aislamiento de microorganismos

AISLAMIENTO BACTERIAS DEL SUELO

1. Objetivos

- Aislar diferentes tipos de microorganismos del suelo.

2. Introducción

El suelo es un ecosistema que contiene una gran variedad de poblaciones microbianas

cuyos miembros representan muchos tipos fisiológicos. Existen miles de millones de
microorganismos tales como bacterias y hongos por gramo de suelo, los cuales
dependen de diversos factores ambientales como son los nutrientes, humedad,
aireación, temperatura, pH, prácticas agrícolas, etc. La presencia de estos
microorganismos contribuye con la fertilidad del suelo, con la fijación de nitrógeno
atmosférico en compuestos disponibles para las plantas, con las descomposición y
mineralización de residuos orgánicos, de donde obtienen su fuente energética y
alimenticia, además, de ser útiles en aplicaciones ambientales e industriales. Por lo que
existe la necesidad de conocer, enumerar y aislar los grupos principales de las
comunidades microbiana en suelos.

El recuento de microorganismos del suelo puede realizarse por el método de

recuento en placa o NMP (número más probable), o usando la curva de
calibración MacFarland

3. Materiales y Reactivos

Materiales Reactivos y colorantes

Erlenmeyer con 90ml de agua destilada
Suelo
estéril
Cajas Petri con agar nutritivo (medio no
selectivo, se usa para el aislamiento y
Pipetas de 1 ml estériles recuento de microorganismos con escasos
requerimientos nutricionales), y agar PDA
(es utilizado para el cultivo de hongos)
Espátulas Tubos con 9 ml de agua destilada estéril
Gradillas
Pipeteadores
Beaker de 250 ml
Pinzas para tubos
Tamiz
Mecheros
Asas de Vidrio
Balanza
Incubadora
Plancha de Calentamiento

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4. Procedimiento

 Tamice la muestra de suelo, elimine las piedras y restos de vegetales

 En condiciones de asepsia (Mechero encendido) adicione 10 gr de suelo en el
erlenmeyer con 100 ml de agua destilada estéril, homogenice agitando durante
3 minutos.
 Tome 1 ml de la suspensión anterior y transfiéralo a un tubo con 9 ml de agua
destilada estéril. A partir de éste último tubo realice diluciones decimales entre
10-4 y 10-5 y agite los tubos en cada paso. Es decir, tome del tubo de ensayo 1
ml y adiciónelo a otro tubo de ensayo con 9 ml de agua destilada estéril, de este
último tome 1 ml y adiciónelo a otro tubo con 9 ml de agua estéril, y continuar las
diluciones hasta la 4 o 5 dilución. La figura muestra el procedimiento:

 Seleccione la cuarta dilución, tome 0.1 ml de las diluciones seleccionadas y

llévela a la superficie del medio de cultivo (realice este procedimiento por
duplicado)

 Extienda la alícuota en la superficie del agar con el asa de vidrio o metálica

previamente esterilizada

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 Incube las cajas con agar nutritivo a 37º C durante 72 horas

 Caracterice las colonias de acuerdo a la forma, tamaño, color etc. (figura 1)

Figura 1. Características macroscópicas de las colonias bacterianas.

 Después del periodo de incubación contar el número de colonias y reportar

como unidades formadoras de colonias (UFC)/ g de suelo seco.

 Guarde los medios de cultivo en la nevera después de realizar el recuento.

5. Cálculos

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a. Contar sólo aquellas cajas (diluciones) que contengan de 30 a 300 colonias.

b. Si el número es mayor que 300:

 Por cm cuadrado hay menos de 10 colonias. Contar 13 cuadrados
representativos (siete consecutivos horizontales y seis que forman
ángulos rectos). Multiplicar la suma de los 13 por 5.
 Por cm cuadrado hay más de 10 colonias. Contar 4 cuadrados
representativos, sacar el promedio y multiplicarlo por 65.si la caja petri es
de vidrio; si la caja petri es plástica multiplicar por 57
 Por cm cuadrado hay más de 100 colonias: Reportar como mayor que
6.500 veces la dilución correspondiente.

c. Si no hay colonias, se informa: NEGATIVO.

Con la siguiente ecuación calcular las UFC/g.

UFC/g = (NC * 1/FD * 1/ V) / (P)

Dónde:
UFC/ g = unidades formadoras de colonias/g de suelo
NC= número de colonias en una caja.
FD = factor de dilución que corresponde a la dilución de donde se tomó la
muestra con la que se inocula la caja (de 10-2 a 10-10).
V= volumen inoculado en la caja = 0.1 ml.
P = peso de la muestra húmeda = 10 g.
(Garcia et al., 2004)

Curva de calibración MacFarland

Esta curva de calibración se utiliza para cuantificar la densidad óptica

representada por el crecimiento microbiano.

Para la turbidez estándar de 0.5 de MacFarland, la absorbancia a una longitud

de onda de 625 nm está entre 0.08-0.1, y la suspensión agitada debe dar un
conteo de 108 UFC/mL

La escala de McFarland mide el número de unidades formadoras de colonias por

mililitro (UFC/ml) usando la siguiente tabla:

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La utilidad de la escala es poder realizar suspensiones bacterianas ajustadas a

un patrón, generalmente se suele usar el 0,5 Mc Farland, para esto se toma una
muestra de bacteria y la inoculamos en un tubo con solución salina, en el
momento en que se produzca un poco de turbidez ya estamos en el 0,5 (de forma
visual).

