ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE LA CALIDAD DEL AGUA

CHISLAINE VEGA AMAYA

ESTUDIANTE

ING. JOSÉ ISAC SIERRA MARTÍNEZ

DOCENTE

UNIVERSIDAD DE LA GUAJIRA

EXTENSIÓN FONSECA

FACULTAD DE INGENIERÍA

INGENIERÍA AMBIENTAL

FONSECA, LA GUAJIRA

2020
 ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE LA CALIDAD DEL AGUA

CHISLAINE VEGA AMAYA

Trabajo de calidad de agua para obtención de nota de segundo corte

ING. JOSÉ ISAC SIERRA MARTÍNEZ

DOCENTE

UNIVERSIDAD DE LA GUAJIRA

EXTENSIÓN FONSECA

FACULTAD DE INGENIERÍA

INGENIERÍA AMBIENTAL

FONSECA, LA GUAJIRA

2020
 TABLA DE CONTENIDO

INTRODUCCIÓN.............................................................................................................................5
2. OBJETIVOS................................................................................................................................6
2.1 OBJETIVO GENERAL.........................................................................................................6
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS...............................................................................................6
3. ANALISIS MICROBIOLOGICO DEL AGUA..........................................................................7
3.1 FACTORES QUE INCIDEN EN LA FLORA BACTERIANA........................................10
3.2 TOMA DE MUESTRAS PARA ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO.................................11
3.3 BACTERIAS COLIFORMES............................................................................................14
3.4 COLIFORMES FECALES.................................................................................................15
3.5 ESTREPTOCOCOS FECALES........................................................................................19
3.6 CLOSTRIDIUM SULFITO REDUCTOR..........................................................................24
3.7 BACTERIAS AEROBIAS..................................................................................................25
4. CONCLUSIONES.....................................................................................................................28
5. REFERENCIAS.........................................................................................................................29

3
 LISTA DE TABLAS

Tabla 1. Características microbiológicas del agua……………………………8

Tabla 2. Coliformes totales y fecales en aguas……………………………….8

Tabla 3. Agua potable……………………………………………………………9

Tabla 4. Enfermedades de los microorganismos……………………………..10

4
 INTRODUCCIÓN

Una de las restricciones más importantes del desarrollo económico del hombre es
el agua. Su escasez y contaminación amenazan aspectos fundamentales de la
seguridad humana, como son: el equilibrio del medio acuático, la producción de
alimentos y la salud pública (Sardiñas, O., Novo, M., Chiroles… Pérez, A. 2006)

Entre los contaminantes más frecuentes de las aguas se encuentran: materias

orgánicas, bacterias, desperdicios industriales y domésticos, entre otros, por lo
que se considera indispensable una toma de decisión adecuada al momento de
controlar vertimientos de aguas residuales e incluso residuos humanos y animales.

Vanegas, mercado y campos (2014), aseguran que en Colombia el acceso al agua

potable y a sistemas de saneamiento no están garantizados para buena parte de
la población, por lo que el consumo de agua contaminada genera enfermedades
de origen hídrico. La alternativa más utilizada para el acceso al agua potable es su
almacenamiento dentro de las viviendas y la improvisación de sistemas de
alcantarillado que generalmente se encuentran a cielo abierto.

Esta investigación se hizo con la finalidad de comprender procedimientos

realizados para el análisis microbiológico del agua (Bacterias aerobias, Coliformes,
Estreptococos fecales y Clostridios sulfito reductores), desde la toma de muestra
adecuada, hasta la interpretación de resultados, la cual enfatiza en la presencia de
materia fecal y su posible trasmisión de enfermedades causada por organismos
enteropatógenos.

5
 2. OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GENERAL

 Describir e investigar los procedimientos realizados para el análisis

microbiológico del agua (Bacterias aerobias, Coliformes, Estreptococos
fecales y Clostridios sulfito reductores).

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Establecer el procedimiento de toma de muestras para el análisis

microbiológico del agua.

 Mencionar los métodos adecuados para la verificación de microorganismos

en el agua.

 Explicar las consecuencias de la presencia de microrganismos patógenos

en las aguas de consumo humano.

 Identificar los valores aceptables de microorganismos en el agua para

consumo humano, según la normativa colombiana.

6
 3. ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DEL AGUA

Según la Resolución 2115: “El análisis microbiológico del agua, son los
procedimientos de laboratorio que se efectúan a una muestra de agua para
consumo humano para evaluar la presencia o ausencia, tipo y cantidad de
microorganismos” (2007, p. 1).

Las técnicas aceptadas para realizar los análisis microbiológicos del agua para
consumo humano son las siguientes:

a) PARA ESCHERICHIA COLI Y COLIFORMES TOTALES: Filtración por

membrana, Sustrato Definido, enzima sustrato y presencia - ausencia. Se podrán
adoptar otras técnicas y metodologías debidamente validadas por el Instituto
Nacional de Salud - INS - o éste realizará una revalidación con base en
documentos soporte de organismos internacionales que presenten los solicitantes.

b) PARA GIARDIA Y CRYPTOSPORIDIUM: Las técnicas y metodologías de

análisis para estos microorganismos deben ser validadas por el Instituto Nacional
de Salud – INS - o revalidadas por éste con base en documentos soporte de
organismos internacionales que presenten los solicitantes (Resolución 2115, 2007,
p. 6).

