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se/std-909354

ESTÁNDAR ISO
INTERNACIONAL 11348-3

Segunda edicion
2007-12-01

Calidad del agua - Determinación del efecto inhibitorio

de las muestras de agua sobre la emisión de luz de Vibrio
fischeri
(Prueba de bacterias luminiscentes) -

Parte 3:
Método utilizando bacterias liofilizadas

Qualité de l'eau - Determinación de l'effet inhibiteur d'échantillons d'eau sur la luminescence

de Vibrio fischeri Essai de bactéries luminescentes) -

Parte 3: Método utilizado de las baterías liofilizadas

Número de referencia ISO

11348-3: 2007 (E)

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ISO 11348-3: 2007 (E)

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ISO 11348-3: 2007 (E)

Contenido Página

Prefacio................................................. .................................................. .................................................. ....... iv Introducción .........................................

.................................................. .................................................. ........... v 1

Alcance ................................................. .................................................. .................................................. 1

2 Referencias normativas ................................................ .................................................. ......................... 1

3 Principio................................................. .................................................. .............................................. 2

44 Interferencias ................................................. .................................................. ...................................... 2

55 Reactivos y materiales ............................................... .................................................. ...................... 2

66 Aparato ................................................. .................................................. ........................................... 3

77 Muestreo y pretratamiento de muestras .............................................. .................................................. .... 4

8 Procedimiento ................................................. .................................................. ........................................... 4

99 Evaluación................................................. .................................................. ........................................... 6

10 Expresión de resultados ............................................... .................................................. .......................... 8

11 Criterios de validez ............................................... .................................................. ............................... 10

12 Precisión................................................. .................................................. ........................................... 10

13 Informe de prueba ................................................ .................................................. ......................................... 10

Anexo A ( informativo) Método de corrección de color .............................................. ........................................... 11

Anexo B informativo) Nivel de dilución D - Preparación de la serie de dilución ......................................... .... 14

Anexo C ( informativo) Datos de precisión ................................................ .................................................. ........... 17

Anexo D ( informativo) Prueba de muestras de agua salada con la prueba de bacterias luminiscentes con
bacterias liofilizadas .............................................. .................................................. ........................... 18

Bibliografía ................................................. .................................................. .................................................. 21

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ISO 11348-3: 2007 (E)

Prefacio

ISO (Organización Internacional de Normalización) es una federación mundial de organismos nacionales de normalización (organismos miembros de ISO). El trabajo de

preparación de normas internacionales se lleva a cabo normalmente a través de comités técnicos de ISO. Cada organismo miembro interesado en un tema para el cual se ha

establecido un comité técnico tiene derecho a estar representado en ese comité. Las organizaciones internacionales, gubernamentales y no gubernamentales, en contacto con

ISO, también participan en el trabajo. ISO colabora estrechamente con la Comisión Electrotécnica Internacional (IEC) en todos los asuntos de normalización electrotécnica. Las

Normas Internacionales se redactan de acuerdo con las reglas establecidas en las Directivas ISO / IEC, Parte 2. La tarea principal de los comités técnicos es preparar las Normas

Internacionales. Los proyectos de normas internacionales adoptados por los comités técnicos se distribuyen a los organismos miembros para su votación. La publicación como

Norma Internacional requiere la aprobación de al menos el 75% de los organismos miembros que emiten un voto. Se llama la atención sobre la posibilidad de que algunos de los

elementos de este documento puedan estar sujetos a derechos de patente. ISO no será responsable de identificar ninguno o todos los derechos de patente. ISO 11348-3 fue

preparada por el Comité Técnico ISO / TC 147, ISO no será responsable de identificar ninguno o todos los derechos de patente. ISO 11348-3 fue preparada por el Comité Técnico

ISO / TC 147, ISO no será responsable de identificar ninguno o todos los derechos de patente. ISO 11348-3 fue preparada por el Comité Técnico ISO / TC 147, Calidad del agua, Subcomité

SC 5,

Métodos biológicos.

Esta segunda edición cancela y reemplaza la primera edición (ISO 11348-3: 1998), que ha sido revisada técnicamente.

