Guía Unificada de Laboratorios Código FLA-23 v.

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1. Título

Guía 6. Tinciones

2. Objetivo

Comprender el fundamento y ejecutar diversas técnicas de tinción para la observación

microscópica de estructuras internas y externas de las bacterias, basándose en la
morfología y características tintoriales.

2.1Objetivos Específicos

- Describir las características morfológicas y tintoriales de estructuras microbianas.

- Adquirir destreza en la observación microscópica de estructuras bacterianas

3. Marco Teórico

TINCIONES
Las tinciones se pueden dividir en simples, diferenciales, negativas de estructuras
microbianas y de materiales de reserva.
La tinción simple involucra la utilización de un solo colorante; en tanto, en las tinciones
diferenciales se emplean por lo menos dos colorantes, que tiñen o reaccionan en forma
diferente con las bacterias, según su estructura química o física. La tinción negativa en
realidad no tiñe las bacterias, sino que tiñe su entorno, aumenta el contraste entre éste y
las células y facilita su observación. Las tinciones para estructuras bacterianas o para
materiales de reserva se basan en la afinidad de la estructura o del material de reserva
por un determinado colorante que fácilmente los evidencia.

En la guía 5 se hizo referencia a la tinción simple, y a la tinción de Gram.

1. OTRAS TINCIONES DIFERENCIALES

- TINCIONES PARA ÁCIDO-ALCOHOL RESISTENTES

Agunas bacterias especialmente del género Mycobacterium, no se tiñen fácilmente con
los procedimientos usuales como la tinción de Gram, éste género presenta en su pared
una gran capa externa con grandes cantidades de materiales lipídicos, ácidos micólicos
por lo que su pared es hidrofóbica. Por esta razón repelen el agua y son impermeables a
los colorantes y otros compuestos químicos en solución acuosa. Para lograr teñir este tipo
de bacterias deben emplearse procedimientos tintoriales especiales, entre ellos las
tinciones de Ziehl Neelsen, Kinyoun y Auramina-Rodamina

Solamente utilizando colorantes como la fucsina fenicada, y forzando su acción mediante

la aplicación de calor o prolongando el tiempo de contacto, estos microorganismos logran
retener el colorante, y lo hacen de tal manera, que incluso decolorantes muy fuerte como
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el alcohol-ácido no consiguen decolorarlos. Por esto se denominan ácido- alcohol

resistentes.

TINCIÓN DE ZHIEHL-NEELSEN
En la tinción de Ziehl Neelsen se aplica fucsina fenicada que debe ser calentada para que
penetre a la célula y se fije fuertemente en los componentes lipídicos de la pared celular
de los microorganismos ácido alcohol resistentes (AAR). En el siguiente paso se utiliza
alcohol ácido como decolorante, que es capaz de extraer la fucsina fenicada en las
bacterias no ácido alcohol resistentes, en tanto las Micobacterias no son decoloradas por
lo que se les denomina “ácido alcohol resistentes”. Posteriormente se adiciona el
colorante de contraste –azul de metileno- el cual tiñe las bacterias decoloradas.

Los colorantes y reactivos usados en esta tinción son:

 Fucsina fenicada.
 Alcohol-ácido (decolorante). Etanol al 95%1: 97 ml.; HCl : 3 ml.
 Azul de metileno o verde de Malaquita

Técnica
1. Realizar el extendido, dejar secar y fijar la lámina con calor
2. Cubrir la preparación con fucsina fenicada y calentar el portaobjetos sobre la llama
de un mechero, hasta la emisión de vapores por parte de la preparación. Cuando
se observa la emisión de vapores se retirará el foco calorífico, volviéndolo a aplicar
2 0 3 veces de modo que se mantenga dicha emisión durante 5 minutos. Hay que
evitar la ebullición del colorante y que en ningún momento la preparación quede
sin colorante. También se puede realizar la coloración cubriendo la preparación
con un rectángulo de papel de filtro y añadiendo el colorante de modo que quede
perfectamente impregnado el papel de filtro. A continuación se irá calentando
manteniéndose la emisión de vapores durante 5 minutos sin dejar que se seque el
papel de filtro.
3. Dejar enfriar y lavar con agua de tubo. En el caso de utilizar papel de filtro se
retirará este mediante unas pinzas y a continuación se lavará con agua.
4. Decolorar con alcohol-ácido hasta que la preparación quede con un ligero tinte
rosa.
5. Lavar con agua de tubo.
6. Cubrir la preparación con azul de metileno ó verde de malaquita durante 2-3
minutos.
7. Lavar con agua de tubo.
8. Secar y observar el microscopio con objetivo de 100X

Los microorganismos ácido-alcohol resistentes se observarán de color rojo y los restantes

de color azul. Si como colorante de contraste en vez de azul de metileno se hubiera
empleado verde malaquita, los microorganismos no ácido-alcohol resistentes se observan
de color verde.
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TINCIÓN DE KINYOUN
Es una tinción ácido-alcohol resistente, modificación de la de Ziehl-Neelsen, llamada
también como método frío debido a que en lugar de emplear calor para facilitar la
penetración del colorante se aumenta la proporción de fenol y fucsina en la fórmula del
colorante con respecto a la fucsina de Ziehl.