Las características microbiológicas del agua para consumo humano deben

enmarcarse dentro de los siguientes valores máximos aceptables como se
observa en la tabla (1), desde el punto de vista microbiológico, los cuales son
establecidos teniendo en cuenta los límites de confianza del 95% y para técnicas
con habilidad de detección desde 1 Unidad Formadora de Colonia (UFC) ó 1
microorganismo en 100 cm3 de muestra (Resolución 2115, 2007, p. 6).

PARÁGRAFO 1. Como prueba complementaria se recomienda realizar la

determinación de microorganismos mesofílicos, cuyo valor máximo aceptable será
de 100 UFC en 100 cm3.

7
PARÁGRAFO 2. Ninguna muestra de agua para consumo humano debe contener
E. Coli en 100 cm3 de agua, independientemente del método de análisis utilizado.

PARÁGRAFO 3. El valor aceptable para Giardia es de cero (0) Quistes y para

Cryptosporidium debe ser de cero (0) Ooquistes por volumen fijado según la
metodología aplicada (Resolución 2115, 2007, p. 7).

Tabla 1

Características microbiológicas del agua

Técnicas utilizadas Coliformes totales Escherichia coli

Filtración por membrana 0 UFC/100cm3 0 UFC/100cm3
Enzima sustrato < de 1 microorganismo < de 1 microorganismo
en 100cm3 en 100cm3
Sustrato definido 0 microorganismos en 0 microorganismos en
100cm3 100cm3
Presencia - ausencia Ausencia en 100cm3 Ausencia en 100cm3
Nota: resolución 2115, (2007)

En la tabla 2, observamos los valores permisibles de coliformes totales y fecales

en las aguas según el decreto 1594 de 1984.

Tabla 2

Coliformes totales y fecales en aguas

Tipo de agua Coliformes totales NMP Coliformes fecales NMP

Uso agrícola No mayor a 5000 No mayor a 1000 NMP
microorganismos/100ml
Uso recreativo 1000 200 microorganismos/100ml
primario microorganismos/100ml
Uso recreativo 5000 200 microorganismos/100ml
secundario microorganismos/100ml
Nota: elaboración propia

Según el decreto 140 del 2003 los criterios sanitarios de la calidad del agua de
consumo humano son los siguientes:

8
 Tabla 3

Agua potable

Nota: elaboración propia.

El interés se centra en los microorganismos patógenos, que son los diferentes

tipos de bacterias, virus, protozoos y otros organismos, que transmiten
enfermedades, tabla (4). En los países en vías de desarrollo las enfermedades
producidas por estos patógenos son uno de los motivos más importantes de
muerte prematura, sobre todo de niños. Normalmente estos microbios llegan al
agua en las heces y otros restos orgánicos que producen las personas infectadas
(Obón, s.f, p.4).

Tabla 4

9
 Enfermedades de los microorganismos

Nota: Obón (s.f)

3.1 FACTORES QUE INCIDEN EN LA FLORA BACTERIANA

 La acidez disminuye el contenido de microorganismos.

 La materia orgánica lo aumenta.
 Mucho oxígeno disuelto disminuye los microorganismos anaerobios.
 Las sales, si son abundantes, producen que el agua sea casi estéril.
 Si existe poca cantidad de sales se estimula el desarrollo bacteriano.
 La filtración disminuye el número de microorganismos.
 La temperatura puede aumentar o disminuir el contenido bacteriano.
 La turbidez hace que el contenido bacteriano pueda aumentar, ya que los
rayos U.V. no manifiestan su acción.

10
  Los protozoos fagocitan bacterias y así disminuyen el número de estas
(Obón, s.f, p.3).

3.2 TOMA DE MUESTRAS PARA ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO

Según el instituto nacional de tecnología agropecuaria, (2011). Los pasos

prácticos para la toma de la muestra para análisis microbiológico son:

1) Las muestras que se tomarán para el análisis deben ser representativas para
poder determinar así su calidad microbiológica. Hay normas para la toma de
muestras de aguas según sus distintas procedencias (grifos, pozos, depósitos,
lagos, ríos, manantiales, etc.). se utilizarán frascos con capacidad de 250 a 300
ml, de plástico o vidrio, esterilizados, con tapa hermética y en lo posible de boca
ancha. También pueden utilizarse bolsas especiales de polietileno estériles
(fabricadas a tal fin), considerando que este tipo de envase es muy cómodo para
la recolección y cerrado. El volumen mínimo de muestra será de 500 mL. En el
caso de aguas envasadas se debería tomar una muestra estadísticamente
representativa, siendo el volumen mínimo para cada muestra de 1 litro.

