FACULTAD DE CIENCIAS DE LA VIDA

ESCUELA DE INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA

LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA BIOMÉDICA

Extracción, Cuantificación, Análisis y Expresión

de Proteínas

Integrantes: Carla Arenas

Claudio Cortés

Docentes: Dr. Miguel Ávila

.
Lic. Daniela Verdugo

Fecha de entrega: 12 de Noviembre, 2018

 Introducción

Las proteínas son las macromoléculas biológicas más abundantes y están presentes en todas las
células, para estudiar una proteína con cierto detalle es necesario separarla del resto de proteínas
y disponer de técnicas que nos permitan determinar sus propiedades. Uno de los pasos más
importantes para el estudio de una proteína, es conocer cuantitativamente la concentración de
estas [1], se han desarrollado una gran cantidad de métodos que se basan en la formación de
complejos coloridos entre las proteínas y reactivos específicos. Uno de estos métodos es el de
Bradford, que entrega resultados rápidos y presenta una alta sensibilidad. Para los estudios del
proteoma de los sistemas biológicos también es muy importante la separación y purificación de
las proteínas, ya que la preparación pura de una proteína es esencial para poder determinar sus
propiedades y su actividad, los métodos de separación de las proteínas aprovechan propiedades
que varían entre ellas como el tamaño , la carga y las propiedades de unión, un ejemplo de estas
es la electroforesis que se basa en el desplazamiento de las proteínas cargadas en un campo
eléctrico [2].
Un método electroforético frecuentemente utilizado para la estimación de la pureza y la masa
molecular emplea el detergente Dodecil Sulfato Sódico (SDS), el cual incorpora una gran
cantidad de cargas negativa dejando la carga intrínseca de la proteína insignificante y además
altera su conformación nativa dejando a todas las proteínas de una forma similar, por lo tanto, la
electroforesis en presencia de SDS separa las proteínas exclusivamente en función de la masa
molecular. Una vez que la electroforesis ha tenido lugar es posible teñir el gel, documentar e
incluso se puede purificar la molécula de interés cortando el fragmento del gel.
Una vez separadas las proteínas en gel de SDS-poliacrilamida, las bandas se pueden transferir a
una membrana de nitrocelulosa y las bandas individuales de proteína se identifican al inundar la
membrana de nitrocelulosa con anticuerpo policlonal o monoclonal radiomarcado o unido a
enzimas específicas que permiten la detección, a esto se le conoce como la técnica Western Blot.
El Western blot es una técnica muy importante utilizada en la biología celular y molecular, nos
permite identificar proteínas específicas de una mezcla compleja de estas, la técnica utiliza tres
elementos para realizar esta tarea: separación por tamaño (por ejemplo, por electroforesis en
condiciones denaturantes SDS-PAGE), transferencia a un soporte sólido (Membrana de
nitrocelulosa) y marcaje de la proteína diana usando un anticuerpo primario y secundario [3].

Un ejemplo de una proteína importante relacionada con una gran cantidad de procesos biológicos
es la Beta-catenina (Cat-β) codificada por el gen CTNNB1, es miembro de la familia de las
cateninas que se encuentran unida a las cadherinas-E y actúan como intermediarios para la unión
de las moléculas de adhesión y el citoesqueleto en las uniones celulares [4]. La Cat-β fue
conocida inicialmente por la participación en la regulación de la funcionalidad de la cadherina,
luego se estableció otra función de esta en la transcripción de genes implicados en el desarrollo
tumoral, ya que es un componente importante de la vía de señalización Wnt. La función de
señalización de la Cat-β es regulada principalmente a través de alterar su estabilidad, la vía Wnt
induce la estabilización de esta que se encuentra normalmente libre en el citoplasma (Anexo 1).
La vía de señalización Wnt-β-catenina juega un rol decisivo en los procesos de regulación,
diferenciación, proliferación y muerte células por lo que su alteración afecta numerosas
anormalidades del desarrollo, crecimiento y homeostasis en organismos animales [5].

Objetivos
Objetivo general:

● Evaluar los niveles de expresión de β-catenina y GAPDH, en extractos totales de proteína

de células HEK293T, incubadas con y sin LiCl.

Objetivos específicos:

● Realizar extractos proteicos totales de células HeK293T.