ISO 11348 consta de las siguientes partes, bajo el título general Calidad del agua - Determinación del efecto inhibitorio de las muestras de agua sobre la
emisión de luz de Vibrio fischeri Prueba de bacterias luminiscentes):

• Parte 1: Método usando bacterias recién preparadas

• Parte 2: Método usando bacterias secas líquidas

• Parte 3: Método usando bacterias liofilizadas

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ISO 11348-3: 2007 (E)

Introducción

Las mediciones especificadas en ISO 11348 pueden llevarse a cabo utilizando bacterias recién preparadas, así como preparaciones bacterianas
liofilizadas o secas líquidas.

El trabajo estandarizado realizado por DIN Normenausschuss Wasserwesen e ISO / TC 147 / SC 5 / WG 1 ha demostrado que, en casos especiales,
estas técnicas diferentes pueden dar resultados diferentes, especialmente en presencia de metales pesados.

Tal sensibilidad variable es causada por las diferencias en la composición de los medios utilizados en la preparación de bacterias liofilizadas o secas
líquidas. Estos medios protectores influyen en la biodisponibilidad de los tóxicos y / o la emisión de luz de las bacterias luminiscentes. Esto significa que
el origen y el tipo de preparación deben tenerse en cuenta al interpretar los resultados. Esto puede ser difícil a veces, ya que las bacterias liofilizadas y
secas líquidas se pueden obtener de diferentes proveedores. Esto, a su vez, puede significar que la composición no se conoce en detalle y, por lo tanto,
no puede ser interpretada por el usuario.

Por esta razón, además de las mediciones de toxicidad con bacterias secas líquidas (ISO 11348-2) y bacterias recién preparadas (ISO 11348-1), en esta
parte de ISO 11348 se describe un procedimiento con bacterias liofilizadas, el desempeño de que puede ser interpretado por el usuario en cada detalle.

Los laboratorios responsables de los resultados tienen la oportunidad de seleccionar la técnica más adecuada basada en el juicio experto y la información
sobre la muestra de agua a analizar.

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ESTÁNDAR INTERNACIONAL ISO 11348-3: 2007 (E)

Calidad del agua - Determinación del efecto inhibitorio de las muestras de agua sobre la
emisión de luz de Vibrio fischeri Prueba de bacterias luminiscentes) -

Parte 3:
Método utilizando bacterias liofilizadas

ADVERTENCIA - Las personas que usan esta parte de ISO 11348 deben estar familiarizadas con la práctica normal de laboratorio. Esta norma
no pretende abordar todos los problemas de seguridad, si los hay, asociados con su uso. Es responsabilidad del usuario establecer prácticas
apropiadas de seguridad y salud y garantizar el cumplimiento de las condiciones normativas nacionales.

IMPORTANTE: es absolutamente esencial que las pruebas realizadas de acuerdo con esta parte de ISO 11348 sean realizadas por personal
debidamente capacitado.

1 Alcance

ISO 11348 describe tres métodos para determinar la inhibición de la luminiscencia emitida por la bacteria marina. Vibrio fischeri NRRL B-11177). Esta
parte de ISO 11348 especifica un método que utiliza bacterias liofilizadas.

Este método es aplicable a:

• aguas residuales;

• extractos acuosos y lixiviados;

• agua dulce (agua superficial y subterránea);

• mar y agua salobre;

• eluatos de sedimentos (agua dulce, salobre y agua de mar);

• agua porosa;

• Sustancias individuales, diluidas en agua.

2 Referencias normativas

Los siguientes documentos referenciados son indispensables para la aplicación de este documento. Para las referencias con fecha, sólo se aplica la

edición citada. Para referencias sin fecha, se aplica la última edición del documento referenciado (incluidas las enmiendas). ISO 5667-16, Calidad del

agua. Muestreo. Parte 16: Orientación sobre la biodetección de muestras.

ISO 5814, Calidad del agua - Determinación de oxígeno disuelto - Método de sonda electroquímica

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ISO 11348-3: 2007 (E)

3 Principio

La inhibición de la emisión de luz por cultivos de Vibrio fischeri se determina mediante una prueba por lotes. Esto se logra combinando volúmenes
específicos de la muestra de prueba o la muestra diluida con la suspensión de bacterias luminiscentes en un tubo de ensayo.