2) Rotular el envase o verificar que el rótulo sea el correcto. Al momento de

muestreo es necesario aclarar como mínimo, la siguiente información: •
Identificación de la muestra (nombre, código, etc.) • Identificación del sitio de
muestreo (georreferenciación: latitud, longitud) • Tipo de fuente y características
de la misma (pozo calzado, perforación, canal, río, represa, aljibe, profundidad del
nivel estático y total si fuera pozo o perforación, diámetro de la perforación o pozo,
cercanía a pozos negros o industrias, existencia de pozos abandonados, etc.) •
Destino (consumo humano, animal, riego, etc.). • Información acerca del
Establecimiento y nombre del Propietario o Encargado (con datos de dirección, e-
mail y/o TE) donde se ha muestreado e información adicional acerca de problemas
que detecta el personal que puede atribuirse al agua, volumen diario que se extrae
normalmente o algún dato indirecto que permita el cálculo (cantidad de personas,
cantidad y tipo de animales que abrevan, superficie de riego). • Condiciones de

11
muestreo (fecha y hora). • Nombre de quien realizó el muestreo. • Tipo de análisis
a efectuar (microbiológico). • Reactivo empleado para su preservación, en caso de
ser utilizado. • si es natural o está sometida a algún tratamiento de depuración
•Cualquier otra observación que se considere de importancia.

3) Si el grifo, canilla o caño es metálico quemar con un mechero donde sale el
agua (si el material es plástico realizar el mismo procedimiento, pero a un menor
tiempo para que no se deteriore el material plástico), luego abrir el grifo, canilla o
activar el mecanismo de bombeo y dejar salir el agua el tiempo suficiente hasta
que se esté seguro de que es agua de la fuente de agua o depósito, de manera
que el chorro no sea intenso.  Lagos y ríos: A la hora de seleccionar las
localizaciones exactas de muestreo se debería tener en cuenta las variaciones
estacionales, así como la estratificación vertical del agua de los lagos y la mezcla
de las aguas de río, profundidad, caudal y distancia a la orilla. La muestra se
tomará lo más lejos posible de la orilla, procurando no remover el fondo y evitando
los remansos y zonas de estancamiento. Para tomar la muestra se sujetará el
frasco por su base en posición invertida (no es necesaria la presencia de
tiosulfato), sumergiéndolo completamente y dándole la vuelta en sentido contrario
a la corriente (río) o desplazándolo horizontalmente en la dirección de la boca del
frasco (lago).  Manantiales naturales o fuentes de caudal continuo: Se tomará
directamente sin adoptar medidas especiales de drenaje.  Bocas de riego: Se
utilizarán acoplamientos especiales que permitan operar como en el caso del grifo.
 Piscinas: Para el muestreo efectuado después de pasar los filtros o en las
tuberías de alimentación de las piscinas, deben estar previstos grifos específicos
para muestreo, que deben estar soldados muy próximos a la propia tubería, para
evitar estancamientos.

4) Cuando se estime probable que el agua a analizar contenga trazas de cloro,

cloramina u ozono, será necesario neutralizar su efecto bactericida en el momento
del muestreo. Para ello se añadirá una cantidad suficiente de tiosulfato sódico.

12
Para un volumen de 250 ml son suficientes 0,2 ml de una solución acuosa al 3%
de tiosulfato sódico.

5) Abrir el recipiente estéril, evitando todo contacto de los dedos con la boca e
interior del mismo y sosteniendo la tapa de manera que ésta mire para abajo.

6) Llenar el frasco dejando una cámara de aire. Durante el llenado es conveniente

tener la precaución de mantener el frasco inclinado a 45° para evitar la
introducción de partículas externas.

7) Tapar inmediatamente asegurando un cierre perfecto.

8) Es conveniente realizar el análisis antes de transcurridas seis horas desde la

toma de muestra; siendo este tiempo el exigible ante cualquier reclamación legal,
sin embargo, la muestra debe ser guardada en una conservadora oscura y con
hielo bien limpia y que no contenga otros elementos propios del muestreo, o en la
parte de abajo de una heladera. Nunca poner la muestra en la hielera o en un
freezer. En cualquier caso, también el mecanismo de conservación (conservadora,
heladera) debe tener la mayor higiene posible y en el caso de la conservadora es
indispensable no guardar otros elementos allí (comidas, bebidas, etc.).

9) Trasladarla lo más pronto posible a Laboratorio (tiempo máximo 24 horas y

correctamente refrigerada en lugar oscuro). Ideal es llegar al Laboratorio en unas
pocas horas y de lunes a miércoles.

Es indispensable que la muestra se mantenga refrigerada hasta su arribo al

laboratorio, ya que tanto las temperaturas mayores a 6ºC, como la luz provocan la
multiplicación de los microorganismos e invalidan la muestra dado que los
resultados no reflejarán la realidad. Siempre es conveniente tomar la muestra y
transportarla los primeros días de la semana (hasta el miércoles en lo posible, sino
consensuar previamente con el Personal del Laboratorio), previendo feriados o
días no laborables, ya que, si se requiriera análisis microbiológico, una vez en el
Laboratorio son necesarias por los menos 48 hrs para realizar los cultivos. En
caso de demorarse el envío, se guarda en la heladera en la parte de abajo, pero

13
no es conveniente que pase más de dos (2) días. En cualquier caso, debe evitarse
el congelamiento de la muestra (el lugar correcto para conservar las muestras que
no se hayan podido entregar al laboratorio es en la parte inferior de una heladera
común). En resumen, tres (3) cosas afectan a los organismos vivos en una
muestra para análisis microbiológico: − las temperaturas por arriba de los 6°C − la
luminosidad − las temperaturas de congelamiento. Las dos primeras cosas hacen
que esos organismos se multipliquen y la muestra no sea válida y de resultados
que no reflejen la realidad. La tercera hace que se mueran y de un resultado de no
contaminación cuando sí puede haberla. Las muestras para análisis
microbiológico se deberán efectuar de manera separada a las destinadas para
análisis fisicoquímico, tanto en el tipo de recipiente, como en su conservación y en
el tiempo de envío a Laboratorio. Hay que guardar las muestras para análisis
microbiológico en un ambiente lo más limpio posible. La limpieza de los vehículos
es importante para evitar problemas de contaminación. Nunca hay que exponer
las muestras al sol, guardarlas en lugar fresco y trasladarlas sin demoras al
Laboratorio, si es posible el mismo día del muestreo asegurando la correcta
identificación de las muestras.