● Determinar la concentración de proteínas totales obtenidas.
● Detectar la presencia de β-catenina en la muestra extractos totales de células HEK293T
mediante Western blot.
● Detectar la presencia de β-catenina mediante inmunofluorescencia en células HEK293T.
 Materiales y métodos
Transfección
Para la Transfección de moléculas de DNA recombinante en células derivadas de mamíferos
HEK293, que previamente los ayudantes de laboratorio transfectaron promotores XX para ello se
utiliza el reactivo comercial Lipofectamine ® 2000. Posteriormente se incubaron con LiCl para
activar la señalización de la vía Wnt/B-catenina. Para determinar la actividad reguladora de unas
secuencias de DNA genómico se utilizó el gen reportero de luciferasa Luc2 inserto en plásmido
STF y para su normalización se co-trasfectó un vector de expresión para otra luciferasa de
Renilla reniformis REN, la cual se mantiene constante entre ensayos. Para ello, se utilizó kit
“Dual-Glo® Luciferase Assay System”, se siguieron las instrucciones del kit y los datos
analizados se a través de la razón Luciferasa/Renilla para cada condición y normalizados según
el control. (Anexo 2) Para cada condición fue realizado por triplicado, para lo que se trabajó con
2 tubos: el primero con una mezcla de ADNs y Optimem según el volumen de plásmido STF, y 1
uL de p3000 por pocillo y se dejó incubando durante 5 minutos. Luego se mezcló en un segundo
tubo Lipofectamina y Optimem para luego mezclar ambos tubos y dejar incubando durante 20
minutos a temperatura ambiente, para luego incorporar un volumen determinado de 13 uL de
Lipofectamina para cada una de las condiciones descritas. (Anexo 2)

Extracción y Cuantificación de proteínas por Método de Bradford

Con el fin de obtener extractos proteicos derivados de células HEK293T provenientes de riñón
humano, se crecieron en placas de 60 mm para estimular a la vía Wnt con distintas
concentraciones de Wnt3a y poder analizar la acumulación de la proteína B-catenina.
Primeramente, se descartó el medio de cultivo y realizando lavados con PBS 1X, posteriormente
se agregaron 200 ul de buffer de lisis y se incubó durante 10 minutos con intervalos de vortex
cada 2 minutos. Se realizó una curva de calibración utilizando concentraciones conocidas de
proteína BSA, cuantificando mediante el método de Bradford utilizando Comassie Blue G-250.
(Tabla 2) Luego se midió absorbancia a 595 nm, y se interpoló en la curva ( ug vs A 595) el dato
obtenido de la muestra de extractos proteicos en las condiciones diferenciales con DMSO y
CHIR.(Fig.2)

Western blot (SDS-PAGE)

Para evaluar los niveles de expresión de B-catenina y Gapdh, en extractos de células HEK293, se
transfectaron con concentraciones crecientes de Wnt3a. Para ello se realizaron geles SDS-PAGE
(Anexo X) y se realizó el montaje del sistema de electroforesis Protean III, BioRad y se procede
a cargó un volumen equivalente 20 ng de muestra de proteína en condición con CHIR y DMSO
(Anexo X2), adicionando previamente buffer de carga, y se corrió a 100 V durante 15 minutos
aproximadamente. Finalmente, los docentes realizaron la transferencia de las proteínas a una
membrana de Nitrocelulosa, utilizando el sistema de transferencia Protean III, BioRad, bajo un
amperaje constante de 0,25 A durante 1 hora aproximadamente. Para la visualización se lavó la
membrana con PBS-Tween 1% y se sumergió en una solución de Rojo Ponceau en agitación, del
cual se retiró el exceso con agua destilada.
Llegados hasta este punto, la membrana de nitrocelulosa fue bloqueada por docentes
previamente con leche descremada al 5% en tampón de lavado PBS 1X + Tween 20 0,1% y se
dejó incubar durante 1 hora. Posteriormente se incubaron anticuerpos primarios anti-Bcatenina
(H-102) rabbit polyclonal IgG, sc-71999 y anti-Gapdh (6C5) mouse monoclonal IgG1 sc-32233
(Santa Cruz Biotechnology inc.) como control de carga durante 1 h, en PBS-Tween/Leche.
Luego se realizaron 3 lavados con PBS. Posteriormente se incubaron los anticuerpos secundarios
X durante 1 hora, para realizar un lavado con PBS en triplicado. Finalmente se realizó el
revelado en cámara oscura mediante quimioluminiscencia, con ECL Plus (GE Healthcare).

