CALCULOS DE VALIDACION

DE METODOS ANALITICOS

Laboratorio de Control Fisicoquimico y

Microbiologico de Medicamentos y Afines II

Por: Carlos Mario Aguirre D. Q.F U de A

Abril de 2013
CALCULOS DE VALIDACION
DE METODOS ANALITICOS
 CALCULOS DE LINEALIDAD

 Regresión Lineal y demostración Linealidad – Prueba ANOVA

 Intervalo de confianza para el intercepto – Prueba t
 Intervalo de confianza para la pendiente – Prueba t
 CALCULOS DE VALIDACION DE METODOS ANALITICOS EN
EXCEL
Paso1. Crear una tabla con los datos básicos para realizar cálculos, calculo de
sumatorias

En Excel los exponentes se colocan con

el símbolo ^, Ejemplo: necesitamos sacar
el cuadrado de 2, entonces en la celda de
Excel colocamos =2^2
 CALCULOS DE VALIDACION DE METODOS ANALITICOS EN
EXCEL

Paso2. Calcular pendiente e intercepto por Excel

Para calcular la pendiente se dice en la celda donde se desea

mostrar el valor = y se selecciona insertar función fx, se
selecciona estadísticas y se escoge de la lista la opción
PENDIENTE, se despliega otro recuadro y en conocido y se
seleccionan todos los datos de área o absorbancia obtenidos y
en conocido x todos los datos de pesos para cada muestra.
Para el intercepto es lo mismo pero se selecciona de la lista
 CALCULOS DE VALIDACION DE METODOS ANALITICOS EN
EXCEL

Paso3. Calcular coeficientes r y r2

Para calcular la pendiente se dice en la celda donde se desea

mostrar el valor = y se selecciona insertar función fx, se
selecciona estadísticas y se escoge de la lista la opción
COEF.DE.CORREL, se despliega otro recuadro y Matriz1 se
seleccionan todos los datos peso obtenidos y en Matriz2 todos
los datos de área o absorbancia para cada muestra. Para
calcular r2 elevamos al cuadrado el valor obtenido para r en
otra celda
 CALCULOS DE VALIDACION DE METODOS ANALITICOS EN
EXCEL

Paso4. Calcular s2x,y, n

Para los posteriores cálculos de la desviación estándar de la pendiente Sb y del intercepto Sa requerimos calcular el valor de la
desviación estándar de X con respecto a Y y el numero de datos n
Sx,y= (ΣY2-(a*ΣY)-(b*ΣXY))/n-2 para este calculo debimos haber calculado primero n, esto se hace con la función estadística
CONTAR

Para calcular n se dice en la celda donde se desea mostrar el valor = y se selecciona insertar función fx, se
selecciona estadísticas y se escoge de la lista la opción CONTAR, se despliega otro recuadro y en Valor1 se
seleccionan todos los datos peso obtenidos, en este caso n=9, con estos datos en otra celda ya hacemos el
calculo según la formula de S2x,y ya que tenemos todos los datos para calcularlo¡
 CALCULOS DE VALIDACION DE METODOS ANALITICOS EN
EXCEL

Paso5. Calcular Suma de cuadrados inexplicada (Ssi), explicada (Sse) y Total

(SSt)
Para los posteriores cálculos de la desviación estándar de la pendiente Sb y del intercepto Sa requerimos calcular el valor de la
suma de cuadrados explicada, inexplicada y total.

SSt = ΣY2-((ΣY)2/n)
Sse=b2*(ΣX2-((ΣX)2/n))
Ssi= SST-SSe
Paso6. Calcular Desviación estándar para la pendiente (Sb) y para el intercepto (Sa)
Sb=√(SSinexplicada/(Σx2-(Σx/r2)))
Sa=√((Sb2)*(Σx/n))
 CALCULOS DE VALIDACION DE METODOS ANALITICOS EN
EXCEL

Paso6. Realizar el análisis de varianza (ANOVA)

Para esto comenzamos construyendo la tabla ANOVA y realizando los cálculos de los cuadrados medios del error y el
Estadístico F

Para el modelo ANOVA los grados de libertad de la regresión son 1,00, los grados de libertad para el residual son igual a n-2 y
para el total igual a n-1
 CALCULOS DE VALIDACION DE METODOS ANALITICOS EN
EXCEL

Paso6. Realizar el análisis de varianza (ANOVA)

