2380 J. Agric. víveres Chem.

2008, 56, 2380–2387

Fermentación de ácido cítrico sumergido en

autohidrolito de cáscara de naranja
A
BEATRIZ RIVAS, AND ANA T ORRADOORRADO,Á PAOLO TORRE, ATTILIO
CONVERTI,
JDARE MANUEL DOM-NGUEZ*,
Departmento de Ingeniería Química, Universidad de Vigo (Campus Ourense), Edificio Politécnico, As
Lagoas, 32004 Ourense, Spain, and Department of Chemical and Process Engineering, Genoa
University, Via Opera Pia 15, 16145 Genoa, Italy

de naranja
La industria deprocesos cítricos genera en el área mediterránea enormes cantidades de cáscara
como subproducto de la extracción industrial de zumos cítricos. Para reducir su impacto ambiental, así
como para proporcionar un beneficio extra, este residuo fue investigado en este estudio como un
sustrato alternativo para la producción fermentativa de ácido cítrico. La cáscara de naranja contenía
16,9% de azúcares solubles, 9,21% de celulosa, 10,5% de hemicelulosa y 42,5% de pectina como
componentes más importantes. Para obtener soluciones ricas en azúcares solubles y almidonados
que se utilizaron como fuente de carbono para la fermentación de ácido cítrico, esta materia
prima fue sometida a la autohidrólisis, un proceso que no hace uso de ningún catalizador ácido. Los licores
obtenidos por este proceso en condiciones óptimas (temperatura de 130oC C y una relación
líquido/sólida de 8,0 g/g) contenían 38,2 g/L de azúcares libres (8,3 g/L de sacarosa, 13,7 g/L de glucosa y
16,2 g/L fructosa) y cantidades significativas de metales, particularmente Mg, Ca, Zn y Kn. Sin
nutrientes adicionales, estos licores fueron empleados para la producción de ácido cítrico por
Aspergillus niger CECT 2090 (ATCC 9142, NRRL 599). La adición de carbonato de calcio mejoró la
la
producción de ácido cítrico porque previno la acidificación progresiva del medio. Además, se investigó
influencia del additi de metanol en la formación de ácido cítrico. En las mejores condiciones
(40 ml de metanol/kg de medio), se garantizó una conversión efectiva de azúcares en ácido cítrico
(concentración máxima de ácido cítrico de 9,2 g/L, productividad volumétrica de 0,128 g/(L) h), y el
rendimiento del producto sobre azúcares consumidos de 0,53 g/g), demostrando así el potencial de
lospts de cáscara de naranja como materia prima alternativa para la fermentación de ácido
cítrico.

PALABRAS CLAVE: Piel de naranja; autohidrolisis; ácido cítrico; Aspergillus niger

Introducción
* Autor al que se debe dirigir la correspondencia [teléfono (+34)
La producción mundial de cítricos ha experimentado un 988 387 075; fax (+34) 988 387 001; correo electrónico
crecimiento continuo en las últimas décadas, Brasil, los países jmanuel@uvigo.es].
†
mediterráneos (particularmente España e Italia), Estados Universidad de Vigo (Campus Ourense).
• Universidad de
Génova.
Unidos y China son los principales países productores,
representando más de dos tercios de la producción mundial.
La FAO estimó una producción total de cítricos de más de
105 millones de toneladas al año en el período 2000-2004
(1). Las naranjas constituyen la mayor parte de la producción
de cítricos, representando más de la mitad de la producción
mundial en 2004 (2). Una gran parte de esta producción está
dirigida a la extracción industrial de jugo de cítricos, lo que
conduce a enormes cantidades de residuos, incluyendo la
cáscara y membranas segmentadas. La gestión de estos
desechos, que producen olor y contaminación del
suelo,reenvió un problema importante para las industrias
involucradas (3, 4). Se hicieron algunos intentos de utilizar
estos residuos como alimento para el ganado, aunque su bajo
valor nutricional sólo permitió limited
2380 J. Agric. víveres Chem. 2008, 56, 2380–2387
success (5). Other applications included the extraction of
pectin (6), the recovery of essential oils, the production of
clouding or thickening agents, and the removal and
purification of carotenoids to obtain natural pigments suitable
for food or juice coloring (7).
Este subproducto contiene también soluble y otros
carbohidratos insolubles, que lo convierten en una materia
prima potencial atractiva para productos de valor añadido,
por hidrólisis química o enzimática preliminar y posterior
conversión biológica. Los azúcares solubles contenidos en
la cáscara de naranja son glucosa, tose fructíficaysacarosa,
mientras que los polisacáridos insolubles de sus paredes
10.1021/jf073388r CCC: $40.75
Society Publicado en La Web 03/06/2008
celulares son básicamente celulosa, hemicelulosa y pectina. La
hemicelulosa se compone principalmente de unidades xilesas
unidas entre sí por §enlacesde -1,4, pero también puede
contener hexosas y ácidos azucarados (es decir, ácido
urónico), mientras que la pectina está constituida
principalmente por ácidos urónicos y otros azúcares como
la rhamnosa y la gactosa (8, 9).
La hidrólisis enzimática de este residuo con preparaciones
crudas com- mercialquecontienen pectinasas, celulasas, y
también hemicelulases, libera glucosa de celulosa, ácidos
urónicos de pectina, y arabinosa, rhamnosa, gatasa y xilosa de
pectina y hemicelulosa. Grandes cantidades de glucosa
 2008 American Chemical
SubmerGed Cítrico Ácido
Fermentación
y la fructosa entrenada en los tejidos de la cáscara también se
liberan junto con algunos compuestos inhibitorios,
× de partícula de 2 2 cm, Secado a los 40 años C a un contenido de
principalmente limoneno residual, que deben eliminarse antes
de que las fermentaciones puedan proceder (10). Sin embargo,
estas mezclas enzimáticas son bastante complejas y costosas
en este momento, porque más de una docena de actividades
enzimáticas individuales parecen ser necesarias para la
hidrólisis completa a los azúcares monoméricos. Además, el
borde de la estructura y la reticulación de los polisacáridos en
las paredes celulares sigue siendo incompleto, y hay
incertidumbre en la transferencia de información estructural de
un tejido vegetal a otro (8).
J. Agric. víveres Chem. Vol. 56, No. 7, 2008 2381
Materia prima. Muestras de naranja Valencia (Citrus sinensis) Pele
obtenidos de una planta nacional de procesamiento de cítricos se
molieron directamente, sin ningún pretratamiento anterior, a un tamaño
humedad de 0,07 g/g (aproximadamente 72 h), y Entonces se sometió a
una segunda etapa de fresado a un tamaño de partícula de <2 mm. Fue
homogeneizado en un solo lote para evitar diferencias de composición
y Almacenado En 4 C En a Frío Cámara Hasta Uso.
Caracterización de la materia prima. Las muestras de la
materia prima del lote homogeneizado se sometieron a la
determinación del contenido de nitrógeno, carbono, hidrógeno y
azufre mediante un analizador elemental flash modelo 1112 (Thermo
Finningan, San José, CA), mientras que

