PROCEDIMIENTOS DE IDENTIFICACION BACTERIANA.

SISTEMAS MANUALES Y AUTOMATICOS. ULTIMAS

TENDENCIAS DE IDENTIFICACION .

1.- INTRODUCCION.

2.- ENSAYOS BIOQUIMICOS

2.1.- COMERCIALES
2.2.- CLASIFICACION DE PRUEBAS PARA
IDENTIFICACION BACTERIANA
2.2.1.- DEFINICION Y LECTURA DE PRUEBAS DE
IDENTIFICACION BACTERIANA.
2.2.1.1.- CATALASA
2.2.1.2.- PRUEBA DE COAGULASA.
2.2.1.3.- HIDRÓLISIS AL HIPURATO.
2.2.1.4.- TOLERANCIA A SAL. BILIS-ESCULINA
2.2.1.5.- AGAR DNAsa.
2.2.1.6.- AGAR MANITOL.
2.2.1.7.- OXIDASA
2.2.1.8 .- ROJO DE METILO
2.2.1. 9.- AGAR CITRATO
2.2.1.10.- FENILALANIN DEAMINASA
2.2.1.11.- DESCARBOXILACION LISINA.
2.2.1.12.- INDOL
2.2.1.13.- LACTOSA
2.2.1.14.- MANITOL, MOVILIDAD, NITRATOS
2.2.1.15.- UREASA
2.2.1.16.- AGAR HIERRO KLIEGER (KIA).
2.2.1.17.- AGAR AZUCAR TRIPLE HIERRO (TSI).
2.3.- IDENTIFICACION AUTOMATICA Y SUSCEPTIBILIDAD
BACTERIANA.
2.4.- IDENTIFICACION SEMIAUTOMATICA BACTERINA
(SISTEMA API).

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1.- INTRODUCCION.

La identificación de una bacteria es su asignación a un taxón

según una clasificación dada. Consiste en la determinación de las
características fenotípicas y/o genotípicas y la comparación de estas
características con los diferentes taxones de la clasificación
considerada. Las características a determinar y su número depende
principalmente del tipo de bacteria y del fin que se persigue en la
identificación. Los pasos a seguir para un perfecta identificación
bacteriana son:
obtener un cultivo puro
examen microscópico de células vivas y de frotis teñido por
coloración Gram. Se determina así la forma y el Gram del
microorganismo en estudio. También es importante determinar
la agrupación y la presencia de esporas y otras características
morfológicas de interés.
determinar las características nutricionales (en general se
desprenden de los métodos empleados en el aislamiento y
cultivo anteriores); fotoautótrofos, fotoheterótrofos,
quimioautótrofos, quimioheterótrofos.
realización de pruebas primarias (Gram, morfología, catalasa,
oxidasa, OF, fermentación de glucosa, esporas, crecimiento en
aerobiosis y anaerobiosis y movilidad.
realización de pruebas secundarias y terciarias a efectos de
llegar a especie. Estas dependerán del género o familia
determinado. (ej: producción de pigmentos, producción de indol
a partir de triptofano, producción de coagulasa, de fenilalanina
deaminasa, etc.) .

A los efectos de realizar identificaciones más rápidas, o cuando

las pruebas bioquímicas no son concluyentes, se recurre al uso de
antisueros específicos.
Los antígenos bacterianos pueden ser capsulares, somáticos (O) que
corresponden al lipopolisacárido de la pared de los Gram negativos,
flagelares (H), y los antisueros se identifican con esas letras y el
número o letra del antígeno correspondiente.

En una primera identificación se usan sueros polivalentes y para

la caracterización serológica se usan sueros monovalentes dentro de
cada tipo de antígeno.
Existen en el comercio antisueros para caracterización de:
Salmonella, Shigella, E.coli, Haemophilus, etc. También se pueden
utilizar métodos de cromatografía gaseosa para identificar productos
metabólicos, en particular para la identificación de bacterias
anaerobias no esporuladas como: Bacteroides, Fusobacterium, etc.
Se puede expresar el nombre de una cepa de la siguiente manera:
Yersinia entercolítica 4 03
género especie biotipo serotipo

2
2.- ENSAYOS BIOQUIMICOS

2.1.- COMERCIALES

La identificación de un aislamiento bacteriano puede realizarse

utilizando diferentes combinaciones de características y diferentes
criterios en la evaluación de similitudes. Los ensayos bioquímicos
tradicionalmente utilizados, llamadas pruebas bioquímicas
convencionales, generalmente determinan la actividad de una vía
metabólica (conjunto de reacciones químicas) a partir de un sustrato
que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer
transforma o no. Existen diferentes sistemas que facilitan la
realización de tales ensayos, porque proponen el mejor conjunto de
pruebas bioquímicas para la identificación de un grupo bacteriano,
porque simplifican la interpretación de un resultado utilizando un
valor numérico, porque proveen los reactivos listos para su uso o
porque son totalmente automatizables.