Técnica:
1. Realizar el extendido, dejar secar y fijar la lámina con calor
2. Cubrir la preparación con la fucsina de Kinyoun y dejar actuar durante 5-7 minutos-
min., sin calentar.
3. Lavar con agua o simplemente escurrir el colorante.
4. Decolorar con alcohol-HCl.
5. Lavar con agua.
6. Coloración de contraste: azul de metileno durante 2-3 min.
7. Lavar, secar y observar al microscopio.

La observación será similar a la expuesta en la tinción de Ziehl-Neelsen.

TINCIONES FLUORESCENTES
Algunos colorantes denominados fluorocromos tienen la propiedad de ser excitados
cuando absorben luz ultravioleta (luz de longitud de onda corta). A medida que las
moléculas excitadas regresan a su estado normal, liberan el exceso de energía en forma
de luz visible de mayor longitud de onda que la radiación excitante. Esta propiedad se
denomina fluorescencia. Los objetos fluorescentes aparecen brillantemente iluminados
contra un fondo oscuro, según el color del colorante usado.

Tinción fluorescente con auramina-rodamina

Es una tinción muy usada para micobacterias, cuando el volumen de muestras a examinar
es elevado. Se fundamenta en la afinidad que poseen los ácidos micólicos de la pared
celular de las Micobacterias por los colorantes fluorescentes o fluorocromos Auramina y
Rodamina. Estos colorantes se fijan a las bacterias que aparecen de color amarillo o
naranja brillante contra un fondo oscuro.

Técnica:
1. Realizar el extendido, dejar secar y fijar la lámina con calor. Dejar enfriar.
2. Coloración: Cubrir la preparación con el colorante auramina-rodamina previamente
filtrado. Mantenerlo así durante 15 min. No hay que calentar.
3. Lavar con agua destilada.
4. Decoloración con alcohol -HCl. Cubrir la preparación con el decolorante y dejar
actuar de 3 a 4 minutos.
5. Lavar con agua destilada.
6. Añadir permanganato potásico al 0,5% en agua destilada y dejar actuar de 2 a 4
minutos. El permanganato se utiliza para eliminar la fluorescencia residual de los
desechos de fondo. Pero debe evitarse el tratamiento excesivo con el
contracolorante porque puede rebajar la intensidad fluorescente de los bacilos
coloreados.
7. Lavar con agua destilada.
8. Secar al aire y observar con el microscopio de fluorescencia.
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El agudo contraste entre las Micobacterias coloreadas brillantemente y el fondo oscuro

ofrece las grandes ventajas de una fácil, rápida y completa observación. Puede usarse un
objetivo de 25X (100X en la tinción de Ziehl-Neelsen y similares), para observar el frotis, lo
que permite la inspección de un área extensa en poco tiempo. Otras ventajas son el mejor
contraste, el mínimo esfuerzo visual y la relativa falta de importancia de la agudeza para el
color del observador.

Tinción fluorescente con naranja de acridina

Se basa en la tinción de los ácidos nucleicos de los microorganismos por el fluorocromo
naranja de acridina.
Esta tinción se utiliza principalmente para el estudio de microorganismos en hemocultivos
y muestras como líquido cefalorraquídeo.

La técnica es muy simple:

- Cubrir la preparación ya fijada con solución de naranja de acridina durante 2 min.
- Lavar con agua destilada.
- Dejar secar.
- Observar al microscopio de fluorescencia. Las bacterias se observan de color naranja
fluorescente.

2. TINCIONES PARA ESTRUCTURAS BACTERIANAS

Utilizan más de un colorante y sirven para poner de manifiesto distintas estructuras
bacterianas como: endosporas, corpúsculos metacromáticos, cápsula y flagelos.

TINCIÓN DE ENDOSPORAS
Algunos microorganismos tienen la propiedad de formar endosporas, que son formas de
resistencia. Su formación se debe a una concentración de protoplasma bacteriano.
Pueden ser de forma esférica u oval y de diverso tamaño. Pueden ser de localización
central, subterminal, o terminal. También pueden salir al exterior.