La hidrólisis con ácidos minerales diluidos (prehidrodílissis)

ofrecería una alternativa para solubilizar una gran fracción de
la cáscara de citrus, proporcionando un residuo insoluble
compuesto de celulosa y lignina y liberando pectina
solubilizada mezclada con mono- soluble y oligosacáridos de la
cáscara. Sin embargo, libera una variedad de productos de
degradación del azúcar como furfural e hidroxymethylfurfural
(HMF), compuestos derivados de la extracción, fenólicos de la
degradación de la lignina (lignina soluble en ácido), ácido
acético y ácidos urónicos (11). Los principales
inconvenientes de la prehidrolito son (a) la corrosión del
equipo causada por el ácido mineral,
(b) el cost de los reactivos (el ácido utilizado como
catalizador, así como el agente neutralizante), (c) la
manipulación de lodos neutralizantes,
(d) la posibilidad de que la lignina que permanece en fase
sólida se someta a reacciones de repomerización, limitando así
su potencial de utilización química adicional, y e) la
generación de compuestos que actúan como inhibidores de la
fermentación (12).
Alternativamente, la autohidrólisis en medios acuosos,
donde el agua y la materia prima son los únicos reactivos,
muestra varias ventajas para el fraccionamiento en
comparación con la prehidhidronólisis (13). Este
procedimiento asegura la despolimerización de la
hemicelulosa, por la acción catalítica de los iones de hidronio
principalmente a partir decompuestos de generación in
situ(como ácidos acéticos, urónicos y fenólicos), lo que
conduce a la liberación de oligosacáridos, azúcares libres y
ácido acético como los principales productos de reacción.
Las condiciones ligeramente ácidas utilizadas dan lugar a
licores con concentración reducida de índoles inhib,
enparticular los de ladescomposición del azúcar como el
furfural y el HMF (14). La fase sólida de la autohistílisis
contiene celulosa (que permanece prácticamente insolu-
bilized), lignina, hemicelulosas residuales y pectinas
residuales (9, 12).
Los licores de hidrólisis obtenidos después de este
tratamiento podrían utilizarse para hacer medios de
fermentación adecuados para una variedad de propósitos,
incluyendo la producción de ácido cítrico. El ácido cítrico es
ampliamente utilizado en la industria alimentaria, de bebidas,
farmacéutica y cosmética yd d encuentra aplicaciones en una
variedad de otras industrias, desde textiles hasta
galvanoplastia (15). Además, la producción de ácido cítrico
podría compensar los costes de eliminación de los desechos
(16). El presente estudio se llevó a cabo para investigar en
detalle lacomposición del pis de naranja con el fin de examinar
el efecto de las condiciones de autohidrocólisis en la
solubilización de azúcares, así como la idoneidad de los
licores resultantes para la producción de ácido cítrico.

