DESARROLLO DE UNA PLATAFORMA DE PRODUCCIÓN DE VACUNAS DE VIRUS VIVOS DE ALTO

RENDIMIENTO UTILIZANDO UN NUEVO BIORREACTOR DE LECHO FIJO

RESUMEN

La creciente importancia de la fabricación de vacunas virales ha impulsado la necesidad de una

optimización del proceso de alta densidad celular que permita niveles de producción más altos.
Las células Vero son una de las líneas celulares adherentes más populares utilizadas para la
producción de vacunas virales. Sin embargo, la producción es limitada debido a las limitaciones
logísticas que rodean los procesos adherentes de la línea celular, tales como grandes huellas de
equipos, procesos intensivos en tiempo y mano de obra, y mayores costos por dosis. Hemos
abordado esta limitación con el establecimiento de un sistema de producción de vacunas virales
utilizando el nuevo biorreactor de carbohidratos scale-XTM de un solo uso. La unidad es compacta
y escalable, y una de las características novedosas del sistema son los procesos continuos de
purificación y concentración en línea aguas abajo asociados con el recipiente del biorreactor.
Presentamos los resultados de una campaña que presenta una línea celular Vero patentada para la
producción de una vacuna viva recombinante del virus de la estomatitis vesicular que presenta las
glicoproteínas del virus de la fiebre de Lassa. Se realizaron análisis de metabolitos y comparación
de rendimiento viral entre matraces tradicionales, fábricas de células y el biorreactor de
carbohidratos a escala X, y en promedio, el biorreactor de un solo uso produjo títulos de 2 a 4
registros más altos por área de superficie, aproximadamente 5 1010 pfu / cm2, en comparación
con el material plano clásico, 2,67 106 pfu / cm2, y la producción de fábricas de células, 5,77 108
pfu / cm2. En general, describimos una nueva plataforma de biorreactor que permite un proceso
rentable y escalable para la producción de vacunas virales.