Las pruebas o ensayos bioquímicos, son pruebas simples que se

han desarrollado para demostrar en forma clara una determinada
característica bioquímica como presencia o ausencia de una
determinada actividad enzimática, grupo de enzimas o determinada
vía metabólica, crecimiento a una determinada temperatura,
crecimiento en presencia de inhibidores, etc. No significan de ninguna
manera un estudio profundo del metabolismo bacteriano. Para
llevarlas a cabo, se pueden utilizar diferentes sistemas de trabajo
(medio de cultivo, indicador, revelador, etc.) que puede ser diferente
aún para el mismo ensayo si se trata de diferentes microorganismos.
Por ejemplo se debe suplir con factores de crecimiento el medio de
cultivo para estudiar la fermentación de distintos azúcares cuando se
sabe que el microorganismo en estudio es exigente. A la
determinación de la especie se puede llegar según diversos sistemas
(manuales de identificación, comerciales, etc.).

Los sistemas comerciales más comúnmente usados son :

BBL, ENTEROTUBE II (Becton Dickinson). Es un sistema para
usar en la identificación de Enterobacterias, definida como
bastones Gram -, aerobios o anaerobios facultativos, oxidasa (-
). Consiste en un tubo de plástico con 12 medios de cultivo
contenidos en compartimentos individuales que se inoculan
simultáneamente en una etapa y permiten la detección de 15
características bioquímicas.
OXI/FERM TUBE II, (Becton Dickinson). Es un sistema listo
para usar para la identificación de bastones gram (-), aerobios
o anaerobios facultativos, oxidasa (+). Consiste en un tubo de
plástico de 12 medios de cultivo que permite la realización
simultánea de 14 pruebas bioquímicas.

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 API (Biomerieux) Es un sistema estandarizado para la
identificación de Bacterias Gram negativos. Consiste en una
plantilla con microtubos conteniendo medios de cultivo
deshidratados que se reconstituyen al agregar una suspensión
bacteriana. Permite la realización de pruebas bioquímicas a
partir de una única colonia bacteriana. Existen distintos
equipos, que identifican cada bacteria, entre ellos tenemos:
 API 20 E, bacilos gram negativos fermentadores de
glucosa, BGNFG (Enterrobacterias)
 API 20 NE, bacilos gram negativos no fermentadores de
glucosa , BGNNFG ( No enterobaterias).
 API C, versión para Candida spp.
 API 10S, versión minimizada de API 20E.
 API NH, versión para Neiseria spp y Haemophilus spp.

En esquema, la realización de una prueba bioquímica implica:

cultivar el microorganismo en un medio que contiene un
determinado sustrato o inhibidor y luego de la incubación
visualizar el crecimiento y la degradación de un sustrato, ya sea
por viraje de un indicador o por agregado de un reactivo
revelador de la presencia del sustrato, o de algún producto de
su degradación.
cultivar el microorganismo en un medio de propagación que
contenga el sustrato de una enzima inducible y luego de la
incubación demostrar la actividad enzimática.
en todos los casos se debe tener un cultivo fresco (18-24 hrs.
de incubación) en un medio en que el microorganismo se
desarrolla en forma óptima, a pH, fuerza iónica, atmósfera y
temperatura adecuados. Siempre que se prepara un nuevo lote
de medio de cultivo para una prueba, deben llevarse a cabo los
correspondientes controles de calidad, sembrando en dicho
medio una cepa positiva y otra negativa para ese test.

Si bien existen una gran variedad de pruebas bioquímicas

empleadas con fines de identificación, se enumerarán a continuación
solo las que se utilizan más frecuentemente, agrupadas según el tipo
de ensayo y se denominan según su nombre corriente.

