FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS

FORMATO PARA LA GUIA DE PRACTICAS

PARA LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA
Natali Poveda, Gabriela Quizhpe, Jorge Saquicela,
Fabiana Vsquez
Dra. Mariana Sa Cruz
Ciclo: Dcimo, Grupo: 4A
Asignatura: Prctica-Anlisis Microbiolgico,
Cuenca Ecuador

Pgina: 1 de
11
Vigencia
desde: Marzo
2016
Fecha de
entrega:
13/diciembre/2
016

PRCTICA No. 11
1. TTULO: Determinacin de coliformes y E. coli por la tcnica de
filtracin de membrana.
2. OBJETIVOS:
GENERAL:
-

Realizar el control microbiolgico del agua, utilizando la tcnica de la

membrana filtrante.

ESPECFICOS:
-

Adquirir conocimiento de la tcnica de filtracin de membrana para el

anlisis microbiolgico del agua.

Aprender las tcnicas de preparacin de diferentes medios de cultivo,

como el de Chromocult.

Evaluar la calidad microbiolgica del tipo de agua seleccionado.

Comparar con norma correspondiente en relacin a coliformes y E.

coli para el tipo de agua analizado.

3. LOGROS DE APRENDIZAJE VINCULADOS:

Aplicar y ejecutar las tcnicas del anlisis microbiolgico de los
alimentos utilizando las normas NTE INEN y otras relativas al control de
los alimentos.

4.

MARCO TEORICO:

Marco terico:
El agua es un alimento esencial y es indispensable para la vida. Interviene
en nuestra alimentacin y en la preparacin de alimentos y constituye un
vector importante en la transmisin de microbios peligrosos. (Pascual
Anderson & Caldern y Pascual, 2000)
Segn su uso alimentario, existen 2 tipos de agua: los de consumo y las no
destinadas a consumo. El primer grupo abarca la de distribucin pblica o

potable, la de captacin individual o de pozo o fuente, y las aguas

envasadas. El segundo grupo abarca las de riego de material, las recicladas,
entre otros. (OPS & OMS, 1985; Pascual Anderson & Caldern y Pascual,
2000)
Las aguas potables reciben tratamientos previos para mejorar su calidad
(requisitos muy controlados). Mientras que las de captacin individual son
fuentes, generalmente en zonas rurales, que abastece casas de campo o
industrias que no reciben agua de distribucin pblicas. Tanto el agua de
alimentacin como la destinada para uso en industria deben ser controladas
microbiolgicamente. Los microorganismos, con frecuencia patgenos
corresponde a los de origen animal o humano y son esencialmente
enterobacterias.(Pascual Anderson & Caldern y Pascual, 2000)
La calidad microbiolgica del agua potable es una preocupacin para los
consumidores, proveedores de agua, reguladores y autoridades de salud
pblica. El potencial del agua potable para transportar patgenos
microbianos a un gran nmero de personas, causando enfermedades
posteriores, est bien documentado en pases en todos los niveles de
desarrollo econmico. (OECD & World Health Organization, 2003; OPS &
OMS, 1985)
Puesto que el consumo humano de aguas sanitarimente permisibles es
considerado por definicin, como excepcional, cuando por falta de un
abastecimiento adecuado o por situacin anormal de un abastecimiento que
habitualmente suministra agua potable, se prevea el suministro temporal de
aguas sanitariamente permisibles, este suministro temporal de aguas
sanitariamente permisibles, deber ser autorizado y se impondr las
medidas sanitarias correctoras pertinentes.(OECD & World Health
Organization, 2003)
Idealmente, el agua para consumo debe estar libre de microorganismos
patgenos y deben estar libres de bacterias indicadoras de contaminacin
fecal. El primer indicador es el grupo de los coliformes, que pueden o no ser
de origen fecal. La determinacin de E. coli brinda una evidencia definitiva
de contaminacin fecal. El papel tradicional de los parmetros indicadores
en el agua potable era un ndice de contaminacin fecal y, por lo tanto,
riesgo probable para la salud. Los parmetros microbianos originales fueron
todas las bacterias que, en mayor o menor grado, se derivaron de la
contaminacin fecal. Sin embargo, la enfermedad fecal-oral no slo es
causada por bacterias entricas sino que puede ser el resultado de una
infeccin por virus patgenos o protozoos. Las funciones del concepto de
indicador se estn expandiendo gradualmente, al igual que el nmero de
posibles parmetros indicadores.(OECD & World Health Organization, 2003)
Un factor limitante fundamental en la evaluacin de la calidad microbiana
de las aguas, y especialmente del agua potable, es a menudo el nmero
muy bajo de cada organismo presente. Por lo tanto, es importante sealar
que la mayora de procedimientos microbiolgicos consisten en:
concentracin / enriquecimiento, deteccin y cuantificacin (Fig. 1). (Kster
et al., 2003)

Fig 1. Ejemplos de pasos en los mtodos para anlisis de microorganismos

en agua. De (Kster et al., 2003)