3.3 BACTERIAS COLIFORMES

FUNDAMENTO

Los coliformes reagrupan ciertas especies bacterianas pertenecientes a la familia

Enterobacteriaceae, de morfología bacilar, Gram negativas, aerobias o anaerobias
facultativas, oxidasa negativa, no esporuladas y que fermentan la lactosa con
producción de ácido a 37ºC en 24-48 horas. Del grupo coliformes forman parte
varios géneros: Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter.

- Escherichia coli produce dolor abdominal, diarrea, náuseas, vómitos y fiebre.

- Klebsiella produce enfermedades respiratorias.

14
- Citrobacter produce alteraciones a nivel del colon y a nivel intestinal (Obón, s.f,
p.9).

MÉTODO

El método consiste en desarrollar solo una prueba presuntiva en el que una

reacción negativa excluye la presencia del grupo coliforme (Obón, s.f, p.9).

PROCEDIMIENTO.

Inocular caldo de peptona con diluciones decimales de la muestra de agua,

expresados en 10-1, 10-2, 10-3. Inocular 3 tubos de lactosa bilis verde brillante (a
los que se les añade un tubo de Durham invertido) con 1 ml de cada dilución.
Incubar a 37ºC (+/-1ºC) durante 24 o 48h (Obón, s.f, p. 10).

LECTURA E INTERPRETACIÓN.

Si se observa crecimiento bacteriano con producción de gas las 24h o antes, la

presencia de bacterias coliformes fecales se considerará confirmada, prosiguiendo
con el método del filtro de membrana para conteo (Obón, s.f, p. 10).

3.4 COLIFORMES FECALES

FUNDAMENTO

E. coli: Escherichia coli: Bacilo gram negativo, capaz de desarrollarse en presencia

de sales biliares u otros agentes (tensoactivos) que tengan propiedades similares
e inhibitorias del crecimiento y que son capaces de fermentar la lactosa a
temperaturas de 35°C +/- 2°C, con producción de ácido, gas y aldehído en un
lapso de 18 a 48 horas. Oxidasa negativa, no esporógena y reduce el nitrato a
nitrito. También es capaz de producir indol a partir de triptófano a una temperatura

15
de 44°c +-05 en un tiempo de 21+/- 3 horas. Poseen la enzima B-glucoronidasa, la
cual es detectada por medios cromógenos o fluorógenos (Navarro, 2007).

LIMITACIONES E INTERFERENCIAS

Las interferencias en análisis microbiológico se refieren a posibles falsos positivos

o negativos, que se pueden presentar por un lavado de material ineficiente, fallas
en el proceso de esterilización de material, ambientes contaminados que afecten
las muestras, procedimientos inadecuados de la siembra, fallas en la toma y
transporte de la muestra (Navarro, 2007).

TOMA DE MUESTRA Y ALMACENAMIENTO.

El recipiente requerido es botellas de vidrio, esterilizables con capacidad no menor

a 100 mL con preservante (tiosulfato de sodio y/o EDTA) si lo requiere. El volumen
mínimo para análisis microbiológico es de 100 mL.

Consideraciones para la preservación de muestras microbiológicas:

Decloración: la cantidad del declorante que debe adicionar a las muestras de

agua potable es 0.63 mL de la solución de tiosulfato de sodio al 0.025 N para un
volumen de muestra de 500 mL, este podrá neutralizar hasta 5 mg/L de cloro
residual. En muestras residuales tratadas con cloro la cantidad es de 0,1 mg/L de
una solución de tiosulfato de sodio al 10% para un volumen de muestra de 120
mL, esta cantidad podrá neutralizar hasta 15 mg/L de cloro residual. Esterilizar las
botellas de muestras más tiosulfato de sodio a 121° C por 15 minutos a 15 psi.

Agente quelante: En muestras de agua de alto contenido de cobre o zinc o níquel

mayor a 0.1 mg/L se debe utilizar un agente quelante como el EDTA (ácido
etilendiamino tetracético) que reduzca la toxicidad del metal, la cantidad debe ser
de 0.3 mL de EDTA al 15% para un volumen de muestra de 120 mL, esto es
especialmente importante cuando el tiempo de transporte de las muestras es
mayor a 4 horas (navarro, 2007).

16
MEDIDAS DE SEGURIDAD

Según navarro (2007), las medidas de seguridad en el área de microbiología para

las actividades de Análisis y Lectura son:

 Hacer las resiembras de las cepas con mucho cuidado, manipúlelas con todos
los elementos de seguridad del caso.

 Realizar todos los procedimientos evitando al máximo la formación de aerosoles.

