Amilasa

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE

INGENIERÍA CAMPUS GUANAJUATO
PRESENTA:
Rosario Jiménez Jurado
Estudiante de la carrera en Técnico en Alimentos
Zulema Karely López Montoya
Estudiante en la licenciatura en Química Farmacéutica
Biológica
Diego Alejandro Soberano Rodríguez
Estudiante en la licenciatura en Bioquímica
PROYECTO:
Producción de alfa-amilasa usando Aspergillus niger,

Rhizopus y Penicillium mediante fermentación en
estado sólido (FES).
ASESOR:
DR. ANASTASIO CORTÉS MENDOZA
VERANO DE INVESTIGACIÓN
PROGRAMA DELFÍN
Dr. ANASTASIO CORTES MENDOZA
❖ ÍDICE
Portada
Índice 1
Resumen 2
Introducción 3
Justificación 9
Objetivo 9
Metodología
10
Resultados
17
Discusión
32
Conclusiones
34
Perspectiva
35
Agradecimientos
36
Bibliografía
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Anexo
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❖ RESUMEN
La Alfa- amilasa es muy importante dentro del metabolismo ya que tiene la
capacidad de hidrolizar los enlaces glicosídicos alfa 1,4 del almidón y convertirlo
en azúcares simples como la glucosa. El objetivo del trabajo es obtener alfa
amilasa por medio de una fermentación en estado sólido usando los siguientes
hongos Aspergillus Niger, Rhizopus y Penicillium como microorganismo de
trabajo, para realizar ensayos enzimáticos procurando usar reactivos más
amigables con el medio ambiente
Para la obtención de la enzima se empleó la fermentación en estado sólido

usando como sustrato papa (solanum tuberosum) el cual es un tubérculo
comestible que contienen una variedad de vitaminas y es muy rica en hidratos de
carbono, en este se inocularon los tres hongos y se incubaron a 38°C por 120 h.
se realizó la purificación con (NH4)2SO4 al 80¨% y también con NaCl al 80%.
Los resultados finales fueron que Aspergillus Níger obtuvo la máxima producción
de enzima y que a pesar de no usar sulfato de amonio también obtenemos
resultados positivos con NaCl, aunque son menores. El análisis cualitativo de los
tres hongos fue positivo porque se comprobó que en todos había una actividad
amilolítica, en este análisis se ocupó maicena y pan ya que son ricos en almidón.
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❖ INTRODUCCIÓN
Las proteínas son cadenas de aminoácidos que se pliegan adquiriendo una
estructura tridimensional que les permite llevar a cabo miles de funciones, están
codificadas en el material genético de cada organismo, donde se especifica su
secuencia de aminoácidos, y luego son sintetizadas por los ribosomas (Guillén, M.
V. L. 2009). Desempeñan funciones que se relacionan a acciones catalíticas
(enzimas), de transporte (albúmina), estructurales (colágeno), reguladores
(hormonas), defensivas (anticuerpos) y como tal son una fuente de energía y de
calor (Torres.V,2014)
Las alfa-amilasa (α-1,4-glucano hidrolasa) son enzimas que catalizan al azar la

hidrólisis de enlaces glicosídicos α-1,4 de polisacáridos como el almidón y el
glucógeno, para producir maltosa y oligosacáridos de diferentes tamaños
(Espinel,2009). Su nombre deriva de Ia configuración α-D de los azúcares que son
el producto final sobre el almidón. Las propiedades cinéticas y el patrón de
hidrólisis de la enzima dependen del organismo que la haya sintetizado, sin
embargo, todas las α-amilasas son del tipo endo amilasas y por ello degradan
rápidamente el almidón.
Las endoamilasas son enzimas que catalizan la hidrólisis de forma aleatoria del
enlace α,1-4 glucosídico presente en la parte interna (endo) de la cadena de
amilosa y amilopectina (Gupta y col. 2003). Mientras que las exoamilasas actúan
en residuos externos de glucosa de la amilosa y amilopectina y solo producen
glucosa (glucoamilasa o α-glucosidasa), o maltosa y dextrina de límite β (β-
amilasa) (van der Maarel y col. 2002; James y Lee 1997)
Estas enzimas son de gran importancia en la industria alimenticia, textil, papelera

y farmacológica, y aunque las fuentes productoras de α-amilasas incluyen plantas,
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animales y microorganismos, son las enzimas microbianas las que encuentran

mayor demanda en aplicaciones industriales (Gupta,2003).
Las enzimas son conocidas por ser biocatalizadores orgánicos que inician,
controlan y reaccionan ante cualquier proceso biológico para la vida. No obstante,
las enzimas pueden obtenerse mediante el uso de fermentación e inclusión de
microorganismos en un medio anaeróbico o aeróbico, donde los microorganismos
oxidan a los hidratos de carbono, obteniendo energía en forma de ATP para su
creación, de donde se libera, agua, amoniaco, dióxido de carbono, nitrógeno entre
otros compuestos.
Las diferencias en comportamientos de solubilidad han sido usadas por más de 50

