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Trabajo Práctico 6
Cromatografía en columna
Tamiz molecular
Facultad de Ciencias
Exactas y Naturales
Universidad de Buenos Aires
Balbuena, J. M.; Watanabe, B.
Objetivos
Objetivos
Introducción
Las mallas del gel permiten la entrada selectiva de las partículas de menor masa
molecular. De ahí que las partículas de mayor peso molecular salgan primero.
Vt Vt-Vo Vo
Figura 3. Representación grafica de Vo, Vt-Vo y Vt.
Estos volúmenes son parámetros de la columna de gel y por lo tanto deben ser
conocidos para una correcta utilización de la técnica. Para ello, se calibra la columna de la
siguiente manera:
APLICACIONES
A) Cambios de buffers. Después de cromatografías de intercambio iónico, afinidad o de
interacción hidrofóbica.
B) Desalado. Proteínas, polisacáridos, polipéptidos etc. Pueden ser desalados antes de
ser concentrados o liofilizados.
C) Eliminación de fenol de las preparaciones de ácidos nucléicos.
D) Eliminación de compuestos de bajo peso molecular marcados. I125, FITC de las
soluciones de marcaje de proteínas.
E) Para reacciones entre macromoléculas y reactivos de bajo peso molecular.
F) Eliminación de productos, cofactores, inhibidores, etc. De las enzimas.
G) Purificación de macromoléculas.
H) Determinación del peso molecular de las proteínas.
Reactivos
Blue-Dextran
Solución buffer fosfato de sodio 50 mM
Solución de cloruro de cobalto (II) CoCl2
Solución de cloruro de bario BaCl
Reactivo de Bradford
Materiales
Columna de cromatografía
Caja de cristalización
Material común de laboratorio
Procedimiento
Determinación de parámetros de la columna
0,6
Intensidad del color unidades arbitratias
0,4
0,2
0,0
0 2 4 6 8
volumen de eluyente (ml)
A partir del perfil de elución obtenido pueden determinarse los parámetros Vt = 5.4 mL
y Vo = 2.9 mL.
0,6
Intensidad del color unidades arbitratias
0,4
0,2
0,0
0 2 4
volumen de eluyente (ml)
Figura 5. Perfil de elución de la mezcla ALA-D – (NH4)2SO4. El pico corresponde a las fracciones que
dieron positivo con el método de Bradford, mientras que se omitió el pico de la sal ya que este dio
positivo en todas las fracciones.
Discusión y conclusiones
La guía indica utilizar BaCl2 para detectar los sulfatos del (NH4)2SO4 como BaSO4,
precipitado blanco. En la práctica, esto no fue posible dado que todas las fracciones
colectadas presentaban una turbidez blanca con el agregado de BaCl2. Frente a este hecho,
se probó agregar bario a la solución buffer. Esta solución también formó el precipitado por lo
que se dedujo que los fosfatos (y/o sus ácidos conjugados) forman un compuesto blanco e
insoluble.
La separación de ALA-D y (NH4)2SO4 no pudo ser observada. Sin embargo, los resultados
para Blue-Dextran y CoCl2 indicarían que el proceso fue posible y que la fracción obtenida ha
sido purificada de la sal empleada durante la precipitación.
Bibliografía