La pared de las endosporas es bastante impermeable, por lo que cuesta trabajo teñirlas,
de modo que en las reparaciones teñidas por los métodos corrientes, las endosporas
aparecen como cuerpos incoloros y refringentes. Pero si se fuerza la coloración mediante
el calor, el colorante llegará a teñir las endosporas.

Debido a la citada impermeabilidad de la pared de las endosporas, durante el periodo de

decoloración, se decolorará toda la célula bacteriana excepto las endosporas. Se
necesitan cultivos de al menos 48 horas, para que el microorganismo haya tenido tiempo
suficiente de formarlas.

MÉTODO DE WIRTZ-CONKLIN
Esta coloración emplea el verde de malaquita como colorante primario, el cual es
eliminado posteriormente del resto de la célula bacteriana, pero no de la endospora, y
como colorante de contraste utiliza la safranina.
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Técnica
1. Realizar el extendido, dejar secar y fijar la lámina con calor. Dejar enfriar.
2. Cubrir la preparación con verde malaquita al 5% en solución acuosa,
manteniéndola a emisión de vapores durante 5 min, teniendo las mismas
precauciones que las especificadas en la tinción de Ziehl-Neelsen.
3. Dejar enfriar.
4. Lavar con abundante agua. La endospora sigue teñida de verde y la célula
vegetativa pierde el colorante.
5. Safranina y dejar actuar durante 1 min.
6. Lavar con agua.
7. Secar y observar al microscopio en 100X

Las endosporas se verán de color verde y las células vegetativas se observarán de color
rosa. La disposición y tamaño de las endosporas tiene gran interés en taxonomía.

Otras tinciones utilizadas para la observación de endosporas son: Coloración de

Schaeffer Fulton, Coloración de Dorner

TINCIÓN DE FLAGELOS
Los flagelos son apéndices bacterianos para locomoción y en algunos casos para
adhesión. El número y disposición de flagelos es una característica constante de la
especie y tiene valor taxonómico. Según el arreglo de los flagelos las bacterias se pueden
agrupar en: monótricas: cuando solo tienen un flagelo; lofotricas las que presentan dos
o más flagelos (mechón) en uno o ambos extremos; anfitricas: que presentan un solo
flagelo en cada extremo y peritricas, las que presentan flagelación en toda la superficie.
Debido a las dimensiones de los flagelos solo pueden observarse al microscopio de luz
con tinciones especiales que incrementan su diámetro por deposición de colorantes.

Para su observación, se debe partir de cultivos jóvenes, de entre seis y doce horas, se
prepara una suspensión del microorganismo en agua destilada, mezclando suavemente
hasta obtener una suspensión lechosa. Si se sospecha que el microorganismo es
patógeno, se debe utilizar agua formolada al 5-10%. Se deposita unas gotas de la
suspensión en un extremo del portaobjetos inclinado, de forma que las gotas se extiendan
a lo largo del cristal. Se dejará secar al aire sin aplicar calor.

MÉTODO DE RHODES
1. Se cubre la extensión con el mordiente de Rhodes durante 3-5 min. Lavar
cuidadosamente con agua destilada, mejor por inmersión.
2. Cubrir con la solución de nitrato de plata amoniacal, calentándolo hasta casi
ebullición y dejándolo actuar de 3-5 min.
3. Lavar con agua destilada y secar.
4. Se observa con objetivo de inmersión, directamente o bajo un cubreobjetos.
Los flagelos podrán observarse gracias al precipitado de nitrato de plata que se deposita
en torno suyo.
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MÉTODO DE TRIBONDEAU
1. Se fija el frotis con alcohol y se cubre con la mezcla formada por 5 ml del
mordiente de Tribondeau y 0,5 ml de cristal violeta previamente sometida a
ebullición. Se deja actuar durante 20 segundos.
2. Se lava rápidamente con agua, sin volcar previamente el colorante, se seca y se
observa al microscopio con objetivo de inmersión.
Los flagelos se verán de color castaño.

MÉTODO DE LEIFSON
1. Se cubre la preparación con el colorante de Leifson y se deja actuar durante unos
10 minutos.
2. Se lava con agua, sin volcar el colorante, se seca y se observa al microscopio con
objetivo de inmersión.
Los flagelos se observan de color rojo oscuro a azul negruzco.

TINCIÓN DE CÁPSULAS
La cápsula es una capa mucosa, más o menos gruesa, que envuelve la pared celular de
algunas bacterias.