INTRODUCCION

Los biorreactores de lecho fijo de un solo uso han surgido como plataformas para emplear células
adherentes para la producción de una miríada de diversos vectores virales, virus vivos y vacunas
basadas en virus. Estos biorreactores combinan un entorno de baja cizalladura de sistemas de
cubiertos con automatización y escalabilidad. Los sistemas Pall iCELLis y Eppendorf Fibra-Cel se
han utilizado para producir altos rendimientos de vectores virales y virus vivos [1–4]. Existen
ventajas significativas para utilizar estos sistemas de biorreactor de lecho fijo cerrado, que
incluyen contención del producto, recursos y materiales limitados, ahorro de tiempo para la
producción, flexibilidad del proceso y menores costos de producción de perdosis [5-7]. Un reciente
participante de lecho fijo en el mercado es el sistema de biorreactor scale-XTM de Univercells. La
cartera de scale-X ofrece una gama de superficies de crecimiento: scale-X 'hidro' (<3 m2), 'carbo'
(10-30 m2) y 'nitro' (200-600 m2). Esta gama ofrece un proceso escalable y la capacidad de
producción de lotes clínicos. Dentro de la línea de productos Univercells, la altura del biorreactor
aumenta, mientras que el diámetro se mantiene constante. Por ejemplo, el biorreactor carbo 10
m2 tiene 1/3 de la altura de un biorreactor de 30 m2. Sin embargo, la ampliación entre las
diferentes líneas se logra manteniendo constante la altura del lecho fijo y aumentando el
diámetro, de forma similar a la ampliación en los sistemas de cromatografía. Por ejemplo, un
biorreactor de 200 m2 tiene la misma altura que un biorreactor de 10 m2, pero el diámetro es
diferente. El sistema de carbohidratos scale-X es un biorreactor de un solo uso junto con la
concentración de productos en línea operada por un controlador de proceso automatizado a
escala de banco (pH, DO, T, agitación, tasas de flujo de líquidos), que permite la producción y la
concentración simultánea de productos virales; Una característica que es novedosa y diferencia
este tipo de biorreactor de lecho fijo de otros en el mercado. El lecho fijo en el biorreactor de
carbohidratos de escala X ofrece áreas de superficie para el crecimiento celular entre 10 y 30 m2
(el área de crecimiento es equivalente a 120–360 botellas de rodillo, 59–175 HYPERFlasks, 16–48
capa CellSTACK-10, o 6 –16 recipientes HYPERStack-36 layer) en un volumen total del recipiente de
1.6–3.2 L, dependiendo del área de la superficie. Esto da como resultado una alta densidad celular
por unidad de volumen y una huella compacta que permite la integración en un gabinete estándar
de bioseguridad. Muchos biorreactores de lecho fijo disponibles comercialmente usan discos o
tiras de tela empaquetados aleatoriamente como sustrato para la unión celular; sin embargo, el
biorreactor de escala X utiliza un lecho fijo que está organizado con una capa de malla que
proporciona uniformidad y consistencia de vaso a vaso para el crecimiento celular. El lecho fijo
consiste en un devanado en espiral que consiste en la alternancia de cintas de 5 cm2 de ancho de
una malla rígida de polipropileno para la estructura y el flujo de medios, y una tela de tereftalato
de polietileno (PET) hidrofilizado no tejido para atrapamiento y adhesión celular. Esto permite una
distribución homogénea de células radiales y verticales y un flujo lineal de medios a través de la
capa de malla, lo que garantiza un suministro homogéneo de nutrientes. Los puertos de muestreo
instalados dentro de la tapa del biorreactor permiten monitorear el crecimiento celular durante el
cultivo a través de un proceso manual. Esta característica proporciona un punto de acceso rápido y
conveniente para obtener muestras para el recuento de células, lo que mejora el riesgo de
contaminación dentro del recipiente. El control medioambiental se proporciona a través de una
mezcla de gases controlada para apoyar el crecimiento celular y se suministra al espacio superior
del biorreactor (suministro de oxígeno, eliminación de CO2) con lo que permite la absorción a
través de la interfaz líquido-gas de la película descendente. Otro diferenciador de este biorreactor
se centra en un filtro de fibra hueca en línea, que puede utilizarse durante la fase de producción o
en el momento de la cosecha para concentrar el producto producido. Los medios que contienen
virus se perfunden fuera del recipiente del biorreactor en un contenedor de retenido dedicado de
‘‘ cosecha ”, mientras que los medios dentro del biorreactor se reemplazan con medio fresco. Esto
da como resultado una cosecha a granel concentrada de bajo volumen del biorreactor, lo que
permite operaciones descendentes simplificadas y reducidas. En los estudios actuales, hemos
agregado un filtro de clarificación en línea antes de la botella de cosecha para mitigar el
ensuciamiento del filtro de fibra hueca. Este sistema proporciona todos los procesos aguas arriba y
los procesos aguas abajo iniciales en un único gabinete de bioseguridad de tamaño estándar.
Debido a la ergonomía conveniente del biorreactor de carbohidratos de escala X, elegimos utilizar
este sistema para el desarrollo de un proceso escalable para producir una vacuna recombinante
basada en el virus de la estomatitis vesicular (RVSV) para el virus Lassa (LASV). VSV es un virus de
ARN monocatenario de sentido negativo que causa una enfermedad autolimitada en varios
animales [8,9], y la infección en humanos produce un síndrome similar a la gripe leve o permanece
asintomático [9,10]. VSV es un virus envuelto en forma de bala de aproximadamente 70 nm a 200
nm [11].

