Inactivación del cromosoma X: nuevos conocimientos sobre la regulación cis y

trans.
La inactivación del cromosoma X (XCI) es un proceso asociado al desarrollo que ha
evolucionado en los mamíferos para permitir la compensación de la dosis de genes
entre los individuos XX y XY. En los mamíferos placentarios, se desencadena por el
largo ARN Xist no codificante, que se produce a partir de un complejo locus regulador,
el centro de inactivación X (Xic). Los recientes conocimientos sobre el panorama
regulador del Xic, incluida su división en dominios topológicos asociados (TAD) y su
disección genética, tienen importantes repercusiones en la regulación monoalélica del
Xist. Aquí presentamos algunos de los últimos estudios sobre la inactivación del Xist,
centrándonos especialmente en la regulación del Xist, sus diversas funciones y el
supuesto papel de la conformación cromosómica en la regulación de la dinámica de
este locus durante el desarrollo y la diferenciación.

Introducción
Se cree que la dosis de cromosomas X es crucial para el desarrollo normal y un fallo en
la inducción de XCI, ya sea en el embrión propio o en los tejidos extraembrionarios,
suele ser letal. En el ratón, dos ondas de XCI ocurren durante el desarrollo embrionario.
Primero, el cromosoma X paterno se inactiva a partir de la etapa de 4 células,
principalmente debido a una impronta materna que impide que el X materno sea
inactivado. Recientemente, se propuso que la trimetilación materna en la lisina 9 de la
histona H3 (H3K9me3) en el promotor Xist podría desempeñar un papel en esta
impronta materna aunque todavía no está claro a qué nivel. La impronta XCI persiste
durante la embriogénesis previa a la implantación hasta el estadio de blastocito, donde
el cromosoma X paterno se reactiva en la masa celular interna (MCI) pero permanece
inactivo en las células que dan lugar a los tejidos extraembrionarios. En el epiblasto, un
linaje derivado de la ICM que da origen al embrión propiamente dicho, la pérdida de
pluripotencia se acompaña de una segunda onda de XCI, en la que el cromosoma X
paterno o materno puede inactivarse al azar. Esta elección es entonces mitóticamente
heredable y estable, dando lugar a individuos adultos femeninos con diversos grados
de mosaicismo para la expresión de genes ligados al X. Las células madre
embrionarias murinas (mESC) derivadas de la ICM se utilizan como un poderoso
sistema modelo para estudiar el XCI ex vivo, ya que albergan dos cromosomas X
activos que se someten a un XCI aleatorio al diferenciarse.
El XCI en los euterianos está controlado por un locus regulador maestro, el centro de
inactivación X (Xic), que es necesario y suficiente para activar el XCI cuando está
presente en dos copias. El Xic incluye el locus no codificador Xist y algunos de sus
reguladores conocidos, como el represor Tsix, el activador Rnf12 y otros supuestos
reguladores positivos (Jpx, Ftx y Xpr). Xist se regula de manera monoparalela tanto
durante el XCI impreso como el aleatorio, y su largo ARN no codificante recubre el
futuro cromosoma X inactivo en el cis. A esto le sigue inmediatamente una serie de
modificaciones de la cromatina, la reorganización espacial del cromosoma y su casi
completo silenciamiento transcripcional. Curiosamente, esta secuencia de
acontecimientos se invierte aproximadamente durante la reprogramación de las células
somáticas en células madre pluripotentes inducidas (iPS).
Mary Lyon, que falleció recientemente (25 de diciembre de 2014), descubrió el proceso
de XCI en 1961. Más de cincuenta años después de su trabajo visionario, muchas de
las preguntas esenciales en el campo siguen siendo exploradas. ¿Cómo está la
expresión Xist estrechamente coordinada con el tiempo de desarrollo? ¿Cuáles son los
mecanismos moleculares sensibles a la dosis que restringen el XCI a las células XX y
no a las células XY o XO? ¿Cómo elige la célula entre dos cromosomas X y se asegura
de que sólo uno esté inactivo? ¿Cómo se propaga el ARN Xist a lo largo del
cromosoma X, de forma limitada a la cis, y cómo induce el silenciamiento de los genes
así como los cambios de cromatina? En este examen se presentarán estudios
recientes que abordan estas cuestiones y se examinarán sus consecuencias para los
modelos actuales en este campo.