años para la separación de proteínas (Weatherley, 1994). Actualmente, la
precipitación es sumamente utilizada como un paso de separación durante las
primeras etapas de un proceso de purificación, y normalmente es seguida por otro
tipo de separaciones, como la cromatografía. La precipitación puede ser utilizada
también como método de concentración de proteínas como paso previo a un
proceso de purificación (Harris y Angal, 1995). Teóricamente, la precipitación debe
producir un soluto concentrado y puro, por lo que es una operación que se utiliza
al inicio de un proceso de bioseparación.
La técnica del Salting out permite que las interacciones proteína-proteína se

vuelvan más fuertes que las interacciones proteína-disolvente y la proteína
precipita. La concentración de sales requerida para alcanzar el efecto de salting
out varía de acuerdo con las características de la proteína (Harris y Angal, 1995).
La diálisis es una forma de filtración molecular. Es un proceso que separa

moléculas de acuerdo con su tamaño, mediante el empleo de membranas
semipermeables que contienen poros de dimensiones inferiores a las
macromoleculares. Estos poros permiten que moléculas pequeñas, tales como las
de los disolventes, sales y metabolitos pequeños, se difundan a través de la
membrana y no permita el tránsito de moléculas mayores. (Amoros.L,2013)
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En el siguiente reporte nos enfocaremos a la producción de amilasas usando

Aspergillus níger mediante fermentación en estado sólido (FES). Los procesos
conocidos como fermentación en estado sólido (FES) o bien en sustrato sólido
comprenden aquellas fermentaciones en las cuales el crecimiento del
microorganismo ocurre sobre un material sólido y en ausencia de agua libre de tal
modo que dicho material actúa simultáneamente como fuente de nutrientes y
soporte del crecimiento del microorganismo. La FES fue probablemente el método
más antiguo que utilizó el hombre para obtener beneficios de los microorganismos
(Hesseltine,1987)
Existen innumerables procesos tanto de producción y/o de preservación de

alimentos fermentados que se remontan a cientos de años en la antigüedad y que
actualmente perduran.
Hay reportes de producción de esta enzima utilizando fermentación sólida

(Lonsane &Ramesh, 1990; Ramesh & Lonsane, 1988; Ramesh & Lonsane, 1987).
En una FES es más fácil que crezcan los microorganismos en la superficie de

materiales solidos con bajo contenido de humedad (Selvakumar & Pandey, 1999).
Según Nigam y Singh en 1994, es importante conocer, comprender y aplicar los
diferentes porcentajes de rendimientos obtenidos mediante la realización del
informe redactado.
De la papa (Solanum tuberosum) deriva un polisacárido: el almidón (Shinde

RN,2014), sustrato que las alfa-amilasas degradan.
La papa es un tubérculo y es muy popular por todo el mundo, tiene una gran
cantidad de carbohidratos además de una cantidad moderada de hierro, pero el
gran contenido de vitamina C fomenta la absorción de este mineral. Además, este
tubérculo tiene vitaminas B1, B3 y B6, y otros minerales como potasio, fósforo y
magnesio, así como folato, ácido pantoténico y riboflavina. También contiene
antioxidantes alimentarios, los cuales pueden contribuir a prevenir enfermedades
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relacionadas con el envejecimiento, y tiene fibra, cuyo consumo es bueno para la

salud. (Información proporcionada por la Dirección de la Nutrición y Protección del
Consumidor de la FAO, 2008)
EI almidón está compuesto básicamente por dos tipos de polímeros de glucosa, la

amilosa y la amilopectina. La proporción de cada una de estas especies varía
según el origen del almidón. La amilosa es el producto de la condensación de D-
glucopiranosas por medio de enlaces glucosídicos (1,4) que conforman largas
cadenas lineales de hasta 5000 residuos (Hoover, 2001) con pesos moleculares
hasta de 1 millón, es decir, que la amilosa es una α-D-(1,4)-glucano .Por su parte
la amilopectina contiene ramificaciones unidas por enlaces α-D-(1,6), localizadas
cada 15 - 25 unidades lineales de glucosa y su peso molecular es muy alto ya que
las fracciones pueden alcanzar hasta 107 daltons (Hoover, 2001).
En la fermentación en estado sólido se utilizaron los hongos Aspergillus niger,

Rhizopus, Penicillium.
CARACTERÍSTICAS DE LOS HONGOS
● Aspergillus niger
Los mohos del género Aspergillus causan el deterioro de muchos productos

alimenticios. Los productos metabólicos de la invasión fúngica suelen ser muy
tóxicos, tanto para el hombre como para otros animales. También producen la
inhibición de la germinación junto con cambios de color, calentamiento,
amohosado, apelmazado y finalmente podredumbre de las semillas. Algunas
especies, por ejemplo A. niger o A. oryzae, son de interés industrial o se emplean
en la fermentación de alimentos en ciertas regiones (Kozakiewicz 1989).
El color es la principal característica macroscópica para la identificación de los

