Capítulo 3

Genética microbiana y sus aplicaciones

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1 Introducción a la genética microbiana y su relación con las enzimas y las
funciones de la célula
El término biología molecular se aplica específicamente al estudio de la estructura y función del
conjunto de macromoléculas que se encuentran en las células vivas. La cual acoplada a la genética
permite entender los mecanismos moleculares que permite que la célula funcione. El estudio de la
genética desde la perspectiva molecular también es fundamental para entender la variabilidad de
los organismos y la evolución de las especies.

1.1 Transmisión de la información genética

El gen es el elemento de información que codifica la secuencia de aminoácidos de la proteína. Los

genes son los almacenes de la información, mientras que las proteínas son las entidades
funcionales. En todas las células los genes están compuestos de ácido desoxirribonucleico (DNA).
La información del gen está contenida en la secuencia de bases del DNA, está información codifica
la secuencia de una proteína y lo hace exclusivamente a través de una molécula intermediaria, el
ácido ribonucleico (RNA).

Los procesos moleculares implicados en la transmisión de la información genética pueden dividirse

en tres fases (Figura 1), las cuales son:

(1) Replicación: la molécula de DNA, que actúa como el material genético de la célula, es una
doble hélice de dos largas cadenas, la cual durante la replicación se duplica produciendo dos
hélices dobles.
(2) Transcripción: el DNA no participa directamente en la síntesis de proteínas sino que lo hace a
través de un intermediario de RNA. La transferencia de la información al RNA se denomina
transcripción y la molécula de RNA que lleva la información que codifica una proteína se
denomina RNA mensajero (mRNA). Algunas regiones del DNA que se transcriben no codifican
proteínas, sino que contienen la información para otros tipos de RNA, tales como RNA de
transferencia (tRNA) y RNA ribosómico (rRNA).
(3) Traducción: la secuencia especifica de aminoácidos en cada proteína está determinada por una
secuencia específica de bases en el mRNA. Existe una correspondencia lineal entre la
secuencia de bases de un gen y la secuencia de aminoácidos de un polipéptido. Se necesitan
tres bases del mRNA para codificar un solo aminoácido y cada uno de estos tripletes se
denomina codón. Este código genético se traduce a proteína por medio de la maquinaria para
síntesis de proteínas. Este sistema consta de ribosomas (compuestos a su vez de proteínas y
rRNA), tRNA y varias enzimas.

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 Figura 1 Síntesis de los tres tipos de moléculas informacionales.

En el proceso de replicación, transcripción y traducción, la información en la secuencia del ácido

nucleico puede codificar bien la secuencia de otro ácido nucleico o de una proteína. Sin embargo,
la transferencia de la información desde el ácido nucleico a la proteína es unidireccional; la
secuencia de la proteína no indica la secuencia del ácido nucleico. Esta transferencia a la proteína
se conoce como dogma central de la biología porque es compartida por todas las formas de vida
de nuestro planeta.

Dentro de los elementos genéticos, es en los cromosomas de todos los organismos celulares donde
el DNA existe en forma de dos cadenas polinucleotídicas cuya secuencia de bases es
complementaria. La complementariedad de las bases surge de la especificidad del apareamiento
de las bases púricas y pirimídicas: la adenina se une siempre con la timina y la guanina con la
citosina. Las dos cadenas de la doble hélice resultante están ordenadas de manera antiparalela,
esto significa que las dos cadenas están orientadas “cabeza-pie”, es decir una de ellas se ordena
en la dirección 5’ a 3’ de arriba abajo, mientras que la otra de 5’ a 3’ de abajo arriba. Las dos cadenas
están enrolladas entre sí formando una doble hélice. Sin embargo, una molécula de DNA relajado
requiere adquirir un tipo de estructura de orden superior que le permite ser empaquetada en la
célula, ya que por ejemplo la longitud del cromosoma de E. coli es 500 veces más largo que su
propia célula, siendo la solución lo que se conoce como superenrollamiento. El superenrollamiento
es un estado en el que las moléculas de DNA bicatenarias están a su vez retorcidas. El DNA puede
superenrollarse en la dirección positiva o negativa. Este último ocurre cuando el DNA se tuerce a lo
largo de su eje en la dirección opuesta a la de la doble hélice (que es hacia la derecha). Esta es la
forma de superenrollamiento en la que el DNA se encuentra en la naturaleza.

En el cromosoma de eucariotas, la molécula de DNA lineal está enrollada alrededor de proteínas

llamadas histonas, formando unas estructuras denominadas nucleosomas (Figura 2). Las histonas
son proteínas cargadas positivamente que pueden neutralizar la carga negativa del DNA (debida a
los grupos fosfato). A su vez el DNA puede compactarse más aún por plegamiento y formación de
bucles formando finalmente una estructura muy densa denominada cromatina. Mientras que en
procariotas el superenrollamiento se lleva a acabo de manera diferente, ya que en bacteria y la
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mayoría de arqueas, existe una enzima llamada DNA girasa o topoisomerasa II que introduce un
superenrollamiento negativo. Primero, la molécula de DNA se retuerce; a continuación, en un punto
en que las dos cadenas contactan ocurre un corte en una de ellas y finalmente, la doble hélice rota
se religa en el sitio opuesto de la cadena intacta (Figura 3).

Figura 2. Empaquetamiento de DNA alrededor de un núcleo de histonas para formar un nucleosoma. Los
nucleosomas se ordena a lo largo de la cadena de DNA asemejando bolas en una cuerda. Esta conformación
es típica del DNA en la células eucarióticas.

Figura 3. Introducción de superenrollamiento en un DNA circular por acción de la topoisomerasa II, que
produce cortes en la doble cadena.

Otra enzima tiene la capacidad de eliminar el superenrollamiento negativo del DNA es la

topoisomerasa I, la cual se encuentra en procariotas y eucariotas. Está introduce un único corte
en una de las cadenas de dúplex de DNA y produce la rotación de una cadena sencilla alrededor
de la otra, lo cual permite al DNA regresar al estado relajado, independientemente de que el
superenrollamiento sea positivo o negativo. Para prevenir que el cromosoma regrese al estado
relajado, en eucariotas las proteínas que lleva unidas previenen el regreso al estado relajado,
mientras que en el cromosoma bacteriano contiene dominios superenrollados, por lo que una mella
en el DNA en uno de estos dominios no relaja el DNA de los demás.

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Debido a que el superenrollamiento es necesario para empaquetar el DNA dentro de la célula y la
relajación es necesaria para que el DNA pueda replicarse, estos dos procesos complementarios
son importantes en la función del DNA en la célula. Además, el superenrollamiento afecta a la
expresión génica. Ciertos genes se transcriben más activamente cuando el DNA está
superenrollado, mientras que un excesivo superenrollamiento inhibe la transcripción de otros.

Otra diferencia entre procariotas y eucariotas es con respecto al cromosoma. Un procariota típico
tiene un único cromosoma que contiene todos (o la mayoría) los genes de la célula, mientras que
las eucariotas tienen múltiples cromosomas formando su genoma. Además, el cromosoma
procariótico típico es una molécula de DNA circular mientras el DNA de todos los cromosomas
eucarióticos es lineal.

En cuanto a la organización de la secuencia del DNA, muchos genes de eucariotas que codifican
proteínas están interrumpidos por secuencias de DNA no codificadoras, las cuales se encuentran
entre las secuencias que en realidad codifican un único polipéptido. Estas secuencias no
codificadoras se denominan intrones y las secuencias codificadoras son los exones. Durante la
transcripción, tanto los intrones como los exones se copian, y las secuencias del intrón son
posteriormente cortadas y eliminadas cuando el RNA mensajero es procesado a su forma final.

1.2 Replicación de DNA

En todos los organismos la replicación del DNA es necesaria para la división celular ya sea para
generar nuevos organismos, como ocurre en organismos celulares, o para producir nuevas células
en un organismo pluricelular. El proceso debe ser preciso, de manera que las nuevas células u
organismos posean esencialmente la misma información genética que la célula progenitora. Así, la
secuencia de bases nucleotídicas existente en cada molécula larga de la doble hélice de DNA debe
duplicarse con precisión para generar una copia de la molécula original. La replicación es
semiconservativa, es decir cada una de las dobles hélices resultantes contiene una cadena parental
y otra de nueva síntesis.

Debido a que el precursor de cada nucleótido en la cadena es un nucleótido 5’-tri-fosfato, del cual
se eliminan los dos fosfatos terminales y el fosfato interno se une covalentemente a la ribosa de la
cadena naciente. La adición del nucleótido a la cadena naciente requiere la presencia de un grupo
hidroxilo libre, el cual se encuentra exclusivamente en el extremo 3’ de la molécula. Por lo tanto, la
replicación del DNA siempre ocurre desde el extremo 5’ al hidroxilo del extremo 3’, uniéndose el
fosfato 5’ de cada nucleótido nuevo que se incorpora al hidroxilo 3’ del nucleótido añadido
previamente.

Por otra parte, las enzimas que catalizan la adición de los nucleótidos se denominan DNA
polimerasas. Estas sintetizan el nuevo DNA en la dirección 5’ a 3’, añadiendo un nucleótido a un
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3’-OH preexistente. Sin embargo, para que pueda comenzarse una nueva cadena, debe existir un
iniciador (primer), un lugar al que la DNA polimerasa pueda añadir el primer nucleótido. En la
mayoría de los casos, el iniciador es un fragmento corto de RNA.

Cuando la doble hélice se abre al comienzo de la replicación, primero actúa una enzima llamada
primasa, la cual polimeriza RNA, lo que da como resultado la síntesis de este RNA iniciador. En el
extremo creciente de este RNA iniciador, existe un grupo 3’-OH al cual la DNA polimerasa añade el
primer desoxirribonucleótido. Por tanto, la subsecuente elongación de la molécula se produce como
DNA y no como RNA.

a) Iniciación de la síntesis de DNA

Como ocurre con la mayoría de los procariotas, el cromosoma es una molécula de DNA circular.
Además, existe un único sitio en el cromosoma en el que se inicia la síntesis de DNA, denominado
origen de replicación. El origen de replicación consiste en una secuencia específica de 300 pares
de bases que es reconocida por proteínas específicas de la iniciación. En el origen de la replicación,
la doble hélice de DNA se abre y la iniciación de la replicación del DNA se produce en las dos
cadenas. A medida que la replicación procede, el sitio de replicación, denominado horquilla de
replicación, parece moverse a lo largo del DNA.

La replicación es frecuentemente bidireccional desde el origen de replicación (Figura 4) y por tanto,

existen dos horquillas de replicación replicando en direcciones opuestas. En el DNA circular, la
replicación bidireccional conduce a la formación de estructuras características denominadas
estructuras theta. La mayoría de las grandes moléculas de DNA, procarióticas o eucarióticas, tiene
replicación bidireccional desde un origen fijo. Cada cromosoma eucariótico tiene muchos orígenes,
lo cual no se debe a que el DNA es más largo sino a que las DNA polimerasas de eucariotas no
replican tan rápidamente como las enzimas de procariotas.

Figura 4. En el DNA circular, la replicación bidireccional desde un origen conduce a la formación de

intermediarios replicativos que recuerdan a la letra griega theta ().

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b) Cadena líder y cadena retardada

Existen cinco DNA polimerasas diferentes en E. coli, denominadas DNA polimerasa I a V. La DNA
polimerasa III es la enzima principal en la horquilla de replicación.

En la horquilla de replicación (Figura 5), la doble hélice de DNA se desenrolla formándose una
pequeña región de cadena sencilla, por la acción de proteínas específicas llamadas helicasas. Las
helicasas son enzimas dependientes de ATP que hidrolizan ATP cuando se mueven a lo largo de
la hélice delante de la horquilla de replicación. La región de cadena sencilla generada está asociada
a una proteína especial, la “proteína que se une a cadena sencilla” que estabiliza el DNA de cadena
sencilla, impidiendo la formación de puentes de hidrógeno intracatenarios. En la cadena que crece
desde 5’-fosfato al 3’-hidroxilo, llamada cadena líder, la síntesis de DNA se produce continuamente
porque siempre existe un 3’-OH al que añadir un nuevo nucleótido. Pero en la cadena opuesta
llamada cadena retardada, la síntesis de DNA ocurre discontinuamente (ya que no existe 3’-OH en
la horquilla de replicación al que se pueda unir un nuevo nucleótido). Por lo tanto, en la cadena
retardada debe sintetizarse primero un pequeño iniciador (o primer) de RNA (11 bases) para
suministrar el extremo 3’-OH libre, Después de sintetizarse el iniciador, la primasa es reemplazada
por la DNA polimerasa III, la cual añade los desoxirribonucleótidos hasta que se encuentre con el
DNA sintetizado previamente. En este momento la DNA polimerasa III se detiene.

Figura 5. Acontecimientos que ocurren en la horquilla de replicación del DNA.

La siguiente enzima involucrada, DNA polimerasa I puede sintetizar DNA sin problemas, sin
embargo, a medida que adiciona nucleótidos al extremo 3’-OH, posee actividad exonucleasa 5’ a 3’
que elimina el RNA con el que se encuentre (Figura 6), por lo que cuando el iniciador se ha eliminado
y reemplazado con DNA, la DNA polimerasa I se libera. El último enlace fosfodiéster se forma por
una enzima llamada DNA ligasa, la cual sella cualquier corte que tenga un 5’-fosfato y un 3’-OH,
además junto con la DNA polimerasa I está implicada en la reparación del DNA.

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 Figura 6. Ligazón de dos fragmentos en la cadena retardada. (a) la DNA polimerasa III está sintetizando
DNA en la dirección 5’ a 3’ hacia el iniciador de RNA de un fragmento sintetizado previamente en la cadena
retardada. (b) Al llegar a este fragmento, la DNA polimerasa I reemplaza a la III. (c) La DNA polimerasa
continúa sintetizando DNA a la vez que elimina el iniciador de RNA del fragmento previo. (d) La DNA ligasa
reemplaza a la DNA polimerasa I cuando el iniciador ha sido eliminado. (e) La DNA ligasa sella el hueco y
liga los dos fragmentos.

Cada corto fragmento de DNA sintetizado por la DNA polimerasa III en la cadena retardada se
denomina fragmento de Okazaki y tiene una longitud de unas 1000 bases. Cada uno debe iniciarse
individualmente. Por el contrario, la cadena líder se inicia sólo una vez, al comienzo. Debido a la
bidireccionalidad, existen dos horquillas de replicación moviéndose en direcciones opuestas, lo que
significa que ya en el origen se forman dos cadenas líder y dos cadenas retardadas (Figura 7).

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 Figura 7. Las dos horquillas de replicación deben comenzar en un origen que dirige la replicación
bidireccional. Por tanto, deben iniciarse dos cadenas líderes, cada una en una dirección.

Mientras continúa la síntesis de DNA en la horquilla de replicación, se producen cambios en el

enrollamiento del DNA, modificados por enzimas desenrollantes y topoisomerasas. A su vez, el
complejo DNA polimerasa está fijo hacia la mitad de la célula bacteriana y actúa como una factoría
de replicación, tirando del DNA molde hacia él a medida que tiene lugar la replicación. Por tanto, es
el DNA y no la polimerasa lo que se mueve durante la replicación.

c) Actividad correctora

Los errores en la replicación del DNA producen mutaciones. Las velocidades de mutación en los
organismos vivos son muy bajas, entre 10-8 y 10-11 por par de bases insertados. Esta precisión es
posible en parte porque la DNA polimerasa tiene dos posibilidades de incorporar la base correcta
en un sitio determinado. La primera posibilidad ocurre cuando se insertan las bases
complementarias de acuerdo con la regla de apareamiento de las bases, A con T y G con C, usando
la cadena molde como modelo. La segunda posibilidad ocurre a causa de la denominada actividad
correctora, asociada tanto a la DNA polimerasa I como a la DNA polimerasa III (Figura 8). Siendo
la actividad exonucleasa correctora opuesta a la actividad nucleasa 5’ a 3’ de la DNA polimerasa I
utilizada para eliminar el iniciador con el que se encuentra.

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 Figura 8. Actividad correctora de la DNA polimerasa III por medio de la actividad exonucleasa 3’ a 5’. (a)
Una base introducida erróneamente en el extremo causa la parada momentánea de la polimerasa. Esta es
la señal para que la actividad correctora (b) elimine la base incorrecta y se (c) incorpore la base correcta por
la actividad polimerasa.

d) Terminación de la replicación

Los detalles del proceso de terminación de la horquilla de replicación no se conocen totalmente,

pero está claro que ambas horquillas de replicación no chocan entre sí como dos trenes. Ciertas
secuencias de DNA y proteínas específicas están implicadas en detener las horquillas de replicación
y permitir la terminación del proceso. Cuando la replicación de la molécula circular se completa, las
dos moléculas circulares quedan enlazadas como los eslabones de una cadena, estas pueden ser
desenganchadas por una topoisomerasa.

El proceso en el cual el DNA se reparte de manera que cada célula hija tenga una copia del
cromosoma, en eucarióticas el núcleo se divide tras la duplicación del número de cromosomas
según un proceso denominado mitosis, el cual produce dos células hijas, cada una con un conjunto
completo de cromosomas. Mientras que en procariotas pueden existir proteínas que se unan a
secuencias específicas de DNA y ayuden a tirar de los cromosomas hacia células hijas.

1.3 Transcripción

La transcripción de la información genética de DNA a RNA se lleva a cabo por la acción de la enzima
RNA polimerasa, que cataliza la formación de enlaces fosfodiéster entre ribonucleótidos. La RNA
polimerasa requiere un molde de DNA. Los precursores del RNA son los ribonucleósido trifosfato
ATP; GTP, UTP y CTP. La química de la síntesis de RNA es similar a la de la síntesis de DNA, es
decir que durante la elongación de la cadena de RNA, se añaden ribonucleótidos al 3’-OH de la
ribosa del nucleótido precedente que se polimerizan mediante la liberación de dos enlaces de alta
energía. Así en la síntesis de RNA, la dirección de la cadena naciente es del extremo 5’ al 3’ y la
cadena molde es antiparalela. A diferencia de la DNA polimerasa, la RNA polimerasa puede
comenzar las cadenas (el nucleótido inicial de la cadena de RNA retiene los tres fosfatos). La
primera base en el RNA es siempre una purina, ya sea adenina o guanina.

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En la mayoría de los casos, el DNA molde utilizado por la RNA polimerasa es un DNA bicatenario,
pero para un gen determinado sólo se transcribe una de las cadenas. Mientras estos principios
son válidos para las RNA polimerasas de todos los organismos. Sin embargo, en procariotas existe
sólo una RNA polimerasa, mientras que los núcleos de eucariotas poseen tres enzimas: RNA
polimerasa I, RNA polimerasa II y RNA polimerasa III. Todas son enzimas multiméricas y todas
contienen algunas subunidades evolutivamente conservadas.

La RNA polimerasa es una enzima enorme formada por las subunidades del núcleo que por sí solo
cataliza la formación de RNA y la subunidad sigma cuya función consiste en el reconocimiento del
sitio apropiado en el DNA para la iniciación de la síntesis de RNA. Por lo tanto, para comenzar la
síntesis de una cadena de RNA correctamente (Figura 9), la RNA polimerasa debe reconocer
primero la región del DNA apropiada, los cuales se denominan promotores. Es importante de
señalar que una de las dos cadenas se transcribe cada vez. La cadena que debe transcribirse está
determinada por la orientación de la secuencia del promotor. La RNA polimerasa sintetiza RNA a
medida que se mueve alejándose del promotor.

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Figura 9. Etapas de la síntesis de un RNA mensajero. Los sitios de iniciación y terminación son secuencias
de nucleótidos específicas del DNA. La RNA polimerasa se mueve sobre el DNA alejándose del promotor,
causando una separación transitoria de la doble hélice y la transcripción de una de las cadenas. Cuando se
alcanza el sitio de terminación, se detiene el crecimiento de la cadena, y el mRNA y la polimerasa se
liberan.

a) Iniciación de la transcripción

Una vez que se une la RNA polimerasa, puede comenzar el proceso de transcripción, en el cual la
doble hélice del DNA es abierta por la RNA polimerasa. A medida que la polimerasa se mueve,
produce el desenrollamiento de segmentos cortos, los cuales se transcriben y posteriormente se
cierran de nuevo. Como resultado de este desenrollamiento transitorio, las bases de la cadena
molde quedan expuestas y se copian al RNA complementario. Así, el promotor orienta a la RNA
polimerasa en una u otra dirección. Cuando una región del DNA posee dos promotores orientados
en direcciones opuestas, la transcripción desde uno de esos promotores se produce en una
dirección (en una de las cadenas) y la transcripción desde el otro se produce en la dirección opuesta
(en la otra cadena).

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Una vez que se sintetiza una pequeña porción de RNA, el factor sigma se disocia; la mayor parte
de la elongación se lleva a cabo exclusivamente por el núcleo de la enzima. Análogamente, el factor
sigma está implicado exclusivamente en la iniciación del complejo DNA-RNA polimerasa. A medida
que el RNA sintetizado se disocia del DNA, el DNA abierto se cierra y regresa a la doble hélice
original. La transcripción se detiene en regiones específicas denominadas terminadores de la
transcripción.

Por tanto, a diferencia de la replicación, que implica copiar un genoma entero, la transcripción se
circunscribe a unidades mucho más pequeñas del DNA, frecuentemente a un único gen. Esto hace
que la célula transcriba diferentes genes a frecuencias muy diferentes.