Inmunofluorescencia
Con el fin de evaluar la localización subcelular de B-catenina en células HEK293 en condiciones
control e incubadas con Wnt3a se realizó una inmunofluoresencia indirecta. Para ello
previamente los docentes sembraron cultivos celulares adherentes tratándolos en portaobjetos de
vidrio con poly-L-lisina, se dejó incubar toda la noche a 37°C en condiciones de humedad y 5%
de CO2. Posteriormente se trató con Wnt3a durante 5 horas, para posteriormente ser fijado
durante 20 minutos en condiciones con PFA 4% en PBS 1%. Luego su permeabilización fue
realizada durante 10 minutos con Tritón 0,5% en PBS 1X. El consiguiente bloqueo se realizó con
Albúmina 1%. La incubación del anticuerpo primario Anti-β-catenina Mouse 1:250 (Santa Cruz
Biotechnology inc.) en Albúmina 1%, posteriormente se realizaron lavados con PBS 1X, para
posteriormente proseguir con la incubación del anticuerpo secundario Anti-Mouse Goat 555
Alexa Fluor 1:500 en Albúmina 1%, para lavarlo nuevamente por duplicado con PBS 1X y
finalizando un lavado con DAPI 1:1000 en PBS 1X con el fin de teñir los núcleos de las células.
Llegados hasta este punto se realizó el montaje en un portaobjetos, para su análisis en
microscopio de fluorescencia.

Azul de Toluidina
Este colorante metacromático catiónico tiñe estructuras basófilas como la cromatina, se puede
comportar como colorante ortocromático (tiñe azul) o metracromático (tiñe violeta-rojo),
dependiendo de las diferentes condiciones y naturaleza de la sustancia teñida. Para ello los
docentes incubaron en cover una línea celular progenitora hematopoyética KG-1, el cual fue
lavado con H20, posteriormente se incubaron con Azul de Toluidina durante 2 minutos a 95°C y
realizar lavados con H20 por duplicado, para finalmente montar el cover en medio de montaje
líquido Fluoromount, secar en la estufa a 37°C para su visualización en microscopía óptica de
campo claro 100X.
 Resultados

Ensayo de Luciferasa
Se transfectó Luciferasa con reactivo comercial Lipofectamine ® 2000. Luego se incubaron con
LiCl para activar la señalización de la vía Wnt/B-catenina. Finalmente, se contransfectó con una
de Renilla reniformis REN, la cual se mantiene constante entre ensayos (Tabla 1) (Fig. 1)

Tabla 1. Normalización de la transfección con Luciferasa. Los resultados obtenidos de la

razón Luc/Ren de cada grupo fue sacado por el promedio del ensayo por triplicado de las
muestras para todas las condiciones descritas en la tabla.
Luc/Ren Luc/Ren Luc/Ren
(Arenas/Cortés) (González /Astorga)-
(Alba/Chamorro)
(Anziani/López/ Paz) (Sharp/Sandoval)
PSC22P+
0,0300 0,0480 0,0389
(80ng)
wnt3a (40ng) 0,147 0,1530 4,4
wnt3a (80ng) 2,366 0,127 0,202
wnt5a (40ng) 8,22^-3 0,0173 0,0746
wnt5a (80ng) 0,011 0,0218 0,068
B-catenina 0,601 1,16 1,056
DMSO 6,15^-3 0,0145 0,082
CHIR 3,50 4,89

Figura 1. Ensayo reportero de la Luciferasa. Representación gráfica de los resultados

obtenidos de la normalización de la Luciferasa, para los 3 grupos de la sección 2.
Cuantificación de Proteínas por el Método de Bradford
Una vez realizadas todas las muestras de la tabla 1, se prosiguió a medir la absorbancia a 595 nm
de todas éstas (Tabla 2). La cuantificación se realizó por el método de Bradford y esta emplea un
colorante hidrofóbico Coomassie Blue G-250. Para este método la longitud de onda para su
detección es de 595 nm. El mecanismo de acción es que reacciona directamente con aminoácidos
específicos y estructuras terciarias de la proteína.