2.2.- CLASIFICACION DE PRUEBAS PARA IDENTIFICACION

BACTERIANA

Para llevar a cabo una perfecta identificación bacteriana, hay que

llevar a cabo una serie de pruebas como las que siguen:
enzimas vinculadas con la respiración
 oxidasa
 catalasa
descomposición de azúcares simples, ácidos orgánicos y otros
 requerimientos de oxígeno

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 o OF (óxido-fermentación)
o crecimiento en caldo tioglicolato
 producción de ácido, o ácido y gas
 fermentación de carbohidratos
detección de enzimas y vías metabólicas
 RM-VP (rojo de metilo - Voges Proskauer)
 Gluconato
 O.N.P.G. (orto nitro ß-D-galactopiranósico)
 Esculina
 Hipurato
fuente única de carbono
 citrato
 malonato
 hipurato para coliformes
utilización de compuestos nitrogenados
 reducción de nitrato
o asimilación
o denitrificación
 descomposición de carbohidratos aminoácidos y otros
o indol
o H 2S
o fenilalanina
o lisina, arginina, ornitina
o urea
ensayos combinados
 TSI (Triple Azúcar Hierro)
 LIA (Agar Hierro Lisina)
 Bilis esculina
detección de exoenzimas
 lecitinasa
 proteasas, coagulasa
 amilasas
 celulasas
 desoxirribonucleasas
 acción de microorganismos sobre la sangre
(hemolisinas)
misceláneos
 KCN
 Bilis
 producción de pigmentos
test de crecimiento o inhibición
 temperatura
 NaCl
 antibióticos

2.2.1.- DEFINICION Y LECTURA DE PRUEBAS DE IDENTIFICACION

BACTERIANA.

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2.2.1.1.- CATALASA
Se utiliza para comprobar la presencia del enzima catalasa
que se encuentra el la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias
facultativas que contienen citocromo. La principal excepción es
Streptococcus spp. Originariamente, esta prueba era utilizada para
diferenciar entre los siguientes géneros:
Streptococcus (-) de Micrococcus (+) y/o Staphylococcus (+).
Bacillus (+) de Clostridium (-).
Lysteria monocytogenes (+) y/o Corynebacterium (+, con las
excepciones de C.pyogenes y C.haemolyticum, ambos -) de
Erysipelothrix (-)

Una prueba de rutina de la catalasa a temperatura ambiente

puede hacerse siguiendo dos técnicas:
Método del portaobjetos (recomendado):
 Con el asa de siembra recoger el centro de una colonia
pura de 18-24 horas y colocar sobre un portaobjetos
limpio de vidrio.
 Agregar con gotero o pipeta Pasteur una gota de H2O2 al
30% sobre el microorganismo sin mezclarlo con el cultivo.
 Observar la formación inmediata de burbujas (resultado
positivo).
 Desechar el portaobjetos en un recipiente con
desinfectante.
 Si se invierte el orden del método (extender la colonia
sobre el agua oxigenada) pueden producirse falsos
positivos.
Método del tubo de ensayo:
 agregar 1ml de H2O2 al 3% directamente a un cultivo
puro densamente inoculado.
 observar la formación inmediata de burbujas (resultado
positivo).

Si se utilizan para esta prueba cultivos procedentes de agar

sangre, se debe tener la precaución de no retirar algo de agar con el
asa al retirar la colonia ya que los eritrocitos del medio contienen
catalasa y su presencia dará un falso resultado positivo

2.2.1.2.- PRUEBA DE COAGULASA.

Se emplea para determinar si el Estafilcoco es (+),
Staphylococcus aureus. o negativo denominandose estafilcoco
coagulasa negativo. Este genero produce una proteina, denominada
coagulasa, capaz de aglutinar el plasma que previamente se ha
tratado con oxalato, citrato, EDTA o heparina y que esta en presencia
de un factor contenido en el suero. La prueba se realiza generalmente
en tubo, y la mezcla se incuba a 37 ºC durante cuatro horas,
considerándose positivo ante una coagulación , en caso de

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negatividad el tubo se deja a temperatura ambiente durante 24 horas
y se repite de nuevo la lectura del mismo modo.

2.2.1.3.- HIDRÓLISIS AL HIPURATO.

Se emplea en la determianción de estreptococos capaces de hidrolizar
este sustrato mediante una enzima denominada hipuricasa. Como
revelador de este prueba se emplea la nirhidrina que al combinarse
con los aminoácidos presentes da lugar a un producto de color
púrpura.

2.2.1.4.- TOLERANCIA A SAL. BILIS-ESCULINA

Ambas prueba se emplean para la determinación de estreptocos, la
primera consiste en inocular en un medio liquido y alta concentración
de sal (6,5 %) el estreptococo a identificar. Se incuba durante 24
horas a 35 ºC y se considera positivo cuando hay un viraje del tubo a
violeta o hay presencia de crecimiento (liquido turbio).
La segunda prueba se emplea como medio diferencial para
enterococos y se recomienda para el aislamiento y la identificación
presuntiva de estreptococos del grupo D. La presencia de bilis de
buey no inhibe el crecimiento de los enterocos del grupo D, pero si
del resto de las bacterias Gram positivas. A su vez, en este medio
biliar, todas las cepas del grupo D, son resistentes al calor, toleran la
bilis e hidrolizan la esculina, poniéndose de manifiesto por
coloración negro-pardusca que toma el cultivo.