Se pueden usar dos mtodos principales para analizar estos indicadores en

el agua: la tcnica de fermentacin en tubos mltiples y la de filtracin de
membrana. La segunda proporciona un mtodo mucho ms rpido y
aplicable en cualquier sitio, y su limitante es que solo es aplicable cuando
no hay particulados en el agua. (Kster et al., 2003)
El principio del mtodo de filtracin de membrana es que proporciona un
conteo directo de coliformes (u otros microorganismos dependiendo del fin
del anlisis) por medio de la filtracin del agua mediante un vaco por medio
de una membrabna de poro conocido (generalmente 0,45um), as
manteniendo a las bacterias retenidas en la superficie de la membrana, la
cual es posteriormente colocada en un medio selectivo e incubado, para
posterior recuento e identificacin. (Bartram & Ballance, 1996)
Dependiendo del origen del agua, se necesitar una dilucin mayor o menor
de la muestra. El medio selectivo seleccionado por las normas ISO para este
mtodo es el Chromocult. Este medio permite el crecimiento selectivo de
coliformes, as como la coloracin de las colonias a travs del uso de
sustratos especficos que reaccionan ms con las enzimas propias de las
bacterias (ms en Procedimiento y en Anexo 1) (Merck Millipore, 2014)
Una de las maneras ms efectivas en contra de microorganismos (en
especial los bacterianos) es el uso del cloro. El cloro es un desinfectante
efectivo, disponible y relativamente barato.
Las normas INEN proporcionan requisitos detallados para el agua potable
(Figura 2); no obstante, no se establecen normas detalladas regionales para
otros tipo de agua como de pozo que son generalmente sanitariamente
permisibles, especialmente en zonas rurales. Se considera el Real Decreto
1423/1982 como criterio microbiolgico de aceptacin de aguas de
consumos no potables. (Figura 3) (BOE, 1982; INEN, 2011)

Figura 2. Requisitos microbiolgicos del agua potable. De (INEN, 2011)

Figura 3. Criterios para aguas de consumo no potables. De: (BOE, 1982)

5. MATERIALES:
Materiales y Reactivos:
MATERIALES
-

Muestra: agua de
Cajas
Petri
pequea.
Pipetas
Membranas
filtrantes
de
0,45um
de
tamao de poro.

EQUIPOS
-

6. PROCEDIMIENTO

Balanza
Contador
de
colonias
Estufa
Equipo de filtracin
de membrana

REACTIVOS
-

Agua de peptona
0,1% estril o agua
esterilizada
Agar Chromocult

7. DATOS A REGISTRAR
Volumen de agua
Tamao de poro
Recuento en Chromocult

100ml
0,45um
15 UFC color rosa (Fig 4)

8. RESULTADOS
Coliformes totales: 15 UFC/100ml

9. CONCLUSIONES Y DISCUSIONES
El recuento en agua de pozo de Paute se realiz obtenindose
un valor de 15 UFC/100ml para coliformes totales, descartando la
presencia de E.coli, por la coloracin meramente rosada de las
colonias (especificidad del medio Chromocult).
Al tratarse de un agua de origen rural no potable, pero an
consumida por la poblacin y en comparacin a las normas
microbiolgicas de agua de consumo no tratadas segn el Real
Decreto Espaol, el agua es rechazada. Es decir que el nivel de
Coliformes totales en la muestra analizada supera los lmites
establecidos
por
esta
norma
internacional
(Mximo
10UFC/100ml).
As se concluye que el agua, no es apto para el consumo humano
dado que representa una posible contaminacin del producto,
as como un posible agente causante de enfermedad. Sin embargo,
se descarta la presencia de E.coli, los mayores indicadores de posible
patogenicidad en muestras de agua, segn la bibliografa.
Como ya se mencion existen muchas bacterias coliformes presentes
en el ambiente (suelo, plantas). Esta podra la razn por la que
contaminaron la muestra y dado que no tuvieron un
tratamiento adecuado (temperatura o cloracin) permanecieron
en el agua analizada. El principal tratamiento a nivel casero que el
agua es el calentamiento, y en algunos casos la cloracin, estos
consisten de mtodos suficiente para destruir la mayora formas
coliformes. A nivel industrial el agua es potabilizada o purificada
para prevenir la aparicin microbiana. El agua analizada no obtuvo
ningn tratamiento previo al anlisis.
El anlisis sugiere que el agua provee las condiciones ptimas que
las bacterias sobrevivan debido a que posee pH adecuado y
actividad acuosa alta.
En cuanto a su almacenamiento en la regin, el agua se encuentra
expuesto y manipulado al ambiente segn lo expuesto por el
recolector, es decir es inadecuado. Esto puede favorecer el
crecimiento de estos microorganismos.

10.