El paisaje cis-regulador de Xic: Xist y su entorno

El Xic alberga varios loci no codificantes que participan en la regulación del XCI,
algunos de los cuales parecen modular la expresión del Xist (figura 1). Uno de ellos - el
Tsix - se transcribe en antisentido a través del Xist, y las pruebas actuales apuntan al
acto de transcripción, en lugar del ARN Tsix, actuando de manera represiva sobre la
expresión del Xist. Tsix también participa en la mediación de la elección del futuro
cromosoma X inactivo: una deleción heterocigótica de Tsix resulta en una inactivación
completamente sesgada del cromosoma mutado. Un mecanismo propuesto para la
elección a nivel de Xist/Tsix fue a través del emparejamiento de los dos loci Xic, a
través de las regiones Xpr y Tsix/Xite. En un estudio reciente se informó de que el
emparejamiento no es esencial para que se inicie el XCI aleatorio, basado en los
heterocariones, aunque ello no excluía una función para el emparejamiento Tsix en la
toma de decisiones. Otro estudio reciente propuso que la conmutación conformacional
de la cromatina que alberga el locus Tsix podría participar en su expresión monoalélica
y, por consiguiente, en la regulación monoalélica de Xist. Además de ayudar a mediar
la elección durante el XCI aleatorio, se ha propuesto que Tsix impida la activación de
Xist en el X materno durante el XCI impreso. La herencia materna de un alelo Tsix
alterado da lugar a una expresión anormal de Xist y a una letalidad embrionaria
temprana que se atribuye a la inactivación inadecuada de ambos cromosomas X en las
mujeres y del cromosoma X único en los hombres durante el desarrollo de la
preimplantación. Sin embargo, un estudio reciente demostró que la misma supresión
materna de Tsix dio lugar a una expresión anormal de Xist del X materno sólo en
etapas posteriores, en ciertos linajes extraembrionarios. Por lo tanto, es posible que se
requiera que Tsix mantenga el estado activo del X materno en determinados tejidos
extraembrionarios, pero parece ser prescindible durante la XCI impresa en los
embriones de preimplantación.

Figura 1
Arquitectura genómica y localización del elemento controlador X (Xce) y del centro de
inactivación X (Xic). Se muestran las regiones candidatas Xce mapeadas hasta la
fecha, incluido el intervalo original definido por Cattanach y Papworth. La mayoría de
las regiones candidatas se superponen con el Xic, pero tienden a excluir la región
Tsix/Xist y el Xite. La más reciente identificó una región de 176 kb situada
aproximadamente a 500 kb proximal al Xist, que incluye notablemente un conjunto de
duplicaciones e inversiones en tándem. El Xic se definió como una región mínima de
450 kb, aunque está organizada topológicamente en dos TAD adyacentes que abarcan
un total de más de 750 kb. Los promotores del Xist y el Tsix se encuentran en
diferentes TAD, junto con sus respectivos reguladores conocidos. Se ha demostrado
que la conformación cromosómica en la TAD Tsix se correlaciona con diferentes
estados transcripcionales de Tsix, probablemente debido a la diferencia de frecuencia
de contacto entre Tsix y sus reguladores cis.