MATERIALES Y MÉTODOS
SubmerGed Cítrico Ácido J. Agric. víveres Chem. Vol. 56, No. 7, 2008 2381
Fermentación 24 o 2 h, respectivamente. En el primer caso, se empleó la
oxígeno se calculó como diferencia con respecto al contenido de metodología Soxhlet anterior, mientras que en el segundo se realizó
cenizas. Todas las muestras fueron preparadas por triplicado. una extracción directa. Las fracciones extraídas se ensayaron para la
El contenido de proteínas se calculó multiplicando el contenido
materia seca mediante secado al horno a 105oC (método ISO
elemental N por el factor universal de 6.25.
638:1978), para diques monosacch yotros monómeros por HPLC,
El contenido de ceniza se determinó de acuerdo con la norma
ISO recomendada 936:1998 (17). Las cenizas fueron ensayadas para oligosacáridos como se describe más adelante, y para ácidos
para iones metálicos (Fe, Mn, Mg, K, Na, Ca, Cu, Zn, Al, Cr y Ni) urónicos utilizando el método de Blumenkrantz y Asboe-Hansen (20).
Los oligosacáridos (OS) se midieron según un método basado en la
por un espectrómetro de absorción atómica modelo 220 Fast posthidrólisis ácida de los licores. A efectos analíticos, las muestras
Sequential (Varian, Palo Alto, CA). Para este propósito, de licores fueron sometidas a posthidrólisis ácida (tratamiento con
0,15 g de cenizas se digería previamente con 5 ml de HNO3 65% ácido sulfúrico al 4% a 121oC durante 45 min), y los productos de
(p/p), 1,0 ml de H2O2 30% (p/p), y 0,5 ml de HF 40% (p/p) en un reacción se ensayaron de acuerdo con el mismo método HPLC que
microondas Labstation mls 1200 mega (Milestone, Bérgamo, Italia). para la determinación directa de caracteres monosac y otros
La fibra detergente neutra (NDF), la fibra detergente ácida (ADF) monómeros. El aumento de las concentraciones de monómeros
y la lignina detergente ácida (ADL) se determinaron de acuerdo causado por la posthidrólisis proporcionó una medida indirecta de la
con los métodos de Goering and van Soest (18) con el concentración del sistema operativo, expresada como sus
oligosacáridos respec- tive: glucooligosacáridos, fructooligosacáridos,
objetivo de obtener unaestimación aproximada del contenido
de celulosa, hemicelulosa y lignina.
Las pectinas se determinaron según el método de Tibensky et al.
(19). Este método incluye acidificación con ácido acético de
2,0 M a pH 4,0, precipitación con 1% de CuSO4,lavado
repetidodel precipitado con agua, disolución del pellet en
tampón de citrato de amoníaco de 1,5 M, pH 9,5, y
medición de absorción a 590 nm después de 30 min en
0,25% cupón (Merck, Darmstadt, Alemania). Las cantidades de
pectinas solubles se expresaron en porcentaje del contenido
total de pectina en la materia prima.
La grasa de las cáscaras de naranja nse extrajo por
percolación repetida conn-hexano bajo reflujo en un Soxhlet
(Selecta, Madrid, España). Las muestras secas (5,0 g) se colocaron
en un dedal de celulosa porosa situado en una cámara de
extracción, que se conectó a un matraz debajo que
contenía el disolvente (100 ml) y un condensador superior.
Después de calentar el matraz en un baño de aceite a 80oC, el
disolvente se evaporó, entró en el condensador, se condensó y
se engó en la cámara de extracción que contiene la muestra. Al final
de la extracción, que duró 24 h, el matraz que contenía el disolvente
y la grasa se se secó al horno a un peso constante a at 90oC.  La
grasa restante se midió por peso y se expresó en porcentaje de
la materia prima.
La cáscara de naranja y las pectinas extraídas se sometieron a
hidrólisis cuantitativa de ácido (QAH) de acuerdo con la
metodología estándar (método TAPPI T13m). Los licores de Q AH
se filtraron a través de mem- branes con un diámetro de poro de0,20
myse ensayaron para monosacáridos y otros monómeros por
cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) en un modelo
1100 (Agilent, Alto Palo, CA) equipado con un detector ri (como se
describe más adelante). Los polímeros de ácido urónico (UAP) en
las muestras líquidas se determinaron según el método de Blumen-
krantz y Asboe-Hansen (20), mientras que el residuo sólido de QAH
fue etiquetado como residuo insoluble (AIR).
Monosacáridos y otros monómeros presentes en los licorese
fueron ensayados para sacarosa, glucosa, fructosa, xilosa, manosa,
rhamnosa, gatasa, arabinosa, ácido acético, furfural y HMF. La
separación se logró utilizando una columna ION-300
(Transgenomic, San Jose, CA) empleando agua como fase móvil.
En los romatogramas HPLC, sacarosa
(S) se eluted primero, seguido de glucosa (G) y fructosa (F),
mientras que la xilosa (X), la manosa (Mn), y la ga gactosa (Ga) se
eluyen juntos en un tercer pico (etiquetado XMG), y arabinose
(A) y rhamnose (R) fueron eluidos juntos en un cuarto pico
(etiquetado AR).
Para obtener más información sobre los compuestos
sacárídicos de la cáscara de naranja, se extrajeron muestras
secas (5 o 9 g, según las necesidades) con 100 ml de etanol 96%
(v/v) o 90 ml de agua destilada, durante
2382 J. Agric. Food Chem., Vol. 56, No. 7, 2008 Rivas et al.
tanto, la determinación de metales mostró los contents más
xylooligosacáridos, mannooligosacáridos, galactooligosacáridos, altos(mg/kg) para K (8.297), Ca (5.457), Mg (827) y Na
arabinooligosacáridos y rhamnooligosacáridos (21). La fracción in (506). Todos estos metales suelen formar parte de los medios
soluble fue presentada a QAH, y los licores obtenidos fueron de cultivo recomendados para el cultivo de varios
ensayados para monosacáridos y otros monómeros por HPLC. microorganismos. Además, se demostró que otros metales
Los resultados permitieron determinar el contenido de polímeros de fundamentales estaban presentes en cantidades más pequeñas
glucosa [aquí etiquetado glucano (Gn), incluyendo celulosa, almidón (mg/kg): Zn, 4,95; Mn, 4.60; Fe, 15.1; Al < 105; Ni < 20;
y otras glucosas que contienen polisacáridos], polisacáridos de xilosa, Cu,
mannosa y/o gatasa (XMGn), polisacáridos de arabinosa y/o 6.00; Cr < 10. Estos elementos se consideran generalmente
rhamnosa (ARn) y grupos de acetil. fundamentales en varios procesos de fermentación diferentes.
El almidón se extrajo del residuo insoluble seco obtenido después Por ejemplo, en el campo de la producción de ácido láctico,
de la extracción de etanol según el método de Lafta y Zhou et al. (23)
Lorenzen (22). El residuo seco se rehidrató en agua, se calentó
durante 1 h a 90oC e incuba con una solución de
amilglucosidasa (10 unidades/ml, 20 mM de NaF, 100 mM de
tampón de acetato, pH 4,5) durante 48 h a 40oC, C, y la
glucosa liberada se determinó colorimétricamente en una reacción
acoplada a la glucosa oxidase.
Todos los porcentajes se refieren a una base sólida seca.
Tratamiento de la autohidrotlisis. Las cáscaras de
naranja fueron sometidas a autohidrólisis no térmica en un
reactor Parr 4842 de 600 ml (Parr Instruments, Moline, IL) en
diferentes condiciones de temperatura (en el rango de 100–200
oC),con unarelación de líquido/seco de 8,0 g/g. Después de la
autohistólisis, las fases sólida y líquida se separaron por filtración. La
fase líquida fue ensayada para monosacáridos y otros monómeros por
HPLC.
Condiciones de microorganismo y fermentación. Aspergillus
Níger CECT-2090 (ATCC 9142, NRRL 599), obtenida de la
Colección Española de Culturas de Tipo (Valencia, España), se utilizó
en este Trabajo. el Microorganismo Fue Crecido En Patata Dextrosa
Agar Inclinaciones (Scharlau, Barcelona, España) a los 33 años C
durante 5 días. × Suspensiones de esporas que contiene
aproximadamente 0,78–1,09 105 unidades formadoras de colonias
(CFU)/ml se prepararon añadiendo 3,0 ml de agua destilada estéril a la
inclinación y agitando vigorosamente durante 1 min, y posteriormente
se utilizaron como inóculo. Naranja Pele hidrolizado (40 g) se
dispensaba en 100 mL Frascos Erlenmeyer y autoclavados a 121 C
durante 20 min. Cada matraz fue inoculado con 0.4 Ml De el Espora
Inóculo Suspensión. En Seleccionado Experimentos carbonato de
calcio se añadió en exceso (20 g/L) para garantizar el neutralización
de todo el ácido cítrico producido, suponiendo una conversión de 1
mol de ácido cítrico/mol de azúcar. Se añadió metanol (0, 20, 40, 60 u
80 ml/kg) en experimentos seleccionados, y los frascos Fueron
incubado a los 30 años C en un agitador orbital (New Brunswick,
Edison, NJ) a 200 Rpm.
En los momentos de reacción dados, las muestras fueron
retiradas de los medios de fermentación, centrifugadas, filtradas
y analizadas por HPLC para determinar la glucosa, la fructosa, la
sacarosa y el ácido cítrico.
La concentración de esporas en las suspensiones se determinó
mediante un ensayo de formación de colonias (CFU). Para ello, se
realizaron diluciones en serie con 0,5% p/p de NaCl. Cien
microlitros de cada dilución se inocularon en triplicado en placas
(que contienen agar rosa dexttade patata) y se incubaron a 33oC
durante 2-4 días. La concentración celular se calculó a partir de
placas que tenían un número adecuado de colonias (30–300).
Todos los experimentos se realizaron por triplicado, y los medios
se indican en el texto. Los datos fueron tratados poranálisis anal de
varianza (ANOVA) utilizando el paquete de software estadístico
SPSS 14.0, y se evaluaron diferencias significativas mediante la
prueba de Tukey en p < 0.05.