2.2.1.5.- AGAR DNAsa.

Se emplea para determinar la actividad de la desoxirribonulceasa
demicroorganismos principalmente de los estafilococos. Los
microorganismos que se siembran en este medio degradan el ADN
que contiene, dando lugar a unas zonas de transparencia alrededor
de las zonas sembradas, después de inundar la placa con HCl 0,1N,
mientras que esto no produce si no hay producción de DNAsa.

2.2.1.6.- AGAR MANITOL.

Se emplea para el aislamiento selectivo estafilococos de
Staphylococcus aureus, el aspecto del medio es blanco y opaco,
contiene 5,5% de cloruro sódico confiriéndole un carácter selectivo.
La placa se inocula y se incuba durante 24 horas a 35ºC, la presencia
de colonias de color amarillo o anaranjada rodeada de un halo
transparente es indicativo de esta bacteria.

2.2.1.7.- OXIDASA
Esta prueba sirve para determinar la presencia de enzimas
oxidasas. La reacción de la oxidasa se debe a la presencia de un
sistema citocromooxidasa que activa la oxidación del citocromo que
es reducido por el oxígeno molecular que produce agua o peróxido de
hidrógeno según la especie bacteriana. El oxígeno actúa por tanto
como aceptor final de electrones en la cadena transportadora de

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electrones. Por lo general, el sistema citocromooxidasa sólo se
encuentra en los organismos aerobios, algunos anaerobios
facultativos y, excepcionalmente, en algún microaerófilo (Vibrio
fetus), pero los anaerobios estrictos carecen de actividad oxidasa.
Asímismo, la presencia de oxidasa va ligada a la producción de
catalasa, ya que ésta degrada el peróxido de hidrógeno que se
produce como consecuencia de la reducción del oxígeno y cuya
acumulación es tóxica. La prueba de la oxidasa se usa sobre todo
para
identificar todas las especies de Neisseria (+)
diferenciar Pseudomonas spp de los miembros oxidasa
negativos de las enterobacterias.

El reactivo de la oxidasa más recomendado es la solución acuosa

al 1% de diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina (reactivo de
Kovacs). Es menos tóxico y mucho más sensible que el
correspondiente compuesto dimetilo (reactivo de Gordon y McLeod),
pero es más caro. Este reactivo tiñe las colonias oxidasa positivas de
color lavanda que vira gradualmente a púrpura-negruzco intenso, la
realización de la prueba presenta dos variantes:
Método en placa directa
 Agregar directamente 2-3 gotas de reactivo a algunas
colonias. No inundar toda la placa y no invertirla.
 Observar los cambios de color. Con el reactivo de Kovacs
la reacción se produce en unos 10-15 segundos, mientras
que con el de Gordon y McLeod es dentro de los 10-30
minutos.
Método indirecto sobre papel
 Colocar un trozo de papel de filtro de 3x3cm
aproximadamente en una placa de Petri.
 Agregar 2-3 gotas del reactivo de Kovacs en el centro del
papel.
 Extender con el asa de siembra una colonia sobre el
papel impregnado.
 La reacción de color positiva se produce a los 5-10
segundos.

2.2.1.8 ROJO DE METILO

Estas dos pruebas forman parte del IMVIC de las colimetrías y
permiten la diferenciación dentro de las enterobacterias del grupo coli
y aerógenes. Las enterobacterias son anaerobios facultativos que
utilizarán la glucosa en dos fases: primero la metabolizarán
aerobiamente (respiración oxibióntica) consumiendo rápidamente el
oxígeno del medio, para, en segundo lugar, continuar
metabolizándola por vía anaerobia (fermentación). Ésta puede ser de
dos tipos:
Fermentación ácido mixta: La realizan las bacterias del grupo
de E.coli y los productos finales son ácidos orgánicos (ácidos

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 fórmico, acético, láctico y succínico) que provocan un fuerte
descenso del pH inicial del medio. Puede detectarse por el
viraje del indicador de rojo de metilo que permanece amarillo
por encima de pH 5,1 y rojo por debajo de 4,4.
Fermentación butilén glicólica: La realizan las bacterias del
grupo Klebsiella spp Enterobacter spp (antiguo aerógenes). Los
productos finales son compuestos neutros como el butanodiol y
el etanol, produciéndose acetoína como intermediario que
podrá ser detectada añadiendo al medio KOH (reactivo A de
Voges-Proskauer) y alfa-naftol (reactivo B de Voges-Proskauer)
que reaccionarán con este compuesto produciendo un color rojo
característico.