grupos de aspergilos. Poseen distintos tonos de verde, pardo, amarillo, blanco,
gris y negro, y a simple vista las más grandes suelen parecer diminutos alfileres
sobre el sustrato (Kozakiewicz 1989).
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Fig 1.Conidióforos de
Penicillium [ 2] Fig 2. Características morfológicas
De Aspergillus [ 2]
En los aspergilos, los conidios constituyen cadenas que se originan en la célula

conidiógena o fiálide. En algunos aspergilos hay células adyacentes a las fiálides
denominadas métulas o células de soporte. Los Aspergillus poseen una o dos
series de células sobre la vesícula, o bien presentan simultáneamente cabezas de
ambos tipos (Kozakiewicz 1989).
Penicillium
Los penicilios son mohos comunes que desarrollan sobre los más diversos
sustratos: granos, paja, cueros, frutas, etc. La importancia de estos mohos en la
alimentación humana y animal se debe a que, además causar deterioro, producen
toxinas (Pitt & Leistner 1991).
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Los filamentos o hifas de estos hongos alcanzan un diámetro de entre dos a tres
micrómetros y tienen septos con un poro central que no es visible al microscopio
óptico. Las paredes del estípite, las ramas o las métulas pueden ser lisas, rugosas
o equinuladas, mientras que la pared de las fiálides es siempre lisa.
Las fiálides pueden tener forma de ánfora o bien ser casi cilíndricas con la porción
apical en forma de cono. El tamaño máximo de las fiálides es de 15 µm y la parte
terminal no supera los 3 µm de largo. Los conidios son esféricos o elipsoidales,
unicelulares, hialinos que en masa se ven de color verde, verde azulado, verde
aceituna o gris. La pared de los conidios es lisa o rugosa según las especies
(Webster 1986).
Rhizopus
Rhizopus es un género de cigomicetos, hongos filamentosos que por lo general

viven en el suelo y se alimentan de materia vegetal o animal en
descomposición. Existen Rhizopus parientes de este hongo que afectan a plantas
y frutos causando una pudrición blanda y acuosa.
Los organismos como Rhizopus que producen enfermedades en las plantas se

denominan fitopatógenos. Se encuentran en el suelo, el compost y,
principalmente, en vegetales en descomposición. Pueden reproducirse de forma
asexual y sexual. La reproducción asexual es por esporas, que son unidades
reproductoras formadas en unas estructuras llamadas esporangios. Las esporas
son resistentes a situaciones desfavorables, pero una vez dispersas en el aire y en
contacto con un sustrato adecuado, germinan y producen filamentos
microscópicos llamados hifas. La reproducción sexual se da por la unión de hifas
de diferentes cepas que forman esporas y así se repite el ciclo sexual.
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Los esporangios son esféricos, negros y están contenidos en una estructura

llamada columela. Rhizopus sp. forma colonias de crecimiento rápido que cubren
Prácticamente toda la superficie del sustrato es afectada en aproximadamente tres

días, a una temperatura promedio de 25 °C.
❖ JUSTIFICACIÒN
La amilasa es una enzima indispensable para el metabolismo ya que cataliza la

degradación del almidón y este a su vez tiene la capacidad de formar unidades de
glucosa.
La presente investigación pretende la producción de amilasa usando a los hongos

Aspergillus niger, Penicillium, Rhizopus mediante la fermentación es estado sólido
(FES) utilizando como sustrato la papa usando reactivos que permitan realizar
prácticas de laboratorio que sean amigables con el medio ambiente.
❖ OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
✔ Obtener alfa amilasa por medio de una fermentación es estado sólido (FES)
usando Aspergillus niger como microorganismo de trabajo, para realizar
ensayos enzimáticos procurando usar reactivos más amigables con el
medio ambiente.
OBJETIVOS ESPECÌFICOS
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✔ Cuantificar la producción de la enzima amilasa por el método de Bradford

para determinar la eficiencia de la fermentación.
✔ Comparar la eficiencia de la purificación de las enzimas obtenidas utilizando
sulfato de amonio como referencia y NaCl como tratamiento seleccionar el
mejor proceso.
✔ Evaluar la actividad de la enzima por medio de ensayos enzimáticos para
demostrar la producción de la enzima.
MATERIALES Y REACTIVOS
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❖ METODOLOGÌA
DIAGRAMA GENERAL
Preparación de Preparación de
medios de la fermentación Fermentación
cultivo en estado sólido
Purificación de Recuperación de
Cuantificación
la proteína la enzima
Electroforesis
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Preparación de los medios de cultivo para la inoculación del hongo (Rhizopus,

Aspergillus y Penicillium) se procedió a utilizar PDA casero según lo investigado.
Cortar en
trozos
pequeños la
papa
Colocar un
matraz con agua
Agregar las Filtrar la papa
destilada a
papas hasta su y obtener el
calentar
ebullición líquido
Pesar 4 g de
azúcar y 4 g de
agar y
homogenizar
Esterilizar en
autoclave por 15
minutos, a 15
libras y 121°
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Preparación de los buffer