Tabla 2. Absorbancias obtenidas a 595 nm para realizar la curva patrón de BSA.

BSA ug de
Tubo Absorbancia (595 nm)
proteína/mL
Control 0 0
2 2 0,01
3 4 0,017
4 6 0,03
5 8 0,04
6 10 0,047
DMSO x 0,024
CHIR x 0,011

Una vez medida la absorbancia, se realizó la cuantificación de extractos de proteínas de lisado de

células HEK293, para esto es necesario la construcción previa de una curva patrón de BSA (Fig.
2).

Figura 2. Curva de calibración para la determinación de concentraciones de proteínas.

Elaborada a partir de concentraciones conocidas de BSA.
Los valores obtenidos de la muestra de DMSO y de CHIR (Tabla.2), ambas con concentraciones
desconocidas se deben interpolar en la ecuación de la recta presente en la curva de calibración
(Fig. 2) realizada con los datos de µg de proteínas y A595:
y = 0,0048x - 0,0001, reemplazando la absorbancia obtenida de cada muestra:

1) Muestra DMSO:
0.024 = 0.0048x – 0.0001
x = 4.98 ug/mL

2) Muestra CHIR:
0.011 = 0.0048x – 0.0001
x = 2.27 ug/mL

Luego de conocer la concentración de cada muestra problema en condiciones DMSO y CHIR, se

procede a calcular cuántos μL de muestra se deben cargar en el gel con su volumen respectivo de
buffer de carga (Anexo 3).

Transferencia de proteínas a la membrana de nitrocelulosa

En la (Fig. 3), se observa la membrana de nitrocelulosa una vez ocurrida la transferencia. Se

observa en el carril 1 el marcador de peso molecular. una vez finalizada la transferencia se
procede a la tinción con Rojo Ponceau, donde no se observó la presencia de proteínas, luego se
procedió con un lavado con agua destilada. La membrana de nitrocelulosa ahora está lista para
ser bloqueada y posteriormente incubada con anticuerpo primario y secundario.

Figura 3. Membrana de nitrocelulosa previo al bloqueo e incubación de anticuerpos. En el

carril 1 está el marcador de peso molecular, en el carril 4 se cargó la muestra y en el carril 5 se
cargó la muestra control.
Western Blot
La membrana de nitrocelulosa fue cortada para su incubación con el anticuerpo primario contra
las proteínas de interés, posteriormente con el anticuerpo secundario y se realizó 3 lavados para
parar la interacción antígeno-anticuerpo primario. El revelado para GADPH se reveló en un
papel Film Kodak (Fig. 4).

Figura 4. Revelado de GAPDH en Film Kodak. El carril uno corresponde a PageRuler

Prestained Protein Ladder, los carriles C1,2,3,4,5 corresponden a las muestras control y los
carriles M1,2,3,4,5 correspondientes con extractos de GAPDH provenientes del cultivo celular
HEK293. En cada carril se cargaron 20 ng de proteínas de las células HEK293.

El revelado de la membrana de nitrocelulosa para β-Catenina con anticuerpos específicos no fue

detectable en papel Film (Kodak) (Fig. 5).

Figura 5. Revelado de β-Catenina en Film Kodak. No se visualizó ninguna transferencia y por

lo tanto no se reveló ninguna banda esperada.
Figura 6. Resultados teóricos esperados para la transferencia de membrana de nitrocelulosa
para GADPH y ꞵ-catenina. Revelado a partir DMSO como control en Carril 1 y a distintas
concentraciones de CHIR 0,5, 1, 2 μM Carril 2, 3, 4, respectivamente, en papel Film (Kodak).
Para la detección colorimétricas de cultivos celulares KG-1, se utilizó una tinción con Azul de
Toluidina. (Fig.7)

Figura 7. Tinción de células KG-1 con Azul

de Toluidina. Se observa la tinción de
estructuras basófilas celulares, como la
cromatina en el núcleo. Se analizó en
microscopio de óptico de campo claro 100X.
Inmunofluorescencia

Para la visualización de la activación de la vía Wnt / β-catenina se realizó la incubación con

Anti-βcatenina Mouse 1:250, y su Anticuerpo secundario Anti-Mouse Goat 555 Alexa Fluor
1:500, donde no se observó una activación de la vía al presentar una baja fluorescencia.