Cubrir las zonas de trabajo con papel absorbente, siempre que exista riesgo de
derrame de material peligroso.

 En caso de derrame de algún material, cubrir la zona con un desinfectante

(hipoclorito de sodio al 2%) de 15 a 30 minutos antes de limpiar.

 Evitar abrir las cajas de Petri, incluso las de mesófilos si no se tiene tapabocas,
pueden provocar infección por inhalación.

 Evitar movimientos bruscos o innecesarios ya que puede ocasionar derrame

infeccioso

 Evitar tener contacto con superficies no estériles cuando se esté sembrando o

cuando se tengan guantes.

 Mantener cerradas las puertas del área de microbiología mientras se está

sembrando.

 Evitar el paso de personal ajeno por el área de microbiología mientras se

siembra.

MÉTODO

Método de filtración de membrana es el mecanismo mediante el cual se atrapan

en la superficie de la membrana microorganismos cuyo tamaño es mayor que el
tamaño del poro 0.45 µm, esto gracias a que una bomba eléctrica ejerce una

17
presión diferencial sobre la muestra de agua haciendo que se filtre. Los
contaminantes de tamaño menor que el específico del poro atraviesan la
membrana o se quedan retenidos en su interior, las bacterias quedan en la
superficie de la membrana y luego está es llevada a un medio de lactosa
enriquecido selectivo (agar de lactosa TTC con heptadecilsulfato de sodio) a una
temperatura de 44,5ºC (+/-0,2ºC) en el cual se promueve el crecimiento y la
identificación (navarro, 2007)

PROCEDIMIENTO

Colocar un filtro de membrana estéril sobre el soporte de filtración. Adaptar el

embudo y conectar el matraz a una bomba eléctrica de vacío. Filtrar 100 ml de
muestra si se trata de agua potable, y 0,1 - 1 ml si se trata de aguas no potables,
previamente homogeneizadas. Lavar con unos 30 ml de agua destilada. Retirar el
embudo. Mediante las pinzas esterilizadas, transferir la membrana filtrante sobre
el medio de cultivo contenido en una placa de Petri, de modo que la superficie de
filtración quede hacia arriba. Cerrar e invertir la placa e incubar a 44ºC (+/-1ºC)
durante 24h (+/-2h) (Obón, s.f.).

LECTURA E INTERPRETACIÓN

El medio de cultivo contiene el sustrato Salmon GAL – 6 cloro – 3 indol y βD

galactopiranosido es un sustrato cromogénico que es usado para la detección de
la enzima galactosidasa de colonias bacterianas en un ensayo colorimétrico; que
da como resultado el cambio de la colonia a un color rojo salmón. Esta reacción se
observa cuando hay coliformes totales. Para diferenciar la E. Coli de los coliformes
totales se hace por medio del sustrato cromogénico X-Glucorósido, que reacciona
con la enzima glucoronidasa, pero estas también reaccionan con el Sustrato
Salmón- GAL produciendo un color azul - violeta en la colonia. El resultado se
informa en UFC/100 mL (Unidades formadoras de colonias) por 100 mL Los
Coliformes totales incluyen todas las colonias tanto las de color rojo salmón

18
(coliformes totales) más las de color violeta o azul (E.coli) y se multiplica por el
inverso de la dilución analizada. Para E.coli, se cuentan solamente las colonias de
color violeta o azul, se multiplica por el inverso de la dilución analizada (navarro,
2013).

La densidad se estima como el total de coliformes totales por 100ml, utilizando

aquellos filtros de membrana que tengan 20-80 colonias de coliformes y no más
de 200 (Obón, s.f.).

3.5 ESTREPTOCOCOS FECALES

FUNDAMENTO

Los estreptococos fecales pueden considerarse como indicadores de

contaminación fecal. Sin embargo, algunos enterococos presentes en las aguas
pueden proceder de otros hábitats. Se pueden detectar y cuantificar las especies:
Enterococcus fecales, E. faecium, E. durans y E. hirae. Además, pueden
determinarse ocasionalmente otras especies de Enterococcus y algunas especies
de Streptococcus (en particular S. bovis y S. equinus). Estas especies de
Streptococcus no tienen una supervivencia larga en agua y probablemente no
puedan determinarse cuantitativamente. Como enterococos intestinales se
consideran aquellos microorganismos capaces de reducir el cloruro de 2,3,5-
trifeniltetrazolio (TTC) y de hidrolizar la esculina en las condiciones y sobre unos
medios específicos (Obón, s.f.).

APLICACIÓN

la determinación de estreptococos fecales en aguas naturales superficiales o

subterráneas, aguas recreacionales y aguas residuales, filtrando un volumen
determinado de la muestra y obteniéndose resultados en 48 horas (pistone, s.f.).

INTERFERENCIAS

19
Aguas con gran turbidez; presencia de tóxicos orgánicos como fenoles; existencia
de una carga bacteriana muy grande de otros microorganismos.