Verificación de cultivos para los tres hongos Preparación de la zona
ubicarlos en los matraces estèril
con los sustratos
Dejar reposando en Filtrar cada uno de los Vertir el buffer

tubos falcòn durante 24 matraces para obtener el respectivo a cada matraz
ha4C concentrado y agitar
PURIFICACIÓN
Agitar (250 rpm, 5-10 Separar fases Colocar permeado en

min) filtrando tubos falcón
Decantar
Precipitar con sobrenadante en
Centrifugar 10min
(NH4)2SO4 matraz erlenmeyer
(250 ml)
Resuspender pastilla
Centrifugar 10 min Realizar Bradford
en 10 ml de buffer.
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DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS
Para realizar la determinación de proteínas se utilizó el método de Bradford
cubrir con aluminio pipetear en cada

Rotular los tubos
todos los tubos para tabla la cantidad
eppendorf
proteger de la luz correspondiente
leer la absorvancia Mezclar y dejar

de la muestra reposar
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ELECTROFORESIS
Colocar el peine y Colocar la muestra

Preparar los geles, en los pozos
Armar la camara de sacarlo una vez que
tapón, separador y Preparar muestra
correspondiente
electroforesis el gel haya
concentrador
polimerizado
Aplicar un voltaje Aplicar el buffer en

Retirar el gel
de 100v durante 1h la camara
Teñir por 20 min

Lavar con agua desteñir durante 20
con soluciòn
destilada min
teñidora
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RESULTADOS
Se inocularon medios de cultivo a partir de papa dextrosa (PDA) para poder
observar su fisiología en el microscopio a 40X y en la fermentación en
estado sólido (FES) utilizando papa (Solanum tuberosum), como sustrato.
Además de la utilización de hongos ( Aspergillus niger, Penicillium
y Rhizopus). Se logró comprobar que Aspergillus niger obtuvo una
fermentación más rápida y efectiva en el consumo del sustrato. El almidón
si puede ser un gran generador de enzimas respectivamente dependiendo
el hongo aplicado.
Los resultados obtenidos fueron los esperados ya que cualitativamente se
logró observar la actividad amilolítica.
Para este análisis se utilizaron papas de un supermercado ubicado en la
ciudad de León, Guanajuato y las cepas fueron proporcionadas por Dr.
Juan francisco Sánchez López y los equipos- reactivos proporcionados por
el laboratorio de fisiología y biotecnología de la UPIIG.
Fig. 1 reproducción del hongo Aspergillus niger en PDA, con un lapso de 4

días a condiciones de 38 grados centígrados.
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Fig. 2 reproducción del hongo Rhizopus en PDA, con un lapso de 4 días a

condiciones de 38 grados centígrados.
Fig. 3 reproducción del hongo Penicillium en PDA, con un lapso de 4 días a

condiciones de 38 grados centígrados.
Fig. 4 Fermentación en estado sólido de hongo Aspergillus niger en matraces

de 500ml, con un lapso de 4 días a condiciones de 38 grados centígrados.
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Fig. 5 Fermentación en estado sólido de hongo Rhizopus en matraces de

500ml, con un lapso de 4 días a condiciones de 38 grados.
Fig. 6 Fermentación en estado sólido de hongo Penicillium en matraces de

Fig. 7 fermentación en estado sólido de hongo Aspergillus niger en matraces

de 500ml, con un lapso de 5 días a condiciones de 38 grados centígrados.
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Fig. 8 Fermentación en estado sólido de hongo Rhizopus en matraces de

Fig. 9 fermentación en estado sólido de hongo Penicillium en matraces de

Tabla 1. Pesos iniciales y finales de la FES

Nombre Peso de C/sustrato Hongo C/buffer Extracto
del hongo los fermentado enzimático
matraces
vacíos
Asperg 218.1g 355.40g 298.8g 398.8g 147.4ml
illus
niger
Penicill 198.7g 326.19g 327.9g 427.9g 170.7ml
ium
Rhizop 230g 374.54g 372.02g 472.02g 145.6ml
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Centrifugación de los extractos enzimáticos
Fig. 10 se centrifugo a una velocidad de 8000 rpm,4 grados centígrados y un

tiempo de 10 minutos. Se cumplió el objetivo de separar el sobrenadante y la
pastilla. Cabe destacar que las concentraciones de proteínas en cada uno son
diferentes.
Micro cultivo
En el siguiente procedimiento, se dará a conocer la visión fisiológica de micelio en
agar en el microscopio.
Fig. 11 Visión fisiológica y morfológica del

Penicillium al microscopio, se observó
que tuvo un crecimiento muy lento en él agar y no se logró una reproducción en el
tiempo estimado. Cabe destacar que el Dr. Juan Francisco Sánchez López, nos
mencionó sobre este caso.
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Fig. 12 Visión fisiológica y morfológica del

Aspergillus niger en el microscopio, se logró obtener el crecimiento adecuado
al tiempo estimado en el agar.
Fig. 13 Visión fisiológica y morfológica del Rhizopus en el microscopio, se

obtuvieron los resultados esperados del crecimiento del hongo en el agar.
Obtención de amilasas por el método cualitativo.

