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se/std-909353

ESTÁNDAR ISO
INTERNACIONAL 11348-2

Segunda edicion
2007-12-01

Calidad del agua - Determinación del efecto inhibitorio

de las muestras de agua sobre la emisión de luz de Vibrio
fischeri
(Prueba de bacterias luminiscentes) -

Parte 2:
Método utilizando bacterias secas líquidas

Qualité de l'eau - Determinación de l'effet inhibiteur d'échantillons d'eau sur la luminescence

de Vibrio fischeri Essai de bactéries luminescentes) -

Parte 2: Método utilizado para las baterías deshidratadas

Número de referencia ISO

11348-2: 2007 (E)

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ISO 11348-2: 2007 (E)

Contenido Página

Prefacio................................................. .................................................. .................................................. ....... iv Introducción .........................................

.................................................. .................................................. ........... v 1

Alcance ................................................. .................................................. .................................................. 1

2 Referencias normativas ................................................ .................................................. ......................... 1

3 Principio................................................. .................................................. .............................................. 2

44 Interferencias ................................................. .................................................. ...................................... 2

55 Reactivos y materiales ............................................... .................................................. ...................... 2

66 Aparato ................................................. .................................................. ........................................... 3

77 Muestreo y pretratamiento de muestras .............................................. .................................................. .... 4

8 Procedimiento ................................................. .................................................. ........................................... 4

99 Evaluación................................................. .................................................. ........................................... 6

10 Expresión de resultados ............................................... .................................................. .......................... 8

11 Criterios de validez ............................................... .................................................. ............................... 10

12 Precisión................................................. .................................................. ........................................... 10

13 Informe de prueba ................................................ .................................................. ......................................... 10

Anexo A ( informativo) Método de corrección de color .............................................. ........................................... 11

Anexo B informativo) Nivel de dilución D - Preparación de la serie de dilución ......................................... ...... 14

Anexo C ( informativo) Datos de precisión ................................................ .................................................. ........... 17

Anexo D ( informativo) Prueba de muestras de agua salada con la prueba de bacterias luminiscentes con
bacterias secas líquidas .............................................. .................................................. ............................ 18

Bibliografía ................................................. .................................................. .................................................. 21

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ISO 11348-2: 2007 (E)

Prefacio

ISO (Organización Internacional de Normalización) es una federación mundial de organismos nacionales de normalización (organismos miembros de ISO). El trabajo de

preparación de normas internacionales se lleva a cabo normalmente a través de comités técnicos de ISO. Cada organismo miembro interesado en un tema para el cual se ha

establecido un comité técnico tiene derecho a estar representado en ese comité. Las organizaciones internacionales, gubernamentales y no gubernamentales, en contacto con

ISO, también participan en el trabajo. ISO colabora estrechamente con la Comisión Electrotécnica Internacional (IEC) en todos los asuntos de normalización electrotécnica. Las

Normas Internacionales se redactan de acuerdo con las reglas establecidas en las Directivas ISO / IEC, Parte 2. La tarea principal de los comités técnicos es preparar las Normas

Internacionales. Los proyectos de normas internacionales adoptados por los comités técnicos se distribuyen a los organismos miembros para su votación. La publicación como

Norma Internacional requiere la aprobación de al menos el 75% de los organismos miembros que emiten un voto. Se llama la atención sobre la posibilidad de que algunos de los

elementos de este documento puedan estar sujetos a derechos de patente. ISO no será responsable de identificar ninguno o todos los derechos de patente. ISO 11348-2 fue

preparada por el Comité Técnico ISO / TC 147, ISO no será responsable de identificar ninguno o todos los derechos de patente. ISO 11348-2 fue preparada por el Comité Técnico

ISO / TC 147, ISO no será responsable de identificar ninguno o todos los derechos de patente. ISO 11348-2 fue preparada por el Comité Técnico ISO / TC 147, Calidad del agua, Subcomité

SC 5,

Métodos biológicos.

Esta segunda edición cancela y reemplaza la primera edición (ISO 11348-2: 1998), que ha sido revisada técnicamente.

ISO 11348 consta de las siguientes partes, bajo el título general Calidad del agua - Determinación del efecto inhibitorio de las muestras de agua sobre la
emisión de luz de Vibrio fischeri Prueba de bacterias luminiscentes):

• Parte 1: Método usando bacterias recién preparadas

• Parte 2: Método usando bacterias secas líquidas

• Parte 3: Método usando bacterias liofilizadas

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ISO 11348-2: 2007 (E)

Introducción

Las mediciones especificadas en ISO 11348 pueden llevarse a cabo utilizando bacterias recién preparadas, así como preparaciones bacterianas
liofilizadas o secas líquidas.