MÉTODO DE HISS
1. Realizar un frotis espeso de una mezcla de suspensión bacteriana con solución
fisiológica y suero sanguíneo. Secar a temperatura ambiente y fijar al calor.
2. Cubrir la preparación con solución de cristal violeta al 1% y calentar con vapor
fluyente durante un minuto.
3. Lavar con solución de sulfato de cobre al 2%, secar y observar al microscopio con
objetivo de inmersión.
4. Las cápsulas se colorean de azul pálido y las bacterias de color púrpura.

MÉTODO DE LA TINTA CHINA

1. Se realiza el extendido y sin fijar el frotis
2. Se cubre con fucsina diluida durante dos minutos.
Lavar con agua destilada y secar al aire.
3. Se colocan en un extremo del portaobjeto dos gotas de nigrosina o de tinta china y
se hace una extensión por el método de los dos portaobjetos.
4. Se deja secar y se observa al microscopio con objetivo de inmersión- 100X.
El fondo aparecerá negro, las bacterias teñidas de rojo y la cápsula como un halo blanco
que las envuelve.

TINCIÓN DE CORPÚSCULOS METACROMÁTICOS

Muchas bacterias cuando crecen bajo determinadas formas de cultivo son capaces de
acumular dentro de su citoplasma depósitos de materiales de reserva que se denominan
inclusiones. Los gránulos metacromáticos son un ejemplo de estas inclusiones,
constituyen acumulaciones de polifosfato y se conocen también como gránulos de volutina
o cuerpos de Babés Ernst.
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Estos gránulos se llaman así porque muestran un efecto metacromático; esto es aparecen
de un color rojo o de diferentes tonos de azul cuando se tiñen con azul de metileno o con
azul de toluidina. Son comunes en el género Corymebacterium
El género Corynebacterium presenta unos gránulos de reserva de fosfato, llamados
gránulos o corpúsculos metacromáticos.

MÉTODO DE ALBERT
1. Realizar el extendido, dejar secar y fijar la lámina con calor. Dejar enfriar.
2. Se cubre con el colorante de Albert, se deja actuar durante 15 minutos y
3. Se lava con agua destilada.
4. Se cubre la preparación con lugol durante un minuto, lavar con agua, secar a
temperatura ambiente y observar con objetivo de inmersión.
Los corpúsculos metacromáticos se tiñen de color rojo y el resto del bacilo azul oscuro.

MÉTODO DE STOLTEMBERG
1. Realizar el extendido, dejar secar y fijar la lámina con calor. Dejar enfriar
2. cubrir con el colorante de Stoltemberg y dejar actuar durante tres minutos.
3. Lavar con agua destilada, dejar secar y observar con objetivo de inmersión.
Los gránulos se verán de color rojo y el resto del bacilo azul oscuro.

4. Materiales, equipos e Insumos

Equipos:
Microscopios

Materiales:
 Láminas portaobjeto
 Láminas cubreobjetos
 Asas bacteriológicas
 Gradillas
 Cinta de enmascarar
 Mecheros de alcohol
 Mechero de bunsen
 Pinzas
 Bandeja de coloración
 Papel kraf

5. Reactivos y Medios de cultivo

 Cultivos bacterianos en medios sólidos y líquidos
 Solución salina fisiológica
 Aceite de inmersión
 Solución limpiadora para microscopios
 Reactivos de coloración de Gram
 Reactivos de coloración de Zielh Neelsen
 Reactivos de coloración de endosporas
 Reactivos de coloración de Gránulos metacromáticos
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 Reactivos de tinción de cápsula

 Reactivos para tinción de flagelos

6.Procedimiento

- A partir de las muestra y/o cultivos bacterianos indicados por el docente realice una
coloración para visualización de: Bacilos ácido-alcohol-resistentes, endosporas, flagelos
cápsula, gránulos metacromáticos.
- Observe cada una al microscopio con el objetivo de 10 y 100X detallando cada una de
las estructuras que desea resaltar con la coloración, así como el color que estas toman
con la técnica de coloración empleada.
-Observe las láminas de demostración

Resultados:

Grafique cada una de las observaciones:

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7. Nivel de Riesgo

Nivel 2 (Riesgo Medio)

8. Bibliografía

BROOKS Geo F., Batel Janet S., Morse Stephen A., Microbiología Médica de Jawetz,
Melnick y Adelberg. Editorial Manual Moderno. 26ª Edición.2014.
http://veterinaria.uaemex.mx/_docs/607_970_MP%20Bacteriolog%C3%ADa%20y%20Mic
olog%C3%ADa.pdf
http://www.higiene.edu.uy/cefa/2008/MorfologiayEstructuraBacteriana.pdf
http://www.pomif.com/pages/practicas/bacteriologia/tinciones