(Pan bimbo blanco).
Fig. 14
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Tabla. 2 indicadores del método cualitativo con pan bimbo blanco

Control negativo: sirve para
- identificar si en realidad mi amilasa
se encuentra activa.
Control positivo: se utilizó para la
+ identificación de amilasa salival.
ER Pan blanco bimbo mezclado con
extractó enzimático de Rhizopus.
EA Pan blanco bimbo mezclado con
extractó enzimático de
Aspergillus niger.
EP Pan blanco bimbo mezclado con
extractó enzimático de
Penicillium.
NOTA: se deja reposar durante 20 minutos, para después agregarle el yodo y así
identificar que los extractos enzimáticos, si tienen actividad.
Electroforesis.
En la siguiente imagen se muestran los carriles en orden y las pruebas de extracto
de cada enzima.
Fig. 15
Resultados de la electroforesis.
Se muestran los resultados obtenidos de la electroforesis. No se mostraron
completos ya que el tiempo de reacción y el voltaje no fue suficiente.
En el cuadro amarillo se ven las capas obtenidas a partir de la enzima extraída del
sustrato, con el respectivo hongo utilizado, para el carril numero uno se utilizo una
muestra de amilasa salival ya que fue el enlace positivo para demostrar nuestras
pruebas.
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Fig. 16
Cromatografía en capa fina.
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Fig. 18
Se rayo un cm con lapis y se colocaron puntos de muestras separadas por
centímetro para obtener mejor visión de resultados.
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Curva de calibración para ovoalbúmina
Al hacer cuantificación con el reactivo de Bradford fueron los siguientes :
Muestras(sobrenadante) absorbancia
Blanco 0.000
SNP1 0.255
SNR1 0.313
SNA1 0.450
SNA2 -0.0050
Muestras(pastilla) absorbancia
PP1 0.448
PR1 0.712
PR2 0.160
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PA1 0.635
PA2 0.229
ECUACIÓN DE LA RECTA:
Y= 0.0019 x +
0.0813
Despejando (para sobrenadante):
X= (y – b)/ m
X= (0.255 – 0.0813)/ 0.0019 =91.42 x 2= 182.84 µg /ml
X= (0.313 – 0.0813)/0.0019 =121.94 x 2= 243.84 µg/ml
X= (0.450 - 0.0813)/0.0019 =194.05 x 2 = 388.10 µg/ml
Despejando para pastillas:
X= (0.448 – 0.0813)/0.0019 =193 x 2 =386 µg/ml
X= (0.160 – 0.0813)/0.0019 =41.42 x2=82.84 µg/ml
X= (0.229 – 0.0813)/0.0019= 113.68 x 2 = 227.36 µg /ml
ANÁLISIS CUALITATIVO UTILIZANDO EL INHIBIDOR ACARBOSA
82.84µg x 0.001µg= 0.082 mg

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227.36µg x 0.00 µg = 0.227 mg
❖ DISCUSIÒN
Existe la evidencia que la fermentación en solido se utilizó desde tiempo muy
antiguos y de manera natural desde el comienzo de la vida. Se emplearon de
manera artesanal para la elaboración de alimentos en el Sudeste Asiático, África y
América Central como lo dice (Vinegra-Gonzalez, 1997) por eso es que se empleó
la fermentación en estado sólido porque este modelo vincula dichas variables con
el desarrollo de biomasa por lo tanto tiene Ia
potencialidad de ser un método sencillo para Ia estimación del crecimiento del

micelio y producción de amilasas en FES.
En las condiciones de temperatura y humedad a 5 días en la incubadora la

cantidad de proteína correspondiente a la a-amilasa es de un 25-30 % de las
proteínas totales presentes en el extracto de fermentación y la presencia de
actividades enzimáticas contaminantes resultó mínima tal como dice Mauricio
Terebiznik en 1998 por esta razón se escogieron las condiciones de fermentación
de 120 horas a 38ºC .
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Se utilizó como sustrato la papa pero también se pueden utilizar cascaras de

banana (Shinde RN, Dhangas MJ ,2014), coco, maní en el caso de Rhizopus tal
como dice Virginia Sánchez en 1999.Pero también se utiliza soya, arroz, trigo,
semillas de café como lo menciona Mathew John y col.2016.
Y como microorganismo se utilizó a Aspergillus niger porque en el trabajo de

selección de un hongo filamentoso altamente productor de amilasas para ser
usadas en detergentes biodegradables de Martín Vargas C.1, Beatriz Piro M.2,
Navarro, A. & Cristina Rubio M.1,2016 y además usándose la fermentación en
estado sólido por el autor Mauricio Terebiznik en 1998 en el trabajo de α- amilasa
de Aspergillus oryzae : estudios de producción por fermentación en sustrato
sólido, purificación y estabilización se demuestra el uso de este hongo para la
producción de amilasa ,y se seleccionó además el hongo Penicillium porque
Esperanza Espinel y Elizabeth Lopez, 2009 en su proyecto de purificación y
caracterización de α-amilasa de Penicillium commune producida mediante
fermentación en fase sólida. Y Finalmente el hongo Rhizopus ssp por sus
características filamentosas que posee gran facilidad de crecer en ambientes con
humedad y nutrientes como lo expresa Virginia Sánchez en 1999.
La extracción de la enzima se realizó siguiendo los parámetros de temperatura a