RESULTADOS Y DISCUSIONES
Caracterización de Peel Naranja. La caracterización de la
cáscara de naranja comenzó con la determinación de su
composición elemental, que resultó ser la siguiente (wt
%): C, 45.1; N, 1.04; H, 5.95; S, 0,00; y O, 44.4. Mientras
 a la actividad invertasa. El residuo insoluble ácido (AIR)
Tabla 1. Composición de pieles de naranja después de la extracción con obtenido después de la posthidrólisis ácida del extracto de
etanol o W ater (Porcentaje sobre base seca) etanol, que repre- enviado 25,0 wt %, estaba compuesto de
ceras, grasas y aceites esenciales, entre otros. Además,
Etanol Agua
teniendo en cuenta que no había otros azúcares solubilizados
Rendi en el extracto de etanol, los polímeros de ácido urónico,
miento 0.25 0.45
extracti
glucano, XMGs y ARn tenían que formar parte de estructuras
vo más complejas insolubles en etanol, como celulosa,
(g/g) hemicelulosas y pectinas..
Por el contrario, la extracción con agua a 100oC durante
Glucosa 3.61 13.1
2 h fue capaz de solubilizar hasta 45,9 % de la cáscara
Sacarosa 30.1 11.4
Fructosa 8.52 16.2 de naranja. Una vez más, la fructosa, la sacarosa, la glucosa y
glucooligosacáridos 12.0 5.34 los glucooligosacáridos fueron los principales componentes de
polímeros de ácido urónico 0.11 11.8 esta fracción (46,0 %
AIRa 25.0 3.50 20,7 % de la cáscara inicial de naranja. Este valor fue
aproximadamente un 50% mayor que el obtenido por la
Composición de la Fracción extracción de etanol, que estratifica la mejor capacidad de
Insoluble Fraction extracción de agua. Además, lospolímeros de ácido uronic
rendimiento (g/g) 0.75 0.54 (UAP) representaron el 11,8 % del extracto soluble, de
Glucanos 18.0 16.9 pectinas solubles en agua. No se solubilizaron otros
XMGnb 11.7 11.5 componentes como XMGs o ARn. Este contenido de la UAP,
ARnc 9.89 6.46 que representó el 5,31 % de la materia prima
grupos acetil 1.20 1.00
ácido urónico 23.2 23.9
AIRa 2.95 9.68

un
residuo insoluble ácido. b Polisacáridos compuestos de xilosa,
manosa y/o or gactosa. c Polisacáridos compuestos de arabinosa y/o
rhamnose.

recomendó el uso de K, Mg, Zn, Cu, Fe y Mn para el cultivo

de Rhizopus oryzae ATCC 52311, mientras que Mercier et
al. (24)elaboraron un caldo de fermentación que contiene Na,
K, Mg, Mn y Fe para la fermentación por diferentes
cepas de Lactobacillus. Según Kubicek (25), los metales
esenciales para el crecimiento de A. níger son Fe, Zn, Cu,
Mn y Co, los niveles de la mayoría de ellos
sonfundamentales para aumentar los rendimientos de ácido
cítrico en caldos pobres. Tran et al. (16) informaron que la
suplementación de Fe2+ entre 1 y 10 ppm en el medio de
cultivo a base de residuos de piña en la fermentación de
estado sólido por A. níger aumentó la concentración de
ácido cítrico en un 22% en comparación con el control.
El siguiente esfuerzo para caracterizar la cáscara de
naranja se ocupaba de la solubilización con etanol o agua.
Este paso es importante porque los azúcares solubles en
cáscara de naranja pueden representar hasta 38-40 % en %
(26). La Tabla 1 muestra que la extracción con etanol fue
capaz de solubilizar el 25,0 % de la materia prima yel55,8 %
de esta fracción se constituyó por fructosa, sacarosa, glucosa
y glucooligosacáridos. Según Grohmann et al. (8), hay
unavariación considerable en el contenido de glucosa,
sacarosa y fructosa que sufren chan ge relativamente
rápidodurante lamaduración de la fruta, posiblemente debido
Sumergido Cítrico Ácido Fermentación J. Agric. víveres Chem. Vol. 56, No. 7, 2008 2383
fructosa debido a su inestabilidad en medio ácido, dando así un
Cuadro 2. Composición de Peel Naranja (Porcentaje sobre Base Seca) porcentaje final de fructan de cero. El contenido de residuos
ácidos insolubles (AIR) (9,66 wt %) fue similar a la constatada
compuesto %
por Grohmann et al. (8) (8,7 wt %); como se esperaba, es un
soluble sugars 16.9
valor bastante más alto en comparación con la lignina Klason
almidón 3,75 (0,84 wt %) según el análisis del detergente de fibra (Tabla2).
Fibra Esto se puede explicar teniendo en cuenta la presencia de
celulosa 9.21 otras sustancias que también tienen una tendencia a precipit
hemicelulosas 10,5 ateen medio ácido, como flavonoides y algunas ceras. El
lignina 0,84
pectinas 42,5 contenido de flavonoide de la
cenizas 3.50
grasas 1,95
proteína 6.50
otros compuestos 4.35