Un organismo determinado puede tener varios factores sigmas y un gran número de promotores.
En el caso de E. coli codifica 7 factores sigma que permiten a la RNA polimerasa reconocer
diferentes secuencias de promotores. Incluso así, en una determinada bacteria la mayoría de los
genes requieren una especie única de factor sigma, ya que como se observa en la Figura 10, todas
las secuencias no son idénticas, sin embargo, dentro de la región promotora hay dos secuencias
altamente conservadas en todos los promotores, que son las reconocidas por sigma. Una es una
región de 10 bases antes del comienzo de la transcripción, la región -10 llamada caja Pribnow, la
cual tiene la secuencia consenso TATAAT. La segunda región de secuencia conservada está a 35
bases del comienzo de la transcripción. La secuencia consenso para esta región es TTGACA.

Figura 10. Interacción de la RNA polimerasa con el promotor. Se indican los contactos de la RNA
polimerasa con la secuencia -35 y la caja Pribnow. Debajo de las secuencias reales de las regiones -35 y
Pribnow se muestran las secuencias consenso derivadas de la comparación de muchos promotores.

Cada factor sigma reconoce una secuencia consenso diferente. Por tanto, estos factores sigma
dirigirán la RNA polimerasa a promotores con secuencias diferentes. Estos promotores estarán

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asociados con diferentes genes. Es importante señalar que los promotores son bicatenarios, esto
es, la RNA polimerasa reconoce y se une a DNA de doble cadena. No obstante, sólo una de las
cadenas servirá como molde durante la transcripción.

Recordar que los núcleos de los eucariotas contienen tres RNA polimerasas diferentes. Cada una
de estas enzimas reconoce un promotor que está asociado con un tipo particular de gen. La RNA
polimerasa I sintetiza la mayoría de los tipos de rRNA; la RNA polimerasa II sintetiza todo el mRNA
y la RNA polimerasa III sintetiza tRNA. La razón de esta especificidad es que cada tipo de RNA
polimerasa sólo reconoce los promotores asociados con cada clase de gen particular.

b) Terminadores de la transcripción

La terminación de la síntesis de RNA tiene lugar en secuencias de bases específicas en el DNA. En

bacteria una secuencia de terminación habitual es una secuencia que contiene una repetición
invertida con un segmento central no repetido (Figura 11). Cuando se transcribe una secuencia de
DNA como ésta, el RNA forma un bucle en forma de horquilla por apareamiento intracatenario de
bases. Cuando tales estructuras de bucles con forma de horquilla en el RNA van seguidos por varias
uridinas, se convierten en terminadores eficaces de la transcripción. Otros sitios de terminación son
regiones donde una secuencia rica en GC es seguida por otra región rica en AT. Tales tipos de
secuencias producen la terminación sin necesidad de factores extras adicionales y se denominan
terminadores intrínsecos.

Figura 11. Las repeticiones invertidas en el DNA transcrito conducen a a formación de estructuras en forma
de bucle con tallo en el RNA, que pueden causar la terminación de la transcripción.

Se han descubierto otros tipos de secuencias terminadoras que requieren factores proteicos
específicos, además de RNA polimerasa, para su funcionamiento En E. coli un tipo de terminador
de la transcripción requiere una proteína denominada Rho, la cual no se une a la RNA polimerasa
ni al DNA, pero se une fuertemente al RNA y acerca la cadena de RNA al complejo DNA-RNA

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polimerasa. Una vez que la RNA polimerasa se ha detenido en un sitio de terminación dependiente
de Rho, Rho hace que tanto el RNA como la RNA polimerasa abandonen el DNA, terminando así
la transcripción. Otras proteínas implicadas en la terminación de la transcripción son al igual que
Rho, proteínas que se unen al RNA. En todos los casos, las secuencias implicadas en la terminación
operan a nivel de RNA. Sin embargo, debemos recordar que el RNA se transcribe del DNA y por
tanto, la terminación de la transcripción está determinada en último término por secuencias
específicas de nucleótidos en el DNA.

c) Procesamiento del RNA y ribozimas

La transcripción puede producir varios tipos de RNA: RNA mensajero, RNA de transferencia y RNA
ribosómico. Sin embargo, para ser funcionales, muchos de estos RNAs deben ser primero
procesados a una forma madura después de transcribirse. En realidad, el único RNA funcional que
es el producto directo de la transcripción es el mRNA de procariotas. El resto de los RNAs requiere
algún tipo de procesamiento. El procesamiento del RNA es la conversión de un RNA precursor a un
RNA maduro.

Existen tipos muy diferentes de procesamiento, en procariotas y eucariotas, los tRNAs y rRNAs son
sintetizados como largas moléculas precursora que son luego cortadas para originar el RNA maduro
final (Figura 12). además, muchas de las bases en el tRNA son modificadas después de la
transcripción.

Figura 12. Transcripción de una unidad de rRNA en Bacteria. Este tipo de unidad transcripcional se llama
“operón rRNA”, los cuales contiene n los genes de los rRNAs, en el orden 16S, 23S y 5S.

En eucariotas y mucho menos frecuentemente en procariotas, el mRNA es el resultado de

procesamiento de un pre-mRNA, ya que los genes de eucariotas están a menudos interrumpidos
por secuencias no codificadoras, intrones, que separan las regiones codificadoras, exones. El
transcrito primario de un gen escindido debe ser procesado para separar las regiones no

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codificadoras antes que se inicie el proceso de traducción. La etapa de procesamiento, por la cual
se eliminan los intrones se denomina proceso de corte y empalme (splicing).

Aunque los intrones se han encontrado en diferentes tipos de genes en procariotas y eucariotas, la
maquinaria de corte y empalme que elimina los intrones del pre-mRNA eucariótico es única. El
proceso implica un complejo de varias ribonucleoproteínas (formado por un RNA pequeño y
proteínas) llamada partícula procesadora (spliceosome). Esta partícula tiene una estructura
altamente compleja capaz de eliminar intrones y unir los exones adyacentes para formar un mRNA
maduro. La Figura 13esquematiza la reacción de dos etapas, mediante la cual se elimina un intrón
presente en el pre-mRNA de eucariotas como una estructura en bucle. Estos intrones eliminados
son degradados por la célula. En eucariotas superiores es frecuente encontrar varios intrones en
un único gen y es importante no sólo que sean eliminados sino que sean eliminados en el orden
correcto. Algunos intrones (en especial los encontrados en los genes tRNA y en genes de las
mitocondrias o cloroplastos) son eliminados por un proceso diferente que requiere varias proteínas.
Varios intrones, incluyendo todos los que se encuentran en bacteria, se autoprocesan, es decir se
autocortan y autoensamblan. Estas se denominan ribozimas y corresponden a enzimas
procesadoras de RNA que se liberan de una molécula de RNA a la vez que enlazan los exones
adyacentes.

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 Figura 13. Eliminación de un intrón del transcrito de un gen eucariótico que codifica proteína. (a) El pre-
mRNA con un único intrón. La secuencia GU está conservada en el sitio de corte 5’ y la AG en el sitio 3’.
Existe también una A interna que sirve de punto de ramificación. (b) Varias partículas de pequeñas
ribonuceloproteínas (mostradas en marrón) se ensamblan sobre el RNA para formar la “partícula
procesadora” (spliceosome). Cada una de estas partículas contiene diferentes pequeñas moléculas de RNA
que están implicadas en el mecanismo del procesamiento. (c) El sitio de corte 5’ se ha cortado con la
formación simultánea de un punto de ramificación. (d) El sitio de corte 3’ ha sido cortado, a la vez que se
unen los dos exones.(e) Los productos finales son exones unidos, el mRNA y el intrón eliminado.

En el procesamiento de los mRNA eucarióticos se producen otras dos etapas únicas. Ambas etapas
tienen lugar en el núcleo, antes de que el mRNA maduro sea transportado al citoplasma. La primera
etapa se denomina capping y ocurre antes de que se complete la transcripción. Esta consiste en la
adición de guanina metilada al fosfato del extremo 5’. La última etapa del procesamiento consiste
en el corte del extremo 3’ del pre-mRNA y la adición de una cola de poliA. Esta etapa se denomina
poliadenilación y puede producirse en conjunto con la terminación (Figura 14).

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 Figura 14. Visión general del procesamiento de un pre-mRNA en un mRNA maduro en eucariotas. Las
etapas del procesamiento incluyen la adición del cap al extremo 5’, la eliminación de intrones y el corte del
extremo 3’ del transcrito a la vez que se añade la cola de poli-A. También se indica la localización de los
codones de inicio y de parada que se usarán durante la transcripción.

1.4 Traducción

En los pasos anteriores de transmisión de la información genética (replicación y transcripción), tanto

el producto como el molde eran ácidos nucleicos. En esta etapa, la traducción, el molde es un ácido
nucleico (RNA mensajero), pero el producto es una proteína.

Antes de considerar el mecanismo de la traducción, analizaremos la correspondencia entre el ácido

nucleico molde y la secuencia amino acídica en el polipéptido producido: el código genético. Este
es el corazón de la transferencia de información biológica a una forma funcional, esto es, la
traducción de la información genética a proteínas estructurales y enzimas que le permiten a la célula
realizar todas sus funciones.

a) Código genético

Convencionalmente se presenta el código genético como mRNA y no como DNA, debido a que el
proceso de traducción se produce en el RNA. Un triplete de tres bases llamado codón codifica un
aminoácido específico (Figura 15). Entre los 64 codones posibles de mRNA se encuentran los que
codifican diversos aminoácidos, codones especiales para iniciar (AUG) y para finalizar la traducción
(UAA, UAG, UGA). Una secuencia de ADN que codifique para una proteína será tal que una vez
llevada a RNA incorporará un codón de inicio seguido por un número de codones (de un largo tal
que codifiquen para una proteína funcional) y un codón de término. Una secuencia de ADN de estas
características se conoce como un marco de lectura abierto (Open Reading frame, ORF)

21
Una característica del código genético es que la mayoría de los aminoácidos están codificados por
varios tripletes relacionados pero diferentes, esta propiedad del código se denomina degeneración.
En la célula un codón es leído por apareamiento de bases con una secuencia de tres bases presente
en un tRNA denominada anticodón. Debido a que el código genético es degenerativo o degenerado,
algunos aminoácidos deben tener varios tRNAs, pero también algunos tRNAs pueden leer más de
un codón. Esto es posible porque en algunos casos las moléculas de tRNA forman apareamientos
estándar en las dos primeras bases del codón, permitiendo apareamientos inusuales en la tercera
posición, lo cual se denomina flexibilidad (wobble). El apareamiento entre G y U se permite en la
tercera posición.

Figura 15: El código genético. Los codones están expresados en DNA (T en vez de U), y se leen desde
el centro. Así, el codón de inicio que codifica para metionina sería ATG en DNA y AUG en RNAm.

El mensaje se lee comenzando con el codón de inicio, AUG, el cual, al comienzo del mensaje,
codifica el aminoácido N-formilmetionina (o metionina en eucariotas y arqueas). La importancia de
tener un lugar de inicio bien definido se debe a que, con el código de tripletes, es esencial para que
la traducción comience en el sitio correcto, ya que en caso contrario cambia el marco de lectura
global y se sintetizará una proteína totalmente diferente (o ninguna proteína). Se ha convenido que
la fase abierta, es decir la que origina la proteína codificada por el gen, se denomine fase 0. Las
otras dos fases de lecturas posibles (-1 y +1) no codifican la misma secuencia de aminoácidos.

22
Los ribosomas de bacterias reconocen AUG como codón de iniciación específico con la ayuda de
una secuencia anterior en el mRNA llamada secuencia de Shine-Dalgarno. Esta ayuda extra en la
iniciación explica por qué unos pocos mensajes de bacterias utilizan en realidad otros codones,
tales como GUC, como codón de inicio. Sin embargo, incluso estos codones de inicio inusuales
codifican N-formilmetionina.

b) RNA de transferencia

Existen unos 60 tRNAs específicos diferentes en células bacterianas y 110 en mamíferos. Las
moléculas de RNA de transferencia son cortas moléculas monocatenarias de 73-93
nucleótidos. Cuando se comparan, se observa que ciertas bases y estructuras son
constantes para todos los tRNAs, mientras que otras regiones son variables. Las moléculas
de tRNA también contienen algunas bases de purina y pirimidina que difieren ligeramente
de las bases normales presentes en el RNA por haber sido modificadas químicamente, a
menudo metiladas; por ejemplo, metil guanosina, dimetil guanosina y metil inosina. Estas
modificaciones de las bases se producen después de la transcripción. Estas modificaciones
de las bases, así como otros tipos de procesamiento, son necesarios para conseguir un
tRNA funcional a partir del transcrito de un gen que codifica un tRNA. Aunque el tRNA es
una cadena sencilla, dentro de la molécula existen regiones de doble cadena como resultado
del apareamiento de bases internas cuando la molécula se pliega sobre sí misma.

La estructura del tRNA puede dibujarse como una hoja de trébol (Figura 16 a ). algunas regiones
de la estructura secundaria reciben nombres relacionados con las bases que contienen (bucle TC
y bucle D) o con funciones específicas (bucle anticodón y extremo aceptor). La estructura
tridimensional de un tRNA (Figura 16 b), muestra que las bases que aparecen separadas en el
modelo de la hoja de trébol están enlazadas por interacciones hidrofóbicas.

Figura 16. Estructura del RNA de transferencia (Fenilalanil tRNA de levaduras). (a) Estructura convencional
en hoja trébol. A, adenina; C, citosina; U, uracilo; G, guanina; pseudouracilo; D, dihidrouracilo; m, metil; Y,

23
 una purina modificada. (b) molécula se pliega de manera que los bucles D y TC quedan muy próximos y
se asocien por interacciones hidrofóbicas.

Una de las regiones variables de la molécula de RNA contiene el anticodón, el sitio que reconoce
el codón en la molécula de mRNA. El anticodón se encuentra en el bucle anticodón y en él hay tres
nucleótidos implicados en el proceso de reconocimiento y que se aparean con el codón. Otras
regiones del tRNA interaccionan con el ribosoma (tanto con su rRNA como con sus proteínas), otros
factores proteicos y la enzima activadora o aminoacil-tRNA sintetasa (es la que reconoce al
aminoácido y al tRNA específico para ese aminoácido). En el extremo 3’ o extremo aceptor de todas
las tRNAs, existen tres bases no apareadas. La secuencia de estos nucleótidos es siempre CCA y
es el lugar donde la ribosa de la A terminal se une covalentemente al aminoácido mediante un
enlace éster.

El reconocimiento del tRNA correcto por una aminoacil-tRNA sintetasa implica contactos específicos
entre regiones clave del ácido nucleico y aminoácidos particulares de la respectiva sintetasa, ya
que si se uniera un aminoácido equivocado al tRNA, se insertaría en un lugar equivocado del
polipéptido, dando lugar a la síntesis de una proteína errónea.

La reacción específica entre un aminoácido y el tRNA catalizada por la aminoacil-tRNA sintetasa

requiere en primer lugar la activación del aminoácido por reacción con el ATP. Una vez formado, el
intermediario aminoacil-AMP normalmente permanece unido a la enzima hasta colisionar con un
tRNA apropiado; entonces, el aminoácido activado se transfiere al tRNA para formar un tRNA
cargado.

c) Etapas de la síntesis de proteínas

 Iniciación: en procariotas, la iniciación comienza siempre con una subunidad ribosómica 30S
libre y un complejo de iniciación compuesto por una subunidad ribosómica 30S, mRNA,
formilmetionina tRNA y factores de iniciación. Para esta etapa se requiere guanosina trifosfato.
A este complejo de iniciación se le une la subunidad 50S para formar un ribosoma activo 70S.
Al final del proceso de traducción, el ribosoma liberado se divide de nuevo en subunidades 30S
y 50S.

Inmediatamente anterior al codón de iniciación existe una secuencia de 3 a 9 nucleótidos,

llamada secuencia de Shine-Dalgarno, involucrada en la unión del mRNA al ribosoma. El sitio
de unión del ribosoma presente en el extremo 5’ del mRNA es complementario al extremo 3’ del
RNA 16S del ribosoma, y este apareamineto de bases es lo que asegura la formación efectiva
del complejo ribosoma-mRNA.

La iniciación comienza siempre con la unión de un aminoacil-tRNA iniciador especial al codón

de inicio AUG. En bacteria este tRNA lleva formilmetionina. Posteriormente, el grupo formilo del
extremo amino terminal del polipéptido se elimina; por tanto, el aminoácido terminal de la
proteína completa es metionina. Dado que las secuencias de Shine-Dalgarno (y otras posibles
interacciones entre el rRNA y el mRNA) están implicadas en dirigir al ribosoma al lugar de inicio,
24
 los mensajes procarióticos utilizan a veces un codón de comienzo diferente a AUG. El codón
alternativo más frecuente es el GUG. Cuando se usa de esta manera inusual, GUC une tRNA
iniciador con formilmetionina (en lugar de valina). En eucariotas y arqueas, la iniciación
comienza con metionina en lugar de formilmetionina. Es importante destacar que aunque todas
las proteínas se inician con metionina, este aminoácido es eliminado por una proteasa específica
al terminar la traducción.

 Elongación: El contacto principal entre el mRNA y el ribosoma se establece primariamente a

través de la subunidad 30S. El ribosoma contiene otros sitios en los que interactúa el tRNA. Dos
de estos sitios están localizados primariamente en la subunidad 50S y son denominados sitio P
y sitio A (Figura 1.65). El sitio A, o sitio aceptor es el lugar donde se une el nuevo AA-tRNA. El
sitio P, el sitio peptidílico, es el lugar donde está anclado el péptido naciente mediante un tRNA.
Durante la formación del enlace peptídico, el péptido se transfiere al tRNA del sitio A a la vez
que se forma un nuevo enlace peptídico. Durante esta etapa se requieren varios factores para
la elongación (no ribosómicos), así como moléculas adicionales de GTP (a efectos de
simplificación, en la Figura 17 se han omitido los factores de elongación y sólo se muestra una
porción del ribosoma). El tRNA que mantiene al polipéptido debe ser ahora translocado desde
el sitio A al sitio P, dejando así libre el sitio A para recibir otro AA-tRNA. La translocación requiere
un factor de elongación específico y una molécula de GTP por cada tRNA translocado. En cada
etapa de translocación el mensaje avanza tres nucleótidos, exponiendo un nuevo codón al sitio
A del ribosoma. La translocación empuja el tRNA que ha quedado vacío a un tercer sitio, llamado
sitio E; desde este lugar de salida, el tRNA es liberado del ribosoma. La precisión de la etapa
de translocación es crítica para la precisión de la síntesis proteica. El ribosoma debe moverse
exactamente un codón cada etapa. El ribosoma es una estructura dinámica: tanto el mRNA
como el tRNA se mueven a través del ribosoma a medida que tienen lugar las varias etapas de
la síntesis de proteínas.

25
 Figura 17. Síntesis de ribosomas y proteínas. Durante la iniciación de la síntesis de proteínas, el mRNA y
tRNA iniciador, llevan N-formilmetionina ("Met"), los cuales se unen primero a la subunidad pequeña del
ribosoma. Factores de iniciación (no mostrados) usan la energía del GTP para promover la adición de la
subunidad ribosómica grande. El tRNA iniciador comienza en el sitio P. Durante la elongación de la
traducción. Factores de elongación (no mostrados) utilizan GTP para instalar el entrante tRNA en el sitio A.
La formación del enlace péptido es entonces catalizada por la 23S rRNA. La translocación del ribosoma a lo
largo del mRNA a partir de un codón requiere la hidrólisis de otro GTP. El tRNA saliente se libera desde el
sitio E. El siguiente tRNA cargado se une al sitio A y el ciclo se repite.

Cuando varios ribosomas están traduciendo simultáneamente un mensaje, el complejo se

denomina polisoma (Figura 18). Los polisomas incrementan la velocidad y la eficacia de la

26
 traducción y dado que cada ribosoma actúa independientemente de los otros, cada ribosoma
del polisoma produce un polipéptido completo.

Figura 18. Traducción de un único RNA mensajero por varios ribosomas (polisoma). El ribosoma más cercano a
extremo 5’ del mensaje está en un estado más temprano del proceso.

 Terminación: Esta etapa ocurre cuando se llega a un codón que no especifica para ningún AA-
tRNA: un codón de parada. Ningún tRNA se une a un codón de parada; en su lugar, unas
proteínas llamadas factores de liberación leen la señal terminadora de la cadena y cortan el
polipéptido unido separándolo del tRNA terminal, liberando así la proteína completa. A
continuación, el ribosoma se disocia y las proteínas quedan libres para formar nuevos complejos
de iniciación.

Posteriormente, las proteínas son plegadas en su forma activa con la ayuda de otras proteínas
llamadas chaperones moleculares para que adquiera el plegamiento apropiado o para
ensamblarse en complejos grandes. Los chaperones no forman parte de las proteínas
ensambladas. Un tipo de chaperón molecular, conocido como chaperoninas permite a la
proteína no-plegada, plegada inapropiadamente o parcialmente desnaturalizada, volver a
plegarse y luego se libera (Figura 19). La energía para el plegamiento proviene del ATP.

Figura 19. Acción de un chaperón molecular. Una proteína impropiamente se incorpora dentro de la estructura en
forma de barril de la chaperonina. Se utiliza la energía del ATP para plegar la proteína adecuadamente.