Fig
ura 8. Inmunofluorescencia de células HEK293 Anti-β catenina Mouse 1:250. La
visualización fue realizada en un microscopio de fluorescencia.
 Discusión

Los ensayos basados en luciferasa usan el gen luc de la luciferasa de luciérnaga (firefly), que es
uno de los genes reporter usados con más frecuencia y que permite monitorizar la actividad
promotora en el control de la expresión génica. Los genes reporter se usan ampliamente para
estudiar los mecanismos de expresión y regulación génica. Puesto que la mayoría de los genes
expresados no son fácilmente detectables, los genes reporter se introducen en el DNA celular
para investigar la función del gen mediante una propiedad fácil de medir: la luminiscencia [6].
Luego de realizar el ensayo reportero de luciferasa (Fig. 1) se determina la actividad reguladora
de la vía Wnt / β-catenina, la cual se ha reportado ser muy sensible al tratamiento con cloruro de
litio (LiCl) [7] lo que se puede apreciar en dicha figura que las células al ser incubadas con LiCl
respondieron a la vía ya que se observa un aumento de actividad de luciferasa en el tratamiento
CHIR que estabiliza la vía (barra roja y azul). El control DMSO no presenta actividad luciferasa
lo cual era esperado ya que DMSO el solo el vehículo sin la droga por lo que no responderá a la
vía.

Para evaluar los niveles de expresión de β-catenina, en extractos totales de proteína de células
HEK293 primero se lisan las células HEK293 por método químico ocupando buffer de lisis, que
rompen la barrera lipídica solubilizando la membrana y produciendo la salida del material
intracelular, después se procedió a la cuantificación de proteínas totales por método de Bradford.
Esa parte es importante para tener una idea de la concentración del extracto y asegurarse de que
las muestras se comparen en una base equivalente además permite medir la cantidad de la
proteína que se está cargando en cada pocillo por la relación entre concentración y determinar el
volumen apropiado para cargar en la electroforesis.

Al cuantificar las proteínas totales con el método de Bradford no se necesitó purificar la muestra
de extractos celulares, gracias a la especificidad del método. El reactivo que se usa está
compuesto por el colorante azul de Coomasie que se une más fácilmente a ciertos aminoácidos
básicos (principalmente la arginina, lisina e histidina) de las proteínas (los aminoácidos libres,
los péptidos y las proteínas de bajo peso molecular no producen color) por fuerzas de Van der
Waals e interacciones hidrofóbicas. Esta especificidad, aunque puede conducir a una variación
en la respuesta del ensayo a diferentes proteínas, (que es el principal inconveniente del método),
es lo que le da la ventaja de especificidad y de poder tratar extractos totales de células, sin
requerir un paso de purificación. Además, la cantidad de colorante unido a la proteína es
proporcional a la cantidad de proteínas por lo que puede cuantificarse midiendo la absorbancia
de la solución a 595 nm [8].

Previamente a la cuantificación de la muestra problema, se realizó una curva de calibración

(Fig.2) con concentraciones conocidas de BSA dando una ecuación de la recta y = 0,0048x -
0,0001 y con un r2 de 0,9939, lo que indica que es un buen modelo que explica y era apto para
realizar la medición mediante esta ecuación. Entonces calculando la concentración proteica se
obtuvo un resultado de 4.98 ug/mL para DMSO y 2.27 ug/mL para CHIR. Se tomó una
cantidad de 17.46 µL de solución de CHIR y 8 uL de solvente de DMSO para poder cargar 20 ng
de proteínas en el aparato electroforético y realizar el Western blot (Anexo 3).

Para evaluar los efectos de la activación de la vía Wnt / β-catenina sobre la proliferación, se
utilizó la molécula pequeña CHIR, un activador de la vía Wnt / β-catenina CHIR puede activar la
vía de Wnt / β-catenina mediante la inhibición de GSK3 y la posterior fosforilación y
degradación de β-catenina [9]. Para confirmar la activación de la vía Wnt / β-catenina a nivel de
proteína, se realizó un análisis de transferencia de Western para β-catenina.