El trabajo estandarizado realizado por DIN Normenausschuss Wasserwesen e ISO / TC 147 / SC 5 / WG 1 ha demostrado que, en casos especiales,
estas diferentes técnicas pueden ofrecer resultados diferentes, especialmente en presencia de metales pesados.

Tal sensibilidad variable es causada por las diferencias en la composición de los medios utilizados en la preparación de bacterias liofilizadas o secas
líquidas. Estos medios protectores influyen en la biodisponibilidad de los tóxicos y / o la emisión de luz de las bacterias luminiscentes. Esto significa que
el origen y el tipo de preparación deben tenerse en cuenta al interpretar los resultados. Esto puede ser difícil a veces, ya que las bacterias liofilizadas y
secas líquidas se pueden obtener de diferentes proveedores. Esto, a su vez, puede significar que la composición no se conoce en detalle y, por lo tanto,
no puede ser interpretada por el usuario.

Por esta razón, además de las mediciones de toxicidad con bacterias recién preparadas (ISO 11348-1) y bacterias liofilizadas (ISO 11348-3), en esta
parte de ISO 11348 se describe un procedimiento con bacterias secas líquidas, el rendimiento de que puede ser interpretado por el usuario en cada
detalle.

Los laboratorios responsables de los resultados tienen la oportunidad de seleccionar la técnica más adecuada basada en el juicio experto y la información
sobre la muestra de agua a analizar.

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ESTÁNDAR INTERNACIONAL ISO 11348-2: 2007 (E)

Calidad del agua - Determinación del efecto inhibitorio de las muestras de agua sobre la
emisión de luz de Vibrio fischeri Prueba de bacterias luminiscentes) -

Parte 2:
Método utilizando bacterias secas líquidas

ADVERTENCIA - Las personas que usan esta parte de ISO 11348 deben estar familiarizadas con la práctica normal de laboratorio. Esta norma
no pretende abordar todos los problemas de seguridad, si los hay, asociados con su uso. Es responsabilidad del usuario establecer prácticas
apropiadas de seguridad y salud y garantizar el cumplimiento de las condiciones normativas nacionales.

IMPORTANTE: es absolutamente esencial que las pruebas realizadas de acuerdo con esta parte de ISO 11348 sean realizadas por personal
debidamente capacitado.

1 Alcance

ISO 11348 describe tres métodos para determinar la inhibición de la luminiscencia emitida por la bacteria marina. Vibrio fischeri NRRL B-11177). Esta
parte de ISO 11348 especifica un método que utiliza bacterias secas líquidas.

Este método es aplicable a:

• aguas residuales;

• extractos acuosos y lixiviados;

• agua dulce (aguas superficiales y subterráneas);

• agua de mar y agua salobre;

• eluatos de sedimentos (agua dulce, agua salobre y agua de mar);

• agua porosa;

• Sustancias individuales, diluidas en agua.

2 Referencias normativas

Los siguientes documentos referenciados son indispensables para la aplicación de este documento. Para las referencias con fecha, sólo se aplica la

edición citada. Para referencias sin fecha, se aplica la última edición del documento referenciado (incluidas las enmiendas). ISO 5667-16, Calidad del

agua. Muestreo. Parte 16: Orientación sobre la biodetección de muestras.

ISO 5814, Calidad del agua - Determinación de oxígeno disuelto - Método de sonda electroquímica

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ISO 11348-2: 2007 (E)

3 Principio

La inhibición de la emisión de luz por cultivos de Vibrio fischeri se determina mediante una prueba por lotes. Esto se logra combinando volúmenes
específicos de la muestra de prueba o la muestra diluida con la suspensión de bacterias luminiscentes en un tubo de ensayo.

El criterio de prueba es la luminiscencia, medida después de un tiempo de contacto de 15 min o 30 min u opcionalmente 5 min, teniendo en cuenta un factor
de corrección ( F k t), que es una medida de los cambios de intensidad de las muestras de control durante el tiempo de exposición. El efecto inhibitorio de la
muestra de agua se puede determinar como LID (ver Anexo B) o como EC 20- y / o EC 50- valores mediante una serie de diluciones. (CE es la concentración
efectiva).

4 interferencias

Las sustancias insolubles, ligeramente solubles o volátiles o las sustancias que reaccionan con el agua de dilución o la suspensión, o alteran su estado durante
el período de prueba, pueden afectar el resultado o afectar la reproducibilidad de los resultados de la prueba.