Se ha propuesto que participen en su activación los loci situados aguas arriba de Xist:
la región de apareamiento X (Xpr), que apenas se expresa en CME y diferenciación
temprana, y los loci Jpx y Ftx, que muestran patrones de expresión similares a los del
Xist. Ftx produce otro lncRNA que al ser eliminado en las ESC masculinas reduce la
expresión de Xist así como de otros loci a través de la Xic. Sin embargo, la supresión
de Ftx no perjudicó al XCI impreso in vivo, y los patrones de expresión y de aumento
del Xist no se vieron afectados en los blastocitos femeninos. Curiosamente, el locus de
Ftx también alberga dos micro ARN (miARN), cuyas funciones aún no se han
explorado. Queda por determinar si Ftx podría afectar a la elección y al establecimiento
del monoparalelismo de Xist. El locus Jpx también produce un lncRNA que puede
regular el Xist, aunque en estudios recientes no se ha llegado a un acuerdo sobre si
actúa en trans o en cis. Mientras que en un estudio se propone que Jpx es un trans-
activador de Xist por desalojo dependiente de la dosis de CTCF en el promotor de Xist,
en otro no se encuentra ninguna prueba de un efecto trans-activador de Jpx. En este
último, una supresión en una X que abarcaba el locus Jpx mostraba un fenotipo XCI
reducido que no fue rescatado por una segunda copia Jpx introducida como
transgénico BAC indicando sólo un efecto cis. También se especuló que el locus Xpr,
anteriormente implicado en el emparejamiento Xic, desencadenaba la expresión Xist en
el trans. Sin embargo, su ausencia en el contexto de una supresión mayor no afecta al
XCI. Así pues, aunque la región que abarca los locus Jpx, Ftx y Xpr no parece tener un
pronunciado efecto de transcripción en la regulación del Xist, ciertamente parece
potenciar la expresión del Xist en cis, reduciendo su umbral para ser activado por los
factores trans. Sigue siendo una cuestión pendiente el hecho de que estos loci actúen a
través de su transcripción, producto de ARN o elementos de ADN, y en cuál de estos
niveles se regula el Xist.
Uno de los loci implicados por primera vez en la toma de decisiones durante el XCI fue
el elemento controlador X (Xce) descrito por Bruce Cattanach para subyacer a los
patrones sesgados del XCI en ratones híbridos F1 de orígenes genéticos divergentes.
Un X que alberga un alelo Xce "más débil" (como Xcea, Mus musculus domesticus) se
inactiva con más frecuencia que un X que alberga un alelo Xce "más fuerte" (como
Xcec, M. m. castaneus) en ratones híbridos. Varios intentos de refinar la región
candidata Xce mostraron que se superpone con el locus Xic, pero puede excluir la
región Tsix/Xist y puede que ni siquiera sea un único locus (Figura 1). De hecho, se
identificaron variantes estructurales en el intervalo Xce, fuera de la región Xist-Tsix.
Queda por dilucidar la naturaleza del Xce y su relación con el Xist en la elección de la
mediación.

Acoplando la conformación y la transcripción de los cromosomas en el Xic

Recientemente se descubrió que los promotores de Xist y Tsix se encuentran en dos
dominios topológicos asociados (TAD) distintos, con el promotor de Xist situado en el
mismo TAD que sus conocidos reguladores positivos y en un TAD distinto y adyacente
a su regulador negativo Tsix (Figura 1). Además, los genes dentro de un mismo TAD
tienden a corregirse durante el desarrollo, lo que sugiere que los TAD podrían
proporcionar una base estructural para los paisajes de regulación. En un estudio
reciente se utilizó la modelización física de polímeros validada por el DNA FISH de alta
resolución para explorar las conformaciones estructurales subyacentes a los TAD Xic a
nivel de una sola célula. Se descubrió que las conformaciones cromosómicas dentro de
un TAD individual eran muy variables de una célula a otra, lo que reveló que los datos
de las "técnicas C" no reflejan una estructura cromosómica uniforme en toda la
población celular, sino que son el resultado de un conjunto de conformaciones. Se
demostró además que la conformación cromosómica estaba relacionada con la
expresión de los genes - los niveles de transcripción de Tsix se correlacionaron con la
compactación de TAD utilizando ARN y ADN FISH en las mismas células. Así pues, se
propuso que las fluctuaciones estructurales dentro de los TAD podían subyacer a la
situación de transcripción diferencial y contribuir a generar asimetrías entre los dos
cromosomas X, influyendo así en la elección durante el inicio del XCI. Se requerirá una
disección genética combinada con un análisis transcripcional y conformacional para
establecer relaciones causales entre la estructura y el fenotipo molecular.