Para esto comenzamos construyendo la tabla ANOVA y realizando los cálculos de los cuadrados medios del error y el
Estadístico F

Para el F tabulado no se requiere tener una tabla estadística ya que Excel da la posibilidad de obtener este valor para ello usamos la función
=DISTR.F.INV(), dentro de los paréntesis se coloca el valor de alfa, luego ;el valor de n-2;el valor de n-1, en este ejemplo la formula seria
=DISTR.F.INV(0,05;7,00;8,00)
 CALCULOS DE VALIDACION DE METODOS ANALITICOS EN
EXCEL

Paso7. Realizar la prueba de Hipótesis acerca de la linealidad del método y

comparar los valores Fcalculado y F tabulado

Se plantean las Hipótesis nula y alterna, la nula establece la hipótesis que no hay relación entre variables y la alterna que si
existe dicha relación. Si Fcalculado>Ftabulado, se rechaza Ho y se acepta H1 lo cual quiere decir que si existe relación lineal
entre cantidad y área, para el caso que hemos venido trabajando, vemos que Fcalculado (21038,9655) es mucho mayor que
Ftabulado (3,50) con 0,05 de probabilidad

Hasta aquí hemos probado que existe una relación lineal entre las variables, sin embargo debemos probar que en todos los
rangos existe una adecuada proporcionalidad en todos los rangos de concentración ensayados (pendiente positiva mayor a cero)
y que el intercepto pasa por cero, para ello debemos realizar pruebas de intervalos de confianza para el intercepto y la pendiente,
empleando pruebas t.
 CALCULOS DE VALIDACION DE METODOS ANALITICOS EN
EXCEL

Paso8. Realizar las pruebas de intervalo de confianza para la pendiente y el

intercepto
Calculo de intervalos de confianza para la pendiente

Tcalculado para la pendiente= (b-0)/Sb

Intervalo de confianza superior para la pendiente= b + (ttabulado*Sb)
Intervalo de confianza inferior para la pendiente= b - (ttabulado*Sb)
Para el t tabulado no se requiere tener una tabla estadística ya que Excel da la posibilidad de obtener este valor para ello usamos la
función =DISTR.T.INV(), dentro de los paréntesis se coloca el valor de alfa, luego ;el valor de n-2 en este ejemplo la formula seria
=DISTR.F.INV(0,05;7,00) con el valor de t tabulado obtenido se harían los cálculos de intervalos de confianza para la pendiente.

Calculo de intervalos de confianza para el intercepto

Tcalculado para la pendiente= (r*√n-2)/(√1-r2)

Intervalo de confianza superior para el intercepto= a + (ttabulado*Sa)
Intervalo de confianza inferior para el intercepto= a - (ttabulado*Sa)

Para el t tabulado no se requiere tener una tabla estadística ya que Excel da la posibilidad de obtener este valor para ello usamos la
función =DISTR.T.INV(), dentro de los paréntesis se coloca el valor de alfa, luego ;el valor de n-2 en este ejemplo la formula seria
=DISTR.F.INV(0,05;7,00) con el valor de t tabulado obtenido se harían los cálculos de intervalos de confianza para la pendiente.
 CALCULOS DE VALIDACION DE METODOS ANALITICOS EN
EXCEL

Paso9. Realizar la prueba de hipótesis para los intervalo de confianza para la

pendiente y el intercepto

Estas pruebas cumplen para la pendiente si el intervalo superior e inferior de la pendiente no incluye el cero, es decir el
valor de ninguno de los dos intervalos es igual a cero o negativo

Estas pruebas cumplen para la intercepto si el intervalo superior e inferior de la intercepto incluyen el cero, es decir el valor
de alguno de los dos intervalos es igual a cero o negativo
 CALCULOS DE VALIDACION DE METODOS ANALITICOS EN
EXCEL

Con los cálculos anteriormente realizados ya hemos comprobado que el método

es lineal en todos los intervalos de concentración ensayados mediante el ANOVA
y la comprobación de los intervalos de confianza para el intercepto y la
pendiente, nos resta comprobar la exactitud y precisión del método en cada uno
de los intervalos de concentración ensayados para de esta forma establecer el
rango y adicionalmente comprobar la repetibilidad y la precisión intermedia. La
selectividad se establece principalmente por medio de calculo de parámetros
cromatograficos como la resolución y comparación de espectros de absorción,
continuaremos entonces con los cálculos de exactitud y precisión.
CALCULOS DE VALIDACION
DE METODOS ANALITICOS
 CALCULOS DE EXACTITUD Y
PRECISION