El criterio de prueba es la luminiscencia, medida después de un tiempo de contacto de 15 min o 30 min y, opcionalmente, 5 min, teniendo en cuenta un
factor de corrección ( F k t), que es una medida de los cambios de intensidad de las muestras de control durante el tiempo de exposición. El efecto inhibitorio de
la muestra de agua se puede determinar como LID (ver Anexo B) o como EC 20- y / o EC 50- valores mediante una serie de diluciones. (CE es la
concentración efectiva).

4 interferencias

Las sustancias insolubles, ligeramente solubles o volátiles o las sustancias que reaccionan con el agua de dilución o la suspensión, o alteran su estado durante
el período de prueba, pueden afectar el resultado o afectar la reproducibilidad de los resultados de la prueba.

Las pérdidas de luminiscencia causadas por la absorción o dispersión de la luz pueden ocurrir en el caso de aguas muy coloreadas o turbias. Esta

interferencia puede compensarse mediante un tratamiento de muestra para turbidez (7.2) o, por ejemplo, utilizando un tubo de ensayo de corrección de

absorción de doble cámara (ver Anexo A). Dado que se requiere oxígeno para la bioluminiscencia [6], Las muestras con una alta demanda de oxígeno (y /

o una baja concentración de oxígeno) pueden causar una deficiencia de oxígeno y ser inhibitorias. Los nutrientes fácilmente biodegradables en la

muestra pueden causar un contaminante independiente

reducción en
bioluminiscencia [1].

Las muestras con un pH fuera del rango de pH = 6,0 y pH = 8,5 afectan la luminiscencia de las bacterias [6], [7]. Se requiere un ajuste de la muestra

cuando no se desea el efecto tóxico del pH. Como el organismo de prueba Vibrio fischeri es una bacteria marina, el análisis de muestras de agua salada

con el procedimiento estándar a menudo conduce a efectos de estimulación de la bioluminiscencia, que pueden enmascarar los efectos de inhibición (ver

Anexo D).

Las concentraciones de sal en la muestra inicial que exceden de 30 g / l de NaCl, o el contenido de otros compuestos que proporcionan una osmolaridad igual
pueden conducir, junto con el aumento de sal requerido por la prueba, a efectos hiperosmóticos. La concentración de sal resultante en las muestras de prueba no
debe exceder la osmolaridad de una solución de NaCl de 35 g / l para evitar estos efectos.

5 reactivos y materiales

Utilice productos químicos de calidad analítica reconocida. Use agua destilada o agua de pureza equivalente.

5.1 Prueba de bacterias.

Use una cepa de bacterias luminiscentes pertenecientes a la especie. Vibrio fischeri NRRL B-11177. Las suspensiones bacterianas utilizadas para las
mediciones de toxicidad se preparan a partir de reactivos liofilizados disponibles en el mercado que pueden almacenarse en un congelador a - 18 ° C a - 20 °
C. Las bacterias comienzan a brillar inmediatamente después de la reconstitución y están listas para usarse para la prueba.

5.2 Solución de cloruro de sodio. como diluyente

Disuelva 20 g de cloruro de sodio (NaCl) en agua y complete hasta 1 l con agua.

5.3 Solución de hidróxido de sodio, p.ej C( NaOH) = 1 mol / l.

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ISO 11348-3: 2007 (E)

5.4 Ácido clorhídrico p.ej C( HCl) = 1 mol / l.

Para el ajuste del pH, puede ser necesario usar ácidos o bases de menor o mayor concentración.

5.5 Solución para bacterias liofilizadas.

20 g Cloruro de sodio (NaCl)

2,035 g Hexahidrato de cloruro de magnesio (MgCl 2 · 6 H 2 O)

0,30 g Cloruro de potasio (KCl)

Disolver en agua y completar hasta 1 l con agua. La solución puede almacenarse en porciones en un congelador a - 18 ° C a - 20 ° C.

5.6 Sustancias de referencia.

Prepare las siguientes soluciones madre de sustancias de referencia con solución de cloruro de sodio (5.2) como diluyente por separado, sin ajustar el
pH:

19,34 mg / l Sulfato de zinc heptahidratado (ZnSO 4 · 7 H 2 O)

6,8 mg / l 3,5-diclorofenol (C 6 H 4 OCl 2) (pureza> 99%)

105,8 mg / l Dicromato de potasio (K 2 Cr 2 O 7)

Estas concentraciones son aproximadamente el doble de la CE 50- esperada valores para las sustancias de referencia respectivas en esta parte de ISO 11348.