El panorama transregulador de Xic: la red de pluripotencia y los mecanismos

sensibles a la dosificación X
La inactivación y reactivación del cromosoma X (XCI) se producen durante ventanas de
tiempo específicas del desarrollo y se han vinculado a la red de pluripotencia. Los
factores de pluripotencia que participan en la regulación de la XCI son Oct4, Rex1, c-
Myc y Klf4, que estimulan la transcripción de Tsix; Nanog y Oct4, así como Rex1
(dirigido a la degradación por Rnf12), que reprimen la expresión de Xist, y contribuyen
a la ausencia de XCI en las CME y potencialmente a la reactivación del X paterno en la
MCI (figura 2). El factor de línea germinal Prdm14 también ha sido implicado en la
reactivación del X, al reprimir el Xist y el activador del Xist Rnf12. Más recientemente,
los complejos asociados al MOF (que participan en la compensación de la dosis en
Droshophila) estuvieron implicados en la represión del Xist en las CMI al aumentar la
expresión de los factores Tsix y de pluripotencia. Los organizadores de la cromatina
Satb1 y Satb2 también influyen en la expresión de Nanog y se propuso que
desempeñaran un papel en el XCI, aunque los ratones mutantes de ambas proteínas
no muestran defectos asociados al XCI.
Figura 2
La red de regulación de Xist. La regulación positiva del Xist está estrictamente
controlada durante la diferenciación y el desarrollo. Los factores de pluripotencia
reprimen la expresión del Xist actuando sobre el locus directa o indirectamente a través
de la estimulación del Tsix. La Rnf12 y los cis-reguladores del Xist promueven su
regulación positiva en ausencia de la represión mediada por la pluripotencia. Más
recientemente, factores como el YY1 y el DNMT1 se han implicado como activadores
de la transducción de la expresión del Xist, mientras que los complejos asociados al
MOF tienen un efecto negativo. El aumento de la regulación del Xist da lugar a la
pérdida de dos cromosomas X activos (Xa), que recientemente se ha descubierto que
retrasan la diferenciación celular mediante la modulación de la expresión de los
factores de pluripotencia. La pluripotencia regula el XCI a través del Xist y la iniciación
del XCI se retroalimenta en la red de pluripotencia, de modo que la diferenciación
celular no procede sin que se logre una compensación de la dosis.

Se propuso que la regulación del Xist por factores de pluripotencia como el Oct4 se
produjera mediante la unión al intrón 1 del Xist y la asociación espacial con el promotor
del Xist. La supresión del intrón 1 del Xist en la ESC femenina o en la ESC masculina
que alberga un transgén del Xist condujo a un aumento moderado de la expresión del
Xist, que se potenció con la supresión del Tsix. También se propuso el intrón 1 de Xist
para mediar el cambio entre el XCI impreso y el aleatorio, mediante la unión
competitiva entre Cdx2 y Oct4 a la región. Sin embargo, en un estudio reciente se
suprimió la región del intrón 1 tanto en las células madre embrionarias como en los
ratones, sin que ello repercutiera de manera evidente en la expresión del Xist, el XCI
impreso, el XCI aleatorio, la reactivación del cromosoma X en el embrión o durante la
reprogramación a la iPSC. También se excluyeron los mecanismos de compensación
de Tsix, aunque sólo en las células masculinas. Así pues, la red de pluripotencia
repercute en la regulación del Xist en el ratón sin ningún requisito aparente para el
intrón 1 del Xist; no obstante, no puede excluirse que esta región actúe de manera
redundante con otros elementos hasta ahora no identificados en el Xic.