4º C,8000 x g (Rinku. Sundar y col.2012) expresado en su trabajo de producción
de amilasa por Aspergillus niger en fermentación usando papas. Donde el
sobrenadante fue usado como extracto en crudo usado posteriormente para la
precipitación.
Las diferencias en comportamientos de solubilidad han sido usadas por más de

50 años para la separación de proteínas (Weatherley, 1994). Actualmente, la
precipitación es usualmente utilizada como un paso de separación durante las
primeras etapas de un proceso de purificación, y normalmente es seguida por otro
tipo de separaciones, como la cromatografía. La precipitación puede ser utilizada
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también como método de concentración de proteínas como paso previo a un

proceso de purificación (Harris y Angal, 1995).
Lo anterior se debe a que a pesar de que los procesos de precipitación pueden ser
aplicados de manera fácil y reproducible, pero además la precipitación de
proteínas es obtenida por la adición de sales, inducida por el cambio de pH o
potencial iónico (Harris y Angal, 1995) y tomando como referencia se procedió a
utilizar la precipitación en salting out demostrado anteriormente utilizando una
saturación del 80% porque el salting-out depende de la naturaleza hidrofóbica de
la superficie de la proteína.
Los grupos hidrofóbicos predominan en el interior de ésta, pero algunos se

localizan en diferentes regiones de la superficie; el agua es puesta en contacto
con la superficie, haciendo que estas regiones no queden expuestas; cuando la
sal es agregada, el agua solvata los iones de la sal, y mientras la concentración de
sal se incrementa, el agua es removida de los alrededores de la proteína,
eventualmente exponiendo las regiones hidrofóbicas. Dichas regiones en las
proteínas pueden interactuar mutuamente o con las de otras moléculas, resultando
en una aglomeración. De esta forma las proteínas con regiones hidrofóbicas más
abundantes formarán agregados y se precipitarán más rápidamente que aquellas
con pocas regiones resultando un fraccionamiento (Harris y Angal, 1995).
Para hacer la cuantificación de la proteína se realizó según el criterio de

Esperanza Espinel y Elizabeth López, 2009 utilizaron el método de Bradford,
empleando como curva de patrón la albúmina bovina mientras que aquí se hizo
con ovoalbúmina por accesibilidad. Donde se utilizaron 0.250 µl de muestra y
0.750 µl de reactivo de Bradford posteriormente leyendo las absorbancias en el
espectrofotómetro.
En el análisis cualitativo para determinar la presencia de enzima amilasa se

procedió a usar la metodología de Damaso, Gálvez Lizbeth y col.2000.Teniendo
como control positivo a la enzima amilasa salival y usando como muestras el
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extracto enzimático sobre almidón comercial(maicena) y para la revelación el uso

de yodo u agua oxigenada sobre cada una de las muestras a analizar.
❖ CONCLUSIÓN
Los hongos con los cuales se trabajó tuvieron gran capacidad de expansión y
consumo del sustrato. De acuerdo con el tiempo establecido en
fermentación se obtuvo que Aspergillus niger presentó el mejor desarrollo al
tener un mayor consumo del sustrato (papa), en un 16% menos de la masa
inicial, a velocidad de 0.47g/h. A diferencia del Penicillium que obtuvo un
consumo de 5.8% menor de la masa inicial, a una velocidad de 0.15g/h y el
Rhizopus un consumo del 10% menos de la masa inicial a una velocidad de
0.252g/h.
Así mismo, y en concordancia con lo anteriormente mencionado, Aspergillus níger
obtuvo la máxima producción de enzima.
Por otro lado, se comprobó que a pesar de no usar sulfato de amonio también es
posible obtener resultados positivos con NaCl, aunque son menores. El
análisis cualitativo de los tres hongos fue positivo porque se comprobó que
en todos había una actividad amilolítica, en este análisis se emplearon
maicena y pan como sustratos ya que estos son ricos en almidón.
❖ PERSPECTIVAS
Para la producción de amilasa usamos la FES, la cual se dejó incubar 5 días, sin
embargo, se recomienda dejar pasar como mínimo 7 días ya que la extracción de
la enzima de cada uno de los hongos sería más efectiva en términos de
concentración de proteínas.
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Para evaluar la actividad enzimática por cuestiones de tiempo sólo fue posible
realizar la prueba cualitativa por lo que se recomienda llevar a cabo la prueba
cuantitativa para determinar completamente los azúcares reductores y de esta
manera obtener resultados menos subjetivos y poder llegar a conclusiones más
contundentes.
Para mejorar los resultados se propone utilizar mayor cantidad de sustrato, lo cual
probablemente posibilitará la obtención de una alta cantidad de enzima y esto a su
vez permitirá la realización de todos los análisis necesarios y por ende lograr todos
los objetivos planteados.
❖ AGRADECIMIENTOS
Este proyecto ha sido posible gracias al apoyo del programa delfín por
concederme un recurso económico para lograr los objetivos esperados,
igualmente quiero agradecer al Instituto Politécnico Nacional y a la escuela UPIIG
por brindarnos un laboratorio en el cual poder trabajar.
Al Dr. Anastasio Cortés Mendoza por darme la oportunidad de participar en su