Los transgenes extraños grandes se pueden empaquetar y expresar dentro de VSV, lo que hace
que este virus sea un candidato ideal como vacuna viral viva. Una serie de vectores que expresan
las glucoproteínas del virus del Ébola (EBOV), el virus de Marburg (MARV) y el LASV se han
construido previamente [12-16]. Sin embargo, la escala requerida para producir material puede
ser un factor limitante, especialmente cuando se utiliza una línea celular adherente como
productor. En este informe, demostramos el uso del biorreactor escala X de Univercells para
producir rVSVLASV (VSVDG / LASVGP). En comparación con la producción clásica de material
plano, la producción del biorreactor de carbohidratos a escala X dio como resultado un aumento
de 4 log en la producción de virus. Los datos del metabolito también se midieron; Las tendencias
de glutamina, amonio, glucosa y lactato fueron consistentes con el crecimiento celular normal en
el biorreactor antes de la infección por el virus. En conjunto, los datos demuestran que el
biorreactor de carbohidratos a escala X conduce a una mayor producción de virus por área de
superficie en comparación con la producción clásica de material plano, lo que afecta el número de
dosis que se pueden producir por campaña. En total, describimos un novedoso sistema de
biorreactor de lecho fijo escalable capaz de producir altos rendimientos de vacunas virales en una
huella ambiental baja.

2. MATERIAL Y MÉTODOS.

2.1. SISTEMA DE CULTIVO DE BIORREACTOR DE LECHO FIJO

El biorreactor Scale-X Carbo de 10 m2 (Univercells, Bruselas, Bélgica) y el módulo de filtración de

flujo tangencial en línea (TFF) se utilizaron para todos los experimentos (Fig. 1). El biorreactor se
inoculó a una densidad de siembra objetivo entre 1.0 y 2.0104 células / cm2 (según las
instrucciones del fabricante), y los parámetros del proceso durante la fase de expansión celular se
establecieron de acuerdo con los protocolos del fabricante. Los parámetros de cultivo se
definieron como temperatura entre 35 y 37 ° C, pH entre 7,0 y 7,6, la agitación se ajustó a 250
RPM, con un volumen de trabajo de 1,6 l. Se conectó un circuito de recirculación de medio
calentado externo al biorreactor para soportar la alta densidad celular. El volumen de medios
dentro del bucle fue lo suficientemente grande como para soportar una relación de medios a área
de superficie entre 0.2 y 0.4 mL / cm2. La tasa de recirculación soportaba 20-30 volúmenes de
biorreactor por día. Los colectores de tubería en el reactor tienen un diámetro interno mayor de ¼
”, excepto la línea de alimentación de base que tiene un diámetro interno de 1/800.

2.2. EXPANSIÓN CELULAR

Se cultivó una línea celular Vero (Ology Bioservices, Inc.) en un medio sin suero patentado (Ology
Bioservices Inc.). Las células se expandieron utilizando plantas planas y fábricas de células
(Corning, Tewksbury, MA) a una densidad de siembra entre 1,0 y 1,5 104 células / cm2. Los vasos
se cultivaron a 37 ° C, 5% de CO2. Las células se pasaron hasta que se logró una población de
aproximadamente 1.0–2.0 109 células viables totales. En la cosecha, las monocapas celulares se
lavaron con 1X de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco, DPBS, (Gibco, Waltham,
MA) para eliminar el exceso de medio gastado seguido de disociación con TrypLE CTS Select
(Gibco, Waltham, MA). La centrifugación se realizó para eliminar TrypLE, y las células se
resuspendieron en medio nuevo. Los recuentos celulares se realizaron en un analizador de
viabilidad celular Vi-CELLTM XR (Beckman Coulter, Brea, California).

2.3. MONITOREO DE DENSIDAD CELULAR Y ANÁLISIS DE METABOLITOS.

Las tiras de muestreo de un solo uso, insertadas en el lecho fijo, se retiraron diariamente para la
determinación de la densidad celular utilizando tampón de lisis y recuentos de núcleos. Las tiras
de muestreo se lisaron durante 5 minutos seguido de agitación vorticial durante 1 minuto. Los
núcleos se tiñeron con cristal violeta para visualizar núcleos intactos. Las concentraciones de
metabolitos se midieron diariamente usando el BioProfile FLEX2 (Nova Biomedical, Waltham, MA)
mediante la eliminación de muestras de medios del puerto de muestreo aséptico. Se realizó una
compensación de pH cuando las medidas fuera de línea se desviaron> ± 0.05 unidades de pH de la
lectura de la sonda en línea.