Otro vínculo entre la red de pluripotencia y el XCI surgió del hallazgo de que las mESC
femeninas, con dos cromosomas X activos, muestran un retraso en la diferenciación
cuando se comparan con las ESC XY o XO y que este retraso puede superarse
induciendo el XCI. Se determinó que la presencia de dos X activos modula vías de
señalización celular específicas y, por lo tanto, retrasa la diferenciación al mantener
niveles más altos de factores de pluripotencia y niveles más bajos de metilación del
ADN al comienzo de la diferenciación en comparación con las células XY o XO. En
consecuencia, la regulación forzada del Xist en XX ESC indiferenciadas dio lugar a una
mayor regulación a la baja de algunos genes asociados a la pluripotencia y a una
diferenciación más rápida, mientras que la supresión de ambos alelos Xist dio lugar a la
retención de una mayor expresión de esos genes, lo que ralentizó la diferenciación.
Este punto de control del desarrollo que vincula el XCI y la diferenciación puede
garantizar que el desarrollo no proceda sin que se logre una compensación de la dosis
del cromosoma X. Queda por identificar el factor o los factores codificados en X que
impiden la salida de la pluripotencia de manera sensible a la dosis.
La presencia de dos cromosomas X activos también es necesaria para desencadenar
el XCI, al producir factores de trans-acción que actúan de manera sensible a la dosis
(también denominados factores de detección o de competencia). Se ha propuesto que
la Rnf12, que reside dentro de la TAD del Xist, aumente la regulación del Xist de
manera que dependa de la dosis. Codifica una ligasa de ubiquitina E3 que promueve la
degradación de Rex1, un represor de Xist que también estimula la expresión de Tsix.
En las células ES masculinas, una sola copia de Rnf12 no es suficiente para inducir el
XCI, pero copias adicionales pueden activar la expresión de Xist. En las células ES
femeninas, el análisis de diferentes knock-outs homocigotos de Rnf12 ha dado
resultados contradictorios. En un caso, el XCI fue abolido en la diferenciación de las
ESC, mientras que en otro no fue afectado en absoluto. Sin embargo, este último alelo
KO sí afectó al XCI impreso in vivo, pero no al XCI aleatorio. Las secuencias
suprimidas en los dos estudios podrían ser una de las razones de la diferencia de
fenotipo, ya que ninguna de ellas abroga completamente la proteína Rnf12: se produce
un péptido de 83 aminoácidos a partir del alelo Shin y otros, y una proteína de 340
aminoácidos a partir del alelo Jonkers y otros. Las diferencias en los antecedentes
genéticos podrían ser otra explicación. La comprensión de esta diferencia en el fenotipo
podría proporcionar información muy útil sobre la naturaleza de la función de Rnf12 en
la regulación de Xist y XCI. En resumen, los altos niveles de Rnf12 parecen ser
suficientes para desencadenar el XCI en mESC y para el aumento de la regulación de
Xist durante el XCI impreso in vivo. También se ha propuesto recientemente una nueva
función para la Rnf12 en la etapa de mantenimiento del XCI, aunque no se han
aclarado los mecanismos moleculares. Es importante señalar que las células ES
femeninas heterocigotas con una sola copia de Rnf12 pueden todavía someterse a
XCI, lo que indica la existencia de otros activadores de XCI, involucrados en la
regulación de la expresión de Xist.