y 12,5 % en peso de la cantidad total de pectinas

(TablaTable 2),representaban la fracción de pectina de
metoxil alta o soluble alta. La Tabla 2 muestra la
composición global de la cáscara de naranja: azúcares
solubles, 16,9 wt %; almidón, 3,75 % en vista; fibra
(celulosa, 9,21 wt
%; hemicelulosas, 10,5 % wt; lignina 0,84 wt %; y
pectinas,
42,5 % wt %), cenizas, 3,50 % wt; grasas, 1,95 % en mic;;
y proteínas,
6,50 % en wt. La pequeña cantidad no cuantificada
(aproximadamente 4,35 wt %) probablemente incluían otras
sustancias de menor preocupación por este trabajo,
principalmente ácidos orgánicos como el cítrico, el malículo,
el malónico, und ácidos oxálicos que pueden representar
aproximadamente 1 wt % de la cáscara (27, 28), y
vitaminas como la vitamina C, porque la mayor parte del ácido
ascórbico de la fruta está en la cáscara y sólo alrededor
de un cuarto aparece en el jugo. De esta manera, fue posible
encontrar alrededor de 10–20 mg/kg en el albedo y 15–30
mg/kg en el flavedo. Estos componentes, aunque menores,
tienen un gran valor nutritivo para varios microorganismos, lo
que sugiere que la cáscara de naranja podría encontrar ungran
potencial enlos procesos biotecnológicos. Además, se detectó
un alto contenido en cenizas (3,50 % en punto, que son una
fuente de oligoelementos, y proteínas (6,50 % en punto).
Estos resultados son muy similares a los obtenidos por
Grohmann y otros (8), que found3,41 wt % de cenizas y 6,06
% de proteínas que trabajan con naranjas de Florida, y a los
reportados por Ma et al. (3), queencontraron 3,59 % de cenizas
y 5,25 % de proteínas en naranjas de Yucatán (México).
El contenido de grasa (extracto de hexano) de cáscara de
orange seca, compuesto principalmente de terpenoides,
aldehídos, cetonas y ésteres alifáticos, fue ligeramente
inferior (1,95 wt %) que el encontrado por otros autores
(3,1-4,9%) (29, 30). Entre ellos, es importante señalar el
limoneno, que se supone que representa aproximadamente el
95 % del total. Estos aceites se pueden recuperar fácilmente
mediante extracción con disolventes orgánicos apolares
como el hexano.
En este estudio, los componentes de comp más
importantes onents fueron los monosac- charides (glucosa o
fructosa), los disacáridos (incluida la sacarosa) y los
polisacáridos. Entre estos polímeros, es necesario destacar
la celulosa (9,21%), las hemicelulosas (10,5%) y las pectinas
(42,5%) que representaban las fracciones mayores.
Otro enfoque experimental, la hidrólisis cuantitativa del
ácido, permitió determinar la composición de carbohidratos
enumerada en la Tabla 3. Cabe destacar que la agresividad
del método condujo a ladegradación w ell-conocida de la
Sumergido Cítrico Ácido Fermentación J. Agric. víveres Chem. Vol. 56, No. 7, 2008 2383
respectivamente, y una disminución simultánea del nivel de
Cuadro 3. Composición de pieles de naranja y pectinas después de la sacarosa de hasta 8,3 g/L. Sobre este umbral de temperature,
hidrólisis cuantitativa del ácido (porcentaje sobre base seca) Basis) las concentraciones de glucosa yfructosa se mantuvieron casi
constantes, mientras que la de sacarosa disminuyó
compuesto de cáscara de naranja pectinasun progresivamente, probablemente debido a su hidrólisis
ácido urónico 20.5 47.8 catalizada por los ácidos liberados por la autohidronólisis. Cabe
polimérico destacar que, a alta temperatura, HMF y AR fueron liberados
Glucano 21.6 0.00
XMGnb 10.9 11.8 incluso a concentraciones muy bajas, pero probablemente se
ARnc 7.49 3.86 formaron otros subproductos de degradación no identificados.
fructan 0.00 0.00 Sin embargo, no se detectó furfural, producto de degradación
grupos acetil 0.94 1.30 de la xilosa, porque este azúcar no fue solubilizado.
AIRd 9.66 2.74
TUCe 28.9 32.4

a
Porcentajes referidos a la masa de peso seco de la fracción de
pectina.
b
Polisacáridos compuestos de xilosa, manosa y/o gactosa. c Polisacáridos
compuesto por arabinosa y/o rhamnose. d Residuos insolubles ácidos. e Total
de compuestos no identificados.
de hecho, la cáscara de naranja madura de Valencia se estimó
en alrededor de 2-4 wt % de sólidos secos (31).
Teniendo en cuenta que el porcentaje de pectinas es de 42,5
wt
% (cuadro 2) y el de UAP 20,5 % en el cuadro3), es
razonable deducir que las pectinas debenconitudirse no sólo
por ácidos urónicos, sino también por XMGn y ARn. Para
confirmar esta hipótesis, las pectinas secas extraídas fueron
analizadas por QAH, cuyos resultados también se enumeran
en el Cuadro 3..
Con respecto al alto valor del glucano (21,6 wt %)
(Cuadro 3), debe b e subrayó que era significativamente
mayor que el porcentaje de celulosa (9,21 wt %) cuantificado
según el método de determinación de la fibra (Tabla2). Esto
sugiere que es probable que la glucosa no sólo se libere de las
acciones de celulosa y almidón fr,sino también, en menor
medida, para formar parte de la hemicelulosa e incluso estar
presente en forma libre (como monómero o como parte de la
sacarosa libre).
Autohidrocólisis de piel de naranja. Es bien sabido que
la prehidronólisis ácida de lignocelulósica (32) libera
pentoses mainly de la fracción hemicelulósica, que sólo
apenas y lentamente puede ser utilizado como fuente de
carbono para la producción de ácido cítrico. Por esta
razón, la autohidrólisis con agua caliente ha sido
seleccionada en este trabajo para solubilizar principalmente
las hexosas simples (mono y disacáridos) contenidas en la
materia prima. La solubi- lización de azúcares por
autohidrólisis en un régimen no isotérmico es una
tecnología novedosa para el procesamiento de cáscara de
naranja. Para este tratamiento deben tenerse en cuenta dos
variables principales: la relación líquido/sólido (fijada en 8,0
g/g) y la temperatura máxima del tratamiento (100–200oC).
C).
La Figura 1 muestra la composición en azúcares
fermentables de licores obtenidos cuando la cáscara de
naranja se sometió a autohigi- drolisis en condiciones
variables. El análisis de ANOVA de los datos que reflejan
la concentración total de azúcares en los autohidrolitos
confirmó la importancia del efecto ejercido por la
temperatura de funcionamiento sobre la solubilización de la
sacarosa, lacebaosa, la fructosa y la arabinosa (véase el
cuadro 4). Un aumento de la temperatura de 100 a 130oC
indujo unaumento significativo (p ) 0,016 según la
prueba t) en la concentración global de azúcares
solubilizados hasta 38,2 g/L, como resultado del aumento de
los niveles de glucosa y fructosa de hasta 13,7 y 16,2 g/L,
2384 J. Agric. víveres Chem. Vol. 56, No. 7, 2008 Rivas Y al.