2.4. PROCESO DE INFECCIÓN

El virus de la estomatitis vesicular recombinante (rVSV) (menos la glucoproteína G) que contiene el

virus de Lassa (LASV) La glucoproteína Josiah (VSVDG / LASVGP) fue gentilmente proporcionada
por el NIAID bajo el Acuerdo de transferencia de material (LAB-18-P_LV-22 para uso in vitro
únicamente y solo para fines de capacitación e investigación). El stock VSVDG / LASVGP, título de
stock de 4,9 108 pfu / ml, se utilizó para todos los estudios de infección que utilizan el biorreactor.
La infección del biorreactor con inóculo de virus se realizó cinco días después de la siembra o
cuando se obtuvo la densidad celular máxima, evidente por el agotamiento de la fuente de
nitrógeno medido por glutamina. Brevemente, el biorreactor se drenó de los medios gastados y
luego se rellenó con medios nuevos que contienen el inóculo viral. El circuito de recirculación se
desconectó en el punto de infección, para realizar una infección en modo discontinuo. Cada
corrida se infectó con un MOI de 0.05, y el proceso de infección continuó durante 48-72 h. La
recolección se inició una vez que se agotaron los recuentos celulares en las tiras de muestra. La
infección de los vasos planos se produjo al mismo tiempo que el biorreactor, utilizando el mismo
inóculo de infección viral.

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Fig. 1. Biorreactor de carbohidratos Scale-X. Representación del sistema de carbohidratos scale-X

con un biorreactor de 30 m2 (rojo) ubicado en el centro del patín de control del biorreactor. Una
botella de cosecha de 5 L se encuentra en el lado derecho de la plataforma con el cartucho TFF en
línea ubicado detrás de la botella de cosecha. Ubicado en el lado izquierdo del patín de control, se
encuentra un panel de control que permite al usuario cebar y pausar las bombas del biorreactor.
Además, las botellas de inóculo y base se muestran a la izquierda del biorreactor. En los
experimentos descritos, se utilizaron los 10 m2, que tiene un tercio de la altura del biorreactor de
30 m2. El circuito de recirculación externo no se muestra.

2.5. COSECHA VIRAL

La recolección a granel se pasó a través de una cadena de filtración en profundidad de dos pasos,
Sartopure PP3 8 mm seguido de un filtro Sartopore 2 de 0.8 / 0.45 mm, y se recogió en un
depósito secundario. En la ejecución 4, después del vaciado inicial del recipiente, el biorreactor se
enjuagó con 1 litro adicional de medio nuevo para eliminar las partículas de virus residuales
contenidas dentro del lecho fijo. Este lavado se pasó a través de los filtros de profundidad, y se
inició el paso TFF para la concentración viral. La cosecha a granel se concentró 2 veces utilizando
un cartucho TFF de hallowfiber de 100 kDa. Los recipientes planos se cosecharon al mismo tiempo
que el biorreactor, y la cosecha a granel se aclaró mediante centrifugación a 1000 g durante 10
minutos.

2.6. ENSAYO DE PLACA

Muestras de la cosecha a granel recolectada para análisis de títulos virales a través de la

cuantificación del ensayo en placa usando métodos optimizados por Ology Bioservices, Inc.
Brevemente, se generó una serie de diluciones de 10 veces y se usó para infectar monocapas de
células Vero. La infección continuó durante 2 días y luego las placas se tiñeron con violeta cristal
durante 15 minutos, se lavaron y se contaron las placas.