 Prueba t para determinación del sesgo

 Comparación de resultados de ensayos de precision
 CALCULOS DE VALIDACION DE METODOS ANALITICOS EN
EXCEL

EXACTITUD

Ejemplo: STD Ws: 25,1mg /100 *1/10 Área (Rs= 20620) Potencia (P)=100,0%
Prep. Muestra: 25,2mg*/100*1/10 Área (Rm=20650)
%Recuperado= (25,1mg/100mL)*(1/10mL)*(100mL/25,2mg)*
(10mL/1)*(20650/20620)*100.0%
%Recuperado= 99,7%
%𝑅𝑒𝑐𝑢𝑝𝑒𝑟𝑎𝑑𝑜 = (𝑊𝑠 𝐷1) ∗ (A1/D2)*(D1/Wm)*(D2/A1m)*(Rm/Rs)*P

Para cada muestra se calcula el porcentaje recuperado empleando los datos de área para el estándar y cada muestra
 CALCULOS DE VALIDACION DE METODOS ANALITICOS EN
EXCEL

EXACTITUD
Nivel de concentración
teórico% cantidad(mg) Area de Pico %Recuperado %Concentración real
X Y %recuperado %Concentración real
80 20,00 15687,00 95,9 76,7
80 20,10 15720,00 95,6 76,5
80 20,20 15780,00 95,5 76,4
100 25,20 20650,00 100,1 100,1
100 25,00 20580,00 100,6 100,6
100 25,10 20610,00 100,3 100,3
120 30,30 25695,00 103,6 124,4
120 30,50 25750,00 103,2 123,8
120 30,00 25530,00 104,0 124,8
Para cada muestra se calculo el porcentaje recuperado empleando los datos de área para el estándar y el modelo de calculo
de la diapositiva anterior, luego se calcula la concentración real equivalente empleando el %Recuperado obtenido y el nivel
teórico de concentración

Ya teniendo estos datos calculados empleamos los datos de %Recuperado para realizar los cálculos de t calculado para la
prueba de exactitud

%Concentración real= (%Recuperado*Nivel teórico de concentración)/100

 CALCULOS DE VALIDACION DE METODOS ANALITICOS EN
EXCEL

EXACTITUD

 tcalculado=100- x/s*√n
Promedio porcentaje desviacion
n tcalculado n-2 alfa ttabulado
recuperado estandar (s)
Concentración%
80 95,6 0,20 3 12,65 1
100 100,4 0,23 3 -0,9 1 0,05 12,7
120 103,6 0,41 3 -5,0 1

Para cada nivel de concentración tenemos 3 datos, para cada nivel

sacamos el promedio de porcentaje recuperado, sacamos la desviación
estándar para los datos de cada nivel, el valor de n que en este caso es
igual a 3 para cada nivel, luego calculamos el tcalculado para cada nivel
con la formula mostrada arriba. Para mostrar el ttabulado, sacamos el valor
n-2 que en este caso es igual a 1 y trabajamos con un valor de alfa igual a
0,05, el ttabulado lo obtenemos con la función =DIST,T.INV(0,05;1) y nos da
un valor de 12,7

Si tcalculado<ttabulado entonces se rechaza Ho

y puede afirmarse que el método es exacto. Esto debe hacerse para cada nivel de concentración
 CALCULOS DE VALIDACION DE METODOS ANALITICOS EN
EXCEL

PRECISION – REPETIBILIDAD O PRECISION

INTRAENSAYO
Tomamos parte de la tabla del ejemplo anterior y calculamos para cada nivel de
concentración ensayado la desviación estándar relativa (%RSD). Generalmente para
métodos en los que se determinan principios en cantidades altas como son los ensayos de
valoración de productos farmacéuticos que no impliquen un procedimiento de
derivatizacion, extracción o pretratamiento complejo, el criterio de aceptación establecido
es no mayor a 2,0%

Promedio porcentaje recuperado desviación estándar (s) %RSD

Concentración%
80 95,6 0,2 0,2
100 100,4 0,2 0,2
120 103,6 0,4 0,4

%RSD=(Desviación estándar/promedio) X 100

 CALCULOS DE VALIDACION DE METODOS ANALITICOS EN
EXCEL

PRECISION
Para definir el %RSD también existen algunas guías como la farmacopea europea que
establece según el rango de valoración esperado un máximo de %RSD permitida
 CALCULOS DE VALIDACION DE METODOS ANALITICOS EN
EXCEL