Para la realización de estas dos pruebas se cultiva el

microorganismo en caldo RMVP (medio de Clark y Lubs) y se incuba a
30ºC durante un periodo de 3 días como mínimo y 5 como máximo.
Al revelar las pruebas, se separa el cultivo en dos porciones de unos
2,5ml que servirán para cada uno de los ensayos.
Rojo de Metilo: A uno de los tubos se le añade unas gotas (4-5)
de solución indicadora de Rojo de Metilo. Se agita para
homogeneizar y se observa la coloración. Se considera positiva
si vira al rojo y negativa si permanece amarillo.
Voges-Proskauer: A la otra porción de cultivo se le añade:
 0,6ml del Reactivo A de Voges-Proskauer (alfa-naftol 5%
en etílico absoluto). El medio adquiere un aspecto
lechoso.
 0,2ml del Reactivo B de Voges-Proskauer (KOH 40%).
Desaparece el aspecto lechoso y se agita fuertemente.
Si la prueba es positiva, antes de cinco minutos aparece un color
rosado-violáceo, más o menos intenso, que se inicia en la parte
superior del tubo. Si la prueba es negativa no aparece coloración
alguna.

2.2.1. 9.- AGAR CITRATO

Esta prueba sirve para determinar si un organismo es capaz de
utilizar citrato como única fuente de carbono y compuestos
amoniacales como única fuente de nitrógeno en su metabolismo,
provocando una alcalinización del medio. Entre las enterobacterias
estas características se dan en los siguientes géneros: Enterobacte
rspp, Klebsiella spp , Serrato spp , Citrobacte spp r y algunas
especies de Salmonella spp. Sin embargo, Escherichia, Shigella,
Salmonella typhi y Salmonella paratyphi son incapaces de crecer con
esos nutrientes.
Se cultiva el microorganismo en agar citrato de Simmons. Este
medio contiene citrato de sodio y fosfato de amonio como fuentes de
carbono y de nitrógeno respectivamente y azul de bromotimol como
indicador de pH. Sólo las bacterias capaces de metabolizar el citrato
podrán multiplicarse en este medio y liberarán iones amonio lo que,

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junto con la eliminación del citrato (ácido), generará una fuerte
basificación del medio que será aparente por un cambio de color del
indicador de pH, de verde a azul.

2.2.1.10.- FENILALANIN DEAMINASA

Esta prueba determina la capacidad de un organismo para
desaminar el aminoácido fenilalanina en ácido fenilpirúvico por su
actividad enzimática de fenilalanina desaminasa, con la consiguiente
acidez resultante. Esta actividad enzimática es característica de todas
las especies del género Proteus spp y del grupo Providencia por lo
que se usa para separar ambos géneros de otras enterobacterias.
Se cultiva el microorganismo en agar fenilalanina sembrando la
superficie del slant con abundante inóculo e incubando durante 12-16
horas. Seguidamente se añade 0,2ml de una solución de cloruro
férrico al 10% de manera que inunde todo el crecimiento. La
presencia de ácido fenilpirúvico (prueba positiva) se manifiesta por la
aparición de un color característico verde oscuro o verde-azulado.

2.2.1.11.- DESCARBOXILACION LISINA.

Se realiza en tubo (caldo o sólido) y se emplea para la
identificación de enterobacterias, cuando estas se proceden a su
cultivo fermenta la glucosa y el medio del pH disminuirá. A partir de
aquí, si son capaces de realizar la descarboxilacion de L-lisina por la
producción de la descarboxilasa el pH volverá a aumentar y en
presencia de un indicador como el púrpura de bromocresol, los tubos
inoculados positivos tomaran un color púrpura o violeta mientras
que los negativos serán de color amarillo. Existe una variante que
consiste que en el medio sólido se adiciona hierro (agar lisina hierro)
capaces sulfuro ferrroso obsrvándose un precipitado negro. Además
pueden aparecer burbujas de gas con lo que el medio se puede
desplazarpara Se utiliza para diferenciar Salmonella spp de Proteus
spp,

2.2.1.12.- INDOL
Mediante esta prueba se detecta la liberación de indol en un
cultivo bacteriano. Dicha liberación se debe a la degradación del
aminoácido triptófano mediante el enzima triptofanasa. Para la
realización de esta prueba la bacteria se cultiva durante 24-48 horas
en un caldo de triptona con NaCl al 0,5% (la triptona presenta
abundante triptófano). Para la posterior detección del indol se usa el
reactivo de Kovacs, cuyos componentes son los siguientes:
Alcohol amílico o isoamílico (puede sustituirse por alc.butílico)
p-dimetilamino-benzaldehído
HCl (concentrado)