La electroforesis del Western Blot se realiza bajo condiciones denaturantes esto significa que se
tratan en un medio que deja solo en estructura primaria a las proteínas y las dota de una carga
negativa proporcional a su tamaño de modo que sólo migren debido a su peso molecular y no a
otras características de las proteínas como (forma o carga) ya que esto podría hacer que proteínas
distintas migren a la misma altura ya que aunque un tenga más peso molecular otra puede tener
menor carga haciendo que migren del mismo modo. Después de separar la mezcla de proteínas,
se transfiere a una membrana. La transferencia se realiza utilizando un campo eléctrico orientado
perpendicular a la superficie del gel, haciendo que las proteínas se muevan fuera del gel y sobre
la membrana. Esta membrana es importante porque como los anticuerpos son moléculas grandes
y penetran los geles lentamente, las proteínas en el gel deben ser inmovilizadas sobre una
superficie expuesta lisa lo que permite un eficiente contacto con el anticuerpo [10].

Finalmente, la visualización en este práctico se utilizó el método de quimioluminiscencia en la

que se trata el complejo proteína de interés-anticuerpo primario con un anticuerpo secundario
marcado, que tiene unida la enzima horseradish peroxidase (HRP). La reacción entre la enzima y
la solución sustrato que se añade produce luz que es detectada como una señal, que se captura en
una película con un scanner que es luego revelada en un cuarto oscuro. El uso del anticuerpo
secundario permite lograr máxima sensibilidad. Ya que el anticuerpo primario al ser policlonal
con muchas regiones Fc, muchos anticuerpos secundarios se unirán a cada anticuerpo primario
resultando en una amplificación de la señal [10].
Como se observa en la (Fig. 5) no se pudo visualizar ninguna banda en el revelado, tanto las
muestras como el marcador de peso molecular, esto se debe posiblemente a que no se dejó el
tiempo suficiente para revelar β-catenina. Esto se comprueba que en la transferencia de la
membrana de nitrocelulosa (Fig.3) si se observó el marcador de peso molecular pero cuando esta
fue revelada luego de ser incubada, no se observaron bandas en Kodak Film. A su vez, en el
procedimiento de revelado deben mantenerse las condiciones de luz aptas y duración de
incubación las cuales no se cumplieron ya que entró luz en el cuarto oscuro y por lo tanto se vela
el film Kodak, no pudiendo visualizar las bandas. En conclusión, no se puede determinar si se
activó la vía Wnt / β-catenina mediante Western blot debido que no se pudo detectar β-catenina.
Se esperaba observar una banda correspondiente a 85 kDa, debido que la proteína β-catenina
posee dicho peso aproximadamente [11].

Al revelar la membrana de nitrocelulosa en el cuarto oscuro (Fig.4) el control de carga GAPDH

(proteína que se encuentra de manera basal en cantidades suficientes en las células) se puede
visualizar ya que, si presenta banda entonces con este resultado se puede deducir que al no
presentar bandas en el revelado de β-catenina no se debe a problemas en el procedimiento por lo
que implica que el método si permite detectar la β-catenina (si está en concentraciones
suficientes). La banda visualizada de GAPDH corresponde al peso molecular reportado de dicha
proteína, teniendo un peso de 36 kDa aproximadamente [12]. Pero al observar esta figura
presenta exceso de proteína ya que se ven las bandas de distinto tamaño siendo que eran de la
misma muestra, entonces se deduce que, por ejemplo, M1 y M2 (Fig. 4) no se diluyeron las
muestras correctamente para ser cargadas en el gel o simplemente no se calcularon de manera
correcta las concentraciones mediante la curva de calibración (Fig.
2).
La línea celular KG1 (Fig. 7) derivada de un paciente con eritroleucemia en recaída
mieloblástica tiene el fenotipo compuesto y el repertorio funcional de los mieloblastos [13].
Esta línea celular fue teñida con Azul de Toluidina, un colorante metacrómatico que se utiliza
típicamente a partir de soluciones débilmente ácidas y que unido al ADN o ARN, en cromatina o
sustancia Nissl, este colorante tiene un color azul. Esto se debe a que las cargas negativas en el
ADN de los grupos fosfatosatraen a los grupos polares cargados positivamente en el colorante, lo
que conduce a la agregación de colorante a colorante en una forma ordenada especializada que
forma una forma polimérica. Además, como ya se mencionó el ADN o ARN son polianiónicos y
la atracción por fuerzas de Van der Waals entre el colorante Azul de Toluidina y los polianiones
contribuye a la afinidad cuando se une al ADN o al ARN, al igual que el enlace hidrófobo [14].

