BIOSENSOR DE PERÓXIDO DE HIDRÓGENO BASADO EN CATALASA PARA LA

DETERMINACIÓN DE MERCURIO MEDIANTE MEDICIONES DE INHIBICIÓN

Los compuestos de mercurio están ampliamente presentes en el aire, el agua y las solas
mercurio elemental o metálico, compuestos inorgánicos de mercurio y compuestos orgánicos
de mercurio.

El mercurio es un contaminante muy tóxico debido a su alta volatilidad y la posibilidad de

que se combine fácilmente con muchos compuestos orgánicos [1]. Es tóxico debido a sus
efectos deletéreos sobre el sistema nervioso central, altera la heminisíntesis y causa trastornos
neuropsiquiátricos [2,3]. Los límites máximos para las concentraciones totales de mercurio
en las aguas están estipulados en las reglamentaciones ambientales. Por ejemplo, la Agencia
de Protección Ambiental de EE. UU. Establece que el nivel máximo de contaminación del
agua superficial no debe ser superior a 2 ug L-1 (10 nmol L-1) [4]. El desarrollo de métodos
sensibles y selectivos para la determinación del mercurio es, por lo tanto, una necesidad muy
importante.

El mercurio se puede detectar mediante diversos métodos analíticos, como la espectrometría

de masas de plasma acoplado inductivamente (ICP-MS), por ejemplo [5], espectrometría de
absorción atómica, p. [6,7], X-.ray fluorescencee.g. [8] y cromatografía acoplada con emisión
atómica, por ejemplo [9]. Estas técnicas son altamente sensibles y reproducibles; sin
embargo, tienen inconvenientes, como la demora en llevar a cabo, el uso de grandes
cantidades de reactivos químicos y equipos costosos, la necesidad de personal calificado y
no pueden ser utilizados para el análisis de campo.

Los enfoques electroquímicos son particularmente ventajosos debido a su alta sensibilidad,

bajo costo y operación simple y pueden convertirse en sistemas de detección portátiles. Entre
ellos, se utiliza a menudo la voltametría de stripping anódico clásico [10], y también se han
desarrollado métodos potenciométricos para la determinación del mercurio [11,12]. Una
estrategia diferente se basa en la influencia de los iones metálicos en las señales
electroquímicas de ADN o ADNzimas, revisado en [13]. Dentro de las estrategias para el
reconocimiento del ion de metal a través de la monitorización de su interacción con
oligonucleótidos de ADN, p. [14-17], un enfoque importante para iones de mercurio
involvesthymine-thymine (T-T) pares de bases en dúplex de ADN con capacidad de
reconocimiento específico para unir Hg2 + en soluciones acuosas, p. [18-20]. Esto puede
conducir a límites de detección extremadamente bajos, pero la arquitectura de los electrodos
modificados es compleja.

En este trabajo, un amperometric catalasa basado en el biosensor para la determinación de la

inhibición de la toxicidad de los animales ha sido pre-pared y utilizado para el primer equipo.
Las condiciones de ensayo están optimizadas para maximizar el biosensor de respuesta,
incluyendo el efecto de la concentración de la enzima, la concentración de la concentración
de la enzima (H2O2), la incubación de tiempo, el pH de los electrones electromagnéticos.
Electrochemical impedance espectroscopy se utiliza para la primera vez a la herramienta de
diagnóstico para la inhibición del mercurio. En el caso de que se produzca un cambio en la
calidad de los alimentos,

Reagents
Reagents fueron todos de la rutina de análisis y se utilizó la depuración de la purificación.
(BSA) y glutaraldehida (GA) fueron adquiridos desde Sigma-Aldrich, Alemania. En la
mayoría de los casos, la mayoría de las personas que sufren de esta enfermedad, se encuentran
en la mayoría de los casos. En el caso de que se produzca un cambio en la calidad de los
alimentos, se debe tener en cuenta que, en el caso de los alimentos, Para los estudios de
inhibición, la cantidad apropiada de HG (NO3) 2 (Fisher Scientific, U.S.A.) se produjo en el
agua