K 806 800

Figura 1. Composición de licores obtenidos

por autohidrólisis de cáscara
de naranja. Los resultados representan el promedio de tres Teniendo en cuenta estos resultados y las diferencias
experimentos independientes. Las desviaciones estándar estaban significativas entre los medios de solubilización total de
por debajo del 2,1% de la media. azúcares según la prueba de Tukey(Tabla 4),los licores de
cáscara de naranja obtenidos por autohidronólisis a 130oC
Cuadro 4. Concentración (Grams por litro) de los Azúcares utilizando una relación líquido/sólido de 8,0 g/g fueron
Solubilizados Totales en los Licores Obtenidos después de La selected como medio de cultivo para llevar a cabo la
Autohidrolisis de Pieles de Naranja a Diferentes Temperaturas de producción biotecnológica- lógica de ácido cítrico. Para
Operacióna caracterizar el caldo, se determinaron composiciones
metálicas de hidrolizado crudos y centrifugados (Tabla 5).
T azúcares totales
(c) solubilizados Una vez más, K, Ca, Mg y Na estuvieron presentes en los
C) levels más altos, y no se observó ninguna diferencia
10 29.60a significativa entre hidrolizado centrifugados o no. Las
0 concentraciones detectadas para estos metales (porcentajes de
11 31.59ab
0 solubilizaciones de 54,3% Mg, 22,5% Ca, 77,4% K, 100%
12 35.90bc Zn y 100% Na),
0
13 38.21c
0
14 36.32bc
0
15 35.68bc
0
16 34.91bc
0
17 33.81abc
0
18 33.44abc
0
19 32.51ab
0
20 32.34ab
0
una
letra diferente diferencias estadísticamente
indica significativas en p
< 0.05 según la prueba de Tukey.

Cuadro 5. Composición de metales (miligramos por kilogramo) en licor

de autohidrolizado de cáscara de naranja Liquor
hidrolizadosincentrifugado centrifuged hidrolizado
hidrolizado
Mg 55.5 5
6.
8
acerca 152 155
de
Zn 0.59 0.85
Mn <1.00 <1.00
En 77.4 5
5.
7
Fe <3.00 <3.00
Al <25.0 <25.0
Ni <5.00 <5.00
Cu <1.50 <1.50
Cr <2.50 <2.50
2384 J. Agric. víveres Chem. Vol. 56, No. 7, 2008 Rivas Y al.
Figure 2. Sugar consumption and citric acid production versus time during
citric acid fermentation of orange peel autohydrolysate liquors by Aspergillus
niger. Results represent the average of three independent experiments.
Standard deviations were below 2.4% of the mean.

aunque inferior a los encontrados en la cáscara de naranja

cruda, seguía siendo significativo y adecuado para un medio
para ser utilizado en fermentaciones posteriores.
Fermentación de ácido cítrico de autohidrolito de cáscara
de naranja. El medio utilizado a lo largo de este estudio,
obtenido por autohigi- drolisis de cáscara de naranja a 130oC,
conteníauna concentración total de azúcares de 38,2 g/L
con una relación glucosa/fructosa/sacarosa de 1,0:1.2:0.61.
Este caldo prácticamente carecía de furfural y HMF y
contained sólo 0,63 g/L de ácido acético; es decir, tenía un
contenido muy bajo de los tres principales inhibidores del
proceso de fermentación (14). Teniendo en cuenta un
proceso industrial, se evaluó la idoneidad de A. níger
CECT 2090 (ATCC 9142, NRRL 599) para fermentar
azúcares al ácido cítrico. Este microorganismo ya fue
empleado con éxito por Aravantinos-Zafiris et al. (7) para la
fermentación del ácido cítrico de los desechos de
procesamiento de naranja.
Figura 2 muestra el comportamiento en comparación con
el tiempo de consumo de azúcar, la producción de ácido
cítrico y la variación del pH, utilizando licores obtenidos Por
autohidrolisis Y Un Inicial Biomasa concentración de 1,09 ×
103 CFU/mL. La sacarosa fue el primer azúcar en Ser
consumido, seguido de glucosa y fructosa, thus confirmando
el comportamiento observado por Hossain et al. (33) en caldo
sintético que contenga una mezcla de estos azúcares. Desde el
principio De fermentación, este consumo se dirigió a el
Producción De Cítrico Ácido ese Alcanzado a Máximo
concentración de sólo 4,9 g/L después de 4 días, y no menos
de 14 g/L de azúcares permanecieron en el medio después de
este tiempo. La acumulación de ácido cítrico redujo el pH a
3,5, detuvo su formación posterior y luego desapareció
progresivamente. Azúcares, por completo después de 9 días,
probablemente estaban destinados tanto al crecimiento
microbiano como a la respiración. En estas condiciones, el
máximo volu- la productividad métrica y el rendimiento del
producto fueron de sólo 0,051 g/L · H y 0,47 g/g,
Respectivamente.
Influencia de CaCO3 como agente de Neutralizing en la
Fermentación de ácidocítrico. Varios autores investigaron la
influencia del pH en la producción de ácido cítrico. Xu et al.
(34) reportaron un valor óptimo de 4-5, mientras que otros
investigadores sugirieron un rango de 5–6 (33). Aravantinos-
Zafiris et otros (7) observaron un aumento dramático en la
acumulación de ácido cítrico cuando el pH se incrementó de 3
a 4 y un óptimo en el rango de pH 4-6. Teniendo en cuenta que
la producción de ácido cítrico puede aumentar
considerablemente la acidez del caldo de fermentación,
limitando en consecuencia la capacidad del microorganismo
para fermentar todos los azúcares, se realizó una fermentación
por lotes en las mismas condiciones que el anterior pero en
presencia de CaCO3 en el caldo de fermentación para
neutralizar el ácido cítrico liberado. Este
Sumergido Cítrico Ácido Fermentación J. Agric. víveres Chem. Vol. 56, No. 7, 2008 2385