En la (Fig. 8), se esperaba observar una visualización clara de la activación de la vía Wnt/ β-
catenina, lo cual se comprueba al observar una translocación hacia el núcleo de las células
HEK293T, donde se espera que active la maquinaria y donde es posible su detección (Anexo 1).
Pero lo que se observó fue diferente, ya que sólo fue posible detectar una leve señal de β-
catenina citoplasmática concentrada en las uniones de adherencia entre las células [7].
 Conclusión

Se logró realizar el extracto de proteínas de células HEK293, para determinar la concentración

de proteínas totales, utilizando una curva de calibrado de BSA en condiciones control y con
CHIR como estabilizante de la β-catenina.
Para evaluar los niveles de expresión se realizó un Western blot específico para β-catenina donde
no se pudo detectar presencia alguna tanto en la membrana de nitrocelulosa como en el revelado,
esto pudo deberse que el tiempo no fue suficiente y las condiciones lumínicas no fueron las
óptimas. Finalmente, en la inmunofluorescencia no fue posible determinar si la activación de la
vía Wnt/β-catenina fue realizada ya que no se observó una translocación hacia el núcleo de las
células utilizadas, lo cual es típico en dicha vía de señalización.
No se puede concluir si la vía fue activada en términos generales debido que no se trabajó con las
mismas muestras celulares en todas las actividades prácticas.
 Bibliografía

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 Anexos

Anexo 1. Vía de transducción de señales canónicas Wnt/ β-catenina. Cuando el Wnt no se use
a su receptor porque es secuestrado está toda la maquinaria inactiva y las β-Catenina son
fosforiladas, en cambia cuando Wnt se une a su receptor se secuestra el complejo encargado de
la degradación de las β-catenina y estas pueden translocar al núcleo y unirse a factores de
transcripción para activar la expresión de genes blancos.

Anexo 2. Preparación de ensayo reportero de luciferasa

1) 10 ng STF 2 ng REN 80 ng PCS2p+

(1μL) (0,2μL) (0.8μL)

2) 10 ng STF 2 ng REN 40 ng Wnt3a (4 40 ng PCS2p+

(1μL) (0,2μL) μL) (0,4μL)

3) 10 ng STF 2 ng REN 80 ng Wnt3a

(1μL) (0,2μL) (8μL)

4) 10 ng STF 2 ng REN 40 ng Wnt5a (4 40 ng PCS2p+

(1μL) (0,2μL) μL) (0,4μL)

5) 10 ng STF 2 ng REN 80 ng Wnt5a

(1μL) (0,2μL) (8μL)
6) 10 ng STF 2 ng REN 60 ng PCS2p+ 20 ng 𝛃cat (2
(1μL) (0,2μL) (0,6μL) μL)

7) 10 ng STF 2 ng REN 80 ng PCS2p+ DMSO (0,5μL)

(1μL) (0,2μL) (0,8μL)

8) 10 ng STF 2 ng REN 80 ng PCS2p+ CHIR 2μM

(1μL) (0,2μL) (0,8μL) (0,5μL)

Anexo 3. Volúmenes carga de gel de extractos proteicos de células HEK293.

μL buffer de
μL muestra
carga
CHIR 17.46 2.91
DMSO 8 1.33

Anexo.4 Preparación de geles SDS-PAGE

Resolving gel 10% Stacking gel

H2O (3680 μl) H2O (2720 μl)

Acrilamida 30% (3340 μl) Acrilamida 30% (680 μl)

Tris-HCl 1,5 M pH 8.8 (2600 μl) Tris-HCl 1M pH 8.8 (520 μl)

SDS 10% (100 μl) SDS 10% (40 μl)

PSA 10% (100μl) PSA 10% (40μl)

TEMED (4μl) TEMED (4μl)

Total: 10004 μl Total: 4004 μl