Pruebas recientes implican factores de acción autosómica en la regulación de Xist
(figura 2), en particular la ADN metiltransferasa Dnmt1, el factor de transcripción YY1, y
el CTCF, un factor de transcripción y aislante de cromatina. La CTCF se une
fuertemente en el límite entre las TAD de Xist y Tsix, cuya supresión conduce a una
inducción de Xist comprometida y a una XCI aberrante. También se cree que la CTCF
promueve el emparejamiento y reprime el Xist al unirse a su promotor. El reclutamiento
de CTCF al Xic fue recientemente propuesto para ser a través de algunos de sus
lncRNAs. YY1 ha estado implicado en el XCI como socio de la CTCF regulando la
transcripción del Tsix y como factor puente entre el ARN del Xist y la cromatina. Un
informe reciente muestra que YY1 también contribuye a activar la transcripción de Xist
al unirse a una región que coincide con el promotor P2 descrito de Xist en el ratón y en
el humano. Antes del XCI, la unión del YY1 probablemente compite con el Rex1, que
se une a la misma región, y al comienzo del XCI, el YY1 se une sólo al alelo Xist en el
X inactivo debido a la metilación diferencial del ADN. Esto implica que la elección
precede a la unión de YY1. Queda por determinar, sin embargo, si estos activadores
interactúan con el factor o factores codificados en X para mediar mecanismos sensibles
a la dosis y cómo la regulación positiva de Xist se restringe a un solo alelo.

Recubrimiento inducido por Xist y silenciamiento del cromosoma X

Una vez regulado al inicio del XCI, el ARN de Xist se asocia con todo el cromosoma en
cis, induciendo cambios en la conformación y creando un compartimiento nuclear
inactivo agotado de marcas de ARN-polimerasa II y euchromatina, en el que casi todos
los genes del cromosoma parecen moverse a medida que se silencian. Posteriormente,
el reclutamiento de numerosos complejos represivos durante las fases de iniciación y
mantenimiento de la XCI, como el PRC1, el PRC2 y las ADN-metiltransferasas, ayudan
a fijar el estado inactivo del cromosoma X (figura 3). El ARN no codificante largo de Xist
contiene varias repeticiones conservadas diferentes, algunas de las cuales han sido
implicadas en la mediación de funciones distintas: el elemento de la repetición A, por
ejemplo, es crucial para el silenciamiento, pero no para la localización de Xist, mientras
que la repetición C parece ser importante para la asociación de Xist con el X inactivo y
las repeticiones B y F parecen estar implicadas en el reclutamiento de complejos de
cromatina. Así pues, el silenciamiento, el recubrimiento y el reclutamiento de factores
son funciones genéticamente separables del ARN Xist.
El mapeo de alta resolución de la localización del ARN Xist reveló recientemente que
este lncRNA se localiza en sitios distales del cromosoma X que están en estrecha
proximidad espacial tridimensional al locus Xist al inicio del XCI (Figura 3). En otro
estudio también se mapearon los sitios de unión del Xist y se encontró que el Xist se
encuentra principalmente en las regiones de cromatina activa de las células sometidas
a XCI. Los sitios encontrados en ambos estudios no eran necesariamente los mismos y
se podían hacer varias interpretaciones. El ARN de Xist puede explotar la conformación
de los cromosomas y asociarse con dominios de cromatina más activos simplemente
porque son más accesibles a su recubrimiento. Alternativamente, el locus Xist puede
asociarse preferentemente con regiones más activas a medida que se expresa más
intensamente durante la iniciación del XCI. Otra posibilidad es que la aparente
asociación del Xist con regiones activas simplemente refleje su mayor accesibilidad
durante la fijación. Las últimas regiones cubiertas por Xist durante el XCI son dominios
repetitivos pobres en genes, incluyendo LINEs. Ambos estudios mostraron una
anticorrelación entre la localización del ARN de Xist y LINEs, como se demostró
anteriormente utilizando el ARN/ADN FISH. ¿Cómo se puede conciliar esto con la
hipótesis de repetición de LINE, originalmente propuesta por Mary Lyon, que sigue
reuniendo pruebas favorables? En el estudio de Chow y otros, se propuso que las LINE
activas de longitud completa eran facilitadoras de la propagación durante la
heterocromatinización inducida por Xis, en particular en las regiones propensas a la
fuga. De hecho, varios genes pueden escapar del Xist mediado por el ARN. La forma
en que estos genes son capaces de resistir el XCI sigue siendo un misterio, pero
informes recientes sugieren que los fugitivos albergan elementos locales que median
su escape, además de estar rodeados de elementos que impiden que los genes
vecinos sucumban al escape. Ciertos tejidos, como las células gigantes del trofoblasto,
muestran una alta tasa de escape de genes ligados al X. En esas células, el ARN de
Xist no forma un compartimiento completamente silencioso y pueden coexistir marcas
de heterocromatina y euchromatina.