3. RESULTADOS

3.1. CRECIMIENTO DE CÉLULAS VERO EN EL SISTEMA CARBOHIDRATO DE ESCALA X

El diseño único del sistema de carbohidratos scale-X permite el flujo de fluido dentro del lecho fijo
y el retorno a través de un canal centralizado interno al impulsor, creando un mecanismo continuo
de película descendente (Fig. 2). Este mecanismo de película descendente permite el intercambio
de gases dentro de la superposición del biorreactor. Se realizó una ejecución de establecimiento
de proceso (Ejecución 1) utilizando pautas y parámetros de proceso proporcionados por el
fabricante. Esta prueba determinó que la línea celular Vero crecería a densidades celulares
consistentes dentro del biorreactor de lecho fijo de 10 m2 (Tabla 1). Las ejecuciones posteriores se
diseñaron para establecer diversas condiciones operativas para lograr una densidad celular óptima
(Fig. 3). Como se demostró en la Fig. 4, se observó un crecimiento celular constante en todas las
pruebas desde el día 1 hasta el día 5 después de la inoculación celular (día 0). Durante la ejecución
3, se permitió que las células crecieran durante un día más para determinar si ese día adicional
condujo a un crecimiento significativo de células. Se concluyó que esperar hasta el día 6 para la
infección no condujo a una densidad celular general más alta que resultó en la producción de virus
maximizada. Por lo tanto, se concluyó que el crecimiento celular óptimo se produjo el día 5
después de la inoculación y que el día 5 sería el desencadenante de futuras corridas de producción
de virus que involucren a estas células Vero para la infección del virus.
 Fig.
2. Esquema del biorreactor de carbo. Se resalta la malla no tejida de doble capa (en azul) rodeada
por la matriz de malla tejida. Además, se muestra que las direcciones de flujo de fluido indican el
flujo de medios a través del biorreactor. Las sondas para el monitoreo de pH y OD en línea son
visibles en el medio del biorreactor.

Las células
se contaron recolectando la tira de muestreo, lisando las células unidas y contando los núcleos en
varios puntos de tiempo como se describe. Los recuentos celulares presentados son los promedios
de cuatro corridas distintas de biorreactores

3.2. TENDENCIAS METABÓLICAS

Durante la fase de crecimiento celular, se midió la actividad metabólica clave, incluido el consumo
de glutamina seguido de glucosa, y la posterior producción de amonio y lactato (Fig. 4). La
concentración de glutamina en la inoculación celular fue de 2.4 ± 0.2 mmol / L y se consumió por
debajo del rango lineal del ensayo. De manera similar, la concentración de glucosa fue de 17.57 ±
1.27 mmol / L en la inoculación y se consumió por debajo del rango lineal del ensayo. La
producción máxima de lactato observada fue de 16,71 mmol / L y la concentración máxima
observada de iones de amonio fue de 2,77 mmol / L.