Las pérdidas de luminiscencia causadas por la absorción o dispersión de la luz pueden ocurrir en el caso de aguas muy coloreadas o turbias. Esta

interferencia puede compensarse mediante un tratamiento de muestra para turbidez (7.2) o, por ejemplo, utilizando un tubo de ensayo de corrección de

absorción de doble cámara (ver Anexo A). Dado que se requiere oxígeno para la bioluminiscencia [6], Las muestras con una alta demanda de oxígeno (y /

o una baja concentración de oxígeno) pueden causar una deficiencia de oxígeno y ser inhibitorias. Los nutrientes fácilmente biodegradables en la

muestra pueden causar un contaminante independiente

reducción en
bioluminiscencia [1].

Las muestras con un pH fuera del rango de pH = 6,0 y pH = 8,5 afectan la luminiscencia de las bacterias [6], [7]. Se requiere un ajuste de la muestra

cuando no se desea el efecto tóxico del pH. Como el organismo de prueba Vibrio fischeri es una bacteria marina, el análisis de muestras de agua salada

con el procedimiento estándar a menudo conduce a efectos de estimulación de la bioluminiscencia, que pueden enmascarar los efectos de inhibición (ver

Anexo D).

Las concentraciones de sal en la muestra inicial que exceden de 30 g / l de NaCl, o el contenido de otros compuestos que proporcionan una osmolaridad igual
pueden conducir, junto con el aumento de sal requerido por la prueba, a efectos hiperosmóticos. La concentración de sal resultante en las muestras de prueba no
debe exceder la osmolaridad de una solución de NaCl de 35 g / l para evitar estos efectos.

5 reactivos y materiales

Utilice productos químicos de calidad analítica reconocida. Use agua destilada o agua de pureza equivalente.

5.1 Prueba de bacterias.

Use una cepa de bacterias luminiscentes pertenecientes a la especie. Vibrio fischeri NRRL B-11177. Las suspensiones bacterianas utilizadas para las mediciones
de toxicidad se preparan a partir de reactivos secados por líquido disponibles comercialmente. Almacene las bacterias secas por líquido en tu –18 ° C y considerar
las recomendaciones del proveedor. Las bacterias comienzan a brillar inmediatamente después de la reconstitución y están listas para usarse para la prueba.

5.2 Solución de cloruro de sodio. como diluyente

Disuelva 20 g de cloruro de sodio (NaCl) en agua y complete hasta 1 l con agua.

5.3 Solución de hidróxido de sodio, C( NaOH) = p. Ej. 1 mol / l.

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ISO 11348-2: 2007 (E)

5.4 Ácido clorhídrico C( HCl) = p. Ej. 1 mol / l.

Para el ajuste del pH, puede ser necesario usar ácidos o bases de menor o mayor concentración.

5.5 Solución para bacterias secas líquidas.

8,0 g D (+) - Glucosa monohidrato (C 6 H 12 O 6 · H 2 O)

20,0 g Cloruro de sodio (NaCl)

2,035 g Hexahidrato de cloruro de magnesio (MgCl 2 · 6 H 2 O)

0,30 g Cloruro de potasio (KCl)

11,9 g NORTE-( 2-hidroxietil) piperazina- NORTE-( Ácido 2-etanosulfónico) (HEPES)

Disolver en agua, agitar durante unos 30 minutos y ajustar el pH a 7,0. ± 0,2 con solución de hidróxido de sodio (5.3) o ácido clorhídrico (5.4). Completar

hasta 1 l con agua. Esta solución puede almacenarse en porciones de –18 ° C a –20 ° C.

5.6 Sustancias de referencia.

Prepare las siguientes soluciones madre de sustancias de referencia con solución de cloruro de sodio (5.2) como diluyente por separado, sin ajustar el
pH:

219,8 mg / l Sulfato de zinc heptahidratado (ZnSO 4 · 7 H 2 O)

9 mg / l 3,5-diclorofenol (C 6 H 4 OCl 2) (pureza W 99%)

22,6 mg / l Dicromato de potasio (K 2 Cr 2 O 7)

Estas concentraciones son aproximadamente el doble de la CE 50- esperada valores para las sustancias de referencia respectivas en esta parte de ISO 11348.

Los volúmenes requeridos dependen de la configuración de la prueba. NOTA

Es posible usar preparaciones químicas disponibles comercialmente con concentraciones definidas de ZnSO 4 4 y
K 2 Cr 2 O 7 ( titrisol) para la preparación de las soluciones madre de las sustancias de referencia.