27
2 Principios de biología molecular y sus aplicaciones en la modificación de
microorganismos
Cualquier organismo está determinado por su material genético y su interacción con el medio
ambiente que selecciona, activa, reprime o cambia el material genético.

Las bacterias poseen un genotipo que transmiten por herencia y un fenotipo que depende de las
circunstancias que les rodean. Las bacterias sufren variaciones en sus caracteres y son de dos
tipos: fenotípicas y genotípicas (mutaciones, fenómenos de transferencia, elementos
transponibles, integrones).

El estudio de la genética bacteriana, atendiendo a los dos aspectos anteriores, permite entender
mejor las funciones esenciales de su material genético y las características que rigen su
comportamiento, su capacidad de adaptación al medio ambiente, la expresión de mecanismos de
virulencia que les permite colonizar, invadir, y dañar células eucariotas, y como consecuencia, el
desarrollo de un gran espectro de enfermedades clínicas.

2.1 Variaciones genotípicas: mutación y recombinación

La mutación es un cambio hereditario en la secuencia de bases del ácido nucleico que constituye
el genoma de un organismo. La recombinación genética es el proceso en el que los elementos
genéticos contenidos en dos genomas separados se juntan en una unidad. Puesto que los
elementos que se han asociado pueden capacitar al organismo a llevar a cabo alguna función
nueva, la recombinación genética puede dar como resultado la adaptación a cambios ambientales,
mientras que la mutación origina generalmente un pequeño cambio genético en una célula, la
recombinación suele acarrear cambios mucho mayores.

a) Mutación

Una mutación es un cambio hereditario en la secuencia de bases del ácido nucleico genómico de
un organismo. Una cepa que lleva este tipo de cambio se denomina un mutante, el cual difiere de
su cepa parental en el genotipo, es decir en el conjunto de genes del organismo. Pero, además, las
propiedades observables del mutante, su fenotipo, pueden también estar alteradas en relación con
la cepa parental. Normalmente, una cepa aislada de la naturaleza se considera una cepa silvestre.
Se puede obtener mutantes de una cepa silvestre o de una cepa derivada de ésta, por ejemplo, de
otro mutante.

Cualquier característica de un organismo puede ser cambiada por mutación. Sin embargo, algunas
mutaciones son seleccionables, confiriendo algún tipo de ventaja a los organismos que la poseen,
mientras que otras son no seleccionables, incluso aunque causen un cambio claro en el fenotipo de
un organismo. Un ejemplo de mutación seleccionable es la resistencia a una droga: un mutante
resistente a un antibiótico puede crecer en presencia de concentraciones de antibiótico que inhiben
o matan la cepa parental. Por tanto, la selección es un instrumento genético muy poderoso que
permite el aislamiento de un solo mutante a partir de una población de cepas parentales. Una
técnica para detectar las mutaciones de fenotipo es mediante un proceso denominado rastreo, en
29
el cual sólo se examina un gran número de colonias buscando las “diferentes”, por ejemplo, la
diferencia entre colonias pigmentadas y no pigmentadas. Existen métodos que permiten el rastreo
de gran número de colonias, como es el caso de réplica en placa que permite detectar mutantes
nutricionales. A partir de una placa original, y con el uso de un terciopelo o filtro de papel estéril, se
hace una impresión en otra placa de agar que carezca del nutriente en cuestión. Las colonias del
tipo parental crecerán normalmente, mientras las del mutante no. Por tanto, la incapacidad de una
colonia para crecer en la placa réplica es una señal de que es una mutante. Un mutante nutricional
que tenga un requerimiento por un factor de crecimiento se suele denominar auxótrofo y la cepa
parental de la que deriva se denomina prototrofo. Por ejemplo, mutantes de E. coli con fenotipo His-
se llaman auxótrofos para la histidina.

Las mutaciones pueden ser espontáneas o inducidas. Las mutaciones espontáneas pueden surgir
como consecuencia de la acción de la radiación natural que alteran la estructura de las bases del
DNA. Las mutaciones espontáneas pueden ocurrir durante la replicación, como resultado de errores
en el apareamiento de las bases, originando cambios en el DNA replicado.

Las mutaciones que implican un par de bases, se conocen generalmente como mutaciones
puntuales. Las mutaciones puntuales pueden ser el resultado de sustituciones de pares de bases
en el DNA o de la inserción o deleción de un par de bases. Como en toda mutación, el cambio
fenotípico derivado de una mutación puntual depende de dónde ocurra exactamente la mutación en
el gen, que cambio de nucleótido tuvo lugar y que producto codifica dicho gen. Cualquier cambio en
el fenotipo de la célula es probablemente consecuencia de un cambio en la secuencia de la proteína
producida. La Figura 20 muestra diversas sustituciones de pares de bases que pueden ocurrir en
una estrecha región del DNA de un gen que codifica para una proteína. El error en el DNA se
transcribe al mRNA y este RNA erróneo se usa a su vez como molde en la traducción a proteína.
Por lo tanto, el código triplete que dirige la inserción de un aminoácido a través de un RNA de
transferencia será, por tanto, incorrecto. Sin embargo, no todas las mutaciones en los genes que
codifican proteínas causan cambios en las proteínas. Esto se debe a que el código genético es
degenerado, es decir existen más tripletes o codones que aminoácidos, de forma que un
determinado aminoácido puede estar codificado por más de un triplete. Esto se ilustra en la Figura
20, que muestra varios resultados posibles cuando el DNA que codifica exclusivamente un codón
de tirosina sufre una mutación. Como se indica, un cambio en el RNA de UAC a UAU no tendría
efecto porque UAU es también un codón de tirosina. Las mutaciones que originan este tipo de
cambio se denominan mutaciones silenciosas. A su vez un cambio de base UAC a AAC ocasiona
un cambio en la proteína de tirosina a asparagina, esto se conoce como una mutación con sentido
erróneo, porque el “sentido” químico (secuencia de aminoácidos) del polipéptido resultante ha
cambiado. Sí el cambio ocurriera en una posición crítica en la cadena polipeptídica, la proteína
podría ser inactiva o tener actividad reducida. Sin embargo, no todas las mutaciones ocasionan la
sustitución de un aminoácido por otro conducen necesariamente a proteínas no funcionales, El
resultado depende del lugar de la cadena polipeptídica en el que ha ocurrido la sustitución y cómo
afecta al plegamiento y a la actividad catalítica de la proteína. Una mutante con sentido erróneo
puede conducir a una enzima que es sensible a la temperatura. Por ejemplo, se conocen mutantes
bacterianos sensibles a la temperatura que funcionan normalmente a 30ºC pero no pueden crecer
a 40ºC, aunque el tipo silvestre crezca bien a las dos temperaturas. Tales sustituciones se
denominan también condicionalmente letales porque la bacteria no puede crecer bajo una
condición, pero puede hacerlo bajo otra. Otro posible resultado de la sustitución de pares de bases
30
es la formación de un codón de parada, lo que causaría la terminación prematura de la traducción,
originando una proteína incompleta que seguramente no sería funcional. Las mutaciones de este
tipo se denominan sin sentido porque el cambio es de un codón para un aminoácido (codón con
sentido) a un codón de terminación (codón sin sentido). A menos que la mutación sin sentido ocurra
muy cerca del final del gen, la proteína incompleta será totalmente inactiva.

Figura 20. Posibles efectos de sustituciones de pares de bases en un gen que codifica una proteína: tres
proteínas diferentes originadas por cambios en el DNA de un único codón del DNA.

Además, como el código genético se lee desde un extremo en bloques consecutivos de tres bases,
cualquier deleción o inserción de un par de bases origina un desfase en el marco de lectura y la
traducción del gen es completamente alterada. Por lo tanto, las microinserciones o microdeleciones
sólo son mutaciones por desfase si tienen lugar en la parte que incluye el marco de lectura de un
gen que codifica una proteína.

Por otra parte, las mutaciones puntuales son reversibles. Un revertiente se define operativamente
como una cepa en la que se ha restaurado el fenotipo silvestre. Los revertientes pueden ser de dos
tipos: revertientes de un mismo sitio, en el cual la mutación que restaura la actividad ocurre en el
mismo sitio en el que ocurrió la mutación original; y los revertientes de segundo sitio, la mutación
ocurre en un sitio diferente en el DNA.

Las mutaciones en un segundo sitio pueden restaurar un fenotipo silvestre debido a varios tipos de
mutaciones supresoras que restaura el fenotipo original. Las mutaciones supresoras son nuevas
mutaciones que compensan el efecto de la mutación original. Se conocen varios tipos de
mutaciones supresoras: (1) una mutación en otra parte del mismo gen puede restaurar la función
génica, por ejemplo, una mutación por desfase del marco de lectura, (2) una mutación en otro gen
puede restaurar la función del gen mutado original y la del fenotipo silvestre; y (3) una mutación en
otro gen puede originar la producción de otra enzima capaz de reemplazar a la mutada usando una
vía metabólica diferente a la usada por la enzima mutante. En este caso no existe producción de la
enzima original, pero en los otros dos sí.
31
Tal como existen microdeleciones y microinserciones donde se ven alterados uno o varios pares de
bases, también pueden ocurrir deleciones que implican la pérdida de varios cientos o miles pares
de bases. La deleción de un gran segmento de DNA ocasiona la pérdida total de la función de
cualquier gen implicado. Algunas deleciones son tan grandes que afectan a varios genes, lo cual
impide que están puedan ser restauradas a través de otras mutaciones sino sólo mediante
recombinación genética.

La microinserciones resultan de errores durante la recombinación genética, como las deleciones,

pero las inserciones grandes son el resultado de errores que ocurren durante recombinación
genética. Muchas de estas mutaciones son debidas a inserciones de DNA específicas identificables
llamadas secuencias de inserción. Incluso las mutaciones debidas a inserciones grandes pueden
revertir por una deleción que elimina la inserción.

Otros tipos de mutaciones a gran escala que implican reordenamientos causados por errores en la
recombinación, incluyen las translocaciones, en la que largos fragmentos de DNA cromosómico se
mueven a una localización diferente y las inversiones, en la que la orientación de un segmento
particular de DNA resulta invertida con respecto al DNA circundante.

b) Mutagénesis

Mientras que la frecuencia de mutación espontánea es muy baja, hay una variedad de agentes
químicos, físicos y biológicos que pueden incrementar la velocidad de mutación y se dice que
inducen a mutaciones. Estos agentes se conocen como mutágenos, los cuales pueden ser
químicos, físicos o biológicos.

Dentro de los mutágenos químicos, algunos son análogos a las bases ya que se parecen
estructuralmente a las bases púricas y pirimídicas del DNA, pero muestran propiedades erróneas
de apareamiento. Cuando unos de estos análogos se incorpora al DNA, la replicación puede ocurrir
normalmente, pero producen errores de copia lo que genera la incorporación de una base
equivocada en la cadena copiada. Otro tipo de mutágenos químicos son los agentes alquilantes,
tales como la nitrosoguanidina, la cual induce mutaciones con mayor frecuencia que los análogos
a las bases, ya que son capaces de introducir cambios directos, incluso en DNA que no se está
replicando. Tanto los análogos a las bases como los agentes alquilantes tienden a inducir
sustituciones de pares de bases.

Otro grupo de mutágenos químicos son los agentes intercalantes, por ejemplo, las acridinas, las
cuales se insertan entre dos pares de bases de DNA separándolas entre sí. Durante la replicación
está conformación anormal puede conducir a microinserciones o microdeleciones en el DNA tratado
con acridina, induciendo a mutaciones por desfase.

32
Dentro de los mutágenos físicos se encuentra la radiación, la cual puede ser ionizante y no ionizante
(electromagnéticas). Dentro de las no ionizantes encontramos la radiación ultravioleta (UV), la cual
induce a la formación de dímeros de pirimidina en el DNA, un estado en el que dos bases pirimídicas
adyacentes (citosina o timina) se unen covalentemente, de manera que se incrementa en gran
medida la probabilidad de que, durante la replicación del DNA, la DNA polimerasa inserte un
nucleótido incorrecto en posición. Suele utilizarse una dosis de radiación UV que produce 90-95%
de muerte en la población y se buscan luego mutantes entre los supervivientes.

La radiación ionizante es una forma de radiación más potente e incluye rayos de longitud de onda
corta, tal como rayos X, rayos cósmicos y rayos gamma. Estas radiaciones causan la ionización del
agua y otras sustancias y los efectos mutagénicos se producen indirectamente a causa de esta
ionización. Entre las especies químicas formadas por la radiación ionizante están los radicales
libres, de los cuales el más importante es el radical hidroxilo OH-. Los radicales libres reaccionan e
inactivan macromoléculas celulares, siendo la más importante el DNA. Al contrario, con la radiación
UV, la radiación ionizante penetra fácilmente el vidrio y otros materiales. Por esta razón la radiación
ionizante se usa con frecuencia para inducir mutaciones en plantas y animales, pero debido a que
es más peligrosa de usar y está menos disponible, se emplea poco con microorganismos.

Se pueden generar mutaciones sin el uso de agentes químicos o físicos mediante el proceso de la
mutagénesis por transposón (véase la sección 2.2d). Dado que los elementos transponibles pueden
insertarse en varias localizaciones del cromosoma, los transposones se usan como agentes
mutagénicos.

Por último, existen mutaciones que surgen de la reparación del DNA. La mayoría de las células
tienen una variedad de sistemas de reparación de DNA para corregir errores o reparar daños. La
mayoría de los procesos de reparación no cometen errores, pero algunos parecen ser propensos a
error y el mismo mecanismo de reparación origina la mutación. Por lo que muchos tipos de
mutaciones surgen como resultado de reparaciones defectuosas de los daños originados en el DNA
por algunos de los agentes mutagénicos.

c) Recombinación genética

La recombinación genética implica el intercambio físico de material genético entre elementos

genéticos. La recombinación general u homóloga, comprende un intercambio entre secuencias de
DNA homólogas, es decir tienen la misma o casi la misma secuencia; por tanto, el apareamiento de
las bases puede ocurrir a lo largo de una longitud considerable de las dos moléculas de DNA. A
este tipo de recombinación también se le conoce como entrecruzamiento (crossing over).

La Figura 21 muestra una visión general del mecanismo de la recombinación homóloga. El proceso
comienza con una mella (generada generalmente por una nucleasa) en una de las moléculas de
DNA. Posteriormente la cadena rota es desplazada de la otra cadena por proteínas con actividad
helicasa. Una proteína de unión a cadena sencilla (SSB) se une al segmento monocatenario
resultante. A continuación, la proteína RecA se une al fragmento monocatenario, formando un
33
complejo que facilita el anillamiento con una secuencia complementaria dúplex adyacente, con
desplazamiento simultáneo de la banda residente. Tras el apareamiento, puede ocurrir un
intercambio de secuencias de DNA homólogas, lo que conduce a la formación de extensas regiones
de heterodúplex, en las que cada cadena proviene de un cromosoma diferente. Finalmente, las
moléculas ligadas se resuelven en dos moléculas recombinantes por la acción de nucleasas y DNA
ligasa.

Figura 21. Versión simplificada de un mecanismo molecular de recombinación genética.

En procariotas, la recombinación genética puede observarse porque los fragmentos de DNA

homólogo de un cromosoma donador son transferidos a una célula receptora por uno de estos
procesos: transformación, transducción y conjugación.

2.2 Técnicas de genética bacteriana: In vivo

a) Transformación genética

La transformación genética es un proceso por el que el DNA libre se incorpora en una célula
receptora y lleva a cabo un cambio genético. Se han encontrado varios procariotas que son
transformables en condiciones naturales, incluyendo ciertas especies de bacterias y arqueas. En
un único suceso de transformación sólo se puede transferir de una célula a otra una pequeña
cantidad de genes.
34
Una célula que es capaz de tomar una molécula de DNA y ser transformada se dice que es
competente. Sólo ciertas cepas son competentes, está capacidad parece ser una propiedad
determinada genéticamente. En las bacterias que se pueden transformar naturalmente, la
competencia está regulada y hay proteínas especiales que juegan un papel en el transporte y
procesamiento de DNA. Las proteínas específicas de la competencia incluyen una proteína de
membrana de unión del DNA, una autolisina de la pared celular y varias nucleasas.

En el proceso de integración del DNA transformante, este se une a la superficie celular por una
proteína de unión al DNA, tras los cual el fragmento bicatenario completo resulta captado por la
célula o bien una nucleasa degrada una cadena y la otra es incorporada (Figura 22). Tras la
incorporación, el DNA se asocia con una proteína específica de la competencia que permanece
unida al DNA, posiblemente para protegerlo de ataques de nucleasas, hasta que alcanza el
cromosoma, donde es sustituida por la proteína RecA. El DNA se integra luego en el genoma del
receptor por proceso de recombinación.

Figura 22. Mecanismo de transferencia del DNA por transformación en una bacteria Gram positiva. (a)
Fijación del DNA por una proteína de unión del DNA ligada a la membrana. (b) Paso de una de las dos
cadenas a la célula mientras la actividad nucleasa degrada la otra cadena. (c) La cadena sencilla dentro de
la célula se une a proteínas específicas y tiene lugar la recombinación con regiones homólogas del
cromosoma bacteriano mediada por la proteína RecA. (d) Célula transformada.

Las bacterias se pueden transformar con DNA extraído de un virus bacteriano, un proceso conocido
como transfección.

35
b) Transducción

En la transducción, el DNA se transfiere de una célula a otra mediante un virus. La transferencia

genética de genes del huésped a una nueva bacteria (transportado por un virus) puede ocurrir de
dos maneras. En la primera llamada transducción generalizada, un trozo del DNA del huésped es
transportado a una nueva bacteria sin que este DNA esté integrado en el genoma del virus. Así, en
la transducción generalizada el DNA del huésped es transportado en un virus que no contiene
material genético del virus original. La segunda, llamada transducción especializada, ocurre sólo
en algunos virus atemperados, y se caracteriza porque el DNA de una región específica del
cromosoma bacteriano se integra directamente en el genoma del virus.

La transducción generalizada se produce sólo como consecuencia de infecciones líticas. En ella,

los fagos que median la transducción generalizada, normalmente cortan el DNA de la célula
huésped en pequeñas piezas y empacan ambos DNAs al interior de la partícula fágica mediante un
mecanismo llamado “head full” o llenado de las cabezas del fago. Ocasionalmente una de las piezas
del DNA de la bacteria huésped resulta empacada al azar dentro de una cubierta de fago. Por lo
tanto, cualquier gen de la bacteria donadora puede ser potencialmente transferido, pero solamente
se transferirá tanto DNA como pueda caber en una sola cápside. Cuando la célula receptora se
infecta con un fago que contiene DNA de una donadora, el DNA de la donadora puede entrar a la
receptora. Ya dentro de la célula receptora puede ocurrir el evento de la recombinación
generalizada, en el cual se substituye el DNA de la célula donadora por el de la receptora.

Por lo tanto, durante una transducción generalizada existen dos posibilidades: (1) el DNA puede
integrarse en el cromosoma del huésped durante la lisogenización y (2) el DNA puede replicarse en
el receptor como parte de una infección lítica.

Un ejemplo de cómo se produce la transducción generalizada es el descrito en la Figura 23. Cuando

la población de bacterias se infecta con un fago, pueden iniciarse las etapas del ciclo lítico del fago.
Durante una infección lítica, las enzimas responsables del empaquetamiento del DNA vírico en el
bacteriófago, a veces introducen DNA del hospedador de forma accidental. La partícula resultante
es una partícula transductora. Cuando la célula se lisa, estas partículas se liberan junto con los
viriones normales y partículas transductantes. Debido a que las partículas transductantes no pueden
iniciar una infección viral normal (no contienen DNA vírico), se les llama defectivo. Cuando este
lisado se usa para infectar una población de células receptivas, la mayoría de las células resultan
infectadas por un virus normal. Sin embargo, una pequeña proporción de la población recibe
partículas transductantes que inyectan el DNA que recibieron de la anterior bacteria hospedadora.
Aunque este DNA no puede replicarse, puede sufrir recombinación genética con el DNA del nuevo
hospedador. Puesto que sólo una pequeña proporción de las partículas del lisado son del tipo
transductor defectivo y cada uno contiene sólo un pequeño fragmento de DNA donador, la
probabilidad de que una partícula transductora contenga un determinado gen es muy baja.

36
 Figura 23. Transducción generalizada, un posible mecanismo por el que pueden formarse partículas del
virus (fago) conteniendo DNA del hospedador.

Un ejemplo de transducción especializada es el descrito en la Figura 24 que representa la

transducción de los genes de la galactosa por el fago atemperado lambda de E. coli. lisado que
contiene fagos defectivos capaces de transducir genes de la galactosa.

Figura 24. Etapas líticas y producción de partículas transductoras de genes de galactosa en una célula de
Escherichia coli conteniendo lambda como profago.

En este caso inicialmente se tiene una célula lisogenizada por lambda, el genoma del fago se integra
en el DNA del hospedador en un sitio específico. La región en la que se integra lambda está
37
adyacente al grupo de genes del hospedador que controla la utilización de la galactosa. Una vez el
DNA de lambda se inserta en ese sitio en el hospedador, la replicación del DNA vírico queda bajo
el control del hospedador. Mediante inducción (por ejemplo, UV) el DNA viral se separa del DNA
del huésped por un proceso inverso al de integración. En un suceso normal, la célula lisogénica es
inducida, el DNA de lambda se escinde como una unidad. Sin embargo, bajo ciertas condiciones
raras, el genoma del fago puede escindirse de forma incorrecta. Algunos de los genes adyacentes
(por ejemplo, el operón galactosa) se escinde junto con el DNA del fago. Al mismo tiempo, algunos
genes fágicos se quedan allí. Posteriormente, cuando se induce uno de estos lisógenos, se produce
un lisado que contiene fagos defectivos capaces de transducir genes de la galactosa.