3.3. PRODUCCIÓN DE VSVDG / LASVGP

Durante la primera campaña de producción de virus (Ejecución 1), la infección por VSVDG /
LASVGP se inició 5 días después de la inoculación posterior al biorreactor a una MOI de 0.05.
Después de la infección, se observaron restos celulares significativos en el sobrenadante dentro
del biorreactor 2 días después de la infección, lo que desencadenó la recolección del virus. El
biorreactor se drenó para recoger el sobrenadante que contiene el virus, y se realizó un paso de
enjuague de medios para eliminar cualquier virus residual del volumen de retención. Una vez que
se completó la recolección de VSVDG / LASVGP, el virus se tituló usando un ensayo de placa
estándar. Se calculó un título de 4.25 1012 pfu / mL, que corresponde a un título total de 6.80
1015 pfu por esta campaña y un título normalizado de 6.80 1010 pfu / cm2 (Tabla 2). Algunos de
los parámetros de producción de virus para las campañas 2 y 3 diferían de la campaña 1. Primero,
la cosecha del virus se realizó 3 días después de la infección, y segundo, la cosecha a granel se
filtró a través de una cadena de filtración en profundidad de 2 pasos para eliminar el exceso.
restos celulares antes de la recolección en el recipiente retenido. El virus insignificante fue
retenido por los filtros de profundidad después de la cosecha (datos no mostrados) y la
producción general de virus fue similar a la Campaña 1 para cada una de estas campañas. Los
títulos de virus a granel promedio de las campañas 2 y 3 fueron 5.03 1012 pfu / mL y 2.90 1012 pfu
/ mL, respectivamente, correlacionando con una cosecha normalizada de área de superficie de
7.55 1010 pfu / cm2 y 4.35 1010 pfu / cm2. No se calculó ninguna diferencia estadística de los
títulos entre estas dos corridas y entre las tres primeras campañas, en general. La campaña final
(Ejecución # 4) implicó el paso de filtración de flujo tangencial en línea (TFF) para la concentración
de virus después de que la cosecha a granel fue sometida a clarificación por filtración profunda. Un
esquema de la TFF en línea, el biorreactor y el reservorio retenido se muestra en la Fig. 5. Todos
los parámetros de inoculación celular e infección siguieron los procedimientos realizados en las
campañas 2 y 3. Sin embargo, después de la recolección del virus en masa, El material
sobrenadante se sometió a TFF para concentración. Este proceso TFF no se realizó en las
campañas anteriores. La adición del paso TFF permitió un lavado adicional del biorreactor para
recolectar cualquier virus residual que pudiera ubicarse dentro del lecho del biorreactor. La
cosecha viral se concentró de 1,6 L a 750 ml, y el título de la cosecha masiva se calculó en 1,03
1012 pfu / ml (Tabla 2). Después de completar la etapa de concentración de TFF, se tituló una
muestra del retenido a 2,47 1012 pfu / ml (Tabla 2). Este título está alineado con la etapa de
concentración 2x, y el exceso de virus podría estar asociado a la recuperación del virus del lecho
después del lavado o es el resultado de la variación natural asociada con el análisis de la placa. Por

último, cuando se compara con la producción en un matraz T-225 o CellSTACK-10, se observó un

aumento significativo en la cantidad de producción de virus cuando se utiliza el biorreactor de
escala X. Se observó un aumento de más de 4 registros de virus por ml, independientemente de
los parámetros asociados con cada ejecución de biorreactor independiente. Esto se correlaciona
con un aumento de 4 a 7 registros de virus por biorreactor cuando se compara con la producción
de CellSTACK-10 y T225. En general, los resultados de las pruebas de carbohidratos a escala X
confirman el uso de este biorreactor como un medio para producir, aclarar y concentrar virus
vivos.
Fig. 3. Cinética de crecimiento celular de campañas de biorreactores individuales. Los recuentos de
células se muestran hasta el momento de la infección del biorreactor. Las diferentes campañas se
indican de la siguiente manera: campaña 1 (), campaña 2 (), campaña 3 () y campaña 4 ().

Fig. 4. Tendencias de concentración de metabolitos para el crecimiento de células Vero en 10 L de

biorreactor de carbohidratos, por campaña. Los metabolitos, asociados con el crecimiento celular,
glutamina (A), amonio (B), glucosa (C) y lactato (D) se analizaron antes de la infección. Las
diferentes campañas se indican de la siguiente manera: campaña 1 (), campaña 2 (), campaña 3 () y
campaña 4 ().

Comparación de títulos virales como resultado de la producción de virus de diferentes vasos, así
como las campañas de biorreactores individuales. También se presenta el resultado de la
concentración viral en línea durante la ejecución 4.

