temperatura ambiente.
Observar los cambios de color del indicador. Interpretar los resultados.
B. Sistema usando p - fenilendiamina:
COMPONENTES / TUBOS I II III IV V
Buffer Fosfato 0.1M pH 7.4 1.5 1.0 1.0 1.0 1.0
p - fenilendiamina 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Fracción nuclear --- 0.5 --- --- ---
Fracción mitocondrial --- --- 0.5 --- ---
Fracción microsomal soluble --- --- --- 0.5 ---
Homogeneizado total --- --- --- --- 0.5
Mezclar.
Dejar en reposo a temperatura ambiente.
Observar los cambios de color del indicador. Interpretar los resultados.
III. RESULTADOS

A. SISTEMA USANDO 2,6 - DICLOROFENOLINDOFENOL: Estado Oxidado Color Azul

TUBOS I II III IV V
Estado inicial AZUL AZUL AZUL AZUL AZUL
Indicador
Cambio de color AZUL AZUL INCOLORO AZUL INCOLORO
Al final de la OSCURO OSCURO OSCURO
reacción

B. SISTEMA USANDO p-FENIL ENDIAMINA: Estado REDUCIDO Color MARRÓN CLARO

TUBOS I II III IV V
Estado inicial MARRÓN MARRÓN MARRÓN MARRÓN MARRÓN
Indicador CLARO CLARO CLARO CLARO CLARO
Cambio de color MARRÓN MARRÓN MARRÓN MARRÓN MARRÓN
Al final de la reacción CLARO CLARO OSCURO CLARO OSCURO
 PRACTICA # 8
EFECTO DE INHIBIDORES SOBRE LA CADENA DE OXIDO - REDUCCION BIOLOGICA
I. INTRODUCCIÓN
La Cadena respiratoria es un conjunto ordenado de enzimas transportadoras responsable del
transporte de los equivalentes reductores desde los sustratos hasta el O2, intervienen en
reacciones redox que va desde los sistemas deshidrogenasa unido al NAD o por el FAD.
Existen sustancias que inhiben la cadena respiratoria y con ello el transporte de electrones y la
respiración celular que puede conducir a la muerte celular. Entre ellos, tenemos inhibidores de:
- sitio I del complejo NADH DH-FMN que entrega los equivalentes reductores a la CoQ, que
son: el antibiótico Piericidina A y la Rotenona
- sitio II del complejo citocromo b- citocromo c1 que entrega los equivalentes reductores al
citocromo c, que son: barbitúricos, el dimercaprol y la antimicina A.
- sitio III del complejo citocromo a- citocromo a3 entrega los equivalentes reductores al O, son
los venenos clásicos: CO, Cianuro, Azida de sodio, H 2S que inhiben a la Citocromo oxidasa.
El estudio de estos inhibidores es importante porque permite comprender la causa de la toxicidad
de estos compuestos y también porque contribuye a la realización de trabajos de Investigación
relacionados con la estructura y función de la cadena respiratoria.
El objetivo es demostrar el efecto de algunos inhibidores de la cadena respiratoria, empleando
como fuente enzimática el homogeneizado celular de hígado de rata.
II. MATERIAL Y MÉTODO
2.1 Material Reactivos:

Buffer fosfato de sodio 0.1 M pH 7.4

2,6-diclorofenolindofenol 0.02 %
Succinato 0.1 M, p - fenilendiamina 1 %
Malonato 0.1 M - Cianuro de sodio
Barbiturato de sodio 0.1 M
Homogenizado total de hígado de rata en sucrosa 0.25 M
2.2. Método
1. Sistema del 2,6- Diclorofenol Indofenol: Estudia la porción inicial de la cadena respiratoria,
se utiliza succinato como sustrato, donador de electrones y el último aceptor es el 2,6-DCFIF
COMPONENTES /TUBOS 1 2 3 4 5 6
Buffer Fosfato 0.1 M pH 7.4 1.5 1.2 1.0 0.5 0.5 0.5
2,6-diclorofenolindofenol 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
Succinato 0.1M 0.5 --- 0.5 0.5 0.5 0.5
Malonato 0.1 M -- -- -- 0.5 -- --
Cianuro Na 0.1M -- -- -- -- 0.5 --
Barbiturato 0.1M -- -- -- -- -- 0.5
Homogenizado total -- 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Mezclar cada tubo
Dejar en reposo a temperatura ambiental.
Observar constantemente los cambios de color del indicador.
Interpretación de los resultados:
La reacción es positiva cuando el 2,6-DCFIF siendo un aceptor de color azul, en estado oxidado,
pasa a incoloro de estado reducido.
(Azul) Aceptor --→ Incoloro (aceptor)

S oxidado → SH2 reducido

 2. Sistema usando p - fenilendiamina: Estudia la porción terminal de la cadena respiratoria, se
utiliza p-fenil endiamina como sustrato artificial, donador de electrones y el último aceptor es un
componente de la cadena respiratoria.

COMPONENTES /TUBOS 1 2 3 4 5
Buffer Fosfato de sodio 0.1 M pH 7.4 2.0 1.5 1.0 1.0 1.0
p - fenilendiamina 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Malonato 0.1M/Rotenona -- -- 0.5 -- --
Cianuro Na 0.1M -- -- -- 0.5 --
Barbiturato 0.1M -- -- -- -- 0.5
Homogenizado total -- 0.5 0.5 0.5 0.5
Mezclar cada tubo
Dejar en reposo a temperatura ambiental.
Observar constantemente los cambios de color del indicador.

Interpretar los resultados:

El p-FEDA es un dador de electrones que en estado oxidado es de color marrón claro, que cuando
dona sus equivalentes reductores se oxida a marrón oscuro a estado oxidado.
SH2 Marrón claro (donador de e-) → marrón oscuro (estado oxidado)

III. RESULTADOS
a. SISTEMA USANDO 2,6 - DICLOROFENOLINDOFENOL: Estado Oxidado Color Azul

TUBOS I II III IV V
Estado inicial
AZUL AZUL AZUL AZUL AZUL AZUL
Indicador
Cambio de color AZUL AZUL INCOLORO AZUL INCOLORO INCOLORO
Al final de la OSCURO OSCURO OSCURO
reacción

TAREA: Esquematizar el flujo de electrones en la cadena respiratoria cuando el sustrato

Succinato, entrega los equivalentes reductores a un componente de la cadena respiratoria y este
al ACEPTOR DE electrones y la reacción redox.
 b. SISTEMA USANDO p-FENIL ENDIAMINA: Estado REDUCIDO Color MARRÓN CLARO

TUBOS I II III IV V
Estado inicial MARRÓN MARRÓN MARRÓN MARRÓN MARRÓN
Indicador CLARO CLARO CLARO CLARO CLARO
Cambio de color MARRÓN MARRÓN MARRÓN MARRÓN MARRÓN
Al final de la reacción CLARO OSCURO OSCURO CLARO OSCURO

Esquematizar el flujo de electrones en la cadena respiratoria cuando el sustrato p-FEDA, entrega

los equivalentes reductores a un componente de la cadena respiratoria y la reacción redox.