proyecto, así como también apoyarme moralmente y responder todas mis dudas.
Al Dr. Agustín Hilario Rocha por apoyarnos en el laboratorio y todos sus consejos
que fueron demasiado útiles.
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Quiero agradecer a la estudiante de ingeniería en biotecnología Grecia Camarena

por acompañarnos en este proyecto, por su apoyo moral y por su indispensable
ayuda en el laboratorio.
A la QFB. Claudia Pérez Sánchez por facilitarnos el uso de laboratorio y

proporcionarnos todos los materiales y reactivos que se utilizaron en el proyecto.
Al Dr. Juan Francisco Sánchez López por proporcionarnos le cepa de los distintos
hongos que se utilizaron.
A la profesora Maricela Blancas Alva por proporcionarme los conocimientos

necesarios en microbiología para poder lograr este proyecto.
Quiero agradecer a todos mis amigos por apoyarme moralmente para poder lograr
este trabajo y a pesar de la distancia son los mejores.
A mis compañeras que se volvieron amigas y que desde mi llegada se convirtieron

en la compañía y soporte de todos los días Laura Claret, Anna y Lucero un abrazo
para todas y gracias por permitirme conocerlas y ser parte de sus vidas.
A mis compañeros de equipo Zulema López Montoya y Diego Alejandro por todo
su apoyo para poder lograr todo este proyecto sin su ayuda no se habría logrado
esto.
A mi papá porque siempre me apoya, aunque no sea muy afectivo, a mis

hermanos por ser los mejores y estar conmigo incondicionalmente.
Y por último dejo a la persona más importante mi mamá que me ayudo desde el
principio con esta meta y creyó en mí, agradezco todo lo que ha hecho hasta
ahora, sin ella no habría podido concluir con este proyecto. Gracias, mamá por ser
tú y nunca dejarme sola.
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PROGRAMA DELFÍN
Quiero agradecer a todas aquellas personas que de alguna manera ayudaron

poniendo un granito de arena contribuyendo a mi formación.
¡GRACIAS A TODOS!
❖ BIBLIOGRAFÌA
1.Bedón, M., Nolasco, O., Santa Cruz, C & Gutiérrez, A. (2013). Purificación
parcial y caracterizaciòn de alfa amilasa de granos germinados de chenopodium
quinoa (Quinua). Rev. ECLPerù, 10, 51-57.
2.Carrillo, J., Candia. M., Lugo, R., Espinoza, O & Noriega, J. (2013). Evaluación
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PAGE). INVURNUS, 8(1), 19-26.
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PROGRAMA DELFÍN
Crueger W y Crueger A. (1993) Enzimas. En: Manual de Microbiología Industrial.

Acribia, España.
Espinel, E & López, E. (2009). Purificación y caracterizaciòn de a-amilasa de

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Online International Journal Available at http://www.cibtech.org/jps.htm 2016 Vol.5
(3) July-September, pp. 79-90/Mathew et al.
JOURNAL OF SCIENTIFIC AND INDUSTRIAL RESEARCH, VOL.66, AUGUST

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Leonor Carrillo.Los hongos de los alimentos y forrajes. PP 61-69
Martín Vargas C.1, Beatriz Piro M.2, Navarro, A. & Cristina Rubio M.1. Selección
de un hongo filamentoso altamente productor de amilasas para ser usadas en
detergentes biodegradables. Instituto de Biotecnología. Facultad de Bioquímica,
Química y Farmacia. 2Facultad de Medicina. Universidad Nacional de Tucumán.
Ayacucho 471 (4000). Bol. Micol. 2016; 31(1): 19 – 27.
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Pág. 282-297. 4) Dixon M. and Edwin C. (1979) Enzyme isolation. En: Enzymes,
Brace J., Academic Press, New York. Pág. 23-47.zZ
Quintero, M., Montoya, O. & Gutierrez, P. (2010). Purificaciòn y caracterizaciòn de

una a-amilasa producida por la cepa nativa Bacillus sp. BBM1. Medellìn, 162, 31-
38.
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PROGRAMA DELFÍN
Rinku. Sundar, Liji.T, Rajila.C, and P.Suganyadevi. AMYLASE PRODUCTION BY