MÉTODO

El grupo de estreptococos fecales para la técnica de filtración por membrana se

define como todos los cocos gram positivos que desarrollan colonias de color rojo
claro y rojo oscuro cuando se incuban en medio Agar Enterococcus para
estreptococos fecales por 48 hs a 35 ± 0.5 oC. El principio de esta técnica consiste
en la filtración de un volumen conocido de muestra a través de una membrana de
nitrato de celulosa y su incubación en un medio de cultivo selectivo a 35 ± 0.5 oC
por 48 horas. La fermentación de carbohidratos presentes en el medio, con el
azido de sodio como agente selectivo, inhibiendo las bacterias gram negativas, y
el cloruro trifenil tetrazolio hace que las colonias positivas presenten un color rojo
oscuro como resultado de la reducción tetrazólica a un azocolorante ácido
(Pistone, s.f.).

MEDIDAS DE SEGURIDAD

El análisis y el recuento deben ser realizados utilizando guantes descartables y

túnica a fin de evitar el riesgo de contraer enfermedades (Pistone, s.f.).

INSTRUMENTAL Y MATERIALES

 Equipo de filtración: embudo y portafiltro poroso que se puedan trabar entre

sí y sean autoclavables; bomba de vacío; kitasato de 1 litro o mayor; trampa
de agua entre el kitasato y la bomba de vacío.
 Balanzas de precisión
 Incubadora a 35 ± 0.5oC.
 Equipo de recuento: microscopio binocular con un aumento de 10 a 15X y
una fuente de luz fluorescente posicionada formando un ángulo de 60-80oC
con la placa (de preferencia).

20
  Autoclave
 Mecheros
 Placas de Petri estériles, de plástico descartables (o de vidrio) de 47 mm de
diámetro aproximadamente u otro tamaño adecuado.
 Filtros de nitrocelulosa cuadriculados estériles de 0.45μm ± 0.02μm de
diámetro de poro, libre de glicerina y sin áreas hidrofóbicas, de 47 mm de
diámetro.
 Pinzas de acero inoxidable para filtros, sin extremidades rugosas.
 Tubos de ensayo de vidrio estériles para diluciones con tapa de algodón o
de rosca.
 Pipetas automáticas de 1000 μL y de rango variable (1-10mL,), y punteros
estériles para cada una de las pipetas automáticas.
 Material de vidrio estéril para preparación del medio de cultivo.
 Termómetros calibrados para controlar la temperatura de la incubadora.
 Heladera a 1-4.4oC.
 Cámara de Flujo Laminar (de preferencia)
 Microondas (de preferencia)
 Cinta de revelado de autoclave (pistone, s.f.).

REACTIVOS

 Peptona.
 Etanol.
 Medio de cultivo m- Enterococcus.
 Agar.
 Agua destilada (pistone, s.f.).

PROCEDIMIENTO

21
 El volumen de muestra a ser filtrado se determina de acuerdo con la
densidad bacteriana esperada y el origen de la muestra. En caso de ser
necesario se preparan diluciones en cascada en los tubos de dilución,
adicionando 1mL de muestra o de la dilución previa, a los 9 mL de agua
peptonada. Se recomienda filtrar 2 volúmenes diferentes de muestra en
múltiplo de 10. Si no se dispone de valores históricos de la muestra se
recomienda filtran tres volúmenes diferentes.
 Conectar el equipo de filtración con el embudo estéril. Colocar un filtro de
nitrocelulosa estéril con la superficie cuadriculada hacia arriba sobre el
porta filtros poroso del embudo utilizando pinzas humedecidas en alcohol,
flambeadas y a temperatura ambiente.
 Filtrar un volumen aproximado a 10 mL de agua peptonada estéril para
humedecer el filtro.
 Homogeneizar la muestra agitándola o usando el vortex (si se hicieron
diluciones en tubos) y filtrar el volumen seleccionado.
 Luego enjuagar el embudo filtrando aproximadamente 10 mL de agua
peptonada estéril. Retirar el filtro con pinzas estériles y colocarlo en la placa
de Petri sobre el medio, con la parte cuadriculada hacia arriba, evitando la
formación de burbujas de aire, pasar suavemente la pinza por el borde del
filtro para sacar el aire. No tocar con la pinza el área de filtración del filtro ya
que se arrastran células bacterianas. Asegurarse de que todo el filtro quede
en contacto con el medio de cultivo. Cerrar la placa y colocarla en la
mesada para luego ser incubada.
 Luego de filtrar cada muestra descontaminar los embudos
humedeciéndolos con alcohol y flambeándolos. Una vez que el alcohol se
consume hacer pasar suficiente agua peptonada estéril para lavar el
sistema y enfriarlo más rápidamente.
 Si el volumen a filtrar es poco (1 mL) colocar en el embudo
aproximadamente 10 mL de agua peptonada estéril y luego la muestra,

22
 para lograr una mejor distribución de la misma sobre la membrana al ser
filtrada.
 Siempre comenzar la serie de filtración por la dilución mayor para no
contaminar el embudo.
 Incubar las placas de Petri en posición invertida, en la estufa de 35 ± 0.5oC
durante 48 horas. (pistone, s.f.).

LECTURA E INTERPRETACIÓN

Las colonias típicas de estreptococos fecales son aquellas que desarrollan un

color rojo claro u oscuro. El recuento de colonias se realiza en las placas que
contengan entre 20 y 60 colonias de estreptococos fecales y no más de 200
colonias de cualquier tipo (pistone, s.f).