Por lo tanto, la transducción especializada sólo se produce como consecuencia de la inducción de

la célula lisogénica por escisión del profago y consiguiente entrada a fase lítica, productora de
nuevas partículas de fago.

La transducción especializada es la transducción en la cual solo ciertos genes del donador pueden
ser transferidos al receptor. Diferentes fagos pueden transferir diferentes genes pero un fago
individual solamente puede transferir unos pocos genes. La transducción especializada está
mediada por fagos lisogénicos o fagos temperados y los genes que se llegan a transferir
dependerán del lugar donde el profago queda insertado en el cromosoma

Una diferencia importante entre transducción generalizada y especializada radica en la forma en

que se puede formar el lisado transductor. En la transducción especializada debe ocurrir por
inducción de un lisógeno, mientras que en la transducción generalizada puede ocurrir de este modo
o por infección de una bacteria no lisogénica, con posterior replicación del fago y lisis de la célula.

c) Conjugación

La conjugación bacteriana es un proceso de transferencia genética que requiere contacto célula a

célula. La conjugación es un mecanismo que está codificado en un plásmido. Los plásmidos son
generalmente elementos que se replican independientemente del cromosoma del hospedador. A
diferencia de los virus, los plásmidos no tienen una forma extracelular y existen dentro de las células
como ácidos nucleicos, y a diferencia de un cromosoma de procariota, un plásmido no lleva los
genes que sean requeridos por el hospedador en todas las condiciones. Casi todos los plásmidos
son DNA bicatenario y la mayoría son circulares, su tamaño es menor que la veinteava parte de un
cromosoma. Un plásmido utiliza la conjugación para transferir una copia de sí mismo al nuevo
hospedador, pero otros elementos genéticos resultan a veces movilizados, como pueden ser otros
plásmidos o el cromosoma del hospedador.

La conjugación requiere una célula donadora, que contiene un tipo particular de plásmido
conjugativo, y una célula receptora que carece de él. Dado que la conjugación se descubrió
realizando cruces genéticos, las células donadoras se llaman machos y las receptoras hembras.
Los genes que controlan la conjugación están situados en la región tra del plásmido. Muchos genes
de la región tra están relacionados con la síntesis de una estructura superficial, el pelo sexual. Sólo
38
las células donadoras tienen estos pelos. Plásmidos conjugativos pueden tener regiones tra
diferentes, y en algunos casos, los pelos pueden ser también distintos. Los pelos permiten el
apareamiento específico entre la célula donadora y la receptora. Estos pelos establecen contactos
específicos con un receptor de la otra célula y luego se retraen, empujando una célula hacia la otra.
Luego los contactos entre las células donadora y receptora se estabilizan, probablemente por fusión
de las membranas externas y el DNA se transfiere de una célula a otra.

Un modelo que explica de mejor manera la transferencia de DNA durante la conjugación es el

presente en algunos bacteriófagos llamado replicación por círculo rodante esquematizado en la
Figura 25. El proceso se inicia tras el contacto célula a célula, en cuyo momento se rompe una
cadena del DNA circular del plásmido y se transfiere una banda parental. La enzima responsable
del corte necesario para iniciar el proceso, TraI, la cual también tiene actividad helicasa y por tanto
está implicada en el desenrollamiento de la banda que se va a transferir. A medida que ocurre la
transferencia, la síntesis de DNA según el modelo del círculo rodante, reemplaza a la banda
transferida en el donador. A su vez, una banda complementaria se sintetiza también en el receptor.
Por lo tanto, al final del proceso, tanto el donador como el receptor poseen plásmidos
completamente formados.

Cuando los genes del plásmido se expresan en el receptor, el propio receptor se convierte en
donador y puede transferir el plásmido a otros receptores. De este modo los plásmidos conjugativos
se extienden rápidamente entre las poblaciones, comportándose como agentes infecciosos.

39
 Figura 25. Transferencia de DNA plasmídico por conjugación. (a) En este ejemplo, el plásmido F de una
célula F+ se transfiere a una célula receptora F-. (b) Detalles de la replicación y proceso de transferencia.

d) Transposones y secuencias de inserción

El orden exacto de los genes en un cromosoma no está permanentemente fijado de modo

necesario; algunos genes pueden moverse de un sitio a otro, proceso llamado transposición. Es
importante resaltar que la transposición es un acontecimiento que ocurre a bajas frecuencia.
Además, no todos los genes son capaces de transposición, ya que se requiere de la presencia de
elementos genéticos especiales llamados elementos transponibles.

Existen tres tipos de elementos genéticos transponibles en bacterias: secuencias de inserción,

transposones y algunos virus. Tanto las secuencias de inserción como los transposones tienen dos
importantes características en común: (1) llevan genes que codifican para una transposasa y (2)
tienen cortas repeticiones terminales invertidas en los extremos de su DNA. Las secuencias de
inserción son el tipo más simple de elemento transponible y no llevan otra información genética que
la requerida para desplazarse a nuevos lugares. Las secuencias de inserción son segmentos cortos
de DNA, de unos 1000 nucleótidos de longitud, que pueden insertarse en sitios específicos del
genoma.

Los transposones son más largos que las secuencias de inserción y llevan otros genes, algunos de
los cuales confieren propiedades importantes al organismo que los lleva. Existen transposones
conjugativos que tienen genes que les permiten no sólo moverse de un sitio a otro del genoma
bacteriano sino también transferirse de una bacteria a otra.
40
Se conocen dos mecanismos de transposición: conservativo y replicativo. En la transposición
conservativa, el elemento transponible se separa de una localización en el cromosoma y se reinserta
en una segunda localización. El número de copias de un transposón conservativo, por lo tanto no
varía. En cambio, los transposones replicativos, se duplican y la nueva copia se inserta en otra
región. Por tanto, tras el proceso completo de transposición, una copia del elemento transponible
permanece en el sitio original y la otra copia se encuentra en el sitio nuevo. Durante este proceso
de transposición, el transposón original permanece en su sitio inicial y nunca se encuentra libre en
la célula. En la Figura 26 se ilustran los modelos para las transposiciones, donde inicialmente se
producen cortes monocatenarios en los extremos del transposón (a nivel de las repeticiones
invertidas) y cortes escalonados en una sola cadena en el sitio diana. El transposón se une luego
al sitio diana mediante los extremos monocatenarios. En la transposición conservativa, el sitio
donador es ahora cortado y la reparación conservativa rellena los espacios de cadena sencilla del
sitio diana. Este proceso origina la formación de repeticiones directas en el sitio diana en los
extremos del transposón. En la transposición replicativa, la reparación ocurre mientras el elemento
transponible está aún unido tanto al sitio original como al sitio diana. Esto conduce a la formación
de una estructura compuesta llamada cointegrado. El proceso final es la resolución de la estructura
del cointegrado, permitiendo la liberación del transposón original y la presencia de una nueva copia
del transposón en el sitio diana.

Figura 26. Dos mecanismos de transposición. ADN del donante (que lleva el transposón) se muestra en
verde, y el ADN receptora con la secuencia diana se muestra en amarillo. En tanto la transposición
replicativa y conservadora, la transposasa inserta el transposón (púrpura) en el sitio de destino (azul) en el
ADN receptor. Durante este proceso, el sitio diana se duplica. En la transposición conservativa, el ADN del
donante se queda con una rotura de doble cadena en la ubicación anterior del transposón. Por el contrario,
después de la transposición replicativa, tanto el ADN donante y el receptor poseen una copia del
transposón.

La transposición es esencialmente una etapa de recombinación, pero no ocurre entre secuencias

homólogas ni usa el sistema general de recombinación de la célula. Utiliza la proteína especial
transposasa en lugar de la proteína RecA implicada en la recombinación general. Debido a que esta
recombinación requiere una secuencia de bases específica, se le denomina recombinación
específica de sitio.

41
Los elementos transponibles representan un medio fácil de crear mutantes, debido a que el sitio de
inserción de un elemento transponible está dentro de un gen, la inserción del transposón dará como
resultado la pérdida de la continuidad lineal del gen originando una mutación caracterizada por la
pérdida de la actividad que codifica el gen. Por ejemplo, un transposón que se inserte en el gen que
codifica para la enzima que permite sintetizar vitamina B12 causará que la bacteria se auxotrofa
para vitamina B12. El elemento más adecuado para la mutagénesis por transposón es el que
contiene un gen de resistencia a un antibiótico. Los clones que contienen el transposón se pueden
seleccionar aislando colonias resistentes al antibiótico. Si estos clones se seleccionan en medio rico
donde pueden crecer auxótrofos y son luego traspasados a una serie de medios mínimos
suplementados cada uno con un factor de crecimiento, entonces podrá determinarse para que
nutriente es auxotrofa la bacteria mutante. Luego, es posible analizar el ADN de esta para
determinar donde se insertó el transposón, lo que en última instancia revelará la función del gen
que fue interrumpido.

2.3 Técnicas de genética bacteriana: In vitro

Los tres mecanismos de intercambio genético, transformación, transducción y conjugación pueden

usarse para hacer cruces bacterianos y seleccionar recombinantes con el fin de confeccionar un
mapa genético de un organismo, crear nuevas cepas de un organismo o estudiar específicamente
la genética y bioquímica del metabolismo de un organismo. Sin embargo, presentan ciertas
limitaciones, las cuales pueden superarse mediante la manipulación de DNA in vitro.

a) Enzimas de restricción

Las enzimas de restricción, también conocidas como endonucleasas de restricción, son enzimas
que cortan los enlaces fosfodiester del material genético a partir de una secuencia que reconocen.
Una clase numerosa de estas enzimas, llamadas enzimas de restricción tipo II, no sólo reconoce
secuencias específicas sino también corta el DNA bicatenario dentro de estas secuencias.

Muchas enzimas de restricción están compuestas de dos subunidades polipeptídicas iguales y cada
subunidad reconoce y corta la secuencia de una de las bandas. Puesto que las secuencias
reconocidas por las enzimas de restricción son relativamente cortas y frecuentemente
palindrómicas, tales enzimas producen cortes en las dos bandas de DNA.

Dentro del uso de enzimas de restricción, existe un sistema de modificación mediado por una
enzima modificadora, la cual como su nombre lo indica modifica las secuencias específicas en su
propio DNA de manera que no sean atacadas por las propias enzimas de restricción de la célula.
Tal modificación generalmente implica una metilación de bases específicas dentro de la secuencia
de reconocimiento, de modo que la nucleasa de restricción no pueda actuar. Por lo tanto, para cada

42
enzima de restricción debe haber una enzima de modificación, estando ambas enzimas fuertemente
asociadas.

Posteriormente, una vez la molécula de DNA es cortada a nivel de secuencias específicas por una
enzima de restricción determinada, los fragmentos generados pueden separarse entre sí por
electroforesis en gel. La electroforesis es el procedimiento por el cual moléculas cargadas migran
en un campo eléctrico, estando la velocidad de migración determinada por la carga y el tamaño de
la molécula. En la electroforesis en gel las moléculas se separan en un gel, compuesto por lo general
de agarosa o poliacrilamida. El gel es una malla compleja de fibrillas, siento el tamaño de los poros
del gel, lo que controla la separación. Los ácidos nucleicos (que están cargados negativamente)
migrarán a través del gel, una vez que se aplique la corriente eléctrica, a velocidades dependientes
de la forma y tamaño de la molécula. Moléculas pequeñas o compactas migran más rápidamente
que las moléculas grandes. Después de un período definido de tiempo de migración el gel puede
teñirse con un compuesto que se una al DNA.

En la Figura 27, se muestra un gel típico de agarosa. En la calle A, se ha aplicado una digestión
estándar, de la que se conoce el tamaño de la banda. Las otras calles contienen una fuente de DNA
purificado (en este caso un plásmido) cortado por una o más enzimas de restricción. Dado que es
una determinada enzima de restricción siempre corta en el mismo sitio, el modelo de bandeo es
reproducible y puede determinarse el tamaño de los fragmentos usando un estándar. Esta técnica
se utiliza para generar un mapa físico del DNA, en el que los sitios que se mapean no son genes o
mutaciones sino la localización de los sitios de restricción de las enzimas. La creación de mapas
físicos de esta manera implica hacer varias digestiones con varias enzimas de restricción, solas o
en combinaciones, y luego determinar cómo deben ordenarse las piezas, de manera similar a la
resolución de un rompecabezas. Posteriormente, los fragmentos de DNA pueden purificarse a partir
de los geles para ser utilizados en la clonación.

Figura 27. Fotografía de un gel de agarosa teñido. El DNA ha sido cargado en pocillos hacia la parte
superior del gel, como se indica y el polo positivo del campo eléctrico está en la parte inferior. La muestra de

43
la calle A contiene fragmentos de tamaño conocido que se usan como estándares. Usando los estándares,
se puede determinar el tamaño de los fragmentos en las otras calles. Aunque cada banda de una calle
contiene el mismo número de moléculas fragmentadas, las bandas inferiores se tiñen menos intensamente
porque los fragmentos son más pequeños y químicamente hay menos DNA para teñir.

b) Clonación molecular

La clonación molecular tiene por finalidad aislar grandes cantidades de genes específicos o
fragmentos cromosómicos en forma pura. La estrategia de la clonación molecular consiste en
trasladar el gen o región deseada, desde un genoma grande y complejo, a otro pequeño y sencillo.

La clonación molecular puede dividirse en varias etapas:

1. Aislamiento y fragmentación de DNA de partida, este puede ser DNA genómico de un organismo
de interés, DNA sintetizado a partir de un molde de RNA por la transcriptasa reversa, el DNA
sintetizado por la reacción de la polimerasa en cadena o incluso DNA totalmente sintético hecho
in vitro. Si la fuente es DNA genómico, se corta por lo general con enzimas de restricción para
originar una serie de fragmentos.
2. Unión de los fragmentos de DNA a un vector de clonación con DNA ligasa. Los pequeños
elementos genéticos usados para replicar genes se conocen como vectores de clonación, los
cuales están generalmente diseñados para permitir la recombinación de DNA foráneo en un sitio
de restricción que corta el vector sin afectar a su replicación. Si el DNA de partida y el vector se
cortan con la misma enzima de restricción, la unión puede lograrse por acoplamiento de las
regiones monocatenarias llamadas “extremos cohesivos”. Los “extremos romos” generados por
diferentes enzimas de restricción pueden también unirse mediante el uso de adaptadores.
3. Introducción y mantenimiento en un organismo hospedador. El DNA recombinante generado en
el tubo de ensayo se introduce en un organismo hospedador, por ejemplo, mediante
transformación con el DNA, donde pueda replicarse. La transferencia del DNA al hospedador
genera a menudo una mezcla de clones. Algunas células contienen el gen deseado clonado,
mientras otras células contienen otros clones generados por unión de otros fragmentos de DNA
al vector. Esta mezcla de clones se denomina genoteca o librería de genes ya que pueden
purificarse muchos clones diferentes a partir de la mezcla, conteniendo cada uno diferentes
segmentos de DNA clonados procedentes del organismo elegido.

Plásmidos como vectores de clonación

Los plásmidos poseen propiedades muy útiles como vectores de clonación. Entre estas propiedades
se incluyen (1) su pequeño tamaño, que hace que este DNA sea fácil de aislar y manipular; (2) su
origen de replicación independiente, de manera que en la célula pueden estar presentes numerosas
copias, lo que posibilita a amplificación del DNA y (3) la presencia de marcadores seleccionables,
tales como genes de resistencia a antibióticos, haciendo así más fácil la detección y selección de
los clones que contienen el plásmido.

Aunque en el ambiente natural los plásmidos conjugativos se transfieren generalmente por contacto
célula a célula, los plásmidos vectores de clonación han sido modificados a fin de evitar su
transferencia por conjugación y así lograr su contención biológica. Sin embargo, in vitro es posible
realizar la transferencia por transformación o electroporación. Dependiendo del sistema
44
hospedador-plásmido, la replicación del plásmido puede estar bajo un estricto control celular, en
cuyo caso sólo se hacen algunas copias, o bajo un control celular relajado, en cuyo caso se produce
un gran número. A menudo, conseguir un número de copias alto es importante en la clonación de
genes, el cual mediante una adecuada selección del sistema hospedador-plásmido y una
manipulación de la síntesis celular de las macromoléculas, se pueden conseguir varios miles de
copias de plásmido por célula.

Bacteriófago lambda como vector de clonación

Durante la transducción especializada algunos genes del hospedador se incorporan en el genoma

del bacteriófago, un fago que se utiliza es el fago lambda, el cual actúa como un vector en la
recombinación que tiene lugar en la célula, pero debido a que se conoce su genética molecular,
puede retener más DNA que la mayoría de los plásmidos y el DNA puede ser eficientemente
empaquetado in vitro dentro de las partículas del fago, el fago lambda es utilizado como vector de
clonación. Sin embargo, la forma silvestre del fago lambda no es adecuada como vector de
clonación porque tiene demasiados sitios para las enzimas de restricción. Para evitar esta dificultad,
se han construido fagos lambda modificados. En un tipo de fagos lambda, llamados fagos Charon,
se han eliminado los sitios de restricción no deseados por mutación puntual, deleción o sustitución.
En variantes que tienen solamente un sitio de restricción, puede insertarse una pieza de DNA,
mientras que en las variantes con dos sitios, el DNA exógeno puede reemplazar a un segmento
específico del DNA de lambda. Estas últimas variantes, llamadas vectores de reemplazamiento, son
especialmente útiles para la clonación de fragmentos grandes de DNA.

La Figura 28 esquematiza los pasos en la clonación con vectores lambda de reemplazamiento, los
cuales son:

(1) Aislamiento del DNA del vector a partir de partículas de fago y digestión con una enzima de
restricción apropiada.
(2) Ligazón de los dos fragmentos de lambda con fragmento de DNA foráneo usando DNA ligasa.
Se escogen las condiciones para que se formen moléculas de una longitud adecuada que
permita su empaquetamiento en las partículas de fago.
(3) Empaquetamiento del DNA, añadiendo extractos de fago que contengan las proteínas de la
cabeza y de la cola, y permitan la formación de partículas de fago viables.
(4) Infección de E. coli y aislamiento de clones de fago, recogiendo las placas de lisis generadas
por una cepa hospedadora.
(5) Detección del DNA clonado en el fago recombinante, mediante hibridación de ácidos nucleicos
u observación de propiedades genéticas.

45
 Figura 28. El uso del bacteriófago lambda como vector de clonación.

La selección de recombinantes es menos problemática al utilizar vectores lambda de

reemplazamientos que cuando se utilizan plásmidos, esto se debe: (1) la eficiencia de la
transferencia de DNA recombinante a la célula por lambda es muy alta y (2) los fragmentos de
lambda que no han recibido nuevo DNA son demasiado pequeños para ser incorporados dentro de
las partículas de fago.

Finalmente, no es posible clonar de forma eficiente fragmentos grandes de DNA, ya que la viabilidad
de las partículas de fago es baja si el DNA es mayor que el 105% del DNA de lambda normal y
algunos genes de lambda no pueden eliminarse sin que se pierda parte de la capacidad del vector
para replicarse.

46
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Los métodos convencionales de clonación molecular pueden considerarse como herramientas para
la amplificación rápida del DNA in vivo. Sin embargo, el desarrollo del DNA sintético ha originado
un nuevo método para la amplificación rápida del DNA in vitro, la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR). Este método puede multiplicar moléculas de DNA hasta miles de millones de
veces en un tubo de ensayo, proporcionando grandes cantidades de genes para su clonación,
secuenciación o mutagénesis. La PCR hace uso de la DNA polimerasa que copia moléculas de
DNA.

La técnica de la PCR requiere que se conozca la secuencia nucleotídica de una región del gen
deseado. Esto es así ya que para que funciones la PCR es necesario disponer de oligonucleótidos
iniciadores cortos, complementarios de secuencias presentes en el gen o genes de interés. Las
etapas de amplificación del DNA en la PCR son las siguientes (Figura 29):

(1) En un sintetizador de nucleótidos se fabrican los dos oligonucleótidos iniciadores que

flanquean el DNA diana y se añaden en gran exceso al DNA diana desnaturalizado por calor.
(2) Cuando se ha enfriado la mezcla, el exceso de iniciadores relativos al DNA diana asegura
que la mayor parte de las cadenas diana hibriden con iniciadores y no entre sí.
(3) La DNA polimerasa alarga los iniciadores usando las bandas diana como moldes.
(4) Después de un período de incubación adecuado, se calienta de nuevo la mezcla para
separar las cadenas. Luego se enfría la mezcla para permitir que los iniciadores se hibriden
con las regiones complementarias del DNA recién sintetizado y se repite todo el proceso.

En resumen cada ciclo de PCR implica las siguientes etapas: (1) desnaturalización por calor del
DNA bicatenario diana, (2) enfriamiento para permitir el acoplamiento de iniciadores específicos con
el DNA diana y (3) extensión de los iniciadores por la DNA polimerasa. En cada ciclo de PCR duplica
el contenido original del DNA diana.