Se disuelve primero el aldehído en el alcohol y después se

agrega lentamente a esta mezcla el ácido. Para el control de calidad
del reactivo se pueden utilizar cultivos conocidos. Las más

10
convenientes son Escherichia coli (indol+) y todas las especies de
Klebsiella spp (indol-).
Si la bacteria posee la enzima triptofanasa, al añadir al medio 5
gotas del reactivo de Kovacs, se producirá un anillo de color rojo en
la superficie del caldo y la prueba será considerada positiva. Si esto
ocurre después de 24 horas, la prueba se considera completa, pero si
es negativo deberá incubarse otras 24 horas y repetirse la prueba.
Por ello es conveniente hacer siempre la prueba no en el tubo
incubado sino en una porción de unos 2ml que se retira de él
asépticamente.

2.2.1.13.- LACTOSA
Esta prueba se usa para diferenciar entre las enterobacterias en
general y el grupo de las coliformes. Se trata por tanto de una prueba
de gran importancia debido a que los colifomes se utilizan como
organismos indicadores de contaminación fecal en análisis, sobre
todo, de aguas. En bacteriología se define el grupo de organismos
coliformes como los "bacilos Gram negativos, aerobios y anaerobios
facultativos, no formadores de esporas y que fermentan la lactosa
con formación de gas a 35ºC en 48 horas". No se trata de un grupo
taxonómico e incluye una gran variedad de bacterias, la mayoría de
ellas de origen intestinal.

Una manera sencilla de realizar la prueba de la fermentación de

la lactosa en enterobacterias es sembrar el microorganismo en agar
McConkey, ya que este medio, además de selectivo frente a bacterias
no entéricas, es diferencial ya que contiene lactosa y un indicador de
pH (rojo neutro). En agar McConkey las bacterias Gram positivas ven
inhibido su crecimiento debido a la presencia de sales biliares y cristal
violeta y sólo crecerán las enterobacterias, pero entre ellas las que
fermenten la lactosa (coliformes) liberarán productos ácidos que
producirán un cambio de pH que se detectará gracias al rojo neutro.
Las colonias lactosa (+) aparecerán de color rojo o violeta
contrastando con la coloración amarillenta de las colonias lactosa (-).

2.2.1.14.- MANITOL, MOVILIDAD, NITRATOS

Se incluyen en este apartado 3 pruebas bioquímicas debido a que
se pueden realizar cultivando el microorganismo en un único medio,
el Manitol Movilidad, que se prepara en tubo con agar recto y se
siembra en picadura, incubándose a 37ºC durante 24 horas. También
existe la posibilidad de hacer las pruebas en otros medios y por
separado.
Prueba del Manitol
Sirve para detectar si los gérmenes son capaces de fermentar
el manitol liberando productos ácidos que serán detectados
gracias al indicador rojo de fenol que cambiará a color amarillo.
Para esta prueba el medio manitol movilidad incluye 7,5 g/l de
D-Manita. Bacterias manitol (-) son, dentro de las

11
 enterobacterias, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris y Shigella
dysenteriae. Entre las bacterias de importancia clínica, la
prueba del manitol sirve para diferenciar Staphylococcus aureus
(+) de Staphylococcus epidermidis (-).
Prueba de la Movilidad
Sirve para determinar si un organismo es móvil o inmóvil. Las
bacterias tienen movilidad por medio de sus flagelos que se
encuentran principalmente entre los bacilos aunque existen
algunas formas de cocos móviles. El medio manitol movilidad
permite la realización de esta prueba gracias a ser semisólido
ya que presenta solamente 3,5 g/l de agar. En estas
condiciones, las bacterias móviles producirán un enturbiamiento
homogéneo del medio debido a la distribución aleatoria de los
microorganismos. Por el contrario, las bacterias inmóviles
permanecerán en la misma línea de la picadura en que se
sembraron.
Entre las enterobacterias, la movilidad nos permite diferenciar
el género Klebsiella spp (-) de las restantes que suelen ser
movilidad (+).
Dentro del género Bacillus spp, nos permite diferenciar
B.anthracis (-) de otras especies generalmente (+).
Prueba de la reducción de nitratos
Sirve para determinar la capacidad de un organismo de reducir
el nitrato en nitritos. Para ello, el medio manitol movilidad
incorpora 1 g/l de potasio nitrato y para revelar la presencia de
nitritos después de su incubación se añaden los reactivos A y B
de Griess-Ilosvay en cantidades iguales (1ml aprox.). Un
cambio de color (rojo) dentro de los 30 seg indica prueba
completa con resultado positivo. Si no cambia de color, se
agrega directamente al tubo una pizca (unos 20mg) de polvo
de cinc purísimo, totalmente exento de nitratos o nitritos, y se
observa el cambio de color durante otros 30 seg, al cabo de los
cuales se realiza la interpretación final. Las enterobacterias son
generalmente nitratos (+). Esta prueba se utiliza
principalmente para diferenciar entre sí determinadas bacterias
de los géneros Haemophilus spp y Neisseria spp .