Si hay colonias típicas se realizará un ensayo confirmativo. Para ello, con ayuda
de unas pinzas estériles, se transfiere el filtro de membrana con las colonias, sin
invertirla, sobre una placa con agar bilis-esculinaazida, precalentada a 44ºC. Se
incuba a 44ºC durante 2h y se lee la placa inmediatamente. En este medio, los
enterococos hidrolizan la esculina dando origen a esculetina (6,7-dihidrocumarina)
que se combina con los iones Fe3+ formando un compuesto de color marrón a
negro. Por tanto, se considera que todas las colonias típicas que muestren un
color de marrón a negro, en el medio circundante, dan reacción positiva y se
cuentan como enterococos (Obón, s.f).

La ecuación que se emplea es la siguiente:

Estrep. Fecales (UFC/100mL) = colonias de estreptococos fecales contadas x

100/mL de muestra filtrados. (Pistone, s.f).

Si las colonias crecen uniéndose sobre la membrana se informa como crecimiento

confluente con o sin presencia de estreptococos fecales y se sugiere la realización
de otro muestreo del mismo punto (Pistone, s.f).

23
Si el número de colonias típicas de estreptococos fecales fuera entre 20 y 60 pero
la placa posee más de 200 colonias de cualquier tipo, se informa como mayor al
recuento realizado y se aconseja la realización de otro muestreo en ese punto
(Pistone, s.f).

Si el número de colonias típicas es mayor a 60, el recuento se realiza siguiendo

algunos de los procedimientos que se detallan a continuación y se informa como
valor estimado:

• Dividir la placa en 4 cuadrantes, contar en uno, multiplicar por cuatro.

• Contar 10 cuadrados del filtro al azar, promediar, multiplicar por el número total
de cuadrados del filtro (Pistone, s.f).

Si el recuento es cero, hay dos casos a considerar:

• Cuando el volumen filtrado es de 100 mL, se informa <1 ufc/100 mL.

• Cuando el volumen filtrado es menor 100 mL, considerar 1 ufc en el mayor

volumen filtrado, calcular la densidad de estreptococos fecales, y expresar los
resultados como < valor obtenido (Pistone, s.f).

Si el número de colonia a contar es menor a 20 se suman los recuentos y se

divide entre la suma de los volúmenes filtrados y se multiplica por 100. El
resultado se expresa como ufc/100ml (Pistone, s.f).

3.6 CLOSTRIDIUM SULFITO REDUCTOR

FUNDAMENTO

Clostridium sulfito reductor: Son aquellas bacterias de morfología bacilar gram

positiva, anaerobias estrictas, capaces de formar esporas y con capacidad de
reducir el sulfito a sulfuro. Son colonizadores habituales del intestino humano y de
algunos animales. Esta cualidad unidad a la alta resistencia de sus esporas le dan

24
valor como indicadores de contaminación fecal de carácter no reciente tanto en
agua como en alimentos (Obón, s.f).

MÉTODO

Se utiliza de método de filtración para la determinación del número de C.

perfringens mediante filtración de un volumen determinado del agua a analizar a
través de filtros de membrana e incubación de los mismos sobre medios de cultivo
a temperaturas adecuada (Obón, s.f).

PROCEDIMIENTO

Siguiendo el método de filtración, se filtran 100 ml del agua a analizar,

previamente homogeneizado. Se coloca el filtro de membrana sobre el medio de
m-CP y se incuban las placas a 44ºC durante 24 h en condiciones de anaerobiosis
(Obón, s.f).

LECTURA E INTERPRETACIÓN

Tras la incubación, se consideran como colonias típicas de C. perfringens todas

las que muestren un color amarillo opaco, consecuencia de la acidificación del
medio tras la fermentación de la sacarosa, y que cambien a color rosa o rojo al
cabo de 20 a 30 segundos de exposición a vapores de hidróxido amónico. En
general, el resto de las especies de Clostridium aparecen de color azul-verdoso si,
además de fermentar la sacarosa, son β-D-glucosidasa positivas (hidrolizan el
indoxil-β-D-glucósido) o de color púrpura si no fermentan la sacarosa. NOTA:
Aunque no está incluido en la Normativa se realizará una tinción de Gram de una
de las colonias positivas para observar al microscopio (Obón, s.f).

25
3.7 BACTERIAS AEROBIAS

FUNDAMENTO

Las bacterias aerobias son todas las bacterias heterótrofas, aerobias o anaerobias
facultativas, mesófilas y psicotróficas capaces de crecer en un medio de agar
nutritivo. Este recuento de colonias es útil para evaluar el estado de los recursos
de agua en su origen y la eficacia del proceso de tratamiento de las aguas
destinadas al consumo humano e indica la limpieza y el estado de los sistemas de
distribución. De igual modo, permite detectar cambios anómalos en el número de
microorganismos en la red de distribución. Así, todo aumento repentino del
número obtenido puede advertir de la existencia de un foco de contaminación y
requeriría su inmediata investigación (Obón, s.f)

MÉTODO

Este método se basa en contar el nº de colonias desarrolladas en una placa de

medio de cultivo sólido, en el que se ha sembrado un volumen conocido de agua
muestra, transcurrido un tiempo y una temperatura de incubación determinados.

MATERIALES

 Placas de Petri
 Pipetas estériles
 Agua peptonada
 Agar (Obón, s.f).