La PCR es extremadamente útil para obtener DNA para la clonación y secuenciación, ya que el gen
o genes de interés pueden amplificarse fácilmente si se conocen las secuencias flanqueantes.
Como los iniciadores utilizados no tienen que ser completamente complementarios, la PCR se usa
rutinariamente en estudios comparativos o evolutivos para amplificar genes de una variedad de
fuentes donde el DNA ya ha sido clonado (y secuenciado) a partir de un organismo. En estos casos,
los iniciadores se diseñan para regiones del gen que se cree que se han conservado a través de
una gran variedad de organismos. Debido a su sensibilidad, la PCR se ha utilizado para amplificar
y clonar DNA de fuentes tales como los restos humanos modificados e incluso muestras de animales
o plantas ya extinguidos.

47
 Figura 29. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la amplificación de secuencias específicas
de DNA. (a) El DNA diana se calienta para separar las cadenas y, junto a la DNA polimerasa, se añade un
gran exceso de dos oligonucleótidos iniciadores, uno complementario a la cadena diana del DNA y otro a la
cadena complementaria. (b) Una vez hibridado el iniciador, la extensión de éste proporciona una copia del
DNA bicatenario original. (c) Un posterior calentamiento, hibridación y extensión del iniciador, proporcionan
un segundo DNA bicatenario. (d) el segundo DNA de doble cadena. (e) Dos ciclos adicioanles de PCR
rinden 4 y 8 copias, respectivamente, de la secuencia del DNA original. (f) Efecto de haber corrido 20 ciclos
de PCR sobre una preparación que contenía originalmente 10 copias del gen diana. Observe que la gráfica
es semilogarítmica.

La PCR se puede utilizar también para amplificar cantidades muy pequeñas de DNA presentes en
una muestra. Debido a la capacidad de amplificar y analizar el DNA sin necesidad de crecer los
microorganismos, la PCR ha alcanzado un importante valor en el diagnóstico microbiológico. La
PCR se ha utilizado también en la huella dactilar del DNA, la cual es una herramienta forense que
permite la identificación de individuos, o relaciones entre individuos, a partir de muy pequeñas
muestras de sus DNAs. La PCR puede acoplarse a la transcripción reversa en un proceso llamado
RT-PCR, el cual permite producir grandes cantidades de DNA usando RNA como molde.

48
Mutagénesis dirigida

Los métodos mutágenos convencionales actúan al azar, mediante el uso de DNA sintético y las
técnicas del DNA recombinante es posible introducir mutaciones en sitios determinados con total
precisión en los genes, lo cual se denomina mutagénesis dirigida.

El procedimiento básico de la mutagénesis dirigida es sintetizar un corto oligodesoxinucleótido que

contenga el cambio de bases deseado y dejar que hibride con un DNA monocatenario que contenga
el gen de interés. El apareamiento es completo excepto en la pequeña región del cambio de bases.
Entonces el fragmento monocatenario corto del oligonucleótido sintético se extiende usando la DNA
polimerasa, copiando de este modo el resto del gen. La molécula bicatenaria obtenida se introduce
en un transformante y se seleccionan los mutantes. El mutante obtenido se utiliza después en la
producción de la proteína modificada o mutante (Figura 30).

Figura 30. Mutagénesis dirigida usando fragmentos cortos de oligodeoxirribonucleótido sintético.

49
Otro procedimiento es la mutagénesis con casete en la cual, en presencia de sitios de restricción
muy próximos, el fragmento de DNA que está entre ellos puede cortarse y separarse, para luego
sustituirse por un fragmento de DNA sintético en el cual se han cambiado una o más bases, estos
fragmentos sintéticos se les denomina casete. Cuando se usan casetes para reemplazar secciones
de genes, los casetes son por lo general del mismo tamaño que los fragmentos de DNA del tipo
silvestre. Sin embargo, el casete utilizado para obtener mutaciones por inserción puede ser de
cualquier tamaño incluso puede ser un gen completo. Por ejemplo, se utilizan casetes que codifican
proteínas que confieren resistencia a un determinado antibiótico en el transformante.

Este tipo de mutagénesis con casete se usa en un proceso llamado interrupción génica (Figura 31),
en el cual una fragmento que lleva un gen que confiere resistencia a kanamicina, el casete kan, se
inserta en un sitio de restricción en un gen clonado. El vector que lleva este gen mutante es
linearizado luego mediante un corte con una enzima de restricción y el DNA lineal se usa para
transformar un hospedador y selecciona para resistencia a kanamicina. El plásmido linearizado no
puede replicarse, de manera que las células resistentes surgirán por recombinación homóloga entre
el gen mutado que está en el plásmido y el gen silvestre presente en el cromosoma. Las células no
solamente han adquirido la resistencia a kanamicina, sino que también han perdido la función del
gen en el cual se insertó el casete kan. Por ello, estas mutantes se llaman “knockout”. Este proceso
es similar a la búsqueda de mutaciones por inserción hechas por transposones, pero en este caso
se escoge exactamente qué gen recibirá la mutación. La disrupción génica en organismos haploides
produce células viables sí el gen que se ha interrumpido no es esencial.

Figura 31. Interrupción de un gen utilizando la mutagenésis por casete. (a) Un plásmido que contiene una
copia clonada del gen X de tipo silvestre se corta con la enzima de restricción EcoRI y se mezcla con un
fragmento de DNA (el casete de la kanamicina) que contien un gen capaz de conferir a una célula
resistencia a kanamicina y que había sido obtenido utilizando la misma enzima de restricción. Se ligan el

50
 plásmido cortado y el casete. (b) El producto de la ligazón es un plásmido que contiene ahora el casete de
kanamicina como una mutación por inserción dentro del gen X. Este nuevo plásmido se corta ahora con una
nueva enzima de restricción, BamHI y se utiliza para transformar una célula que contiene un gen X del tipo
silvestre. (c) La célula transformada contiene el plásmido linearizado con un gen X interrumpido y su propio
cromosoma con una copia del gen X silvestre. En algunas células ocurre recombinación homóloga entre las
formas silvestre y el mutante del gen X. (d) Las células que crecen en presencia de kanamicina deben tener
el casete de kanamicina recombinado en su cromosoma, ya que el plásmido linearizado no se puede
replicar. Estas células tienen una única copia del gen X interrumpido. Por lo general, esta disrupción anula
toda función del gen X.

51
3 Productos microbianos de interés industrial
La microbiología industrial y la biotecnología utilizan microrganismos para alcanzar un objetivo
similar: crear productos con valor monetario y con una demanda en el mercado. Entre los productos
desarrollados se encuentran compuestos médicos y farmacéuticos (antibióticos, hormonas,
vitaminas y esteroides, algunos de estos serán tratados en el Tema 4), solventes, aminoácidos y
ácidos orgánicos. Estos últimos tienen como característica el ser producidos en un gran volumen y
tener un bajo precio. Por ende, su producción obliga una alta eficiencia y un bajo costo.

3.1 Selección y modificación de microrganismos

La mayoría de los microrganismos utilizados industrialmente han sido aislados desde ambientes
naturales, especialmente aquellos utilizados hasta 1980, lo que involucraba la búsqueda aleatoria
de las características deseadas en un gran número de muestras. Existen dos estrategias para la
aislación de microorganismos desde el ambiente, basadas en objetivo o el enfoque bandada
(shotgun approach). En esta última, se toman muestras de microorganismos libres o biofilms desde
animales, plantas, suelo, alcantarillas, y particularmente desde hábitats fuertemente modificados
por el hombre. Estas muestras son analizadas en búsqueda de microorganismos que exhiban las
características deseadas. Por otro lado, la alternativa basada en objetivo busca microorganismos
en sitios donde las características buscadas constituyan una ventaja para un posible
microorganismo que lo habite. Por ejemplo, si se busca un microorganismo que degrade
hidrocarbonos, un buen sitio puede ser las cercanías de una refinería de petróleo u otro lugar
contaminado con este compuesto. En la tabla se presentan más ejemplos:

Aislación por enfoque bandada Aislación por objetivo

- Buscar una microalga para la producción
de biocombustible. Se requiere realizar
una búsqueda desde colecciones o desde
la naturaleza
- Aislación de mo desde el ecosistema
marino cercano a una industria
petroquímica en la Bahía de Cartagena,
para su utilización en biorremediación de
lugares contaminados
- Para procesos de degradación anaerobia
a baja temperatura, se busca aislar
microorganismos desde ecosistemas
antárticos debido a que sus procesos
naturales metabólicos se realizan a baja
temperatura

En forma alternativa, es posible utilizar microrganismos que estén almacenados (y clasificados) en

una colección (por ejemplo, American Type Culture Collection, ATCC, o Deutsche Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkulture, DSMZ. Sin importar su origen, los microorganismos son
modificados y mejorados utilizando mutagénesis y programas de selección para mejorar sus
propiedades para uso industrial. Algunas de estas características son (Waites et al. 2011):

1. Estabilidad genética, de manera que no pierda los rasgos que llevaron a su selección
2. Producción eficiente del producto de interés, idealmente, la ruta biosintética debe estar bien
caracterizada
3. Sin requerimientos de vitaminas o factores de crecimiento
4. Capaz de utilizar múltiples fuentes de carbono de bajo precio y alta disponibilidad
5. Susceptible de ser manipulado genéticamente
46
 6. Seguro, no patogénico y no debe producir agentes tóxicos
7. Fácil de cosechar desde la fermentación
8. Si el producto es intracelular, fácil de romper
9. Limitada producción de subproductos (facilita la recuperación)

En las últimas décadas, se han desarrollado aplicaciones industriales que utilizan microorganismos
modificados por ingeniería genética.

3.2 Fermentación
3.2.1 Crecimiento de los microorganismos

En un cultivo bacteriano en medio líquido, se pueden diferenciar cuatro fases según la evolución de
los parámetros que miden el crecimiento microbiano (concentración celular), tal como se muestra
en la Figura 32.

Figura 32: Fases del crecimiento microbiano

Cada una de las diversas fases son descritas a continuación:

1. Fase lag o de adaptación: en esta fase los microorganismos adaptan su metabolismo a las
nuevas condiciones ambientales para poder iniciar el crecimiento exponencial.

2. Fase de crecimiento exponencial o logarítmica: el número de microorganismos aumenta

(concentración celular) a una la velocidad especifica de crecimiento máxima y el tiempo de
duplicación es mínimo. Durante esta fase las bacterias consumen los nutrientes del medio a
velocidad máxima. La evolución del número de células durante esta fase puede ser modelada
y/o predicha mediante un modelo matemático. Cuando los microorganismos sintetizan
productos que solo se pueden realizar en esta etapa, a éstos se le denomina metabolitos
primarios. Entonces un metabolito primario corresponde a un metabolito asociado al
crecimiento, el cual solo puede ser sintetizado durante la fase de crecimiento exponencial. En
la figura se aprecia un ejemplo de la concentración de biomasa y producto, en este caso etanol.

47
3. Fase estacionaria: en esta fase no se incrementa el número de microorganismo (ni la masa u
otros parámetros del cultivo). Los microorganismos entran en fase estacionaria bien porque se
agota algún nutriente esencial del medio, porque los productos de desecho que han liberado
durante la fase de crecimiento exponencial hacen que el medio sea inhóspito para el
crecimiento microbiano o por la presencia de competidores u otras células que limiten su
crecimiento. Las células en fase estacionaria desarrollan un metabolismo diferente al de la fase
de exponencial y durante ella se produce una acumulación y liberación de metabolitos
secundarios o metabolitos no asociados al crecimiento. En la figura se precia el ejemplo de la
producción de penicilina, la cual se comienza a producir al inicio de la fase estacionaria,
correspondiendo ésta a un metabolito secundario.

4. Fase de muerte: en esta fase se produce una reducción del número de células viables del
cultivo.

Las fases, parámetros y cinética de crecimiento discutidas para el caso de los medios líquidos se
presentan también en los sólidos. La cinética de crecimiento, en este caso, sólo se puede seguir
utilizando unos sistemas de detección especiales siendo el más sencillo, la medida del número de
células viables por unidad de superficie o por unidad de masa.

48
3.2.2 Tipos de cultivo

Dependiendo de la modalidad en que se opera el fermentador existen diversas formas de cultivo,

entre las principales se encuentran: cultivo por lote y cultivo continuo.

En un cultivo por lote la fermentación se realiza en un contenedor cerrado (reactor) en donde todos
los nutrientes se adicionan al cultivo antes de inocular (agregar las células microabianas), esta forma
de operación es la más sencilla. Sin embargo, todas las variables como pH, crecimiento celular,
concentración de sustrato entre otras varían durante el transcurso la fermentación.

Por otra parte, en un cultivo continuo se adiciona o alimenta constantemente medio de cultivo fresco
al fermentador, por lo que también es necesario retirar el equivalente de cultivo desde el interior del
fermentador, para mantener el volumen constante. Este constante intercambio de medio de cultivo
permite que no varíe la composición al interior del reactor con el tiempo, condición que se alcanza
en el estado de equilibrio o estado estacionario.

Dentro de los parámetros cinéticos para la comparación entre cultivos o condiciones se utiliza la
productividad volumétrica que puede ser de biomasa o producto. En la siguiente tabla se muestran
las distintas formas de operación y como se definen las productividades según corresponde en cada
caso.

Cultivo por lote Cultivo continuo

Prod. Vol. 𝑀𝑎𝑠𝑎 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜 𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜 ⋅ 𝐹𝑙𝑢𝑗𝑜 𝑑𝑒𝑠𝑐𝑎𝑟𝑔𝑎

de 𝑇𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜 𝑑𝑒 𝑓𝑒𝑟𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑐𝑖ó𝑛 ⋅ 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒𝑙 𝑓𝑒𝑟𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑑𝑜𝑟
producto
Prod. Vol. 𝑀𝑎𝑠𝑎 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜 𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜 ⋅ 𝐹𝑙𝑢𝑗𝑜 𝑑𝑒𝑠𝑐𝑎𝑟𝑔𝑎
de 𝑇𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜 𝑑𝑒 𝑓𝑒𝑟𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑐𝑖ó𝑛 ⋅ 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒𝑙 𝑓𝑒𝑟𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑑𝑜𝑟
biomasa

Otro parámetro cinético utilizado en fermentaciones es el rendimiento 𝑌𝑥/𝑆 o 𝑌𝑃/𝑆 , el cual

corresponde a la biomasa o producto producido a partir del sustrato consumido. Se utiliza tanto en
cultivo continuo como por lote, con la diferencia es que en este último solo se considera la fase de
crecimiento exponencial para su determinación. Se representa como:

Rendimiento de sustrato en 𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑑𝑒 𝑏𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑥

𝑅𝑒𝑛𝑑𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 𝑌𝑥/𝑆 =
biomasa 𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑑𝑒 𝑠𝑢𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜 𝑐𝑜𝑛𝑠𝑢𝑚𝑖𝑑𝑜 𝑆

Rendimiento de sustrato en 𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜 𝑃

𝑅𝑒𝑛𝑑𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 𝑌𝑃/𝑆 =
producto 𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑑𝑒 𝑠𝑢𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜 𝑐𝑜𝑛𝑠𝑢𝑚𝑖𝑑𝑜 𝑆

49
Otra forma de clasificación de los cultivos de microorganismos se realiza en base a si estos
requieren o no oxígeno como aceptor final de electrones. En caso de requerir oxígeno para el
desarrollo del cultivo nos referimos a fermentación aerobia, por otra parte, si los microorganismos
requieren condiciones de ausencia de oxígeno en el cultivo para su crecimiento se le conoce como
fermentación anaerobia. A continuación, se mencionan diversos ejemplos:

Fermentación anaerobia Fermentación aerobia

Producción de metano Producción de ácido acético
Producción de alcohol Producción ácido cítrico
Producción de ácido butírico
Producción de ácido láctico

3.2.3 Fermentación industrial

A nivel industrial, la fermentación se realiza en tanques cilíndricos, generalmente de acero y con

una altura mayor a su diámetro, cuya función es delimitar el ambiente donde se realiza la
fermentación del ambiente exterior. Dentro del fermentador, se intenta entregar a los
microorganismos las condiciones óptimas para su crecimiento y la producción del compuesto (o
compuestos) de interés y evitar o reducir la presencia de otros microorganismos.

Un fermentador cuenta con algunos de los siguientes elementos:

• Agitadores. Permiten mantener la homogeneidad del cultivo, promover la transferencia de

calor desde o hacia la chaqueta o serpentín, y mejorar la transferencia de gases.
• Serpentín o chaqueta. Permiten suministrar o retirar calor en forma indirecta. Para esto, se
hace circular por el interior de la tubería que forma el serpentín, o por el interior de la
chaqueta, un fluido refrigerante (normalmente agua o una mezcla de agua y etilenglicol) o
un fluido de calefacción (vapor de baja presión o agua caliente). El uso de chaquetas está
restringido a fermentadores de tamaño menor a 1000 L.
• Aireadores. Ubicados en el fondo del fermentador, permiten la producción de pequeñas
burbujas de aire al forzar el paso de una corriente de aire presurizada a través de pequeños
agujeros en una tubería o de un difusor.
• Instrumentación y control. Incluyen a lo menos la medición del pH y la temperatura. Estas
mediciones son utilizadas por el sistema de control para mantener dichas variables en los
valores preestablecidos. Para la mantención del pH se utilizan soluciones concentradas de
ácido o base, las que son dosificadas en forma automática utilizando bombas. Para el control
de la temperatura, es posible variar los flujos y temperatura del fluido de enfriamiento o
calentamiento.
• Puertos de entrada y salida de cultivo. Corresponden a tuberías que permiten alimentar
el medio de cultivo e inóculo. Las tuberías de descarga permiten vaciar el fermentador al
término de la operación mientras que los puertos de toma de muestras permiten obtener
pequeñas porciones de líquido para realizar análisis de laboratorio.

Un fermentador utilizado para la producción en gran escala puede tener un volumen superior a los
500.000 litros, lo que requiere múltiples agitadores (véase la Figura 33).

50
Figura 33: Diagrama de un fermentador (derecha) e imagen del interior de un fermentador industrial durante
una inspección.

Para evitar el desarrollo de microorganismos indeseados durante el curso de una fermentación es

posible esterilizar tanto el fermentador como el medio de cultivo. El tanque y todos sus accesorios
son esterilizados a una temperatura de 121°C utilizando vapor. Generalmente, el medio de cultivo
es esterilizado por separado en un esterilizador continuo, lo que permite recuperar parte de la
energía utilizada para llevar el medio de cultivo a la temperatura de esterilización mediante el
aprovechamiento de la energía liberada durante el enfriamiento del medio esterilizado. El uso de
medios y fermentadores esterilizados sólo es utilizado en la producción de compuestos de alto valor
agregado (véase la Tabla 1).

Tabla 1: Cultivos asépticos y no asépticos en la industria

Cultivo aséptico Cultivo no aséptico

Aeróbico Anaeróbico Aeróbico Anaeróbico
Aminoácidos Butanol Vinagre Bebidas alcohólicas
Enzimas Acetona Tratamiento aeróbico de Tratamiento
aguas anaeróbico de aguas
Vacunas Ácido láctico Maduración de quesos Etanola
Vitaminas
Antibióticos

51
3.3 Producción de alcoholes y solventes
3.3.1 Etanol como combustible y químico

La mayoría de las regiones en el mundo han producido bebidas alcohólicas desde sustratos
disponibles localmente (granos, frutas, caña de azúcar). En forma similar, en la actualidad se
produce etanol para su uso en la industria química o como combustible. La producción anual de
etanol es superior a 30.000 millones de litros, siendo cerca de un 70% obtenido por fermentación,
el 30% restante se obtiene de la hidrogenación catalítica del etileno. Casi un 12% del etanol es
utilizado como bebida alcohólica, un 20% en la industria química y el 68% restante como
combustible. En este uso, el etanol es mezclado a razón de 10-22% (v/v) con gasolina, aumentando
su octanaje. El etanol producido mediante fermentación utiliza como substrato material ricos en
carbohidratos, principalmente sacarosa presente en la caña de azúcar y almidón obtenido desde
granos como el trigo y desde papas (Figura 34).

La producción a nivel industrial de etanol comenzó en la década de los 70 en Brasil. Motivado por
el alto y volátil precio del crudo, el gobierno brasileño lanzó el programa Proálcool. El programa
buscaba aprovechar las condiciones naturales del país para el cultivo de la caña de azúcar, planta
capaz de acumular altas cantidades de sacarosa.

Almidón
(cereales, tubérculos)

Cultivos azucareros
Suero de leche Remolacha o caña

Gelatinización y Extracción
Deproteinización
sacarificación sacarosa
(nitrógeno, fosfato, vitaminas)
Nutrientes para fermentación

Fermentación
Subproductos de
Batch, continua,
fermentación
semi-continua

Destilación
< 95,6 %(v/v) etanol

Deshidratación
> 99,8 %(v/v) etanol

Figura 34: Fuentes de carbono en la producción de etanol y diagrama de bloques del proceso.

52
3.3.2 Producción de azúcares fermentables

El proceso de producción de etanol desde caña de azúcar consiste en la cosecha y transporte de

la caña hasta las plantas de producción de etanol. En estas, la caña es lavada y prensada para
extraer el jugo de caña el que es enviado a los estanques de clarificación, donde se ajusta el pH
con ácido sulfúrico produciendo la precipitación de algunas impurezas. En las plantas modernas, la
extracción de azúcar de caña es maximizada utilizando extractores por difusión, en los que se usa
agua caliente para extraer el azúcar. La caña de azúcar extraída se conoce como bagazo y es
enviada a caldera para producir vapor (que es utilizado en el proceso) y electricidad, en parte
consumida en el proceso y en parte exportada a la red eléctrica. Las impurezas separadas luego
del tanque de precipitación son separadas en un filtro y comercializadas como ingrediente de
alimentación animal (cachaza).