Figura 3.
El ARN de Xist durante las fases de propagación y mantenimiento. El reciente mapeo
del ARN de Xist reveló que los primeros sitios cubiertos corresponden a sitios en
estrecha proximidad espacial al locus de Xist. La localización del Xist se hace más
homogénea a medida que avanza el XCI, y durante la mitosis todavía no está claro si el
cromosoma X sigue estando recubierto. Se cree que la propagación del ARN del Xist
va acompañada de un silenciamiento del gen, que el complejo PRC2 ayuda a
mantener. La correlación entre el ARN de Xist y el PRC2/H3K27me3 se encuentra
basada en el ChIP seguido por el RAP-seq y el CHART-seq, pero se observó poca
superposición entre el ARN de Xist y los focos de la proteína PRC2 en un estudio que
utilizó la microscopía de iluminación estructurada (SIM). Durante la fase de
mantenimiento, el ARN de Xist recluta directa o indirectamente complejos
silenciadores, como el PRC1, el PRC2 y el Jarid2. Se ha propuesto que nuevos
factores como el Cdyl y el Atf7ip son importantes para bloquear el estado inactivo del
cromosoma post-XCI.

Aunque tenemos una imagen más clara de dónde se encuentra el ARN de Xist cuando
se propaga a lo largo del cromosoma X, los asociados moleculares que median la
asociación entre este ARN largo no codificante y la cromatina ligada al X siguen siendo
esquivos. Curiosamente, un experimento en el que el ARN de Xist es "eliminado" del
cromosoma X reveló que el recubrimiento posterior del cromosoma X eliminado se
produjo de una manera diferente a la del recubrimiento inicial de un cromosoma X que
no existe en Xist: en lugar de dirigirse primero a los dominios de cromatina activa, Xist
se propaga ampliamente a través del cromosoma. Esto indica que el Xist induce
cambios en el cis que facilitan su asociación de manera amplia en el cromosoma. En
anteriores estudios de imágenes de células vivas de ARN de Xist se había informado
de una observación similar: la cinética del revestimiento de Xist dentro de un grupo
establecido era dos veces más rápida que el establecimiento inicial del grupo de Xist
después de la mitosis o la inducción de la expresión. Ambos estudios subrayan las
capacidades de transformación de la cromatina del ARN de Xist e implican algún tipo
de memoria de la cromatina inducida por el recubrimiento previo de Xist, lo que podría
ser pertinente para mantener el estado silenciado del X inactivo al dividirse las células
(figura 3).
Aunque cabe esperar que la propagación del ARN de Xist corresponda a la
propagación del silenciamiento de genes a lo largo del cromosoma, no está claro si las
primeras regiones que se silencian son, de hecho, los primeros sitios en los que se une
el ARN de Xist. Además, aunque existe una correlación entre la unión del ARN de Xist,
la ocupación del PRC2 y la deposición de H3K27me3, basada en ChIP-seq y CHART,
el FISH de ARN de Xist combinado con la inmunofluorescencia mediante microscopía
de iluminación estructurada muestra una separación espacial significativa y la ausencia
de colocalización de las proteínas PRC2 y el ARN de Xist (Figura 3). Estas
discrepancias no se explican fácilmente, pero probablemente se deben a las diferentes
técnicas. De hecho, los mecanismos de reclutamiento de la PRC2 en el cromosoma X
siguen siendo discutibles; aunque depende del ARN Xist, el hecho de que sea directo o
indirecto sigue siendo una cuestión pendiente (figura 3). Algunos estudios sugieren una
interacción directa con la transcripción del ARN Xist. Sin embargo, el reclutamiento de
PRC2 todavía se encuentra en las células que expresan el ARN Xist sin la repetición A.