PROCEDIMIENTO

Preparar 3 tubos con 9 ml de agua peptonada cada uno. Inocular el caldo de

peptona con diluciones decimales de la muestra de agua problema expresados en
10-1, 10-2, 10-3. De cada dilución depositar 1 ml en cada placa de Petri. Verter 30
ml de medio de cultivo de agar en cada placa y dejar solidificar (5-10min), invertir
las placas y meterlas en la estufa a 37ºC (+/-1ºC), incubar durante 48h. También

26
se emplean placas con medio agar extracto de levadura en las que se siembra un
volumen conocido de agua, y la incubación se lleva a cabo a 22ºC durante 72
horas (Obón, s.f).

LECTURA Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS

Transcurridos 48h (+/-3h) contar todas las colonias desarrolladas en cada placa.
El resultado se expresará, como nº de bacterias totales en 1 ml. Se estima
utilizando aquellos filtros de membrana que tengan 20-80 colonias de coliformes y
no más de 200 (Obón, s.f).

27
 4. CONCLUSIONES

Gracias a los conocimientos adquiridos durante este trabajo, se puede concluir

que:

 El análisis del agua es indispensable ya que un inadecuado tratamiento

puede traer consigo daños en la salud humana inclusive la muerte, debido a
microorganismos provenientes especialmente de materia fecal de humanos
y animales.
 La turbidez, temperatura, acidez, salobridad, oxígeno disuelto y cantidad de
materia influyen en la formación y reproducción de microorganismos en el
agua.
 Para realizar un adecuado muestreo es necesario tener en cuenta en
primer lugar la higiene y esterilización de recipientes, y no pasar por alto
que debe ser una muestra representativa. Además de esto, es muy
relevante su conservación, la temperatura debe ser de 2 a 6°C y no se
puede permitir su congelamiento.
 Es necesario tomar medidas de seguridad al momento de realizar el
análisis microbiológico del agua, ya que se está tratando con bacterias y
cualquier uso inadecuado de los EPP, puede causar daños a la persona
que está manipulando los equipos y muestras.
 El método de filtración por membrana es uno de los más comunes para
determinar los microrganismos en muestras de agua, acompañado de
cultivos selectivos con agar y uso de reactivos para hacer tinciones y de
esta forma contar las colonias de microorganismos.

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 5. REFERENCIAS

 Decreto 1594 de 1984. Ministerio de ambiente, vivienda y desarrollo

territorial. Recuperado de:
https://www.minambiente.gov.co/images/GestionIntegraldelRecursoHidrico/
pdf/normativa/Res_2115_de_2007.pdf
 Decreto 1594 de 1984. Ministerio de ambiente, vivienda y desarrollo
territorial. Características microbiológicas [tabla]. Recuperado de:
https://www.minambiente.gov.co/images/GestionIntegraldelRecursoHidrico/
pdf/normativa/Res_2115_de_2007.pdf.
 Navarro, M. (2007, 30 de agosto). determinación de escherichia coli y
coliformes totales en agua por el método de filtración por membrana en
agar chromocult. Recuperado de:
http://www.ideam.gov.co/documents/14691/38155/Coliformes+totales+y+E.
+coli+en+Agua+Filtraci%C3%B3n+por+Membrana.pdf/5414795c-370e-
48ef-9818-ec54a0f01174
 Obón, J. (s.f). Análisis microbiológico del agua. Universidad politécnica de
Cartagena, Colombia. Recuperado de:
https://www.upct.es/~minaeees/analisis_microbiologico_aguas.pdf
 Obón, J. (s.f). Análisis microbiológico del agua. [tabla]. Recuperado de:
https://www.upct.es/~minaeees/analisis_microbiologico_aguas.pdf
 Pistone, G. (s.f). Determinación de Estreptococos Fecales en aguas
naturales superficiales o subterráneas, aguas recreacionales y aguas
residuales. Técnica de filtración por membrana. Recuperado de:
https://docs.google.com/document/d/1YffDaQhazBv8L7AVXhZjbIqoCyW6g2
BSUTR2O2b1G9U/edit
 Resolución 2115 del 2007. Ministerio de ambiente, vivienda y desarrollo
territorial. Recuperado de:
https://www.minambiente.gov.co/images/GestionIntegraldelRecursoHidrico/
pdf/Legislaci%C3%B3n_del_agua/Resoluci%C3%B3n_2115.pdf

29
 Instituto nacional de tecnología agropecuaria. (2011). Protocolo de
Muestreo, Transporte y Conservación de Muestras de Agua con Fines
Múltiples (consumo humano, abrevado animal y riego). Recuperado de:
https://inta.gob.ar/sites/default/files/script-tmp-
protocolo_de_muestreo_de_aguas_inta.pdf

 Sardiñas, O., Novo, M., Chiroles… Pérez, A. (2006). valuación fisicoquímica

y microbiológica del agua de la presa El Cacao (Cotorro, Cuba).
Recuperado de: http://salud-
publica.es/secciones/revista/revistaspdf/bc51015aa031684_Hig.Sanid.Ambi
ent.6.202-206(2006).pdf
 Venegas C, Mercado M, Campos C. (2014). Evaluación de la calidad
microbiológica del agua para consumo y del agua residual en una población
de Bogotá (Colombia). Recuperado de:
http://vip.ucaldas.edu.co/biosalud/downloads/Biosalud13(2)_3.pdf

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