En el caso de cultivos ricos en almidón, como trigo o maíz, la glucosa está en forma del polímero
almidón. La mayor producción de etanol a partir de almidón se realiza en Estados Unidos utilizando
granos de maíz como substrato. Existen dos procesos para la obtención de azúcares fermentables
desde el maíz: molienda seca y molienda húmeda. El primero es utilizado en cerca del 70% de las
instalaciones, y por ende será discutido. El proceso está diseñado para convertir el almidón en
azúcares fermentables.

3.3.3 Conversión de almidón en glucosa

El almidón es el polímero de reserva utilizado por las plantas para almacenar energía en forma de
gránulos semicristalinos característicos de cada especie vegetal, con tamaños que varías desde los
2 a 100 𝜇𝑚. El polímero está constituido por dos tipos de moléculas:

Amilosa: formada por glucosas unidas mediante enlaces glucosídicos α-(1 → 4) en una cadena sin
ramificaciones (cadena lineal). Cada molécula está formada por miles de unidades y se organiza en
una estructura helicoidal. Constituye entre el 25% a 30% del almidón (Figura 35)

Amilopectina: también formada por glucosas conectadas mediante enlaces glucosídicos. A

diferencia de la amilosa, se trata de una molécula ramificada. Aproximadamente, cada 12 unidades
de glucosa unidas por enlaces α-(1 → 4) se origina una ramificación mediante una unión α-(1 → 6).

La proporción exacta entre amilosa y amilopectina depende del organismo. Los gránulos de almidón
son insolubles en agua fría, pero en agua caliente sufren un proceso conocido como gelatinización.
En él, los gránulos captan agua y revientan, perdiendo su estructura semicristalina permitiendo que
las moléculas más pequeñas de amilosa escapen a la solución incrementando su viscosidad. Hasta
este punto, no se ha liberado glucosa, sino sólo se han destruido los gránulos aumentando la
accesibilidad de las cadenas de glucosa.

Figura 35: Molécula de amilosa (a la izquierda) y amilopectina (a la derecha).

53
La liberación de la glucosa desde el almidón requiere de la destrucción de los enlaces glucosídicos
que unen el polímero. Esto puede hacerse mediante el uso de un ácido mineral a alta temperatura,
usado antiguamente a nivel industrial, o mediante el uso de enzimas. El uso de ácido ha caído en
desuso dado que requiere reactores y equipamiento resistente a la corrosión, además consumía
más energía y generaba residuos sólidos (sales del ácido).

Actualmente, varios tipos de enzimas son utilizadas para producir glucosa desde almidón en dos
procesos sucesivos: licuefacción y sacarificación. En el primero, la harina de maíz es mezclada con
agua hasta alcanzar un contenido de sólidos de entre 30 a 40% (p/p), el pH es ajustado a 6,5, se
agrega una sal de calcio para alcanzar entre 20 a 80 ppm de Ca+2 y amilasas (principalmente).
La temperatura de la mezcla se eleva hasta 105°C (para la enzima obtenida desde B.
amyloliquefaciens) o 95°C cuando se usa una enzima producida por B. licheniformis. Las
amilasas requieren de la presencia de iones calcio como cofactores, de ahí que este sea
agregado al medio de reacción. Producen cortes en enlaces -1,4 en puntos aleatorios de los
polímeros, produciendo dextrinas (polímeros cortos de glucosa u oligosacáridos producidos por la
hidrólisis del almidón) además de maltosa, trímeros, tetrámeros y otras cadenas cortas de glucosa.
El rompimiento de las cadenas largas de polímeros causa una disminución de la viscosidad (de ahí
el nombre licuefacción). Una vez alcanzado un estado líquido, la suspensión es enfriada
rápidamente a 60°C, el pH es reducido a valores de entre 4,0-5,0 y se agrega un mix de
-glucosidasa y pululanasa para iniciar el proceso de sacarificación. En este, la enzima
-glucosidasa hidroliza los enlaces -1,4 desde el extremo no reductor de las cadenas cortas
liberadas en el proceso de hidrólisis produciendo -D-glucosa. Esta enzima también hidroliza
enlaces -1,6, aunque a una velocidad mucho menor comparada a la velocidad de hidrólisis de
enlaces -1,4. Por esto, industrialmente se utiliza la enzima pululanasa, la que hidroliza sólo
enlaces -1,6, permitiendo que al final del proceso se recupere un jarabe en el que las azúcares
están representadas por 97% de glucosa, 1,5% de maltosa y otras azúcares y oligosacáridos.

Enzima EC Origen Acción

Sólo corta enlaces -1,4 produciendo -
Bacillus
dextrinas, maltosa (G2) y oligosacaridos
amyloliquefaciens
G3, G6 y G7.
-Amilasa 3.2.1.1
Sólo corta enlaces -1,4 produciendo -
B. licheniformis dextrinas, maltosa (G2) y oligosacaridos
G3, G4 y superiores
Corta enlaces -1,4 y -1,6 desde
Glucoamilasa o -
3.2.1.3 A. niger extremos no reductores produciendo-
Glucosidasa
glucosa
Sólo corta enlaces -1,6 produciendo
Pululanasa 3.2.1.41 B. acidopullulyticus
maltodextrinas de cadena lineal

3.3.4 Fermentación a etanol

Desde tiempos ancestrales la elaboración de bebidas alcohólicas ha utilizado a dos

microorganismos para la fermentación de azúcares a etanol: Saccharomyces cerevisiae y
Zymomonas mobilis (especialmente en México y África). ¿Por qué estos microorganismos y no
otros?

Normalmente en el medio ambiente, las azúcares son muy escasas. Luego, la mayoría de los
microorganismos evolucionaron para vivir en esta clase de ambientes, siendo inhibidos por altas
concentraciones de azúcares. Sin embargo, con la aparición evolutiva de las frutas, a finales de
54
otoño cuando estas maduran se desata una competencia para aprovechar la gran cantidad de
azúcares contenidas en ellas. Cualquier microorganismo que triunfe en este ambiente debería ser
capaz de propagarse en presencia o ausencia de oxígeno (aerobio facultativo), ser tolerante a altas
concentraciones de azúcares, consumir rápidamente los azúcares o evitar que otros lo hagan (por
ejemplo, produciendo un tóxico). Tanto Z. mobilis como S. cerevisiae tienen estrategias para triunfar
en un ambiente así, aunque diferentes.

En S. cerevisiae la estrategia para consumir la mayor cantidad de azúcares es producir etanol,

compuesto generalmente tóxico para los microrganismos. Bajo condiciones anaeróbicas, S.
cerevisiae produce etanol y CO2 (lo que es común entre los organismos fermentativos). Sin
embargo, bajo condiciones aeróbicas en las que es posible la respiración utilizando el oxígeno como
último aceptor de electrones, S. cerevisiae convierte las azúcares en etanol y CO2 hasta que se
alcanzan bajas concentraciones de ésta. Este fenómeno se conoce como el efecto Crabtree y las
levaduras que lo presentan se conocen como levaduras Crabtree positivas. La capacidad para
producir etanol en presencia de oxigeno permite que, en su medio natural, S. cerevisiae limite la
velocidad de crecimiento de otras especies y, una vez que las azúcares han sido consumidas,
consumir el etanol producido (sólo bajo condiciones aeróbicas).

Z. mobilis, también un aerobio facultativo, consume las azúcares glucosa, fructosa y sacarosa
alrededor de 2,5 veces más rápido que S. cerevisiae produciendo etanol y dióxido de carbono
principalmente. Sin embargo, no es ampliamente utilizado en la industria, especialmente cuando se
usa caña de azúcar, en parte a su menor tolerancia a altas concentraciones de etanol y a menor
producción de etanol debido a la formación de subproductos de la sacarosa (sorbitol y levano) y a
la inhibición del crecimiento causado por algunas sales en el jugo de caña.

Aunque tanto S. cerevisiae como Z. mobilis producen etanol y CO2 desde glucosa, cada una utiliza
rutas metabólicas distintas: Entner-Doudoroff (ED, utilizada por Z. mobilis) y ruta de Embden–
Meyerhof–Parnas (EMP, utilizada por S. cerevisiae.)

55
Figura 36: Rutas de degradación (catabólicas) de glucosa. A la izquierda ruta de Entner–Doudoroff (ED) y a
la derecha ruta de Embden–Meyerhof–Parnas (EMP).

El resultado neto de la degradación de 1 mol de glucosa utilizando la ruta ED es la producción de 1

mol de ATP y 1 mol de NADH. En cambio, utilizando la ruta EMP, S. cerevisae es capaz de producir
2 moles de ATP y 2 moles de NADH. Luego, utilizando esta última es posible producir el doble de
energía por cada mol de glucosa que al utilizar la ruta ED. Esto podría explicar porque Z. mobilis es
capaz de consumir glucosa en forma más rápida que S. cerevisiae.

Una vez obtenido piruvato desde glucosa, es necesario reoxidar el NADH a NAD+. En presencia de
oxígeno (a menos que se trate de levaduras Crabtree positivo), el NADH sería oxidado utilizando el
oxígeno como último aceptor de electrones. En cambio, en levaduras Crabtree positivo o en
ambientes anaeróbicos, el NADH es oxidado convirtiendo el piruvato en un compuesto más
reducido. Cuando el producto de la fermentación es etanol (compuesto más reducido que el
piruvato), la reacción ocurre en dos pasos. Primero, el piruvato es decarboxilado mediante la acción
de la enzima piruvato decarboxilasa (la que utiliza magnesio y pirofosfato de tiamina como
cofactores) para producir acetaldehído. Finalmente, este compuesto es reducido por la enzima
alcohol deshidrogenasa utilizando un electrón proveniente del NADH.

Actividad recomendada
Encuentre una ecuación balanceada para la producción de etanol y CO 2 desde 1 mol de glucosa. Considere
las moléculas de ATP, ADP, NADH y NAD+.
56
3.3.5 Fermentación industrial de etanol

La fermentación de las azúcares resultantes de la sacarificación del almidón o aquellas contenidas

en el azúcar de caña son fermentadas utilizando principalmente S. cerevisiae. El modo de
fermentación puede ser por lotes, continuo o con alguna forma de reciclo de células, lo que impacta
la productividad volumétrica de etanol, la cual, dependiendo del cultivo queda definida como:

Cultivo Productividad volumétrica de etanol

𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑑𝑒 𝑒𝑡𝑎𝑛𝑜𝑙
Lote 𝑃𝑟𝑜𝑑𝑢𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚é𝑡𝑟𝑖𝑐𝑎 𝑑𝑒 𝑒𝑡𝑎𝑛𝑜𝑙 ≔
𝑡𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜 𝑑𝑒 𝑓𝑒𝑟𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑐𝑖ó𝑛 ⋅ 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑒𝑡𝑎𝑛𝑜𝑙 ⋅ 𝐹𝑙𝑢𝑗𝑜 𝑑𝑒𝑠𝑐𝑎𝑟𝑔𝑎
Continuo 𝑃𝑟𝑜𝑑𝑢𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚é𝑡𝑟𝑖𝑐𝑎 𝑑𝑒 𝑒𝑡𝑎𝑛𝑜𝑙 ≔
𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒𝑙 𝑓𝑒𝑟𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑑𝑜𝑟

Luego, para producir una determinada masa de etanol por hora, la productividad volumétrica
determina el volumen del reactor a utilizar. Un listado de valores típicos de productividad volumétrica
se presenta en la Tabla 2.

Tabla 2 Valores típicos de productividad volumétrica de etanol

Tipo de operación Productividad volumétrica de etanol (g/L/h)

Lotes 2,5 - 3,5
Lotes con reciclo de células 5 - 6,5
Continua 12 - 14

La operación por lotes es poco utilizada en la industria debido a su baja productividad volumétrica.
La operación por lotes con reciclo de células es utilizada en cerca del 75% de las plantas de
producción en Brasil. El proceso, conocido como Melle-Boinot, consiste en la separación de las
levaduras, utilizando una centrífuga de discos, una vez que termina un ciclo de fermentación por
lotes. La corriente de levaduras concentradas es mezclada en un tanque con agua y ácido sulfúrico
donde se mantienen por 4 horas. Por cada 4000 L de concentrado de levadura se utilizan unos
6000L de agua y 20 L de ácido sulfúrico comercial. La disminución del pH impide el crecimiento de
bacterias. Las levaduras son enviadas a un fermentador y comienza la alimentación de medio fresco
a fermentar, rico en azúcares. La alta concentración inicial de levaduras permite una fermentación
rápida (Valsechi, 1944).

Por otro lado, en Estados Unidos, el método de fermentación más utilizada es la fermentación
continua. Típicamente, se usan entre 4 a 6 fermentadores conectados en serie. La alimentación de
medio fresco se realiza al primer fermentador, mientras que la salida de este corresponde a la
alimentación del siguiente y así sucesivamente. De esta forma, los fermentadores siempre están en
operación. De ahí, el nombre continuo de la operación.

57
3.4 Butanol y acetona
Mediante la fermentación de azúcares utilizando diversas especies del género Clostridium es
posible obtener acetona, butanol, acido butírico e isopropanol, además de cantidades menores de
etanol y ácido acético. La cantidad relativa de cada producto de fermentación depende de la especie
y cepa de Clostridium utilizada y las condiciones ambientales de la fermentación. Pese a lo anterior,
se distinguen tres tipos principales de fermentación:

• Acetona-butanol (Clostridium acetobutylicum), con ácido butírico, ácido acético, acetoína,

etanol, CO2 e hidrógeno como subproductos.
• Butanol-isopropanol (Clostridium butylicum), con ácido butírico, ácido acético, CO2 e
hidrógeno como subproductos.
• Ácido butírico-ácido acético (Clostridium butyricum), con CO2 e hidrógeno como
subproductos.

Los miembros del género Clostridium son bacterias Gram-positivas, con forma de bastones y
flagelados. Se caracterizan por formar esporas resistentes al calor y poseer un metabolismo
fermentativo. Todos son anaerobios, abarcando desde la anaerobiosis obligada hasta especies que
toleran el oxígeno. La mayoría son mesófilos, aunque se conocen algunas especies termofílicas
como C. thermoaceticum.

La fermentación acetona-butanol fue utilizada desde principios de siglo. Desarrollada por Weizmann
en el Reino Unido utilizando Clostridium butylicum, jugó un rol clave en la producción de acetona
durante la primera guerra mundial, cuando era utilizada para la producción de explosivos. Luego de
la primera guerra, el butanol se convirtió en el producto de interés, el que era utilizado para la
producción de rayón, detergentes y butadieno para la síntesis de caucho estireno-butadieno entre
otras aplicaciones. La producción anual de butanol alcanzo 20000 toneladas en 1945, pero su
producción declinó en occidente gracias al bajo precio de precursores de la industria petroquímica
para la producción de butanol desde propileno. Sin embargo, aún existen plantas de fermentación
operando en Rusia y, principalmente, China. Recientemente, la fermentación para la producción de
butanol ha resurgido como una opción de producir butanol utilizando materiales lignocelulósicos
como sustrato.

La producción industrial de butanol se realizaba en grandes reactores anaerobios sin agitación dado
que los gases producidos permitían la agitación de su contenido. Las fermentaciones eran operadas
por lotes, frecuentemente usando entre 5-7% (p/p) de almidón o melazas (un subproducto de la
producción de azúcares con alto contenido de sacarosa) como fuente de carbono. Una vez cargado
el reactor con el medio de cultivo, éste era esterilizado y el reactor era purgado con CO2 de manera
de alcanzar una condición anaerobia. Luego, el fermentador era inoculado con una baja
concentración de C. acetobutylicum (0,03 % v/v). Durante las primeras 24 horas, el pH caía desde
un nivel inicial de 6,0 a 5,2 causado por la producción de ácidos butírico y acético durante la fase
de crecimiento rápido (véase la Figura 37, izquierda). Durante las siguientes 24 h o más, el pH subía
nuevamente a 6,0 al metabolizarse los ácidos producidos para formar acetona, butanol y etanol
(véase la Figura 37, derecha). Al final de la fermentación, la concentración total de solventes
alcazaba un 2% (v/v), con una relación butanol, acetona y etanol en razón de 6:3:1 (p/p) con un
rendimiento típico de solventes de 37% (p/p) basado en los carbohidratos iniciales.

58
La recuperación de los solventes se realizaba por destilación fraccionada de acuerdo a su
volatilidad. En una primera columna se recuperaba acetona, en una segunda columna se
recuperaba una corriente de butanol y agua por fondo y una corriente de etanol por tope.
Finalmente, en una tercera columna se recuperaba butanol por fondo y agua por tope.

Figura 37: Rutas metabólicas involucradas en la producción de ácidos (fase acidogénica, a la izquierda) y
en la metabolización de los ácidos para producir solventes (fase solventogenica, a la derecha) en C.
acetobutylicum.

3.5 Producción de ácidos orgánicos

3.5.1 Láctico

El ácido láctico tiene múltiples aplicaciones en la industria farmacéutica, química, cosmética y

alimentaria. En esta última se utiliza como aditivo y conservante en productos cárnicos y lácteos,
en la industria derivada de cereales y en numerosas industrias de bebidas. Una aplicación más
reciente del ácido láctico es su utilización para la producción de PLA (ácido poliláctico). El PLA es
un bioplástico con características similares a las del polystyrene o PET. Actualmente es utilizado en
la elaboración de envases rígidos y flexibles, vasos para bebidas frías, botellas y como insumo de
impresoras 3D. Una de las ventajas del PLA es que bajo ciertas condiciones es biodegradable.

El ácido láctico tiene un carbono asimétrico lo cual da lugar a actividad óptica. Existen dos isómeros
ópticos, tal como se muestra en la Figura 38, el D(-) láctico y el L(+) láctico y una forma racémica
constituida por fracciones equimolares de las formas L(+) y D(-). A diferencia del isómero D(-), la
configuración L(+) es metabolizada por el organismo humano.

59
 L (+) ácido láctico D (-) ácido láctico
Figura 38: Enantiómero de ácido láctico

Su obtención se puede realizar tanto de forma química como biológica. La producción biológica está
basada en la fermentación de sustratos ricos en carbohidratos por bacterias u hongos. Actualmente
la conversión de azúcares a ácido láctico es realizada por microorganismos que no requieren
oxígeno.

Al igual que en casi todas las fermentaciones industriales en las que el producto no es de alto valor,
existen múltiples características que describen al microorganismo ideal:

• Alta productividad volumétrica para reducir el tiempo de fermentación o el volumen de los

fermentadores
• Alto rendimiento para reducir el costo de operación asociado a la fuente de carbono
• Capacidad de usar fuentes de nutrientes económicas
• Alta concentración de producto
• Debe resistir contaminación por otras bacterias e infecciones (por ejemplo, por fagos).

El ácido láctico es producido por fermentación anaerobia de azúcares en fermentadores de 20 a

100 m3 utilizando Lactobacillus delbruckii u otra bacteria homoláctica como L. bulgaricus. El medio
de cultivo normalmente contiene una fuente compleja de nitrógeno y está suplementado con
vitaminas. La fuente de carbono es típicamente sacarosa o glucosa en concentraciones de 12%
(p/v). En forma alternativa, es posible utilizar lactosa, típicamente obtenida del permeado de suero.
Las azúcares son metabolizadas hasta piruvato por la ruta EMP, para posteriormente convertir el
piruvato en L-lactato por la acción de la enzima L-lactato deshidrogenasa. En esta reacción, el
piruvato actúa como último aceptor de electrones al reducirse hasta ácido láctico. Al igual que en la
fermentación de etanol, los electrones provienen del NADH, permitiendo a la célula la regeneración
del NAD+. La fermentación de ácido láctico es operada a temperaturas de entre 45-60°C, pH de 5-
6 y dura entre 4 a 6 días, alcanzando un rendimiento superior a 90% basado en las azúcares
suplementadas.

3.6 Producción de aminoácidos

Los aminoácidos se utilizan ampliamente en la industria alimentaria como aditivos para alimento
animal; en la industria dietética, como suplementos nutricionales, y en la industria química como
precursores.

El aminoácido comercial más importante es el ácido glutámico, que se emplea como potenciador
del sabor (glutamato monosódico, GMS). Otros dos aminoácidos importantes, el ácido aspártico y
la fenilalanina, forman el edulcorante artificial aspartamo, un edulcorante no nutritivo utilizado en
refrescos y otros alimentos que se comercializan como productos bajos en calorías o sin azúcar. La
Tabla 3 muestra diversos aminoácidos producidos con microorganismos y sus principales
aplicaciones.