BIBLIOGRAFA

Bartram, J., & Ballance, R. (Eds.). (1996). Water quality

monitoring: a practical guide to the design and implementation
of freshwater quality studies and monitoring programmes (1st
ed). London; New York: United Nations Environment Programme
and the World Health Organization.
BOE. Real Decreto 1423/1982: Reglamentacin Tcnico sanitaria para el abastecimiento y control de calidad de las
aguas potables de consumo pblico., BOE-A-1982-16316 I.
Disposiciones generales 27338-27341 (1982). Recuperado a
partir de https://www.boe.es/diario_boe/txt.php?id=BOE-A-198216316
INEN. (2011). NTE INEN 1108: Agua potable. Requisitos (Norma
Tcnica
Ecuatoriana
No.
1108:2011).
Quito:
Instituto
Ecuatoriano de Normalizacin. Recuperado a partir de
https://law.resource.org/pub/ec/ibr/ec.nte.1108.2011.pdf
Kster, W., Egli, T., Ashbolt, N., Botzenhart, K., Burlion, N., Endo,
T., Rust, A. (2003). Analytical Methods For Microbiological
Water Quality Testing. En OECD & World Health Organization,
Assessing Microbial Safety of Drinking Water Improving
Approaches and Methods: Improving Approaches and Methods.
OECD Publishing.
Merck Millipore. (2014). Chromocult Coliform Agar, de Merck
Millipore, se establece como base para el nuevo estndar de la
ISO.
PR
Newswire.
Recuperado
a
partir
de
http://www.prnewswire.com/news-releases/chromocult-coliformagar-de-merck-millipore-se-establece-como-base-para-el-nuevoestandar-de-la-iso-281447821.html
OECD, & World Health Organization. (2003). Assessing Microbial
Safety of Drinking Water Improving Approaches and Methods:
Improving Approaches and Methods. OECD Publishing.
OPS, & OMS. (1985). Guas para la calidad del agua potable.
Estados Unidos: OPS (Organizacin Panamericana de la Salud).
Pascual Anderson, M. del R., & Caldern y Pascual, V. (2000).
Microbiologa alimentaria: metodologa analtica para alimentos
y bebidas (2da ed.). Madrid: Ediciones Daz de Santos.
Recuperado
a
partir
de
http://public.eblib.com/choice/publicfullrecord.aspx?p=3174278

11.

ANEXOS
MEDIOS DE CULTIVO

FICHA TCNICA DE AGAR CHROMOCULT (DE MILLIPORE MERCK)

Chromocult coliformes Agar
Agar selectivo para la deteccin simultnea de coliformes totales y E. coli en
el agua potable y las muestras de alimentos procesados.
MODO DE USO:
Uso en el mtodo de la membrana filtrante. Filtrar un volumen apropiado de
la muestra (por ejemplo, 100 ml para los municipales agua potable, 250 ml
de agua embotellada, o 1 ml de agua superficial) usando un filtro de
membrana. Coloque el filtro en Chromocult Coliformes Agar asegurando que
no quede aire atrapado debajo. Incubar las placas sembradas en
condiciones aerobias a 35-37 C en posicin invertida durante 24 horas.
Despus de incubacin, examinar las placas de la presencia de colonias
tpicas de E. coli y otros coliformes.
NOTA: El tipo de filtro de membrana afecta al tamao y a la coloracin de
las colonias.
COMPOSICIN

PREPARACIN.
Disolver 26,5 g en 1 litro de agua purificada. Caliente en agua hirviendo y
agite con frecuencia hasta que se disuelva por completo. No esterilizar en
autoclave, no recalentar!
Se enfra el medio a 45 - 50 C y verter en placas. De acuerdo con la norma
EN ISO 9308-1 de dispensacin en placas de Petri a una profundidad de al
menos 4 mm (aproximadamente 18 ml en una placa de 90 mm).
Para poder utilizar por el mtodo de placa de vertido enfriar el medio a 44 47C en un bao de agua antes de su uso.
El medio preparado es ligeramente turbio a turbio y amarillento. El valor de
pH a 25 C est en el intervalo de 6,6-7,0.
No debe haber humedad visible en las placas antes de su uso. Cuando la
humedad est presente, las placas deben secarse durante el tiempo mnimo
requerido para eliminar la humedad visible, siguiendo el procedimiento
como se describe en la norma.

INTERPRETACIN.

DATOS DE RECEPCIN DE LA MUESTRA

IDENTIFICACIN DE LA MUESTRA _______________
Muestra N: 1
Fecha y hora de la toma:
__________________
Registro Sanitario: _NA_
Fecha de Caducidad: _NA_
Marca Comercial: _NA_
Fbrica: _NA_
Direccin del lugar de recoleccin:
CARACTERSTICA ORGANOLPTICAS
Aspecto: Caracterstico Color: NO
Olor: NO
Consistencia: NA Sabor: NA
CONDICIONES DE TRANSPORTE
Al ambiente: X Congelada _________
Refrigerada________
Temperatura a la hora de la toma: 20C
Tipo de Envase: Envase de plstico limpio.
Defectos del envase:__NA__
Ingredientes: NA
Procesos tecnolgicos que ha sufrido: _NA_
Fecha y hora de recepcin en el laboratorio: ___________________
Observaciones y datos adicionales:
Nombre de la persona que ha tomado las muestras:
_______________________