6 aparatos

6.1 Congelador, para el almacenamiento de bacterias preservadas.

6.2 Termobloque controlado termostáticamente, para mantener las muestras de prueba a una temperatura de 15 ° C ± 1 ° C. Dentro de una prueba, la
desviación de temperatura debe ser como máximo ± 0,3 ° C.

6.3 Luminómetro, célula de medición mantenida a 15 ° C ± 1 ° C, equipado con tubos de ensayo adecuados.

6.4 Tubos de ensayo, hecho de un material químicamente inerte, apropiado para el luminómetro seleccionado, con una capacidad que facilita la lectura
sobre el área de superficie más grande posible y capaz de encajar en el termobloque (6.2).

6.5 Medidor de pH.

6.6 Cronómetro.

6.7 Pipetas de pistón o jeringas de plástico, 100 µl, 500 µl y 1 000 µl.

6.8 Pipetas de pistón, con volumen variable, 10 ml a 200 ml y 200 µl a 5 000 µl.

6.9 Baño de agua, capaz de mantener una temperatura de 20 ° C ± 2 ° C.

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6.10 Baño de agua o termobloque con control termostático, para mantener al menos 12 ml de volumen (p. ej. recipiente de reactivo) de la solución
preparada en 5.5 a 15 ° C ± 1 ° C.

6.11 Conductómetro.

6.12 Sonda de oxígeno, de acuerdo con ISO 5814.

7 Muestreo y pretratamiento de muestras

7.1 Muestreo

Recoja muestras en contenedores químicamente inertes y limpios como se especifica en ISO 5667-16. Llene los contenedores por completo y séllelos. Pruebe las
muestras lo antes posible después de la recolección. Cuando sea necesario, almacene las muestras a una temperatura de 2 ° C a 5 ° C en la oscuridad en los
contenedores durante no más de 48 h. Para períodos de hasta dos meses, almacene en tu - 18 ° C. No use productos químicos para preservar las muestras. Realice
el ajuste de pH y la adición de sal necesarios inmediatamente antes de la prueba.

7.2 Preparación de muestra

Mida la concentración de oxígeno en todas las muestras. Se requiere una concentración de oxígeno> 3 mg / l para la prueba. Si la concentración de oxígeno
de la muestra sin diluir es inferior a 3 mg / l, utilice métodos adecuados para oxigenar la muestra, por ejemplo, aireación o agitación.

Mida el pH de todas las muestras. Si el pH está entre 6,0 y 8,5, generalmente no es necesario un ajuste. Sin embargo, el ajuste del valor de pH puede

alterar la naturaleza de la muestra. Por otro lado, el pH de la muestra y el pH del lote de prueba pueden diferir debido a la capacidad tampón del medio de

prueba. Puede ser necesario llevar a cabo pruebas en las muestras con pH ajustado y sin pH. Si es necesario, ajuste el pH de la muestra agregando

ácido clorhídrico (5.4) o solución de hidróxido de sodio (5.3). Dependiendo del propósito de la prueba, el pH puede ajustarse a 7,0 ± 0,2 o hacia arriba (8,5 ±

0,2) y límites inferiores (6,0 ± 0,2). Elija la concentración del ácido clorhídrico o la solución de hidróxido de sodio para restringir el volumen agregado a no

más del 5% del volumen total. Agregue 20 g de cloruro de sodio por litro a la muestra de agua o a la muestra de agua neutralizada. Para muestras con

altas concentraciones de sal, mida la salinidad y agregue la cantidad de sal necesaria para ajustar la osmolaridad a 20 g / l de NaCl.

Si la muestra contiene entre 20 g / ly 50 g / l de equivalentes de NaCl, no agregue sal. La concentración de sal resultante en las muestras de ensayo no

deberá exceder la osmolaridad de una solución de cloruro de sodio de 35 g / l. Para muestras de agua salada, el Anexo D brinda más información.

Las muestras fuertemente turbias deben dejarse reposar durante 1 hora o centrifugarse, por ejemplo, durante 10 minutos a 5 000 sol, o debe ser filtrado. Use el
sobrenadante o el filtrado para la prueba.

8 Procedimiento

Prepare las muestras de referencia de acuerdo con 5.6. Pruebe cada lote de bacterias después del parto con las tres sustancias de referencia. Pruebe al

menos una de las tres sustancias de referencia en paralelo con cada tubo de ensayo de suspensión stock descongelado para las pruebas. Prepare las

muestras de acuerdo con 7.2.