Instrumentación
Se realizaron experimentos amperométricos y voltamétricos con un potenciostato Ivium
CompactStat (IviumTechnologies BV, Eindhoven, Países Bajos) y se realizaron mediciones
de impedancia con referencia 600 de potenciostato / galvanostato ZRA-Gamry (Gamry
Instruments, EE. UU.). Se utilizó un sistema de tres electrodos convencional para todos los
experimentos consistentes en un electrodo de carbono de vidrio de 1 mm de diámetro (GCE)
como electrodo de trabajo, un contraelectrodo de platino y un electrodo de referencia de Ag
/ AgCl (3 M de KCl).
Preparación del catalasa biosensor

La catalasa (Cat) se inmovilizó en la superficie del electrodo por enlaces cruzados con
glutaraldehído (GA) y albúmina sérica bovina (BSA) para que la enzima se mantenga cerca
de su entorno natural [31]. En el procedimiento optimizado, se pipeteó un volumen de 1u L
de mezcla que contenía 10 mg mL-1Cat, 40 mg mL-1BSA en la superficie de una GCE,
seguido inmediatamente por 1 L de GA al 2.5% (v / v), y dejar secar durante 1 ha temperatura
ambiente. El electrodo modificado enzimáticamente se designó Cat / GCE. Cuando no
estaban en uso, los biosensores se almacenaron en solución tampón de fosfato a 4 ° C.

Resultados y discusión

3.1. H2O2 biosensor

El biosensor de la enzima catalasa se caracterizó electroquímicamente por voltametría cíclica

en ausencia y en presencia de peróxido de hidrógeno. La Fig. 1A muestra los voltamogramas
cíclicos del electrodo de enzima Cat / GCE medido sin y con la adición de H2O2 2.4 mM en
tampón de fosfato 0.1 M, pH 7.0. En el electrolito de soporte, no aparecieron picos y cuando
se agregó peróxido, se observó un gran aumento en la corriente de reducción que comenzaba
alrededor de -0.4 V.

La influencia del potencial aplicado se investigó mediante amperometría de potencial fijo en

el rango de -0.5 V a 0.0 V frente a Ag / AgCl, ver Fig. 1B. La mayor respuesta al H2O2 se
logró a -0,5 V y luego disminuyó continuamente a medida que el valor del potencial aplicado
no se volvió negativo: el 67% de esta respuesta se obtuvo a -0,4 V, 30% a -0,3 V y solo 3%
a 0,0 V. A la luz de estos resultados, y para no utilizar un potencial muy negativo, pero para
garantizar una buena respuesta al peróxido, se seleccionó un potencial aplicado de -0,4 V
para las medidas de amperios-ometría.La respuesta al peróxido de hidrógeno fue lineal de
0,5 a 4,8 mM con un límite de detección (S / N = 3) de 0.28 mM y sensibilidad de 1.23 A
cm-2mM-1, ver diagrama de calibración en la Fig. 1C.3.2. Optimización de las condiciones
experimentales para la inhibición Las mediciones amperimétricas a potencial fijo se
realizaron en primer lugar mediante inyecciones sucesivas de cationes de mercurio en un
stirFigt

Optimización de las condiciones

experimentales para la inhibición Las mediciones amperimétricas a potencial fijo se
realizaron en primer lugar mediante inyecciones sucesivas de cationes de mercurio en una
FIV agitada.
solución de tampón fosfato, pH 7,0 en presencia de peróxido de hidrógeno, pero no se
observó reducción en la respuesta del biosensor debido a las concentraciones de mercurio.
Sin embargo, la incubación de la enzima biosen-sor con iones de mercurio condujo a la
inhibición. La respuesta al H2O2 se midió antes y después de la incubación con Hg2 + y se
observó una disminución en la respuesta al sustrato de la enzima, correspondiendo a su
inhibición. Todas las medidas adicionales se realizaron de esta manera. Se investigaron los
parámetros experimentales que pueden influir en el rendimiento del biosensor de inhibición
usando amperometría, tales como concentración de enzima y sustrato, pH del electrolito de
soporte y tiempo de incubación con iones de mercurio para optimizar la respuesta de
inhibición