60
Tabla 3: Aminoácidos producidos con microorganismos y sus usos

Producción anual
Aminoácido mundial (ton Usos Finalidad
métricas)
L-Glutamato (glutamato 370.000 Alimentos Potenciador del sabor,
monosódico, GMS) ablandador de la carne
L-Aspartato y L-Alanina 5.000 Jugos de fruta Enriquecedor del sabor
Glicina 6.000 Alimentos Mejora el sabor,
edulcorados materia prima para
síntesis orgánicas
L-Cisteína 700 Pan, jugos de fruta Mejora de la calidad,
antioxidante
L-Triptófano + L-Histidina 400 Alimentos, leche Antioxidante, previene
en polvo la rancidez, aditivos
nutritivos
Aspartamo (fabricado a 7.000 Refrescos, chicles, Edulcorante bajo en
partir de L-fenilalanina + productos sin calorías
acido L-aspártico) azúcar
L-Lisina 70.000 Pan (Japón), Aditivo nutritivo
aditivo alimentario
DL-Metionina 70.000 Productos de soja, Aditivo nutritivo
aditivo alimentario

3.6.1 Producción de ácido L-glutámico

Como se muestra en la Tabla 3, el ácido L-glutámico, o glutamato, es el aminoácido de mayor

producción a nivel global. Su uso principal es como aumentador o mejorador del sabor, al permitir
una intensificación del sabor de los alimentos sin adicionar un sabor característico. Este compuesto
fue asilado en 1908 desde el alga Laminaria japónica, la que era usada en la cocina tradicional
oriental. Aunque inicialmente fue obtenido desde plantas y algas, este proceso fue reemplazado por
un proceso de fermentación al inicio de la década de 1960 utilizando especies de los géneros
Brevibacterium y Corynebacterium. Estas son bacterias Gram-positivas, no móviles, aerobias y que
requieren de biotina para su crecimiento. Comparten el hecho que poseen una intensa actividad de
la enzima glutamato-deshidrogenasa:

ácido oxoglutarico + NH4+ + NAD(P)H + H + → ácido L − glutámico + NAD(P)+ + H2 O

La cepa salvaje de Corynebacterium glutamicum es inhibida por concentraciones intracelulares de

ácido glutámico superiores al 5% en base seca. Sin embargo, las cepas utilizadas en producción,
desarrolladas usando mutagénesis y programas de selección, son mutantes en sus sistemas
regulatorios y en su auxotrofía (eliminan la necesidad de suministrar biotina y otras vitaminas). Las
cepas industriales acumulan cerca de 100 g/L de glutamato, muestran rendimientos de 1 mol de
glutamato por 1,4 moles de glucosa y son resistentes a infecciones por fagos. Recientemente, se
ha utilizado tecnología de DNA recombinante para aumentar la actividad de algunas enzimas
biosintéticas mediante la introducción de múltiples copias de plásmidos que portan los genes de
dichas enzimas.

Las estrategias generales para la sobreproducción de este aminoácido son:

• Aumentar la actividad de las enzimas anabólicas

61
 • Manipulación de la regulación para eliminar mecanismos de control feedback, donde un
metabolito inhibe a la enzima que lo sintetiza al alcanzar cierta concentración.
• Bloqueo de rutas que producen subproductos
• Bloqueo de rutas en las que el metabolito buscado es consumido como reactivo
• Limitación de la capacidad para procesar el precursor inmediato del ácido L-glutámico (ácido
oxoglutárico) al siguiente intermediario del ciclo de los ácidos tricarboxílicos (succinil
coenzima A). Esto es, usar mutantes que carezcan de la enzima ácido glutárico
deshidrogenasa. Durante la fase de crecimiento, en la que se requiere el uso del TCA, estos
mutantes completan el ciclo de los ácidos tricarboxílicos utilizando el ciclo del glioxilato, un
bypass desde isocitrato a malato.

Adicionalmente, estas bacterias no secretan en forma natural el ácido glutámico al medio. La

adición de penicilina o detergentes (como el Tween 40) o la limitación por biotina permite la
liberación de los aminoácidos al medio por un mecanismo aún desconocido.

Figura 39: Síntesis de ácido L-glutámico en cepas mutantes de C. glutamicum

La fermentación industrial se realiza en reactores de alrededor de 450 m 3 en procesos por lotes

operados a 30-37°C con aireación y bajo condiciones estériles. Además de una fuente de carbono,
típicamente melazas de caña o remolacha, el medio requiere de una fuente de nitrógeno y sales
inorgánicas. Típicamente, no es necesario suplementar el medio con biotina cuando se utilizan
melazas, por lo que la excreción del aminoácido al medio se logra mediante la utilización de un
detergente o un aminoácido.

La recuperación del ácido glutámico se logra mediante la cristalización de este luego de la

separación de las células. La formación de cristales se alcanza mediante la disminución del pH
hasta 3,2 alcanzando el punto isoeléctrico del ácido glutámico. En este punto, el ácido glutámico no
62
tiene carga superficial, lo que le permite agregarse formando cristales. Estos son separados del
medio de cultivo libre de células utilizando filtros.

3.6.2 Referencias

Michael J. Waites, Neil L. Morgan, John S. Rockey, Gary Higton. 2001. Industrial Microorganisms,
in Industrial Microbiology: An Introduction

63
4 Productos de alto valor agregado producidos por microorganismos
4.1 Introducción
La microbiología industrial utiliza microorganismos, generalmente cultivados a gran escala, para
obtener productos comerciales o realizar importantes transformaciones químicas. Los procesos
industriales que emplean microorganismos potencian las reacciones metabólicas que éstos ya
pueden realizar por sí mismos, con el objetivo principal de producir una mayor cantidad del producto
de interés.

La microbiología industrial tiene su origen en los procesos de fermentación alcohólica, como los que
se utilizan para producir cerveza y vino. Posteriormente, se desarrollaron procesos microbianos
para la síntesis de productos farmacéuticos (como los antibióticos), aditivos alimentarios (como los
aminoácidos y el vinagre), enzimas, productos químicos (como el alcohol y el ácido cítrico) y células
microbianas (extracto de levadura).

Para que un microorganismo pueda ser utilizado en un proceso industrial, además de producir la
sustancia de interés de forma rentable, debe tener otras características. Entre ellas, el
microorganismo debe ser capaz de crecer y sintetizar el producto en un cultivo a gran escala.
Adicionalmente, es preferible que produzca esporas o alguna forma de célula reproductora, que
pueda ser fácilmente inoculada en los grandes reactores utilizados para cultivar el microorganismo
productor a escala industrial. Por otra parte, el microorganismo debe crecer rápidamente y sintetizar
el producto deseado en un período relativamente corto de tiempo. Los microorganismos de interés
industrial también deben ser capaces de crecer en un medio de cultivo líquido relativamente de bajo
costo que se comercialice a granel. Muchos procesos microbiológicos industriales utilizan productos
de desechos carbonados provenientes de otras industrias como ingredientes principales o
suplementarios de los medios de cultivo a gran escala. Entre éstos se encuentran el licor de
maceración del maíz (un producto de la industria de la molienda húmeda del maíz que es rico en
nitrógeno y factores de crecimiento) y el suero de la leche (un líquido residual de la industria láctea
que contiene lactosa y minerales). Es importante considerar que un microorganismo industrial no
debe ser patógeno, especialmente para los seres humanos, ni para animales o plantas. Por último,
los microorganismos industriales deben ser susceptibles de manipulación genética, porque en
microbiología industrial a menudo se incrementa genéticamente el rendimiento mediante mutación
y selección. Por tanto, un microorganismo genéticamente estable y fácilmente manipulable presenta
claras ventajas para el desarrollo de un proceso industrial.

Los productos microbianos de interés industrial comprenden las células microbianas propiamente
tal, como, por ejemplo, las levaduras cultivadas para ser usadas en alimentación, panadería o la
elaboración de cerveza y las sustancias producidas por las células. Un ejemplo de productos
obtenidos a partir de microorganismos son enzimas como la glucosa isomerasa, importante para la
producción de jarabes ricos en fructosa; fármacos activos como los antibióticos, esteroides y
alcaloides; productos químicos especializados y aditivos alimentarios como el aspartamo (un
edulcorante para alimentos y bebidas); y productos químicos genéricos baratos producidos a granel,
como el etanol y el ácido cítrico, entre otros.

64
4.2 Producción de antimicrobianos
Los antibióticos o antimicrobianos son sustancias químicas producidas por microorganismos que
matan o inhiben el crecimiento de otros microorganismos. La mayoría de los antibióticos que se
utilizan en medicina son producidos por hongos filamentosos o por bacterias del grupo de los
actinomicetos. En la Tabla 4 se mencionan los antibióticos más importantes producidos hoy en día
mediante procesos de fermentación industrial a gran escala.

Tabla 4 Antibióticos producidos por microorganismos. BFE: bacteria formadora de endosporas, H: hongos,
A: actinomiceto

Antibiótico Microorganismo productor

Bacitracina Bacillus licheniformis (BFE)
Cefalosporina Cephalosporium spp. (H)
Cloranfenicol Síntesis química (antiguamente producido por el
microorganismo Streptomyces venezuelae) (A)
Cicloheximida Streptomyces griseus (A)
Cicloserina Streptomyces orchidaceus (A)
Eritromicina Streptomyces erythreus (A)
Griseofulvina Penicillium griseofulvin (H)
Kanamicina Streptomyces kanamyceticus (A)
Lincomicina Streptomyces lincolnensis (A)
Neomicina Streptomyces fradiae (A)
Nistatina Streptomyces noursei (A)
Penicilina Penicillium chrysogenum (H)
Polimixina B Bacillus polymyxa (BFE)
Estreptomicina Streptomyces griseus (A)
Tetraciclina Streptomyces rimosus (A)

Desafortunadamente, la mayoría de los antibióticos nuevos falla en los ensayos, y sólo algunos
demuestran tener eficacia terapéutica y llegan a ser producidos comercialmente. El tiempo y los
costos invertidos en el desarrollo de nuevos antibióticos, desde su descubrimiento hasta su uso
terapéutico, es de 15 años y 1.000 millones de dólares americanos. Esto supone realizar diversos
niveles de ensayos clínicos, que pueden tardar varios años en ser completados, analizados y
enviados a las autoridades sanitarias para que éstas los aprueben.

4.3 Vitaminas
La mayoría de las vitaminas se obtienen industrialmente mediante síntesis química. Algunas
vitaminas son demasiado complicadas como para sintetizarlas a bajo costo, pero se pueden fabricar
en cantidades suficientes de forma relativamente sencilla mediante procesos microbianos. La
vitamina B12 y la riboflavina son las vitaminas más importantes de este tipo.

La vitamina B12 se sintetiza en la naturaleza exclusivamente a partir de microorganismos, pero

todos los animales la necesitan como factor de crecimiento. En seres humanos, un déficit importante
de B12 produce un debilitamiento llamado anemia perniciosa, caracterizada por la baja producción
de eritrocitos (glóbulos rojos) y por alteraciones del sistema nervioso. Los animales satisfacen sus
necesidades de vitamina B12 mediante el consumo de alimentos, o bien mediante la absorción de
la vitamina producida por la microbiota normal residente en su propio intestino. Las plantas no
producen ni utilizan la vitamina B12, por lo que es importante que las personas que sean
vegetarianas estrictas complementen su dieta tomando esta vitamina. Las especies bacterianas de
65
los géneros Propionibacterium y Pseudomonas son las principales productoras comerciales,
especialmente Propionibacterium freudenreichii.

4.4 Enzimas y proteínas de aplicación industrial y médica

Todos los microorganismos producen una gran variedad de enzimas, muchas de las cuales se
producen sólo en pequeñas cantidades y funcionan dentro de la célula. No obstante, algunas
enzimas son producidas en cantidades mucho más grandes por algunos microorganismos, y en
lugar de permanecer en el interior de la célula, son excretadas al medio de cultivo (enzimas
extracelulares). Actualmente se utilizan tanto enzimas de animales y plantas, como de
microorganismos, obteniéndose a partir de estos últimos la mayoría de las enzimas comerciales.
En la Figura 40 se muestra la distribución de las ventas de enzimas, según su aplicación, en un total
de US$ 1.500 millones.

Otros usos

Pastelería 9%
5%
Alimentación animal 35% 7%
Bebidas y licores 7%

Textiles
11%
Procesamiento del almidón 14%
12%
Productos lácteos

Detergentes

Figura 40: Aplicación de enzimas microbianas

En menor cantidad se requieren enzimas de alta pureza para diversas aplicaciones terapéuticas,
como en kits de diagnóstico médico, biosensores y herramientas de investigación.

Además de la aplicación de enzimas en procesos conocidos, son utilizadas en el desarrollo de

nuevos procesos e innovaciones tecnológicas. Estas enzimas son producidas con un nivel de
pureza, según lo establecido por el cliente y los requerimientos del proceso, en cuanto a la actividad
y estabilidad necesaria. A menudo estos preparados contienen otras enzimas, resultando en
algunos casos beneficioso para su utilización.

Las enzimas, en su mayoría extracelulares, pueden digerir polímeros insolubles, como celulosa,
proteínas y almidón. Son especialmente útiles como catalizadores industriales debido a su alta
especificidad para el sustrato. Una ventaja de las enzimas es que muchas catalizan reacciones de
manera estereoespecífica, produciendo sólo uno de los dos estereoisómeros posibles.

66
 Isómeros
Dos moléculas pueden tener la misma fórmula, pero presentar diferentes formas estructurales.
Estas moléculas relacionadas, pero no idénticas se llaman isómeros. Por ejemplo, la glucosa y
la fructosa son isómeros. Los isómeros ópticos que tienen la misma fórmula molecular y
estructural pero que difieren en que uno es la imagen especular de otro (como la mano derecha
refleja a la izquierda) se denominan enantiomorfos o enantiómeros. Los enantiomorfos de un
compuesto determinado nunca se pueden superponer uno sobre otro, y se designan como D o L
dependiendo de si desvían la luz hacia la derecha o hacia la izquierda, respectivamente, cuando
están en una solución pura. Los azúcares con la forma enantiomorfa D son los que predominan
en los sistemas biológicos.

Estereoisómeros de glucosa Estereoisómeros de alanina

4.4.1 Aplicación industrial de enzimas

Las enzimas son utilizadas en diversas aplicaciones industriales. En la Tabla 5 se muestran diversos
usos que tienen las enzimas y las fuentes de las cuales son obtenidas.

Tabla 5: Enzimas producidas por microorganismos y sus aplicaciones

Enzima Fuente Aplicación

Pan, fabricación de jarabe de glucosa, ayuda
Hongos
digestiva
Amilasa Coberturas de almidón, almidonado en frio de la
Bacterias ropa, eliminación de revestimientos, eliminación de
manchas, detergentes
Hongos Pan
Eliminación de manchas, reblandamiento de la
Proteasa
Bacterias carne, limpieza de heridas, eliminación de
revestimientos, detergentes de uso domestico
Invertasa Levaduras Relleno blando de caramelos
Eliminación de glucosa, eliminación de oxígenos,
Glucosa oxidasa Hongos
papeles para pruebas de diabetes
Glucosa isomerasa Bacterias Jarabe de maíz alto en fructosa
Pectinasa Hongos Prensado, clarificación
Renina Hongos Coagulación de la leche
Celulasa Bacterias Suavizante de tejidos, abrillantador, detergente
Lipasa Hongos Ruptura de la grasa
Lactasa Hongos Ruptura de la lactosa en glucosa y galactosa
Bacterias Replicación del ADN en la técnica de la reacción
ADN polimerasa en cadena por la polimerasa (PCR)
Arqueas

67
A continuación, se mencionan algunas enzimas más en detalle, respecto de su aplicación y
producción.

- Proteasas bacterianas. Son las enzimas microbianas que se producen en mayor cantidad, son
utilizadas como aditivos en detergentes para lavar la ropa. La mayoría de estos detergentes
contienen enzimas, normalmente proteasas, pero también amilasas, lipasas y reductasas. Muchas
de estas enzimas se aíslan a partir de bacterias alcalófilas (microorganismos que crecen mejor en
un pH alcalino). Los principales productores son especies del género Bacillus, como Bacillus
licheniformis. Estas enzimas, tienen un pH óptimo comprendido entre 9 y 10, lo que es muy
importante ya que les permite permanecer activas al pH alcalino de las soluciones de los
detergentes.

- Amilasas. El almidón está formado por una fracción de amilosa de cadena recta de moléculas de
glucosa unidas por enlaces glucosídicos α-1,4; en tanto que la fracción amilopectina, además de la
cadena recta, presenta ramificaciones con enlaces glucosídicos 1,6. Se pueden clasificar en dos
tipos de amilasas: α-amilasa, cataliza la hidrólisis de la cadena lineal (amilosa) y la ramificada
(amilopectina) del almidón, rompiendo enlaces 1,4 interiores (endoamilasa) generando glucosa. Por
otra parte, la β-amilasa actúa sobre la amilosa, rompiendo unidades 1,4, dando maltosa. Son
utilizadas en la producción de glucosa a partir de almidón. Mediante una segunda enzima llamada
glucosa isomerasa, la glucosa se convierte entonces en fructosa, que es mucho más dulce que la
glucosa. El producto final es jarabe con un alto contenido de fructosa producido a partir de materias
primas que carecen de fructosa, pero que tienen un alto contenido de glucosa, como el maíz, el
trigo o las papas. Los jarabes altos en fructosa se utilizan mucho en la industria alimentaria para
edulcorar refrescos, jugos y muchos otros productos. La producción mundial de jarabes ricos en
fructosa supera los 10.000 millones de kilogramos anuales.
𝑎𝑚𝑖𝑙𝑎𝑠𝑎 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 𝑖𝑠𝑜𝑚𝑒𝑟𝑎𝑠𝑎
𝑎𝑙𝑚𝑖𝑑ó𝑛 → 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 → 𝑓𝑟𝑢𝑐𝑡𝑜𝑠𝑎

- Celulasas. Son producidas a partir de hongos como Trichoderma reesei, T. viride y Aspergillus
flavus. Las celulasas están formadas a partir de un complejo de al menos 3 enzimas, las cuales en
su conjunto son capaces de hidrolizar la celulosa hasta glucosa. Se cree que su aplicación estaría
relacionada con la elaboración futura de glucosa y productos azucarados a partir de residuos de
material lignocelulósico de bajo costo y gran disponibilidad, como lo son muchos desperdicios de
ciudades (poda de árboles) y desechos industriales, entre ellos los de la industria papelera. Los
residuos lignocelulósicos podrían presentar compuestos inhibidores para la acción de la enzima,
como las ligninas, entonces podría ser necesario realizar un pretratamiento de la materia prima,
antes de adicionar la enzima.

- Renina. Es una enzima proteolítica que se obtiene de los estómagos de terneros, se ha utilizado
durante miles de año para la producción de queso. Su acción sobre las proteínas de la leche
produce una coagulación de las mismas, produciendo queso. Adicionalmente en la elaboración de
quesos se utilizan otras enzimas para disminuir el tiempo de maduración y mejorar las propiedades
organolépticas de los quesos, así como también proporcionar las características propias de cada
variedad, entre ellas se encuentran proteasas y lipasas.

- Lactasa. Se produce a partir de hongos y es una enzima hidrolasa que producto de la hidrólisis
de la lactosa, genera glucosa y galactosa.
𝑙𝑎𝑐𝑡𝑎𝑠𝑎
𝑙𝑎𝑐𝑡𝑜𝑠𝑎 + 𝑎𝑔𝑢𝑎 → 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 + 𝑔𝑎𝑙𝑎𝑐𝑡𝑜𝑠𝑎

68
Su aplicación comercial consiste en la fabricación de productos lácteos como leche deslactosada,
para personas que presentan intolerancia a la lactosa debido al déficit de lactasa intestinal.

4.4.2 Aplicación médica de enzimas

La tecnología enzimática actualmente desempeña un papel importante en dos aspectos de la

práctica médica: el diagnóstico y el tratamiento. A continuación, se presentan ejemplo de ambas
aplicaciones.

Uso diagnóstico de las enzimas: Los análisis enzimáticos proporcionan información importante
con relación a la presencia y severidad de una enfermedad. Además, las enzimas suelen
proporcionar un medio de seguimiento de la respuesta de un paciente al tratamiento. Las
predisposiciones genéticas a determinadas enfermedades pueden determinarse también mediante
la medición de actividades enzimáticas específicas.

En el laboratorio clínico, las enzimas se utilizan de dos formas. En primer lugar, la actividad de
determinadas enzimas puede medirse directamente. Por ejemplo, la medida de la actividad en
sangre de la fosfatasa ácida se utiliza para diagnosticar el cáncer de próstata. En segundo lugar,
varias enzimas se utilizan como reactivos. Debido a la disponibilidad de enzimas purificadas, la
detección de determinados metabolitos es más exacta y rentable. Por ejemplo, la enzima urato
oxidasa se utiliza para medir la concentración en sangre de ácido úrico, un metabolito cuya
concentración habitualmente esta elevada en los pacientes con gota.

Uso terapéutico de las enzimas: El uso de las enzimas en los tratamientos médicos ha sido
limitado. Cuando se administran a los pacientes, las enzimas frecuentemente se inactivan o
degradan. Las cantidades importante de enzima que suelen requerirse para mantener un
tratamiento pueden dar lugar a reacciones alérgicas. Sin embargo, existen varios ejemplos de
tratamiento con enzimas que tienen éxito.

La estreptoquinasa es una enzima proteolítica producida por Streptococcus pyogenes. Esta enzima
estimula el crecimiento de la bacteria en los tejidos debido a que digiere los coágulos sanguíneos.
Actualmente de utiliza con bastante éxito en el tratamiento del infarto de miocardio, que presenta la
oclusión de las arterias coronarias. Si se administra pronto tras el comienzo del ataque cardiaco, la
estreptoquinasa suele evitar o reducir de forma significativa el daño del corazón.