PRECISION – PRECISION INTERMEDIA O

INTERENSAYO
Esta precisión se calcula cuando hay datos de dos análisis de dos analistas diferentes en
días diferentes dentro del mismo laboratorio, generalmente un criterio de aceptación
establecido es que el %RSD obtenido por el analista 1 no debe ser mayor a 2 veces el
%RSD obtenido por el analista 2. Para el ejemplo mostrado debajo el método puede
considerarse de buena precisión intermedia ya que el %RSD del analista no excede en mas
de 2 veces el %RSD obtenido por el analista 2.

Analista 1 – Día 1
Promedio porcentaje recuperado desviación estándar (s) %RSD
Concentración%
80 95,6 0,2 0,2
100 100,4 0,2 0,2
120 103,6 0,4 0,4

Analista 2 – Día 2
Promedio porcentaje recuperado desviación estándar (s) %RSD
Concentración%
80 97,0 0,3 0,3
100 100,8 0,3 0,3
120 102,8 0,7 0,7
CROMATOGRAFIA LIQUIDA HPLC –
VALIDACION DE METODOS

SELECTIVIDAD
 CROMATOGRAFIA LIQUIDA HPLC –
VALIDACION DE METODOS

 Selectividad y Especificidad
La selectividad de un método analítico se define como la
capacidad de este para discriminar la respuesta instrumental
correspondiente a un analito de otras respuestas instrumentales
de otros analitos o interferencias, se mide generalmente por la
resolución, la mayor parte de los métodos empleados son
selectivos mas no específicos.

La especificidad es la capacidad de un método de arrojar

respuestas instrumentales debidas únicamente al analito de
interés sin otras respuestas de otras sustancias. Ejemplos:
métodos inmunoquimicos (antígeno-anticuerpo), métodos
radioquímicos con isotopos radioactivos.
 CROMATOGRAFIA LIQUIDA HPLC –
VALIDACION DE METODOS

 Selectividad y Especificidad

Las condiciones mínimas para evaluar la selectividad de una

metodología son:
 Condiciones normales con o sin adición de interferencias.
 Termólisis a temperaturas variables 40°C, 50°C u 80°C.
 Degradación alcalina: con NaOH al 1N
 Degradación acida: con HCl 1N
 Degradación oxidativa: con H2O2 al 4% o NaHSO3
 Fotolisis
En cada caso la degradación no debería ser menor al 10% ni mayor al 30%, ya que por debajo del 10%
podrían no aparecer todas las posibles interferencias, y por encima del 30% podrían aparecer
interferencias que no son comunes (artefactos) que podrían no verse en la vida real.
 CROMATOGRAFIA LIQUIDA HPLC –
VALIDACION DE METODOS

LINEALIDAD Y RANGO

LINEALIDAD- mg ABACAVIR SULFATO VS AREA DE PICO

35000000,00
y = 710572x + 248516
30000000,00 R² = 0,9991
AREA DE PICO

25000000,00

20000000,00
ABACAVIR SULFATO
15000000,00

10000000,00 Lineal (ABACAVIR SULFATO )

5000000,00

0,00
0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00

mg ABACAVIR SULFATO
 CROMATOGRAFIA LIQUIDA HPLC –
VALIDACION DE METODOS

 Linealidad y Rango
La linealidad de un método es la capacidad que tiene este para
producir respuestas instrumentales que son directamente o por
medio de transformaciones matemáticas proporcionales a la
concentración de analito en la muestra. Se puede trabajar en
diferentes niveles.
El Rango es la concentración máxima y mínima entre las cuales
se ha demostrado una adecuada precisión y exactitud.
 CROMATOGRAFIA LIQUIDA HPLC –
VALIDACION DE METODOS

PRECISIÓN Y EXACTITUD

Baja precisión y precisión y exactitud

exactitud Precisión alta y Precisión y exactitud
media exactitud baja altas
 CROMATOGRAFIA LIQUIDA HPLC –
VALIDACION DE METODOS