Influencia de la concentración enzimática

Se evaluó la cantidad de enzima inmovilizada que conduce a la mejor respuesta al peróxido
de hidrógeno y Hg2 +. Se usaron diferentes concentraciones de 5, 10, 20 y 30 mg ml-1 de
solución enzimática, y la inmovilización se realizó como se explica en la sección
experimental; la respuesta al peróxido aumenta con el aumento de la carga de la enzima. La
inhibición se evaluó usando las pendientes de la curva de calibración para el peróxido de
hidrógeno antes y después de la incubación con 5 nM de Hg (II). El porcentaje de inhibición
disminuye con el aumento de la concentración de la enzima, siendo 26.3% para 5 mg mL-1,
3.9% para 10 mg mL-1, 0.7% para 20 mg mL-1 y no se observó inhibición para 30 mg mL-
1. El mayor porcentaje de inhibición se obtuvo para 5 mg mL-1, como era de esperar, sin
embargo, esto también corresponde a la menor respuesta al peróxido de hidrogen. Como
compromiso, se eligió una concentración de enzima de 10 mg mL-1 para futuros
experimentos.

Influencia de la concentración de H2O2

El grado de inhibición puede verse influido por la concentración del sustrato. Si el inhibidor
compite con el sustrato de la enzima, entonces un aumento de la concentración del sustrato
conducirá a una disminución de la inhibición de la enzima por el inhibidor [24]. Por otro
lado, cuando la concentración de sustrato es baja, es fácil que se oxide catalíticamente, y no
se observa una disminución clara de la corriente de respuesta con la adición de inhibidor. Por
lo tanto, para un biosensor de inhibición, la cantidad de sustrato enzimático debe ajustarse
cuidadosamente. Se examinó el efecto de la concentración de sustrato (H2O2) sobre la
inhibición de Hg2 +. Se usaron concentraciones de 0.1, 0.5 y 1.0 mM de H2O2; la respuesta
a Hg2 + en estas condiciones se muestra en Fig. 2. La inhibición máxima disminuyó con el
aumento en la concentración de peróxido. El límite de detección, calculado como la
concentración de iones de mercurio que conduce al 10% del grado de inhibición, I10,
[22,33,34]. también aumentado, Por lo tanto, un valor intermedio de H2O2 0.5 mM fue
elegido como el mejor valor para el biosensor de inhibición.

Influencia del pH
La sensibilidad de un biosensor enzimático puede depender significativamente del pH de la
solución. Por esta razón, se investigó la influencia del pH del electrólito de soporte sobre el
grado de inhibición en el Cat / GCE incubado con 5,0 nM de Hg2 + a valores de pH entre 6,0
y 8,0. La sensibilidad del biosensor de peróxido de hidrógeno disminuyó en un 4,4% cuando
se incubó con iones de mercurio en una solución de pH 6,0. Se obtuvo un valor de 35,7% de
inhibición a pH 7,0, y a pH 8,0 no se observó inhibición, véase la Tabla 1. Por lo tanto, se
seleccionó pH 7,0 como el mejor pH para experimentos adicionales, de acuerdo con el pH
óptimo para la actividad de catalasa. Este valor de pH también se ha utilizado en estudios de
inhibición enzimática para la determinación de iones de mercurio utilizando otras enzimas,
como la glucosa oxidasa [35,36] y la ureasa [26,37].
Influencia del tiempo de incubación
La influencia del tiempo de incubación en el grado de inhibición se investigó usando periodos
de incubación de 2, 5, 10 y 15 min con H2O2 0.5 mM, Fig. 3. El límite de detección
disminuyó y la inhibición máxima aumentó al aumentar el tiempo de incubación. El aumento
de la sensibilidad en comparación con 2 minutos de incubación fue del 40% durante 5
minutos, 84% durante 10 minutos y 116% durante 15 minutos. Para la minincubación de 10
y 15, se alcanzaron los límites más altos de inhibición y detección más bajos. Teniendo en
cuenta que el aumento en la sensibilidad de 10 a 15 min es mucho menor que de 5 a 10 min
y que los límites de detección fueron muy similares, 1.5 × 10-9 y 1.1 × 10-9M durante 10 y
15 min, respectivamente, una se seleccionó un valor de 10 min como tiempo de incubación
para otras mediciones amperométricas.
También se preparó y probó un biosensor de inhibición enzimática con una GCE modificada
con nanotubos de carbono (MWCNT) sobre la cual se inmovilizó la catalasa, pero
proporcionó solo un pequeño aumento de ~ 10% en la sensibilidad y un límite de detección
similar. Esto no es suficiente para justificar el uso de una arquitectura más compleja biosen-
sor.