Figura 3. Sugar Consumo de azúcar y producción de ácido cítrico En todos los casos, la producción de ácido cítrico aumentó a
frente al tiempo durante la fermentación de ácido cítrico de los licores de un umbral máximo, más allá del cual disminuyó
progresivamente tan pronto como se consumieron
autohidrolizado de cáscara de naranja por A. en presencia de
prácticamente todos los azúcares. Una vez más, la sacarosa fue
CaCO3. Los resultados representan el promedio de tres
el primer azúcar en ser completamente metabolizado,
experimentos independientes. Las desviaciones estándar seguido de glucosa y fructosa. Es necesario destacar que la
estaban por debajo del 2,4% de la media. sacarosa se consumió por completo en todos los casos, pero
la tasa de consum-
técnica ya fue utilizada con éxito por otros autores para
neutralizar el ácido láctico generado por diferentes cepas de
Lactobacillus (35, 36).
Como era de esperar, el pH de la fermentación se mantuvo
constante alrededor de 6. En este caso, el consumo de
azúcares siguió una tendencia similar, pero la concentración
de ácido cítrico alcanzó 8,3 g/L después de 4 días, mientras
que 11,3 g/L de azúcares residuales permanecieron en el
medio (Figura 3). Durante los siguientes 2 días, la
concentración de ácido cítrico creció sólo ligeramente,
logrando un máximo de value de 8,5 g/L, mientras que el nivel
de azúcar no consumo disminuyó a 2,7 g/L, probablemente
debido al alto crecimiento de la biomasa. Después, el ácido
cítrico se consumió muy rápidamente como fuente de carbono
debido a la falta de carbohidratos en el medio. En estas
condiciones, la productividad volumétrica máxima aumentó
a 0,086 g/(L? h) y el rendimiento del producto a 0,57 g/g.
Estos resultados demuestran que CaCO3 es necesario para
mantener un pH adecuado en el caldo de fermentación.
Influencia de la adición de metanol en el ácido cítrico
Fermenta- tion. Como es bien sabido, el metanol es capaz de
aumentar el rendimiento de la producción de ácido cítrico por
A. cepas de níger (7, 37, 38), siendo la necesidad de
establecer su concentración según las condiciones. Las
bajas concentraciones de metanol suelen ser necesarias para
eliminar el efecto adverso de los trazas de metales, mientras
que las altas concentraciones se utilizan para materiales
altamente contaminados. Sin embargo, se demostró que la
adición de exceso de alcohol era inhibitorio cuando se añadió
a los caldos de synthetic (39). A. niger no asimila el metanol,
y, aunque todavía no se conoce su papel exacto en la
estimulación de la producción de ácido cítrico, se cree que el
metanol aumenta la permeabilidad de la membrana celular
del microorganismo, facilitando así la excreción de ácido
cítrico (40).
Figura 4 muestra los perfiles de tiempo del consumo de
azúcar Y Cítrico Ácido Producido Usando Licores Obtenido
De autohidronólisis de cáscara de naranja complementada con
carbonato de calcio Y metanol en el rango de concentración de
0 a 80 ml/kg. todo las fermentaciones se llevaron a cabo con
una concen- ration inicial
× de 0,78–0,81 103 CFU/ml y después
de la adaptación de thY Microorganismo En precultivaciones
En mismo medio que contiene Metanol.
Sumergido Cítrico Ácido Fermentación J. Agric. víveres Chem. Vol. 56, No. 7, 2008 2385

Figura 4. Efecto de la adición de metanol en la producción de ácido

cítrico de los licores de autohidrolito de cáscara de aceite por A. en
presencia de CaCO3. Concentraciones de metanol: (A) 0 mL/kg; (B)
20 mL/kg; (C) 40 mL/kg; (D)
60 mL/kg; (E) 80 mL/kg. Los resultados representan el promedio de
tres experimentos independientes. Las desviaciones estándar
estaban por debajo del 2,1% de la media.
ción aumentó con el aumento de la concentración de metanol
hasta 40 ml/kg y disminuyó más allá de este umbral. Por
otro lado, parte de la glucosa y la fructosa permanecieron sin
ser consumidas cuando se llevaron a cabo experimentos con
60 y 80 ml/kg de metanol,
2386 J. Agric. víveres Chem. Vol. 56, No. 7, 2008 Rivas Y al.