 Exactitud
Es la capacidad de un método para generar resultados
experimentales cercanos a un valor de referencia o aceptado
como verdadero, la medición de la exactitud se hace por medio
de pruebas t.
 CROMATOGRAFIA LIQUIDA HPLC –
VALIDACION DE METODOS

 Precisión
La precisión expresa la cercanía entre series de valores
individuales obtenidos en el análisis de una muestra homogénea
en condiciones de operación idénticas o variables. Existen tres
tipos de precisión diferentes:
 Repetibilidad
 Precisión intermedia
 Reproducibilidad
La repetibilidad expresa la precisión obtenida bajo las mismas
condiciones de operación (intraensayo) para una serie de
muestras obtenidas por un mismo analista en un solo día.
 CROMATOGRAFIA LIQUIDA HPLC –
VALIDACION DE METODOS

 Precisión
Precisión intermedia: Expresa el grado de precisión en
condiciones operativas diferentes (diferentes analistas,
diferentes días, diferentes equipos), se expresa también como
precisión intralaboratorio o interensayo.

Reproducibilidad: Expresa el grado de precisión cuando se

cambia de laboratorio (precisión interlaboratorio), esta precisión
es la evaluada en los estudios de colaboración interlaboratorios
y son los que llevan a cabo por ejemplo laboratorios estatales y
la USP para validar y aprobar las metodologías para
monografías individuales.
 CROMATOGRAFIA LIQUIDA HPLC –
VALIDACION DE METODOS

 ROBUSTEZ
La robustez de un método s define como la capacidad de este para mantener
su desempeño ante pequeñas pero deliberadas modificaciones en las
condiciones de operación. Los estudios de robustez se realizan para evaluar que
posibles cambios que deban efectuarse en la vida real por alguna situación no
afectaran los resultados que arroja el método, la evaluación de este parámetro
se hace principalmente por técnicas estadísticas factoriales como la de Youden-
Steiner, Placket-Burmann o el cuadrado latino, parámetros generalmente
estudiado son la dilución de la muestra, la longitud de onda, el pH de la fase
móvil, el volumen de inyección, la temperatura, la longitud de columna, entre
otros parámetros, no existe una regla especifica para llevar a cabo estos
estudios y depende de los desarrolladores de métodos y quien realiza la
validación realizar el diseño de estos estudios de acuerdo con las condiciones de
su laboratorio.
 CROMATOGRAFIA LIQUIDA HPLC –
VALIDACION DE METODOS
LIMITE DE DETECCIÓN Y
Distribución,
CUANTIFICACIÓN
campana o trompeta
de Horwitz

VWD1 A, Wavelength=254 nm (C:\PROYEC~1\PBQ-008\VOLUNT~2\VOLUN~29\21010001.D)

mAU
Límite Superior
-0.04

-0.045

-0.05

-0.055

-0.06

-0.065

-0.07

-0.075
Límite Inferior
-0.08
9 9.1 9.2 9.3 9.4 9.5 min
 CROMATOGRAFIA LIQUIDA HPLC –
VALIDACION DE METODOS

 Limites de cuantificación (LC) y detección (LD)

Limite de detección (LD): Es la mínima cantidad de un
analito que puede ser detectada pero no cuantificada con
exactitud. Equivale a tres veces la relación señal/Ruido (S/N).

Limite de cuantificación (LC): Es la mínima cantidad de un

analito que puede ser detectada y cuantificada con exactitud y
precisión aceptables. Se establece como aquella concentración
que es 10 veces la relación señal/Ruido (S/N).
 CROMATOGRAFIA LIQUIDA HPLC –
VALIDACION DE METODOS

 Guías o normatividad aplicable a validación de métodos

analíticos y literatura recomendada
 <621>Cromatografia en USP35 aunque no es relativo a validación allí se dan parámetros
básicos que deben cumplir los métodos cromatograficos que deben tenerse en cuenta a la
hora de validar.
 <1092> Procedimiento de disolución: Desarrollo y validación
 <1223> Validación de métodos microbiológicos alternativos
 <1224> Transferencia de procedimientos analíticos
 <1225> Validación de procedimientos compéndiales
 <1226> Verificación de procedimientos compéndiales
 <1227> Validación de recuperación microbiana de artículos farmacopeicos
 Guía ICH Q2(R1) Validación de procedimientos analíticos: Texto y metodología (1996)
 De Muth, J.Basic statistical and pharmaceutical statistical applications. Ed Marcel
Dekker;inc. New York. 1999