9. Anexos

PREPARACIÓN DE REACTIVOS PARA TINCIONES

COLORACIÓN DE ZIEHL NEELSEN

1. Fucsina
Solución Madre de Fucshina fenicada de Ziehl:
Fucshina básica para microscopía C22H24CIN3 10gr.
Etanol 95° 100mL.
Triture la fucshina en un mortero con el alcohol, agregándolo poco a poco; trasvase a un
frasco ámbar. En caso que no disponga de un mortero, coloque directamente la fucsina y
el alcohol en el frasco ámbar y agite hasta su completa disolución.
Coloque la solución madre de fucsina a 37°C por 8 días, para su maduración: agite
diariamente para extraer la mayor cantidad de colorante procedente del polvo de fucsina.
Rotule y almacene a temperatura ambiente protegida de la luz. Filtre con papel filtro antes
de usar.
Solución de fenol al 5%:
Fenol 5mL.
Agua destilada 95mL.
Funda los cristales de fenol en baño maría; utilice cámara de extracción; mida en probeta
los 5 ml y complete con agua destilada a 100mL. Envase, rotule y almacene a
temperatura ambiente protegida de la luz.
Solución de trabajo de fucsina fenicada:
Solución de fucshina filtrada 10mL.
Solución de fenol al 5% 90mL.
Envase en frasco ámbar. Rotule y almacene a temperatura ambiente protegido de la luz.
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2. Alcohol ácido al 3%
Ácido clorhídrico 37% 3mL
Etanol 95° 97mL.
Agregue lentamente el ácido sobre el alcohol. Envase, rotule y almacene a temperatura
ambiente.

3. Azul de Metileno
Solución Madre de Azul de metileno:
Azul de metileno para microscopía C16H18CIN3S.2H2O 10gr.
Etanol 95° 100mL.

Coloque la solución madre de azul de metileno a 37°C por 8 días, para su maduración;
agite diariamente para extraer la mayor cantidad del colorante procedente del polvo de
azul de metileno. Rotule y almacene a temperatura ambiente protegida de la luz. Filtre con
papel filtro antes de usar.

Solución de trabajo de azul de metileno:

Solución madre filtrada 30mL.
Agua destilada 70mL.

COLORACIÓN DE SCHEAFFER-FULTON
1. Verde de Malaquita:
Verde de Malaquita 5.0gr.
Agua Destilada 100mL.

2. Safranina: la misma de la tinción de Gram

COLORACIÓN DE HISS
1. Fucsina
Fucsina básica 0.15-0.30gr.
Agua destilada 100ml.
2. Sulfato de cobre al 20% en agua destilada.
3. Cristal violeta
Cristal violeta 0.05-0.1gr.
Agua destilada 100ml.
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COLORACIÓN DE FLAGELOS MODIFICADA DE LEIFSON

 Fucsina básica al 1.2% en Etanol al 95%.
 Ácido tánico al 3% en agua destilada. La suspensión debe tener un color amarillo para
ser satisfactoria, se agrega fenol en una proporción 1 a 2000 para evitar la aparición de
mohos durante el almacenamiento.
 Cloruro de sodio al 1.5% en agua destilada.

Para preparar la solución colorante se mezclan volúmenes iguales de los tres stocks
anteriores. El colorante está listo para ser usado después de la preparación y debe
almacenarse en frascos bien cerrados. La vida útil de la solución tintorial es de una
semana a temperatura ambiente, un mes en el refrigerador e indefinida si se congela.

COLORACIÓN DE ALBERTH
Azul de toluidina 0.15gr.
Verde de malaquita 0.02gr.
Ácido acético glacial 1ml.
Alcohol etílico (95%) 2ml.
Agua destilada 100ml.

COLORACIÓN DE STOLTEMBERG
1. Verde de malaquita 1.25gr.
Agua destilada 500ml.

2. Azul de toluidina 0.25gr.

Ácido acético 15ml.

3. Hematoxilina 0.05gr.
Alcohol etílico 15ml.

Cada colorante se macera en morteros diferentes, se mezclan y se filtran.

CONSULTA

1. Describa las Técnicas de coloración de Shaeffer fulton y Dorner

2. Realice un cuadro comparativo en el cual incluya la estructura a colorear, la tinción
usada y como se visualiza la estructura.
3. Investigue para que sirven la Tinción de Grocott , Tinción de Dieterle, Tinción
con mucicarmina
4. ¿Cuáles son las fuentes de error más frecuentes en la preparación y fijación de
frotis?
5. Si se aplica la tinción de Gram de Bacillus sp. Con endosporas ¿Cómo se
observarían la célula vegetativa y la endospora? ¿Por qué?