Table 6. Effect of Methanol Addition on Citric Acid Production from Orange Peel Autohydrolysate Liquors by Aspergillus niger in the Presence of CaCO3
a
metanol (mL/kg) t (días) ácido cítrico máximo b (g/L) glucosa (g/L) azúcares residuales (g/L) c
(g/L) consumidos azúcares (g/L) Y d
(g/g) Q e
[g/(L- h)]
P/S P

0 4 7.7a 4.2 4.0 8.2 20.4 0.38 0.080

2 3 7.4a 5.6 6.1 11.6 18.5 0.40 0.103
0
4 3 9.2b 4.1 8.3 12.4 17.4 0.53 0.128
0
6 4 7.7a 5.9 8.0 13.9 14.7 0.52 0.080
0
8 4 7.5a 5.4 6.4 11.8 16.4 0.45 0.078
0
un
tiempo de máxima concentración de ácido Las letras indican diferencias estadísticamente significativas en p < 0.05
cítrico. b
según la
prueba de Tukey. Sacarosa se consumió completamente en todas las carreras. d Rendimiento de ácido cítrico en azúcares consumidos. e
c

Productividad volumétrica del ácido cítrico calculada en el momento t.

lo que demuestra claramente que las altas concentraciones de 0,63 g/g].

este alcohol inhibió la fermentación. Por último, a pesar de las concentraciones relativamente
La Tabla 6 resume los principales resultados y los bajas de ácido cítrico logradas en este trabajo debido a la
parámetros cinéticos y de rendimiento de estas fermentaciones. baja concentración inicial de azúcares, los rendimientos son
Los valores más altos de concentración de ácido cítrico (9,2 comparables o incluso superiores a los obtenidos para la
g/L), el rendimiento del producto sobre los azúcares producción comercial de ácido cítrico sumergido utilizando
consumidos (YP/S ) 0,53 g/g) y la productividad ([QP ) otras materias primas como hidrocarburos, almidón y melaza
0,128 g/(L ) h)] se lograron en 3 días en presencia de metanol (45). Estos autores informaron de una concentración de
de 40 ml/kg. Por lo general, se requiere menos metanol para ácido cítrico de 27 g/L con un rendimiento del 45%,
estimular la liberación de ácido cítrico en las fermentaciones utilizando hemicelulosa de madera y
de estado sólido. (16), utilizando residuos de piña y A. Niger A. Niger IMI-41874; mientras tanto, Adham (46) alcanzó una
ACM 4992 (ATCC 9142), obtuvo de hecho el mayor concentración máxima de 8,6 g/L (9,8% de conversión)
rendimiento de ácido cítrico (YP/S ) 0,74 g de ácido cítrico/g
utilizando melaza de remolacha y A. niger A20.
de azúcar consumido) utilizando sólo 30 ml/kg de metanol.
Hang et al. (37) reportó una concentración óptima de Conclusiones. La cáscara de naranja es un residuo industrial
metanol de sólo 20 ml/kg kg en la fermentación en estado de gran volumen que se infrautiliza como alimento para
sólido de la cáscara de kiwi por A. Níger ATCC 9142, animales o incluso se elimina,
obteniendo 82 g/L de ácido cítrico después de 5 días a partir
de 168 g/L de azúcares iniciales [QP ) 0,683 g/(L ? h);
YP/S ) 0,60 g/g). Resultados similares fueron reportados por
Zhang (41) para el residuo sólido de una fábrica de jugo de
naranja y por Kang et al. (42) para la cáscarade mandarina.
peel. En este último caso, se utilizó un cultivo semisólido en
presencia también de 0,2% de HNO3 y 0,1% de MgSO4
7H2O (p/p). Flores et al. (43) observaron la producción
máxima de ácido cítrico por A. niger [380 g de ácido cítrico
monohidrato/kg de piel seca; QP ) 0,539 g/(L) · h); YP/S
) 0,68 g/g] en fermentación en estado sólido de cáscara de
pera espinosa (5 días a 30oC y 86% de humidificación),
aunque necesitaban un inóculo de no menos de 175 g de
biomasa/kg de piel seca. Sin embargo, de Lima et al. (44),
utilizando A. níger ATCC 1015 y pineapple residuos en la
fermentación de estado sólido, logró la mayor producción de
ácido cítrico mediante la adición de 40 mL/kg de metanol
como en el presente trabajo, obteniendo 132 g/kg después de 6
días.
taking Estos resultados pueden considerarse bastante
prometedores
a) el alto impacto ambiental y la enorme producción de
este residuo que necesita eliminación o reciclaje, b) su
contenido medio de azúcar relativamente bajo (S0 ) 25,5
g/L), y
(c) el hecho de que las fermentaciones eran sólo
preliminares, necesitando
una optimización rigurosa de las condiciones. Sin
embargo, se comparan con los resultados reportados
por Aravantinos-Zafiris et al. (7) para la fermentación de
ácido cítrico a partir de desechos de procesamiento de
naranja que tienen casi el doble de contenido de azúcar
(S0 ) 55 g/L), utilizando la misma cepa de hongos y
la misma concentración de metanol [concentración de
ácido cítrico) 30 g/L, QP ) 0,104 g/(L ) h) y YP/S
)
2386 J. Agric. víveres Chem. Vol. 56, No. 7, 2008 Rivas Y al.
causing serious environmental problems. The composition
analysis revealed that soluble sugars, cellulose, and pectins
are the most outstanding fractions, but proteins and metals
play also an important role. A treatment of autohydrolysis at
130 C and liquid/solid ratio of 8.0 g/g, a novel technology
for this material, had a beneficial effect on its hydrolysis,
producing liquors rich in soluble sugars, mainly sucrose,
glucose, and fructose, which could be utilized for citric acid
production by A. niger.
La fuerte disminución del pH en el caldo de
fermentación consecuente a la liberación de ácido cítrico
limitó su fermentabilidad, haciendo necesaria la adición de
carbonato de calcio para neutralizar el producto. Además, el
aumento de la concentración de metanol a 40 ml/kg
enhanced la producción de ácido cítrico a partir de cáscara
de naranja, pero niveles más altos ejerció un efecto
inhibitorio. Los datos experimentales presentados en
este estudio mostraron que la fermentación del
autohidrolito de cáscara de naranja por A. níger no requirió
ninguna flexibilidad de nutrientes adicionales y que, en
presencia de CaCO3 y 40 ml/kg de metanol, los azúcares se
consumían cuantitativamente y se producía ácido cítrico con
rendimiento prometedor, mostrando así la viabilidad de la
prodde ácido cítrico de estos residuos industriales.
La investigación futura se dedicará a la optimización de
este proceso.

LITERATURA CITADA

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Sumergido Cítrico Ácido Fermentación J. Agric. víveres Chem. Vol. 56, No. 7, 2008 2387
Received for review
November 20, 2007. Revised
manuscript received January
18, 2008. Accepted January
21, 2008. We are grateful to
the Xunta de Galicia (DOGA:
13/12/2006) for the financial
support of this work and to
the “Isidro Parga Pondal”
program.

JF073388R