Espectroscopia de impedancia electroquímica

La espectroscopía de impedancia electroquímica (EIS) se ha utilizado raramente para
caracterizar biosensores de inhibición, el único ejemplo conocido [43]. El EIS se realizó en
Cat / GCE a -0,4 V frente a Ag / AgCl, el mismo potencial que en amperometría. Los
experimentos se llevaron a cabo en solución tampón, con adición de peróxido de hidrógeno,
sin y con 10 min de incubación con diferentes concentraciones de mercurio entre 5 × 10-11
y 2.5 × 10-9M. El cambio en la resistencia de transferencia de carga, Rct, se puede monitorear
como un diagnóstico de inhibición de mercurio.
Los espectros se muestran en la Fig. 5A y estaban equipados con el mismo circuito
equivalente eléctrico, Fig. 5B, que comprende la resistencia de la celda, R, en serie con una
combinación paralela de un elemento de fase constante, CPE y una resistencia a la
transferencia de carga , Rct. El CPE es mod-elled como un condensador no ideal de acuerdo
con la relación CPE = -1 / (Ci), donde C es la capacidad (que describe la separación de carga
en la interfaz de doble capa), es la frecuencia angular y la exponente expresa el grado de no
uniformidad, heterogeneidad

Los valores de los parámetros obtenidos de la adaptación se muestran en la Tabla 3; R fue constante
a 5 cm2. Las variaciones ocurren en los valores de Rct, pero los valores de CPE y exponente son
esencialmente constantes, como cabría esperar, el valor de exponente de 0,88 representa un
pequeño grado de no uniformidad, como se observa comúnmente en los tipos de electrodos
modificados. Se observó una gran disminución del valor de Rct cuando se añadió H2O2,
correspondiente a la ocurrencia de transferencia de carga, Fig. 5A. Con Hg2 + incubación, Rctbegin
aumentará gradualmente y se obtuvo una dependencia lineal de la concentración del inhibidor hasta
5x10-10M, Fig. 5C, de acuerdo con la metrometría. Por lo tanto, el uso de los valores de Rct de los
experimentos de EIS podría ser una alternativa de medición interesante en los sensores de inhibición
de enzimas.
Tipo de inhibición y reactivación
La respuesta al peróxido de hidrógeno se evaluó en mediciones realizadas después de una serie de 8
incubaciones sucesivas de diferentes concentraciones de mercurio, cayendo en alrededor del 20-25%, en
ausencia de algún tratamiento especial. En trabajos previos, hasta 70% recuperación después de la inhibición
[38] se logró para algunos biosensores enzimáticos por inmersión en solución de tampón fosfato [24, 38, 39],
y otros biosensores podrían ser regenerados hasta un 70-90% de la respuesta inicial mediante el uso de un
agente metalquelante, tales como EDTA [23,35,36].

Selectividad
Selectividad con respecto a diferentes interferentes, incluidas lascaracciones Pb2 +, Cd2 +, Cu2 +, Zn2 +, Co2
+, Ni2 +, Na + y K +, los aniones PO43-, SO42-y Cl-, así como los pesticidas orgánicos atrazina, cianazina,
pestanal y terbutryn pestanal fue estudiado, en una proporción de 1: 2 de analito a interferencias. El biosensor
se incubó durante 10 min con cada uno de estos posibles interferentes y se midió la respuesta al peróxido de
hidrógeno antes y después de la incubación. La inhibición porcentual se calculó usando el mismo
procedimiento que para los iones de mercurio y los resultados se ilustran en la Fig. 6. Ninguna de las especies
analizadas condujo a ningún cambio significativo en la inhibición. La inhibición medible de la actividad de la
catalasa solo se exhibió para las especies siguientes: 1,4% de Pb2 +, 1,3% de Cd2 +, 0,4% de Cu2 +, 1,0% de
atrazina, 1,2% de cianazina y 1,5% de terbutrina; todos los valores son mucho menores que el 21% para Hg2
+. Estos resultados aseguran una excelente selectividad del nuevo biosensor de inhibición para la
determinación de iones de mercurio. La literatura muestra que estos mismos cationes no interferían con la
determinación de mercurio en biosensores basados en glucosa oxidasa, donde sus límites de detección,
considerados como 4% de inhibición, eran 500 veces más altos que los de Hg2 + [23]. Por otro lado, en un
urease biosen-sor [37], para las mismas concentraciones de cationes, el cobre exhibió un 27.8%