4. DISCUSIÓN
Las tecnologías de uso único continúan siendo el estándar de oro en la fabricación de productos
biológicos con escalabilidad que limita el uso de sistemas de biorreactor de lecho fijo de células
adherentes. La línea de biorreactores scale-X abarca desde sistemas de sobremesa de 2,4 m2
hasta el sistema de escala comercial de 600 m2. El biorreactor de carbohidratos scale-X ha
demostrado ser una herramienta útil para cerrar la brecha de escalabilidad que se encuentra en
otros sistemas de biorreactores de lecho fijo. Sistemas similares no tienen las opciones de área de
superficie para escalas intermedias como 10 m2 o 30 m2. Esta escala es útil para generar material
para una amplia gama de usos, como lotes de toxicología preclínica, desarrollo de métodos
posteriores, métodos analíticos, generación de material de referencia y estudios clínicos de fase I.
Una limitación encontrada con otros sistemas de biorreactor de lecho fijo gira en torno a una
disminución en la eficiencia de la producción cuando ocurre el aumento a un diámetro de lecho
fijo más grande. La línea de carbohidratos scale-X aumenta la altura del lecho mientras mantiene
el diámetro para limitar el impacto de los procesos de escalado. Además, la matriz del lecho fijo es
otra característica única de este biorreactor que lo diferencia de otros sistemas de biorreactor de
lecho fijo. El lecho fijo consiste en cintas alternas de 5 cm2 de ancho de tela PET no tejida y una
capa de malla de polipropileno que se enrolla en espiral. El tejido PET proporciona un
microambiente tridimensional para la unión y el crecimiento celular; La malla de polipropileno
proporciona estructura y un canal para el flujo de fluido. El diseño en espiral del lecho fijo junto
con el aumento de la altura del biorreactor permite una distribución uniforme de células radiales y
verticales dentro del biorreactor, que puede controlarse mediante la recopilación de tiras de tela
PET insertadas en el lecho fijo a las que se puede acceder puertos de muestreo dentro de la tapa
del sistema de biorreactor. Estos ocho puertos de acceso se distribuyen uniformemente alrededor
de la tapa, y se caracterizan por un sistema de puerto de bloqueo que contiene una tapa
conectada magnéticamente a varillas de plástico que se conectan a las tiras de PET. El sistema de
tapa y varilla se extrae fácilmente del biorreactor y la capacidad magnética de la varilla y la tapa
permite una fácil extracción de la varilla de la tapa y el reemplazo de la tapa al puerto de acceso
mientras se mantienen prácticas asépticas. Las tiras se pueden quitar de la varilla, y las tiras de PET
se pueden usar para determinar el recuento celular por superficie después de la lisis de las células
y el recuento de núcleos. La ubicación de los puertos de acceso y la distribución de las tiras de PET
en todo el lecho fijo permiten determinar la densidad y distribución celular.

Además, la tecnología en espiral de malla de PET-polipropileno permite un suministro de

nutrientes homogéneo debido al patrón de flujo de medios a través de las capas de malla de
polipropileno del lecho fijo en espiral (Fig. 2). La velocidad de flujo de recirculación de medios se
ha configurado para lograr aproximadamente 25 cambios de medios por día. Los intercambios son
necesarios tanto para el suministro de nutrientes frescos como para la eliminación de metabolitos
tóxicos antes de su acumulación, y los resultados presentados demuestran un crecimiento celular
constante durante la etapa de expansión celular dentro del biorreactor. Se podrían realizar
intercambios adicionales si los requisitos metabólicos de las células determinaran la necesidad de
una mayor recirculación.

Por último, el biorreactor presenta un sistema de fibra hueca TFF en línea que permite la
purificación y concentración del producto viral de manera continua y aséptica. Para los procesos
de clarificación y para mitigar el ensuciamiento del sistema de fibra hueca debido a los desechos
celulares que fluyen del biorreactor durante la cosecha, se solda un tren de filtro de profundidad
al sistema de tubos que sale del biorreactor. Esto permite un paso de clarificación adicional y la
captura de restos celulares durante el proceso de purificación en línea. Esto es esencial cuando se
propagan virus que causan lisis celular dentro del biorreactor y se purifica el producto viral a
través del sistema TFF en línea.