Además, no se encontraron factores de PRC2 en un estudio reciente que purificaba a
las parejas que interactuaban con el ARN Xist. Recientemente, dos factores han sido
implicados en el reclutamiento de PRC2 inducido por el ARN de Xist: el remodelador de
cromatina ATRX y Jarid2, que también puede influir en la actividad enzimática del
PRC2. Se ha demostrado que ambos son importantes para el objetivo inicial y la carga
del PRC2 en el cromosoma X. Los complejos PRC1 también pueden ser reclutados
tanto directa como indirectamente en el cromosoma X recubierto por ARN Xist: la
interacción con la proteína cromodominio CBX apunta al PRC1 a sitios H3K27me3,
mientras que la asociación con otra proteína, RYBP, permite el reclutamiento
independiente del PRC2.
Además del PRC2 y el PRC1, recientemente se han identificado otros factores como
socios de la cromatina X inactiva, incluida la CDYL, que pueden asociarse a la
combinación de las marcas H3K27me3 y H3K9me2, que se enriquecen en el X inactivo
durante el XCI (Figura 3). La CDYL también se asocia con las metiltransferasas H3K9
G9a y SETDB1, por lo que puede promover la propagación de la marca H3K9me2. El
propio SETDB1 participa en una vía que contribuye al mantenimiento del XCI en las
células somáticas y que podría tender un puente entre la metilación del ADN y la
metilación del H3K9 en el XCI, gracias a la participación de una proteína de unión al
ADN de metilo, la MBD1. Es evidente que el descubrimiento y la purificación de las
proteínas inactivas del cromosoma X y sus parejas proporcionarán un mango con el
que definir los mecanismos moleculares subyacentes al XCI. Utilizando la
espectrometría de masas tras diferentes técnicas de purificación del ARN Xist, dos
informes muy recientes lograron identificar los interactores del ARN Xist, que incluían
proteínas de matriz nuclear (como el conocido interactor del ARN Xist HnrnpU o SAF-
A), reguladores de la cromatina y varios represores transcripcionales. Curiosamente, en
ninguno de los estudios se encontraron componentes del PRC2, y las subunidades del
PRC1 se identificaron sólo en uno. La proteína SPEN/SHARP, parte de un complejo
que interactúa y activa la HDAC3, fue identificada en ambos estudios y se encontró que
interactuaba con el elemento de repetición Xist A dentro de Xist. Su derribo condujo a
la reducción del silenciamiento de los genes.

Observaciones finales
El XCI es un paradigma para la regulación genética y epigenética durante el desarrollo.
Los recientes progresos descritos aquí avanzaron en su mayoría nuestro conocimiento
en términos de los cis-reguladores y trans-reguladores involucrados en la regulación
positiva del Xist y su expresión mono-paralela. El muy reciente descubrimiento de
algunos de los factores involucrados en el silenciamiento mediado por el ARN de Xist
abre el camino a una nueva y excitante era de investigación del XCI. Predecimos que la
reciente revolución en las nuevas técnicas de ingeniería del genoma proporcionará la
rápida disección funcional tanto de los elementos cis como de los ARN trans-activos y
las proteínas implicadas en la iniciación, propagación y mantenimiento del XCI. El
creciente interés en la interacción entre la conformación y la transcripción de los
cromosomas a través del genoma también ha aportado importantes conocimientos
sobre el XCI. En el futuro, la aplicación de tecnologías de células únicas y de imágenes
de células vivas será fundamental para comprender la dinámica temporal de estas
características y sus relaciones funcionales.