Los volúmenes requeridos dependen de la configuración de la prueba. NOTA

Es posible usar preparaciones químicas disponibles comercialmente con concentraciones definidas de ZnSO 4 4 y
K 2 Cr 2 O 7 ( titrisol) para la preparación de las soluciones madre de las sustancias de referencia.

6 aparatos

6.1 Congelador, para el almacenamiento de bacterias preservadas.

6.2 Incubadora o refrigerador, para mantener la suspensión de reserva (8.2) y, opcionalmente, la "solución para bacterias liofilizadas" (5.5)
(variante B) a una temperatura de 4 ° C ± 3 ° C.

6.3 Termobloque controlado termostáticamente, para mantener las muestras de prueba a una temperatura de 15 ° C ± 1 ° C. Dentro de una prueba, la
desviación de temperatura debe ser como máximo ± 0,3 ° C.

6.4 Luminómetro, célula de medición mantenida a 15 ° C ± 1 ° C, equipado con tubos de ensayo adecuados.

6.5 Tubos de ensayo, hecho de un material químicamente inerte, apropiado para el luminómetro seleccionado y con una capacidad que facilita la lectura
sobre el área de superficie más grande posible y capaz de encajar en el termobloque (6.3).

6.6 pH-metro.

6.7 Cronómetro.

6.8 Pipetas de pistón o jeringas de plástico, 10 µl, 500 µl y 1 000 µl.

6.9 Pipetas de pistón, con volumen variable, 10 ml a 200 ml y 200 µl a 5 000 µl.

6.10 Conductómetro.

6.11 Sonda de oxígeno, de acuerdo con ISO 5814.

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7 Muestreo y pretratamiento de muestras

7.1 Muestreo

Recoja muestras en contenedores químicamente inertes y limpios como se especifica en ISO 5667-16. Llene los contenedores por completo y séllelos. Pruebe las
muestras lo antes posible después de la recolección. Cuando sea necesario, almacene las muestras a una temperatura de 2 ° C a 5 ° C en la oscuridad en los
contenedores durante no más de 48 h. Para períodos de hasta dos meses, almacene en tu - 18 ° C. No use productos químicos para preservar las muestras. Realice
el ajuste de pH y la adición de sal necesarios inmediatamente antes de la prueba.

7.2 Preparación de muestra

Mida la concentración de oxígeno en todas las muestras. Se requiere una concentración de oxígeno> 3 mg / l para la prueba. Si la concentración de oxígeno
de la muestra sin diluir es inferior a 3 mg / l, utilice métodos adecuados para oxigenar la muestra, por ejemplo, aireación o agitación.

Mida el pH de todas las muestras. Si el pH está entre 6,0 y 8,5, generalmente no es necesario un ajuste. Sin embargo, el ajuste del valor de pH puede

alterar la naturaleza de la muestra. Por otro lado, el pH de la muestra y el pH del lote de prueba pueden diferir debido a la capacidad tampón del medio de

prueba. Puede ser necesario llevar a cabo pruebas en las muestras con pH ajustado y sin pH. Si es necesario, ajuste el pH de la muestra agregando

ácido clorhídrico (5.4) o solución de hidróxido de sodio (5.3). Dependiendo del propósito de la prueba, el pH puede ajustarse a 7,0 ± 0,2 o hacia arriba (8,5 ±

0,2) y límites inferiores (6,0 ± 0,2). Elija la concentración del ácido clorhídrico o la solución de hidróxido de sodio para restringir el volumen agregado a no

más del 5% del volumen total. Agregue 20 g de cloruro de sodio por litro a la muestra de agua o a la muestra de agua neutralizada. Para muestras con

altas concentraciones de sal, mida la salinidad y agregue la cantidad de sal necesaria para ajustar la osmolaridad a 20 g / l de NaCl.

Si la muestra contiene entre 20 g / ly 50 g / l de equivalentes de NaCl, no agregue sal. La concentración de sal resultante en las muestras de ensayo no

deberá exceder la osmolaridad de una solución de cloruro de sodio de 35 g / l. Para muestras de agua salada, el Anexo D brinda más información.