2.2.1.15.-UREASA
Determina la capacidad de un organismo de desdoblar la urea
formando dos moléculas de amoniaco por acción del enzima ureasa.
Esta actividad enzimática es característica de todas las especies de
Proteus y se usa sobre todo para diferenciar este género de otras
enterobacterias que dan negativo o positivo retardado. Se cultiva el
microorganismo en agar urea de Christensen. Este medio se
complementa después del autoclavado con 50ml/l de urea. Ésta será
degradada por aquellos microorganismos capaces de producir el
enzima ureasa. Esta degradación produce amoniaco que hará variar

12
el color del indicador de amarillo a rojo, poniéndose así de manifiesto
la actividad ureasa.

Para revelar el resultado de esta prueba es importante tener

en cuenta el tiempo de incubación ya que especies de Proteus spp
vuelven alcalino el medio poco después de la inoculación y sus
resultados deben ser leídos en las primeras 2-6 horas, mientras que
Citrobacter freundii y Klebsiella pneumoniae tienen actividad ureasa
dentro de las 24-48 horas de incubación.

2.2.1.16.- AGAR HIERRO KLIEGER (KIA).

Se utiliza este medio en lengüeta para la diferenciación de los
bacilos entéricos gram-negativos según la fermentación de dos
azucares (glucosa y lactosa) y la producción del sulfuro de hidrogeno.
La acidificación del medio a causa del proceso de fermentación se
pone de manifiesto con un cambio de color del rojo de fenol que
pasa de rojizo a amarillo. Los microorganismos que solo fermentan la
glucosa (Salmonella spp y Shigella spp ) que se encuentra a una
concentración 10 veces inferior a la lactosa, si bien producen viraje a
amarillo, este solo se produce en la parte vertical, mientras que la
superficie inclinada restablece el color rojo por oxidación del ácido. El
color amarillo obtenido en la acidificación del medio, producida por la
fermentación de la lactosa, es persistente. Los cultivos que contienen
microorganismos capaces de formar sulfuro ferroso, presentan un
precipitado negro. La producción de gas se observa por la formación
de burbujas e incluso por la rotura del medio. La incubación se realiza
durante 24 horas a 35ºC realizándose la lectura correspondiente a la
fermentación/oxidación de los azúcares, presencia/ausencia de
sulfuro ferrroso y presencia/ausencia de gas

2.2.1.17.- AGAR AZUCAR TRIPLE HIERRO (TSI).

Este medio de identificación es análogo al anterior, pero se le añade
un tercer azúcar teniendo pues glucosa (10 veces menos
concentración que lactosa), sacarosa y lactosa

LECTURA TSI (AGAR TRIPLE HIERRO)

GENERO S. INCLINADA FONDO GAS SH2
Escherichia A A + -
Shigella K A - -
Salmonella K A + +
Citrobacter A A + +
Klebsiella A A + -
Enterobacter A A - +
Serratia A A - +
Hafnia A A - +
Proteus K A + +
Yersinia K A - -

13
(A) : amarillo, acidificación del medio
(K): rojo,no acidificación del medio.

MEDIO SIEMBRA INCUBACI LECTURA + LECTURA -

ON
CITRATO PICADURA 35 -37ºC, azul verde
Y ESTRIA 18-24
h.oras
UREA ESTRIA 35 -37ºC, rosa crema
24 h.oras
FENILALANINA ESTRIA 35 -37ºC, Verde Amarillo
DEAMINASA 24 horas
(1)
INDOL MEDIO 35 -37ºC, Anillo rosa Anillo
LIQUIDO 24 h.oras amarillo
(2)
LISINA MEDIO 35 -37ºC, Purpura Amarillo
DESCARBOXILAS LIQUIDO 24 h.oras
A (3)
MANITOL SEMISOLID 35 -37ºC, Amarillo Rojo
MOVILIDAD O 24 h.oras Difusión No difusión
PICADURA
PICADURA 35 -37ºC,
Y ESTRIA 24 h.oras
TSI Lactosa-sacarosa Amarillo Rojo