La finalidad, es establecer una relación entre una precipitación química y una

suspensión bacteriana. Se crean 10 estándares (en la tabla aparece la
composición de estos, entre 1 y 10) y por espectrofotometría, creamos una recta
patrón, de forma que vamos a poder detectar la concentración de nuestras
diluciones bacterianas (de manera aproximada, ya que depende de factores
como el tamaño de la bacteria, la formación de agregados). La escala se basa
en la capacidad de precipitación del cloruro de bario en presencia de ácido
sulfúrico.

Preparación escala Mac Farland y recuento de microorganismos por

turbidez

1. Añadir los volúmenes de BaCl2 a 0,048M (1,175% P/V BaCl2*2H2O) a los

volúmenes de H2SO4 al 0,18 M (0,36 N) (1% V/V). según se indicó en la tabla
anteriormente mencionada.
2. Se debe verificar la densidad correcta de cada estándar usando un
espectrofotómetro. Por ejemplo, el patrón McFarland 0,5 se prepara
adicionando 0,05ml de BaCl2 *2H2O a 9,95 ml de H2SO4 y la absorbancia a
625-600 nm debería ser 0,08 a 0,13
3. Para los demás tubos se debe leer según la siguiente tabla

Nº TUBO UFC ABSORBANCIA

0 0 0
0,5 1,5 · 108 0,074
3 9 · 108 0,846
5 15 · 108 1,040

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6 18 · 108 1,272

4. Homogenice para mantener en suspensión

5. Cuando estos estándares están en suspensión completa, la turbidez equivale
a un cultivo que contiene 1,5 x 108 bacterias/ml para el N° 0.5 hasta 3,0 x 109
bacterias/ml para el N° 10.
6. Los tubos que contienen la solución de McFarland se deben guardar en
ausencia de luz y a temperatura ambiente.

Cuantificación de los microorganismos mediante la curva McFarland

Se raspa la biomasa de cada plato, se la colocó en un tubo de vidrio estéril que contenía
10 ml de medio líquido (caldo nutritivo) YM (preparado con D-Glucosa Anhidra granular)
y se midió la absorbancia a 600 nm, utilizando medio líquido (medio nutritivo) YM como
blanco.
A partir de este valor de absorbancia se calculó la concentración inicial de
microorganismo mediante la ecuación de la curva McFarland.
Posteriormente se realizaron diluciones seriadas hasta 10 -8 y se sembró 1 ml de las
diluciones 10-6, 10-7 y 10-8 en medio líquido (caldo nutritivo) para adicionar al suelo

Determinación de microorganismos de suelo

 Materiales
- Cultivo bacteriano
- Espectrofotómetro
- Erlenmeyer
- Agar Plate Count
- Pipetas
- Tubos con 5 ml de caldo BHI
 Procedimiento
 Tome una colonia de la cepa a estudiar y dilúyala en 10 ml de (caldo BHI)
solución salina, incube por 24 horas.
 Tome 0.3 ml del medio anterior y adiciónelos a un erlenmeyer con 30 ml de caldo
BHI solución salina (Cultivo inicial).
 Tome 5 ml del medio anterior y colóquelos en una celda de espectrofotometría.
Mida la O.D (densidad óptica) y denomine este tiempo como tiempo cero. Las
mediciones se harán a una longitud de onda de 550-600 nm Este valor refleja un
parámetro proporcional a la concentración de masa celular (siguiendo la ley de
Lambert-Beer). El blanco es el medio de cultivo sin inocular.
 A partir del tiempo considerado como 0 se seguirán tomando muestras de 5 ml
cada 30 minutos del cultivo inicial el cual está en agitación a una temperatura de
37 ºC en las que se medirá la turbidez para reflejarlo con posterioridad en una
gráfica.
 Cada vez que mida la O.D deberá preparar 5 diluciones seriadas y sembrar 1 ml
de cada dilución en agar Plate Count, se debe repetir el anterior procedimiento
hasta que se obtengan 8 lecturas.
El medio de cultivo liquido es para bacterias, no tiene que ser ese, puede ser un caldo
nutritivo que incluso también lo podrías verificar con los hongos.

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Y el plate Count lo puedes reemplazar con agar nutritivo para bacterias y con PDA para
hongos

Ensayo con pesticidas

Los microorganismos fueron suspendidos en solución salina al 0.9% NaCl a la

concentración deseada de microorganismos
El suelo debe mantenerse con un 20% de humedad antes y durante el proceso de
análisis
Muestra con bacterias y pesticida + muestra con hongo y pesticida + muestra con hongo
y bacteria y pesticida + muestra con pesticida sin microorganismos (biorremediación
natural) + muestra sin pesticida y con bacterias + muestra con hongo y sin pesticida

Se toman muestra cada semana y se dejan 8 semanas para el análisis químico y

microbiológico

6. Referencias bibliográficas

- Standard methods for the examination of water and Wastewater 20th edition.
Washington D.C. 2000. EUA.

- Brock. Biología de los microorganismos. Editorial Pearson educación S.A.

10º edición. 2005.

- García, G. et al. 2004. Manual de Laboratorio Microbiología General. Ed.

Universidad de Antioquia.

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