Descongele las bacterias secas líquidas (suspensión de reserva) en un baño de agua a 20 ° C ± 2 ° C. Las suspensiones de existencias congeladas pueden usarse solo para
pruebas preliminares.

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Prepare la suspensión de prueba de la suspensión estándar en dos pasos:

• Añadir 0,5 ml (por 100 µl de suspensión de reserva en el tubo de ensayo) de solución (5.5), mantenida a 15 ° C ± 1 ° C,
y homogeneizar agitando suavemente el tubo de ensayo.

• Espere unos 15 min.

Pipetee esta suspensión en un recipiente de reactivo (aproximadamente 20 ml de volumen) y agregue 11,5 ml de solución (5.5), mantenida a 15 ° C ± 1 °

C y homogeneizar agitando suavemente el recipiente de reactivo. Espere unos 15 min.

Prepare, en un primer conjunto de tubos de ensayo (6.4), la serie de dilución de muestra, la muestra de referencia (5.6) y los controles (5.2) requeridos.

En el Anexo B se describe un procedimiento común para la preparación de la serie de dilución. Dependiendo del propósito de la prueba y los requisitos
estadísticos relativos a los resultados de la prueba, también pueden ser apropiados otros diseños de dilución con concentraciones en una serie
geométrica o logarítmica. Debido a la mezcla de volúmenes iguales de muestra / muestra diluida y suspensión de prueba, la concentración de muestra
más alta en la prueba es 50% de muestra como regla. Para la prueba de muestras de agua casi sin diluir (muestra del 80%), se necesita un lote de
control adicional (ver B.2 y Tabla 1).

Mantenga los tubos de ensayo que contienen la solución de cloruro de sodio (5.2) para los controles, las muestras de referencia (5.6), las muestras (7.2) y
las muestras de la serie de dilución (Tabla B.1) a 15 ° C ± 1 ° C.

Elija condiciones de prueba que garanticen que la desviación máxima de temperatura en el termobloque dentro de una prueba sea como máximo ± 0,3 ° C.

Para pruebas con volúmenes iguales de suspensión de prueba y muestra, pipetee porciones de 500 µl de la suspensión de prueba en un segundo conjunto
correspondiente de tubos de ensayo (6.4), mantenido a 15 ° C ± 1 ° C en la incubadora, en los mismos intervalos de tiempo (5 sa 20 s) que se usan para mediciones
de intensidad posteriores.

Realice dos determinaciones paralelas por nivel de dilución a una temperatura de prueba de 15 ° C ± 1 ° C. Ajuste el instrumento del luminómetro a una

configuración conveniente, casi máxima. Determinar y registrar la intensidad de luminiscencia, yo 0, de las suspensiones de prueba por medio de un luminómetro.

Como el tiempo de contacto para todas las muestras de prueba debe ser igual, use un cronómetro (6.6) para medir las intensidades de luminiscencia a

intervalos de tiempo iguales, seriatim. Se ha encontrado conveniente un intervalo de 5 sa 20 s. Mida todas las suspensiones de prueba, ya que puede

esperarse una luminiscencia diferente debido a posibles inhomogeneidades de la suspensión de prueba.

Inmediatamente después de la medición inicial de luminiscencia de una suspensión de prueba, complete esta suspensión hasta un volumen total de 1 ml con

muestras (7.2), muestras diluidas (Anexo B), muestra de referencia (5.6) o solución de cloruro de sodio (5.2), según corresponda. . Esto se hace pipeteando 500 µl

de cada una de las muestras (7.2), muestras diluidas (Anexo B), muestra de referencia (5.6) o solución de cloruro de sodio (5.2), preparada en el primer conjunto de

tubos de ensayo, a las suspensiones de prueba en cada una de los tubos en el segundo conjunto correspondiente de tubos de ensayo. Mezcle a mano, encienda el

cronómetro y vuelva a colocar los tubos de ensayo en el termobloque a 15 ° C. ± 1 ° C. Repita para todos los otros tubos de ensayo, dejando el mismo intervalo de

tiempo entre adiciones sucesivas. Determine y registre la intensidad de luminiscencia en todos los tubos de ensayo del segundo conjunto de tubos de ensayo,

incluidos los controles, después de, opcionalmente, 5 minutos ( yo 5) y nuevamente después de 15 min y 30 min ( yo 15, yo 30) según sea necesario, a intervalos de 5 sa

20 s.

Registre el ajuste del instrumento.

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