Glucosa Amarillo Rojo

Gas Ennegrecimi No
ento ennegrecimi
ento
SH2 Producción No
burbujas producción
burbujas

La lectura de los tubos de TSI o KIA, se realizan mediante cuatro

dígitos, cada uno de los cuales corresponde a la lectura positiva o no
de la reacción, por ejemplo:
Escherichia coli AA10 :
 Amarillo superficie
 Amarillo fondo
 No produce gas
 No produce sulfhídrico
Proteus spp KA11:
 Rojo en superficie
 Amarillo fondo
 Produce gas (burbujas)

14
  Produce sulfhídrico ( ennegrecimiento del medio, por lo
que no se puede ver el fondo del tubo)
Shigella spp KA00
 Rojo en superficie
 Amarillo fondo
 No produce gas
 No produce sulfhídrico ( se observa el color amarillo del
fondo)

La nomenclatura en la lectura de los tubos, se puede modificar

en los dos últimos dígitos, modificando el (1) y (0) por (+) y (–)
respectivamente, quedando:
E.coli AA10 es igual AA+ -

2.3.- IDENTIFICACION AUTOMATICA Y SUSCEPTIBILIDAD

BACTERIANA.

Hoy en día, en el mercado existen dispositivos automáticos

capaces de identificar automáticamente al microorganismo (gram
positivo, gram negativos y levaduras) así como la concentración
mínima inhibitoria (CMI), entre estos dispositivos tenemos:
VITEK 2 (Biomerieaux)
MICROSCAN ( Dade-Diagnostics)

Ambos sistemas, empelan una tecnología de fluorescencia para la

detección del metabolismo bacteriano y un test de sensibilidad al
microorganismo, basado en el principio de curvas de crecimiento
cinético según el patrón fenotípico de resistencia, además se le puede
asociar una detección rápida de alto nivel que proporciona datos
fiables y rápidos que ayudan al clínico en el tratamiento de pacientes
con infecciones. Independientemente de la utilización de uno u otro
equipo, ambos constan del siguiente aparataje:
consola satélite, en la cual se identifica la placa correspondiente
de lectura, en la cual se ha inoculado el microorganismo
correspondiente.
módulo de incubación-análisis, en el cual se efectúan las
lecturas correspondientes. Se pueden realizar múltiples
incubaciones de distintas cepas, atendiendo al volumen del
módulo
ordenador
software de análisis y detección del microorganismo
microplacas de lectura ( 80 o 64 pocillos dependiendo del
sistema utilizado), en ellas se tienen tanto las pruebas
bioquímicas para identificar al germen y las concentraciones de
antibióticos distintas con las que se le enfrenta. Estas se tiene
que conservar en lugar refrigerado.

15
el procedimiento se puede resumir del siguiente modo:
Preparación de
Tinción de Gram Aislamiento de la inóculo bacteriano
bacteria 0,5 escala de
Mc Farland

Lectura de los datos

bioquímicos y Incubación de Inoculación en la
cinética bacteriana microplaca microplaca
cada 4 horas 35º-37ºC, 24 horas correspondiente (G+,
G-, levaduras)

Salida de informe
previa comprobación
del analista

2.4.- IDENTIFICACION SEMIAUTOMATICA BACTERIANA

(SISTEMA API).

El sistema API es un sistema estandarizado que permite la

identificación de cepas bacterianas (G+ y G-) y levaduras
(auxonograma) mediante test bioquimicos miniaturizados. El test
consiste en 20 microtubos (API20) o 10 microtubos (API 10) que
contienen los sustratos deshidratados. Los microtubos se inoculan
con una suspensión bacteriana que reconstituye los test. Las
reacciones producidas durante el periodo de incubación se traducen
en cambios de color (perceptibles o en presencia de reactivos que
delatan el color) o presencia de turbidez. La identificación de la
bacteria se realiza mediante un código de 7 dígitos utilizando una
tabla de lectura, catalogo analítico o del software de identificación. El
procedimiento sería el siguiente:

Preparación de inóculo
Tinción de Gram Aislamiento de la bacteriano 0,5 escala de
bacteria Mc Farland

Revelar los pocillos Incubación de galeria Inoculación en la galeria

correspondientes(*), 35º-37ºC, 24 horas correspondiente (G+, G-,
lectura e interpretación levaduras)
mediante el catálogo

Salida de informe previa

comprobación del
analista

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