Las muestras fuertemente turbias deben dejarse reposar durante 1 hora o centrifugarse, por ejemplo, durante 10 minutos a 5 000 sol, o debe ser filtrado. Use el
sobrenadante o el filtrado para la prueba.

8 Procedimiento

8.1 Preparaciones iniciales

Prepare las muestras de referencia de acuerdo con 5.6. Pruebe cada lote de bacterias después del parto con las tres sustancias de referencia. Pruebe al
menos una de las tres sustancias de referencia en paralelo con cada vial de suspensión de reserva reconstituido.

Prepare las muestras de acuerdo con 7.2.

Prepare, en un primer conjunto de tubos de ensayo (6.5), la serie de dilución de muestra, la muestra de referencia (5.6) y los controles (5.2) requeridos.

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ISO 11348-3: 2007 (E)

En el Anexo B se describe un procedimiento común para la preparación de la serie de dilución. Dependiendo del propósito de la prueba y los requisitos
estadísticos relativos a los resultados de la prueba, también pueden ser apropiados otros diseños de dilución con concentraciones en una serie
geométrica o logarítmica. Debido a la mezcla de volúmenes iguales de muestra / muestra diluida y suspensión de prueba, la concentración de muestra
más alta en la prueba es 50% de muestra como regla. Para la prueba de muestras de agua casi sin diluir (muestra del 80%), se necesita un lote de
control adicional (ver B.2 y Tabla 1).

Mantenga los tubos de ensayo que contienen la solución de cloruro de sodio (5.2) para los controles, las muestras de referencia (5.6), las muestras (7.2) y
las muestras de la serie de dilución (Tabla B.1) a 15 ° C ± 1 ° C.

Elija condiciones de prueba que garanticen que la desviación máxima de temperatura en el termobloque dentro de una prueba sea como máximo ± 0,3 ° C.

8.2 Preparación de la suspensión de existencias

Retire el vial del cultivo liofilizado (contenido suficiente para hasta 100 mediciones) del congelador inmediatamente antes de la reconstitución en agua.
Para la reconstitución, enfriar 1 ml de agua destilada en un tubo de ensayo de vidrio a 4 ° C. ± 3 ° C.

Vierta este volumen de agua enfriada de una vez en las bacterias liofilizadas en el vial, minimizando así el daño celular durante el proceso de
rehidratación.

Es importante que se agregue agua rápidamente, para permitir que las bacterias entren en contacto con el agua de una vez, evitando así la acumulación
y la pérdida de actividad. Por lo tanto, no use una pipeta. El volumen exacto de agua no es crítico.

La suspensión de bacterias luminiscentes reconstituidas (concentración celular aproximadamente 10 8 células por mililitro) sirve como una suspensión de reserva;
guárdelo a 4 ° C ± 3 ° C. La suspensión de existencias puede usarse para fines de prueba, siempre que se cumplan los criterios de validez establecidos en la Cláusula 11.
Las bacterias rehidratadas y congeladas pueden usarse solo para pruebas preliminares.

8.3 Preparación de suspensiones de prueba

8.3.1 Paso inicial

Después de un tiempo de espera de al menos 10 minutos, prepare las suspensiones de prueba de la suspensión original en un segundo conjunto correspondiente de
tubos de ensayo (6.5), mantenidos a 15 ° C ± 1 ° C por una de las dos variantes.

8.3.2 Variante A

Prepare las suspensiones de prueba directamente en los tubos de ensayo.

Añadir alícuotas de 10 µl de la suspensión madre a 500 µl de la solución (5.5), contenida en tubos de ensayo mantenidos a 15 ° C. ± 1 ° C, en los mismos
intervalos de tiempo (5 sa 20 s) que para mediciones de intensidad posteriores. Agite las mezclas a mano.

8.3.3 Variante B

Prepare las suspensiones de prueba fuera de los tubos de ensayo en un matraz cónico (volumen, por ejemplo, 250 ml).

Añadir 1 volumen de la suspensión madre a 50 volúmenes de la solución (5.5) mantenida a 4 ° C ± 3 ° C y mezclar bien la suspensión resultante.

Pipetee 500 µl de suspensión de prueba en los tubos de ensayo, mantenidos a 15 ° C ± 1 ° C en la incubadora, en los mismos intervalos de tiempo (5 sa 20 s) que se
usan para mediciones de intensidad posteriores.

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