ASPERGILLUS NIGER UNDER SUBMERGED FERMENTATION USING
IPOMOEA BATATAS.INTERNATIONAL JOURNAL OF APPLIED
PHARMACEUTICAL TECHNOLOGY.VOLUME 3,ISSUE -2, APRIL-JUNE 2012.
Sánchez, Virginia E.(1999).Producción de proteasas fúngicas por fermentación en

estado sólido para su aplicación en la industria de alimentos. Facultad de Ciencias
Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.
Terebiznik, Mauricio R. (1998). Alfa-amilasa de Aspergillus oryzae : estudios de

producción por fermentación en sustrato sólido, purificación y estabilización.
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.
http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_3001_Terebiznik.pdf
Vargas, M., Piro, B., Navarro, A & Rubio, C. (2016). Selección de un hongo
filamentoso altamente productor de amilasas para ser usadas en detergentes
biodegradables. Bol.Micol, 31, (1)19-27.
Vol. 44, N. 1 : pp. 107 - 111, March, 2001 ISSN 1516-8913 Printed in Brazil
❖ ANEXO
LACASA
QUITINASA
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE

Producción de alfa-amilasa usando Aspergillus niger,

Para la obtención de la enzima se empleó la fermentación en estado sólido

Las alfa-amilasa (α-1,4-glucano hidrolasa) son enzimas que catalizan al azar la

Estas enzimas son de gran importancia en la industria alimenticia, textil, papelera

animales y microorganismos, son las enzimas microbianas las que encuentran

Las diferencias en comportamientos de solubilidad han sido usadas por más de 50

La técnica del Salting out permite que las interacciones proteína-proteína se

La diálisis es una forma de filtración molecular. Es un proceso que separa

En el siguiente reporte nos enfocaremos a la producción de amilasas usando

Existen innumerables procesos tanto de producción y/o de preservación de

Hay reportes de producción de esta enzima utilizando fermentación sólida

En una FES es más fácil que crezcan los microorganismos en la superficie de

De la papa (Solanum tuberosum) deriva un polisacárido: el almidón (Shinde

relacionadas con el envejecimiento, y tiene fibra, cuyo consumo es bueno para la

EI almidón está compuesto básicamente por dos tipos de polímeros de glucosa, la

En la fermentación en estado sólido se utilizaron los hongos Aspergillus niger,

CARACTERÍSTICAS DE LOS HONGOS

Los mohos del género Aspergillus causan el deterioro de muchos productos

El color es la principal característica macroscópica para la identificación de los

En los aspergilos, los conidios constituyen cadenas que se originan en la célula

Rhizopus es un género de cigomicetos, hongos filamentosos que por lo general

Los organismos como Rhizopus que producen enfermedades en las plantas se

Los esporangios son esféricos, negros y están contenidos en una estructura

Prácticamente toda la superficie del sustrato es afectada en aproximadamente tres

La amilasa es una enzima indispensable para el metabolismo ya que cataliza la

La presente investigación pretende la producción de amilasa usando a los hongos

✔ Cuantificar la producción de la enzima amilasa por el método de Bradford

Preparación de los medios de cultivo para la inoculación del hongo (Rhizopus,

Preparación de los buffer

Dejar reposando en Filtrar cada uno de los Vertir el buffer

Agitar (250 rpm, 5-10 Separar fases Colocar permeado en

cubrir con aluminio pipetear en cada

leer la absorvancia Mezclar y dejar

Colocar el peine y Colocar la muestra

Aplicar un voltaje Aplicar el buffer en

Teñir por 20 min

Fig. 1 reproducción del hongo Aspergillus niger en PDA, con un lapso de 4

Fig. 2 reproducción del hongo Rhizopus en PDA, con un lapso de 4 días a

Fig. 3 reproducción del hongo Penicillium en PDA, con un lapso de 4 días a

Fig. 4 Fermentación en estado sólido de hongo Aspergillus niger en matraces

Fig. 5 Fermentación en estado sólido de hongo Rhizopus en matraces de

Fig. 6 Fermentación en estado sólido de hongo Penicillium en matraces de

Fig. 7 fermentación en estado sólido de hongo Aspergillus niger en matraces

Fig. 8 Fermentación en estado sólido de hongo Rhizopus en matraces de

Fig. 9 fermentación en estado sólido de hongo Penicillium en matraces de

Tabla 1. Pesos iniciales y finales de la FES

Centrifugación de los extractos enzimáticos

Fig. 10 se centrifugo a una velocidad de 8000 rpm,4 grados centígrados y un

Fig. 11 Visión fisiológica y morfológica del

Fig. 12 Visión fisiológica y morfológica del

Fig. 13 Visión fisiológica y morfológica del Rhizopus en el microscopio, se

Obtención de amilasas por el método cualitativo.

Tabla. 2 indicadores del método cualitativo con pan bimbo blanco

Cromatografía en capa fina.

Curva de calibración para ovoalbúmina

Al hacer cuantificación con el reactivo de Bradford fueron los siguientes :

Despejando (para sobrenadante):

X= (0.255 – 0.0813)/ 0.0019 =91.42 x 2= 182.84 µg /ml

X= (0.313 – 0.0813)/0.0019 =121.94 x 2= 243.84 µg/ml

X= (0.450 - 0.0813)/0.0019 =194.05 x 2 = 388.10 µg/ml