69
5 Aplicaciones microbianas para la producción de fuentes alternativas de
energía y químicos.
5.1 Introducción
Previo a la revolución industrial, la humanidad obtenía la energía necesaria para sus actividades,
calefacción, cocina, industria y transporte desde fuentes renovables (Figura 41). Entre ellas, madera
como combustible y tracción animal. La invención de medios mecánicos que pudieran transformar el
calor en trabajo, como la máquina de vapor, permitió el uso de carbón y petróleo para producir trabajo,
posibilitando el uso industrial y, posteriormente con la invención del motor de combustión interna, la
masificación del transporte privado en automóviles.

Figura 41: Consumo mundial de energía desde distintas fuentes desde la revolución industrial hasta
principios del siglo XXI. Tomado de www.theoildrum.com/node/9023

El consumo de combustibles fósiles (carbón, gas natural y petróleo, Figura 41) aumentó rápidamente y
a la fecha, cada chileno consume algo más de 2,8 L de petróleo por día1. Siendo el petróleo rico en
carbono, su combustión produce CO2, uno de los gases de efecto invernadero. En este sentido, el
sector transporte contribuyó con un 22% de la emisión global de dióxido de carbono en el 2010, y se
proyecta que las emisiones de este sector se duplicarán para el año 2050 (IEA, 2012). A esto se suma
la naturaleza no renovable del petróleo, la que llevará a un punto en el que su uso no sea
económicamente, ambientalmente o energéticamente viable para satisfacer la necesidad de energía
para el transporte. A modo de evidencia, considérese la disminución del EROI, energy return on
investment, para la explotación de petróleo desde 1930. El indicador EROI es el cociente entre la
energía disponible para ser utilizada (en algún punto de la cadena de producción y distribución) sobre
la energía invertida para obtener dicho combustible. Considerando el EROI en la boca del pozo, los
valores recolectados por Murphy et al. (2010) muestran que este indicador en 1930 era mayor a 100;
esto es, por cada MJ invertido en perforación, equipos, exploración y otros se obtenían más de 100 MJ
disponibles para ser transformados en productos finales (gasolina, diésel y otros) consumiendo parte
de la energía en el proceso. Para el 2007 el EROI se había reducido a valores entre 11 a 18. En este

1
Index Mundi. http://www.indexmundi.com/g/r.aspx?v=91000

82
mismo año el EROI del petróleo importado a USA era de 12, mientras que la producción de
combustibles fósiles alternativos presenta EROIs aún más bajos: shale oil, con EROI cercano a 5 y
bitumen desde tar sands con EROI de 2 a 4. El valor mínimo de EROI que una fuente de energía debe
entregar para mantener los estándares modernos de sociedad se ha estimado en 10:1. Luego, es claro
que es necesario encontrar nuevas fuentes de energía.

Adicionalmente, la mayoría de los compuestos químicos, desde saborizantes y colorantes hasta

diluyentes de pinturas, espumas, agentes de limpieza, lubricantes y otros, son producidos utilizando
compuestos derivados del petróleo. Luego, su producción contribuye al calentamiento global y al
agotamiento de los combustibles fósiles.

5.2 La biomasa como fuente de energía y carbono

Entenderemos como biomasa a la materia viva formada mediante la acción de la fotosíntesis. Aunque
bajo esta definición, la biomasa abarcaría desde microalgas hasta árboles, restringiremos el análisis a
la biomasa vegetal que crece sobre la tierra (Plantae->Viridiplantae->Embryophyta). A diferencia de los
combustibles fósiles, la biomasa es un recurso renovable. Su formación tiene como base fundamental
a la reacción bioquímica conocida como fotosíntesis:
𝑘𝐽
6𝐶𝑂2 + 6𝐻2 𝑂 → 𝐶6 𝐻12 𝑂6 + 6𝑂2 Δ𝐺 = 2720
𝑚𝑜𝑙 𝑑𝑒 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎
En ella, los átomos de carbono en las moléculas de dióxido de carbono son reducidos, formando ahora
parte de moléculas de glucosa (𝐶6 𝐻12 𝑂6, ¿cuáles son los números de oxidación del carbono en ambas
moléculas?). La energía para que esta reacción no espontánea (Δ𝐺 > 0) y que requiere electrones
proviene del sol. Siendo el sol una fuente inagotable de energía, la biomasa es una fuente renovable,
al menos en principio como veremos más adelante.

La glucosa generada durante la fotosíntesis es utilizada por las plantas para almacenar energía, en
forma de almidón como en papas y choclos, o en forma de polímeros estructurales. Estos últimos
forman parte de la estructura de sostén de las células vegetales, siendo los tres más importantes la
celulosa, hemicelulosa y lignina. Las células vegetales están altamente estructuradas, pudiendo
encontrarse en su pared celular macrofibrillas, las que a su vez están constituidas de microfibrillas
(Figura 42, A). Estas últimas están formadas por celulosa, la que actúa como un polímero rígido y
cristalino que entrega soporte estructural a las microfibrillas y en última instancia a la planta. Cada
microfibrilla está entrecruzada por hemicelulosa, la que entonces contribuye a rigidizar la pared celular
manteniendo unidas las microfibrillas de celulosa (Figura 42, B). Finalmente, la lignina actúa como un
“pegamento” al unirse mediante enlaces covalentes a la hemicelulosa. Además, a diferencia de la
celulosa y hemicelulosa es de naturaleza hidrofóbica y es resistente a ataques por la mayoría de los
microrganismos.

83
 Figura 42. Estructura de los vegetales (A,
tomado de). Estructura de la pared celular a
nivel de nanómetros (tomado de

A nivel molecular, la celulosa corresponde a un polímero lineal de moléculas de glucosa unidas

mediante enlaces covalentes. De manera similar, la hemicelulosa está constituida por unidades de
xilosa, arabinosa, manosa y glucosa (principalmente) unidas por enlaces covalentes, aunque su
composición es específica para cada especie y el polímero es ramificado. La lignina por su parte, está
compuesta no de azúcares como en los casos anteriores, sino de compuestos fenólicos, esto es,
formados por un anillo de átomos de carbono (un anillo aromático) y sustituidos con un grupo funcional
(en este caso un grupo alcohol, -OH). La celulosa y hemicelulosa representan entre el 40-50% y 20-
40% de la biomasa, siendo el resto principalmente lignina. Luego, la biomasa está compuesta
principalmente de azúcares, aunque en una forma en la que no son directamente aprovechables como
sustrato para la producción industrial de compuestos obtenibles por fermentación (véase el Tema 3.4).

5.3 Fuentes y disponibilidad de biomasa

A nivel industrial las fuentes más importantes de material lignocelulósico corresponden a los
subproductos de los cultivos agrícolas y a los subproductos y cultivos dedicados de biomasa forestal.
A nivel mundial, los residuos agrícolas corresponden principalmente a los tallos que quedan en el
campo luego de la cosecha del trigo y el maíz, y la caña de azúcar agotada luego de la extracción del
azúcar. Sólo en USA, se estima que hubiese sido posible recolectar 85 millones de toneladas de
rastrojos de maíz en 20122. En cuanto a la caña de azúcar, se estima que anualmente se producen
150 millones de toneladas, de las cuales aproximadamente la mitad se utilizan para generar energía
(vapor y electricidad) en las destilerías de etanol.

Chile, siendo un país con escasas tierras arables, tiene una disponibilidad reducida de residuos
agrícolas igual a 0,7 millones de toneladas de rastrojos de trigo y 0,2 millones de toneladas de rastrojos
de maíz por año. Sin embargo, el país cuenta con un importante número de hectáreas de tierras con
aptitud forestal, reflejo de lo anterior son los 2,5 millones de hectáreas plantadas con pino (60%) y
eucaliptus (33%). La mayoría de la biomasa forestal es utilizada actualmente para la producción de

2
https://www1.eere.energy.gov/bioenergy/pdfs/btu_crop_residues.pdf

84
pulpa de papel, tableros aserrados y chips de madera. En particular, estos últimos se exportaron a
razón de 10600 toneladas por día durante el 2014 (INFOR, 2014), creando poco encadenamiento
productivo local.

5.4 Conversión de biomasa a azucares

Mientras las plantas evolucionaban para vivir en el ambiente terrestre, recurriendo a polímeros como la
celulosa, hemicelulosa y lignina para entregar resistencia estructural, rigidez y resistencia a los ataques
del medio ambiente y de los microorganismos, estos últimos vivían su propia carrera evolutiva, en la
forma de nuevas enzimas, para lograr utilizar estos abundantes polímeros como fuente de carbono.
Estas enzimas no fueron descubiertas por el hombre hasta finales de la segunda guerra mundial.
Gracias a los reportes de tropas norteamericanas que describían la desintegración de equipo militar
que contenía celulosa (por ejemplo, algodón) en la selva tropical de Nueva Guinea. Más tarde, este
hecho sería atribuido por E.T. Reese al hongo Trichoderma reesei, el que secreta la enzima. Por
supuesto, esta no podía ser la única fuente de enzimas que degradan celulosa, ¿sino de que otra forma
vivirían las termitas, las vacas y todos los insectos y animales que se alimentan de lignocelulosa?

La acción de las enzimas que rompen los enlaces covalentes en la celulosa (o enzimas celulolíticas)
puede representarse mediante la siguiente reacción:

(𝐶6 𝐻10 𝑂5 )𝑛 + 𝐻2 𝑂 → 𝐶6 𝐻12 𝑂6 + (𝐶6 𝐻10 𝑂5 )𝑛−1

Donde (𝐶6 𝐻10 𝑂5 )𝑛 representa una cadena de n glucosas conectadas mediante enlaces glucosídicos
(enlace covalente). En la reacción de hidrólisis catalizada por la enzima celulolítica, el enlace
glucosídicos se rompe mediante la introducción de una molécula de agua para producir glucosa (Figura
43).

Figura 43: Rompimiento de un enlace glucosídicos (hidrólisis)

Esta reacción no ocurre normalmente en la naturaleza sin ser catalizada por una enzima, dado que la
celulosa es un polímero altamente estable. Dado que la celulosa se encuentra siempre asociada a
hemicelulosa y lignina, los microorganismos que degradan celulosa también producen enzimas
celulolíticas, y en algunos casos enzimas capaces de degradar (lentamente) la lignina, como en los
hongos de pudrición blanca de la madera. Se conocen dos modos de mecanismos celulolíticos. El
primero, característico de T. reesei, consiste en la liberación al medio de un conjunto de celulasas y
85
hemicelulasas. Las enzimas de T. reesei incorporan un módulo de unión a carbohidratos, el que les
permite unirse a las microfibrillas. Este módulo permite que la enzima, que de otra forma se encontraría
en solución y solo hidrolizaría celulosa cuando se encuentre con una microfibra, se posicione sobre la
microfibrilla, aumentando entonces la probabilidad de degradar el polímero. Otra estrategia se conoce
como celulosomas, los que corresponden a complejos multi-enzimáticos formados por celulasas,
hemicelulasas y proteínas que permiten unir el celulosoma al sustrato insoluble. Los celulosomas
comúnmente están asociados a la superficie de la célula, aunque también pueden actuar en solución,
siempre como un complejo multi-enzimático. Los modos de acción de ciertos microorganismos, como
Fibrobacter succinogenes, aún son desconocidos, aunque se sabe que sólo crece adherido a celulosa,
no genera celulosomas.

Organismo Tipo Modo de acción Ambiente

Trichoderma reesei Hongo Celulasas y hemicelulasas Selvas
filamentoso libres tropicales
Fibrobacter succinogenes Bacteria ¿? Rumen
anaerobia
Cytophaga hutchinsonii Bacteria ¿? Suelo
aerobia
Clostridium cellulolyticum Bacteria Celulosoma Suelo
anaerobia
Ruminococcus flavefaciens Bacteria Celulosoma Rumen
anaerobia
La acción de estas enzimas sólo es posible cuando pueden tener acceso a las microfibrillas. Sin
embargo, las plantas evolucionaron ocultando estas en la pared celular y en la macroestructura de la
planta. Por ende, los microorganismos celulolíticos dependen de la acción del ambiente o de sus
huéspedes para aumentar la accesibilidad de las fibras. Por ejemplo, en los rumiantes la acción
mecánica de los dientes del animal permite separar las fibras dividiendo la biomasa en pequeñas
partículas. Luego estas son atacadas por los cerca de 1010 bacterias por ml presentes en el rumen. Sin
embargo, para un uso industrial de la biomasa se requieren métodos rápidos y económicos de aumentar
la accesibilidad de las enzimas a la celulosa, esta operación se conoce como pretratamiento.

5.5 Producción industrial de azúcares desde la biomasa

El proceso de producción industrial de azúcares desde biomasa comienza con la recepción de esta en
forma de fardos (rastrojos de maíz o trigo) o troncos. El tamaño de la biomasa se reduce por medios
mecánicos para obtener chips de madera (con 3 a 6 mm de espesor) o trozos de similar tamaño de
residuos agrícolas. Estos son alimentados a un recipiente presurizado (reactor de pretramiento) junto
con agua (a razones típicas de 3-5 kg de agua por kg de material seco) y un ácido fuerte como
catalizador (típicamente sulfúrico, en el orden de 20 g por kg de material seco). La mezcla es calentada
con vapor a temperaturas de entre 150°C a 200°C y mantenida en esta condición por tiempos de 5 a
30 minutos (dependiendo del material). Este proceso destruye parte de los enlaces que unen la
hemicelulosa con la lignina y la celulosa. Además, parte de la hemicelulosa es hidrolizada a sus
azúcares constituyentes o a cadenas de azúcares con pocas unidades (oligómeros), los que son
recuperados en la fase líquida. Los sólidos que abandonan el reactor de pretratamiento corresponden
a fibras con bajo contenido de hemicelulosa, por ende, las fibras de celulosa están más expuestas para
el ataque enzimático al que serán sometidas en la siguiente etapa, la sacarificación.

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El material pretratado es conducido a los estanques de sacarificación (o hidrólisis enzimática) donde
son mezclados con agua para diluirlos hasta alcanzar entre 15 a 20% de sólidos totales y enzimas
celulolíticas y hemicelulolíticas. A nivel industrial los estanques de sacarificación tienen volúmenes
cercanos a 1000 m3 y la temperatura de sacarificación es cercana a 50°C. Luego de 48 a 72 horas,
entre el 80 a 90% de la celulosa se habrá hidrolizado a glucosa, entonces los sólidos restantes
(principalmente partículas de lignina) son separados utilizando un filtro prensa o un filtro a vacío,
obteniéndose como producto una corriente clarificada con una concentración cercana a 100 g/L de
glucosa y otras azúcares (xilosa principalmente).

5.6 Producción de Etanol

En forma similar a la producción de etanol desde las azúcares liberadas desde la caña de azúcar o el
almidón, es posible producir etanol desde las azúcares obtenidas mediante el pretratamiento y
sacarificación de biomasa. Sin embargo, existen dificultades a nivel metabólico que impiden que los
organismos más utilizados para la producción de etanol (S. cerevisiae y Z. mobilis) sean los candidatos
más lógicos para fermentar dichas azúcares. Sin duda, la dificultad más importante para utilizad dichos
microorganismos es su incapacidad para fermentar xilosa y otras azúcares de cinco carbonos (como
arabinosa). En los subproductos agrícolas y en algunas maderas (por ejemplo, eucalipto), la xilosa
representa cerca de un tercio del total de las azúcares presentes en la materia prima. Luego, no
convertirla en producto significa una pérdida importante de materia prima. Aunque existen
microorganismos que son capaces de utilizar xilosa como fuente de carbono para producir etanol y
otros compuestos, generalmente tienen bajos rendimientos, no muestran efecto Crabtree (véase el
Tema 3.3) o requieren de condiciones de cultivo que resultan difíciles de lograr a una escala industrial.
Este es el caso de Pichia stipitis (ahora Scheffersomyces stipitis), una levadura capaz de fermentar
xilosa a etanol sólo bajo condiciones microaerobicas, las que son practicante imposible de mantener
en escala industrial. Por esto, la comunidad científica y tecnológica ha realizado importantes esfuerzos
por obtener cepas genéticamente modificadas de S. cerevisiae y Z. mobilis que sean capaces de
fermentar xilosa.

Tabla 6 Microorganismos capaces de producir etanol desde xilosa.

Levaduras Genero Enzimas

Kluyveromyces Xilosa reductasa
Pachysolen +
Pichia xilosa deshidrogenasa
Hongos Fusarium
Neurospora
Bacterias Bacillus Xilosa isomerasa
Clostridium
Las modificaciones genéticas involucran la incorporación de los genes que codifican para la enzima
xilosa isomerasa (típicamente encontrada en bacterias que son capaces de crecer en xilosa) y xilosa
reductasa + xilosa deshidrogenasa (obtenida de levaduras). Los genes que codifican para estas
enzimas han sido incorporados principalmente en S. cerevisiae (sistema xilosa reductasa + xilosa
deshidrogenasa) y Z. mobilis (incorporación de xilosa isomerasa).

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 Una bacteria Z. mobilis exitosamente modificada fue
Xilosa
presentada en 1995 por Zhang y colegas (1995). Dos
Xilosa NAD(P)H cepas fueron construidas, la cepa CP4(pZB168)
incorpora solamente los genes xylA y xylB, que
+
Xilosa NAD(P) codifican para las enzimas xilosa isomerasa y
Xilosa
isomerasa reductasa
xilulokinasa respectivamente, mientras que una
NADH NAD+
segunda cepa, CP4(pZB5) incorpora además genes de
Xilulosa Xilitol
Xilitol la ruta de las pentosas fosfato. Los resultados
deshidrogenasa (presentados en la Figura 46) muestran que la cepa
ATP
Xilulokinasa CP4(pZB168) es incapaz de producir etanol y crecer en
ADP xilosa. Por otro lado, la cepa CP4(pZB5) es capaz de
crecer y producir etanol en xilosa pura o en mezclas de
Xilulosa-5- fosfato xilosa y glucosa. Esto muestra la importancia de un
adecuado nivel de expresión de las enzimas de la ruta
de las pentosas fosfato en el catabolismo de la xilosa.
Ruta de las Resulta interesante analizar el consumo de xilosa y
pentosas fosfato glucosa en la Figura 45. C (panel a la derecha), donde
se aprecia que la glucosa es consumida a una mayor
velocidad que la xilosa. Sin embargo, ambas son
simultáneamente consumidas. Esto indica que la cepa
D-Fructosa-6P Gliceraldehído-3P no sufre de un fenómeno de represión catabólica (no se
observa un crecimiento diauxico). La explicación
Figura 44: Incorporación de xilosa a la ruta de propuesta para las diferentes velocidades de
las pentosas fosfato en bacterias y levaduras. incorporación de glucosa y xilosa consiste en la
inhibición del sistema de transporte facilitado de glucosa
(el que también mediaría el transporte de glucosa) a altas concentraciones de glucosa (Zhang & et al.,
1995)

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Figura 46: Fermentación de glucosa y xilosa por dos cepas de Z. mobilis. En la cepa CP4(pZB168) sólo
se insertaron los genes que codifican para xilosa isomerasa (gen xylA) y xilulokinasa (gen xylB). En la
Cepa CP4(pZB5), además de los genes xylA y xylB se insertaron genes que codifican para enzimas de
la ruta de las pentosas fosfato. Xilosa(□), glucosa (○), etanol (▪) y absorbancia de las células (●). Tomado de
(Zhang & et al., 1995)

5.7 Nuevos biocombustibles y químicos

Disponer de una fuente de azúcares a un costo menor que las fuentes convencionales (almidón de
maíz o sacarosa desde caña de azúcar) y con un menor impacto ambiental (respecto a este punto,
consulte la lectura de esta sesión), permitiría la producción de biocombustibles con mejores
propiedades que el etanol y compuestos químicos que reemplacen a aquellos producidos desde el
petróleo. Por ejemplo, el butanol posee una densidad energética similar a la gasolina, es poco
higroscópico y tiene una muy baja presión de vapor en mezcla lo que lo hace un aditivo ideal para ser
mezclado con gasolinas o para la producción de lubricantes y de combustibles para la aviación
comercial y militar (véase el Tema 3.3).

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La siguiente lista presenta biocombustibles y químicos con alto potencial de ser producidos a partir de
biomasa.

Compuesto Usos Producción

1,3-Butadieno Producción de caucho estireno-butadieno Conversión química de butanol
para la fabricación de neumáticos (véase Tema 3.3) o 1,4
butanodiol (producido usando
E. coli modificada)
Etil-lactato Solvente industrial sin efectos sobre la capa Esterificación de ácido láctico y
de ozono. etanol.
Ácido láctico Usos en la industria de alimentos, Véase el Tema 3.3
farmacéuticos, cuidado personal y en la
producción de ácido poli-láctico, un plástico
biodegradable
Ácido succínico
Butanol Solvente industrial y biocombustible capaz Producción desde glucosa,
de mezclarse con gasolina o diésel. xilosa y otra azucares utilizando
Clostridium acetobutylicum o C.
beijerinckii, entre otros.
5.8 Referencias
IEA. (2012). World Energy Outlook 2012. International Energy Agency. Paris. Paris.

Murphy, D. J., & Hall, C. A. S. (2010). Year in review--EROI or energy return on (energy) invested.
Annals of the New York Academy of Sciences, 1185, 102–18. http://doi.org/10.1111/j.1749-
6632.2009.05282.x

Zhang, M., & et al. (1995). Metabolic engineering of a pentose metabolism pathway in ethanologenic
Zymomonas mobilis. Science 267:240-243, (November), 1–4.

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