Nuestro objetivo para esta campaña fue determinar primero si una línea celular Vero se
propagaría después de unirse al lecho de tela de PET de biorreactor y, en segundo lugar,
determinar cómo la producción de un candidato a vacuna viral dentro del biorreactor se compara
con la producción tradicional de material plano. Las densidades celulares dentro del biorreactor
fueron más altas que las densidades celulares máximas observadas en matraces T-225 o
recipientes CellSTACK-10 cuando se normalizaron los recuentos celulares en un área de superficie
igual. Esto se traduce en el potencial de una mayor productividad del virus simplemente debido a
la cantidad de células por área de superficie, y sin tener en cuenta la aptitud general de las células,
lo que podría conducir a una mayor producción de virus. Además, el perfil de metabolitos de las
células que crecen en el biorreactor fue consistente durante las cuatro corridas e indicativo de la
aptitud celular general. En cuanto a la producción de virus, es difícil comparar el título en función
del volumen de los vasos y el biorreactor, ya que se usa un volumen diferente para cada uno. Por
ejemplo, el volumen de la cosecha de un recipiente T-225 es de aproximadamente 60 a 65 ml,
mientras que el volumen cosechado de un carbohidrato CellSTACK-10 y scale-X es de
aproximadamente 1.5 L y 1.8 L, respectivamente. Como se indica en la Tabla 2, los títulos se
informan por volumen, además de la cosecha total. Sin embargo, para normalizar la producción
para comparación, los títulos se informan por área de superficie. Esto permite una comparación
más completa de la producción de virus en cada uno de los diferentes vasos y biorreactores. En
promedio, un T225 produjo 2,67 106 pfu / cm2, mientras que un CellSTACK-10 produjo
aproximadamente 5,77 108 pfu / cm2. El título promedio de las cuatro series distintas de
carbohidratos a escala X fue de aproximadamente 5.09 1010 pfu / cm2. Después de la
normalización por área de superficie, el biorreactor de carbohidratos a escala X produjo un
aumento de aproximadamente 2 registros de virus en comparación con CellSTACK-10 y más de 4
registros de virus en comparación con el T-225. Además, los títulos altos que resultan de la
producción de carbohidratos a escala X ocurren a través de un pequeño volumen de medios que
mide aproximadamente 1.6 L. Este pequeño volumen permite procedimientos aguas abajo menos
complicados asociados con la clarificación, purificación y concentración. La adición de los filtros de
profundidad para clarificación y el TFF en línea para purificación y concentración permite un
proceso continuo aséptico aguas abajo que resulta en la recolección de producto viral en el
depósito retenido. El proceso de purificación aguas abajo se asocia normalmente con cierto grado
de pérdida del producto viral. Sin embargo, el uso del sistema de concentración de fibra hueca TFF
en línea no pareció provocar la pérdida del producto viral. Esto puede explicarse mediante el
lavado del biorreactor durante la cosecha para eliminar cualquier virus residual que pueda haber
quedado atrapado dentro de la matriz de lecho fijo, la adición del filtro de profundidad para
aclarar los restos celulares y el tamaño adecuado de los filtros. El TFF en línea permite un paso de
lavado después de la cosecha del virus para recolectar cualquier virus residual ya que el TFF
permite una concentración de 2 a 3 veces, lo que niega el volumen adicional como resultado del
lavado. Por último, debido a los diversos tamaños de diferentes virus, debe mencionarse que los
filtros deben elegirse adecuadamente de acuerdo con el tamaño para evitar la pérdida del virus en
el filtro durante la purificación.
En conclusión, el aumento en la producción de vacunas virales probablemente se deba a múltiples
factores que se centran en el número de células por área de superficie y la aptitud general de las
células, lo que puede deberse a la geometría del lecho de fibra de PET que proporciona
uniformidad de densidad celular, atrapamiento y adhesión. Finalmente, estos factores conducen a
un suministro de nutrientes homogéneo de los medios que fluyen a través de la capa de malla de
polipropileno del lecho fijo. Este sistema aborda una necesidad crítica de producción de vacunas
de bajo costo y alto rendimiento y representa otro paso adelante para la producción a gran escala
de vacunas de virus vivos. En última instancia, el aumento de títulos por área de superficie puede
conducir a un aumento en el número de dosis por campaña.

Fig. 5. Esquema de la estrategia de purificación en línea. El biorreactor de carbohidratos scale-X

está conectado al cartucho TFF en línea y al contenedor de recolección. En algunos casos, se
agregó un tren de filtro de profundidad, no mostrado, los componentes de procesamiento aguas
abajo a la línea de salida del biorreactor antes de la botella de cosecha.